DE2908241C2

DE2908241C2 - Die tumorspezifische Immunität vergrößernder Bakterienzellenextrakt und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2908241C2
Application number: DE2908241A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Kanagawa Fujisawa; Yoshio Yokohama Kanagawa Furutani; Hitoshi Chiba Inoue; Shizuo Shimada; Tadashi Sudo
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1978-03-10
Filing date: 1979-03-02
Publication date: 1985-10-31
Also published as: US4726947A; JPS6241214B2; IT1110450B; CA1146467A; DE2908241A1; FR2419071A1; GB2015876B; GB2015876A; FR2419071B1; IT7920841A0; JPS54140710A; DE2954387C2

Description

Die Erfindung betrifft einen zum Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden Tieren geeigneten Bakterienzellenextrakt und ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Bakterienzellenextraktes.

Es ist bereits bekannt, daß die Tuberkelbazillen eine starke Antitumoraktivltät besitzen, und es vurden Versuche unternommen, lebende Zellen des Tuberkelbazillus Patienten mit bösartigem Tumor zu verabreichen. Die Verabreichung lebender Zellen des Tuberkelbazillus enthält jedoch ein großes Risiko der Infektion und erzeugt schwere Nebeneffekte wie Geschwürsbildung und Fieber. Zur Vermeidung dieses Infektionsrisikos wurde eine Anzahl von Versuchen unternommen, den Bestandteil mit der Antitumoraktivltät von dem Tuberkelbazillus zu extrahieren. Die aktiven Substanzen, die bisher von dem Tuberkelbazillus präpariert worden sind, umfassen Heißwasserextrakt, wasserlösliches Adjuvans, Wachs, RibonucleinsSure, Zellwandgerfist, extrahierte Zellrückstände mit organischen Lösungsmitteln und dergleichen.

Jedoch lassen diese von dem Tuberkelbazlllus abgeleiteten Substanzen noch viel zu wünschen übrig. Die Substanzen, die nur geringe Nebenwirkungen besitzen, haben nicht immer hohe Antitumoraktivltät, während diejenigen, die eine hohe Antitumoraktlvität besitzen, dazu neigen, schwere Nebenwirkungen wie Leberschaden «

oder Nierenstörungen, Fieber, Erbrechen und Geschwürsblldung (Ulzeratlon) zu erzeugen. Darüber hinaus £

machen einige Substanzen ein kompliziertes Verfahren zur Herstellung erforderlich, und die so erhaltenen |

Substanzen besitzen nicht immer hohe Antitumoraktivltät. >S

Die Erfinder dei vorliegenden Erfindung haben intensive und ausgedehnte Untersuchungen verschiedener ί

Extrakte angestellt, die von Zellen der Tuberkelbazillen und verwandter Mikroorganismen hergestellt worden %

w?rsn, und haben ganz unerwartet gefunden, daß eine aktive Substanz mit einer hohen Antitumoraktivltät und '

niedriger Toxlzität reproduzierbar In einem einfachen Verfahren und mit guter Ausbeute hergestellt werden I

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Bakterienzellenexiraki aus Zeilen des Tuberkeibaziiius bzw. verwandter Mikroorganismen zu schaffen, der eine hohe Antltumoraktivität bei niedriger Toxizität besitzt und einfach mit guter Ausbeute herstellbar Ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Bakterienzellenextraktes anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch einen zam Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden Tieren geeigneten Bakterienzellenextrakt gelöst, der dadurch erhalten wird, daß ein wäßriger zellfreier Extrakt aus zerrissenen Zellen von Mycobacterium smegmatis ATCC 607 oder Mycobacterlum avlum IFO 3153 hergestellt, dazu ein Flockungsmittel hinzugegeben, der entstehende Niederschlag aufgesammelt, der aufgesammelte Niederschlag In Wasser oder Pufferlösung suspendiert, die entstandene Suspension zur Entfernung des darin enthaltenen Flockungsmittels dialysiert und dann die Suspension gefriergetrocknet wird.

Gemäß der Erfindung Ist das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Bakterienzellenextraktes dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Maßnahmen in der vorstehend angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden.

Der Mikroorganismus, von dem eine Substanz mit Antitumoraktivltät (im folgenden als »K-l Substanz«

so bezeichnet) nach der Erfindung hergestellt wird. Ist aus der Gruppe von Bakterien ausgewählt, die zu dem Genus Mycobacterlum gehört, und betrifft Mycobacterium snugmatls ATCC 607 und Mycobacterlum avlum IFO 3153

Für das Wachstum des Mikroorganismus werden keine bestimmten Beschränkungen auferlegt, und es kann nach beliebigen herkömmlichen Verfahren searbeltet werden, die für den verwendeten Mikroorganismus geelgnet sind. Der Mikroorganismus wird beispielsweise (wie es z. B. mit einem anderen Mikroorganismus Mycobacterlum bovis BCG praktisch durchgeführt wurde) In ein Kulturmedium wie Sautons's Medium oder Glycerin-Boulllon-Medlum geimpft. Dieses Kulturmedium wird bei etwa 37° C drei bis acht Wochen stehen gelassen, und die entstehende Kultur wird filtriert, um eine Masse aus Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden In Wasser oder vorzugsweise einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und dann mittels einer geeigneten Vorrichtung wie

«) einer Dyno-Mühle oder einer Pulver-Mühle oder französischer Presse zerrissen, um eine Suspension aus zerrisse- k

nen Zellen zu bilden. Es Ist vorzuziehen, bei dem Zerreißen der Zellen die Temperatur unterhalb 10° C, beispielsweise durch Abkühlen mit Eis, zu halten. Wenn die Temperatur der Suspension 10" C übersteigt, wird die Aktivität des extrahierten Bestandteils aufgrund der während des Zerrelßens gebildeten Wärme durch die Wirkung von Enzymen herabgesetzt werden. Bevorzugte Beispiele für die Pufferlösung umfassen Phosphat-, Borat-, Acetat-, Zltrat-, Tartrat-, Succlnat- und Trls(hydroxynieuiy])amlnomethanpufferlösungen, und sie können In einer Konzentration von 0,001 bis 1 M und vorzugsweise von 0,01 bis 0,1 M, eingesetzt werden,

Die so erhaltene Suspension aus zerrissenen Zellen wird dann filtriert oder zentrifugiert, um einen wäßrigen zellfrelen Extrakt zu bilden, der für die Herstellung einer aktiven Substanz geeignet Ist. Der Ausdrück »wilßrlaer

zelJ freier Extrakt«, wie er hier verwendet wird, bedeutet die Suspension aus zerrissenen Zellen, aus der die verbliebenen unzerstörten Zellen und die Zellwandrückstände soweit wie möglich durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt worden sind. Diese Abtrennung wird vorzugsweise so durchgeführt, daß der Gehalt des ZeIlwandgerüstes in der endgültigen N-I Substanz 8% nicht überschreitet. Beim Durchführen des Trennens ist es auch zu bevorzugen, die Temperatur unterhalb 10⁰C zu halten. Wenn die Temperatur 10⁰C überschreitet, wird der aktive Bestandteil des wüßrigen zellfreien Extraktes durch die Wirkung von Enzymen verschlechtert und die Trennfähigkeit desselben verringert.

Das Flockungsmittel, das verwendet wird, um die N-I Substanz von dem zellfreien Extrakt auszufällen, "-ann aus einer breiten Vielfalt von Verbindungen ausgewählt werden. Bevorzugte Beispiele für die Flockungsmittel umfassen mehrwertige Metallsalze wie Aluminiumsulfat, Calziumchlorid, Magnesiumchlorid, EisendlD-Chiorid und Manganchiorid; synthetische polymere Flockungsmittel wie Polyacrylamid und Poiyamin; natürliche wasserlösliche basische Polymere wie Chitosan und Protaminsulfat und Natriumalginat; wasserlösliche basische Antibiotika wie Streptomycin und Kanamycin und Salze derselben; und dergleichen. Die Menge der verwendeten Flockungsmittel kann in Abhängigkeit von ihrer Art geeignet bestimmt werden. So werden z. B. mehrwertige Metallsalze geeigneterweise in einer Konzentration von 0,1 bis 10» (Gew.-% des Flockungsmittels, berech- >5 net bezüglich des Volumens des zellfreien Extraktes) und vorzugsweise von 0,1 bis 3% (Gewicht/Volumen, abgekürzt »W/V«), synthetische polymere Flockungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 1%(W/V) und vorzugsweise 0,01 bis 0,1% (W/V), natürliche wasserlösliche basische Polymere und Natriumalginat in einer Konzentration von 0,01 bis 10% (W/V) und vorzugsweise 0,01 bis 1%(W/V), und wasserlösliche basische Antibiotika In eifter Konzentration von 0,1 bis 10« (W/V) und vorzugsweise 0,1 bis 1% (W/V), verwendet.

Dann wird die N-I Substanz durch Zugabe eines Flockungsmittels, wie es oben angegeben ist, von dem wäßrigen zelirreien Extrakt ausgefällt. Der Niederschlag wird von der Mutterlauge durch ein geeignetes Verfahren wie beispielsweise Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Während der Bildung eines Niederschlags und seiner Abtrennung von der Mutterlauge ist es auch zu bevorzugen, die Temperatur unterhalb 10⁰C zu halten. Nach der Zugabe des Ausfiockungsmittels wird die Mischung vorzugsweise einige Stunden stehen gelassen, damit sich der Niederschlag gut Lüdet. Die N-I Substanz, die von der Muttertage durch Filtrieren oder Zentrifugleren abgetrennt worden ist, wird einer zusätzlichen Behandlung unterworfen, um das in dem Niederschlag vorhandene Flockungsmittel zu entfernen. Dies kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren durchgeführt werden. Die N-I Substanz, die wie oben angegeben aufgesammelt worden ist, wird in Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung suspendiert. Dann wird das Flockungsmittel von der entstehenden Suspension durch ^o Dialyse (Geininierung oder Ultrafiltrieren) entfernt. Schließlich wird die so behandelte Suspension gefriergetrocknet (lyophilisiert), um ei ι gereinigte N-I Substanz zu erhalten. Bei dem Reinigungsvorgang wird die Temperatur vorzugsweise rnterhalb 10" C gehalten, um zu verhindern, daß der aktive Bestandteil durch die Wirkung von Enzymen inaktiv gv nacht wird. Bevorzugte Beispiele für die Pufferlösungen für die Reinigung umfassen Phosphat-, Borat-, Acetat-, Zitrat-, Tartrat-, Sueclnat- und TrisfhydroxymethyOamlnomethanpufferlösungen, und sie können in einer Konzentration von 0,001 bis 2 M und vorzugsweise 0,01 bis 0,2 M verwendet werden. Der pH-Wert der Pufferlösung sollte im Bereich von 4 bis 10 liegen. Wenn der pH-Wert niedriger als 4 ist, wird die Dispergierbarkeit der N-I Substanz so verringert werden, daß das Flockungsmittel nicht mehr zufriedenstellend entfernt werden kann, während, wenn der pH-Wert höher als 10 ist, die N-"! Substanz gelegentlich zersetzt werden wird. Wenn Streptomycin als Flockulierungsmittel verwendet wird, wird seine Entfer- « nung durch eine Pufferlösung erleichtert, die Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 M enthält. Die Konzentration von Natriumchlorid, die höher als 0,5 M Ist, bewirkt keine weitere Entfernung des Streptomycins In dem Endverfahrensschritt wird die Suspension gefriergetrocknet, um die Verschlechterung der N-I Substanz zu verhindern.

Die N-I Substanzen, die gemäß dieser Erfindung hergestellt worden sind, besitzen eine komplizierte Zusammenset/ung und bestehen im wesentlichen aus Zucker, Protein, Liplden und Nucleinsäure. Die mit den verschiedenen Flockullerungsmitteln erhaltenen N-I Substanzen zeigen keine merklichen Unterschiede in der Zusammensetzung und haben alle übereinstimmend hohe Antitumoraktlvltäten und nur einen leichten Grad an Toxizitäi und Nebenwirkungen, so daß sie als die aktiv an Bestandteile von antitumoraktiven Zubereitungen verwendet werden können. Darüber hinaus können sie leicht mit guter Ausbeute hergestellt werden. Daher wird die N-I Substanz als ein antitumoraktives Mittel brauchbar sein.
Die N-I Substanzen können Tieren in Form von injizierbaren Lösungen, entweder allein oder In Kombination mit einer antlgenischen Substanz verabreicht werden. Die N-I Substanzen können sowohl in Wasser als auch In Öl suspendiert werden.

S'.e können beispielsweise entweder In Form von Suspensionen in physiologischer Kochsalzlösung oder Emu!- slonen (vorn Wasscr-ln-ÖI-Typ) durch Dispergieren dieser Suspensionen in einem pflanzlichen oder einem mine-

rauschen Öl oder Emulsionen (vom ÖI-in-Wasser-Typ) durch ihre Suspension direkt In einem pflanzlichen oder

einem mineralischen Öl und dann Dispergieren der entstehenden Suspensionen In physiologischer Kochsalzlösung verwendet werden.

Die Dosierung der N-I Substanzen kann In Abhängigkeit von der Tierart, dem Verabreiehungsweg und dem «' Vcrabreichungszeitplan geeignet bestimmt werden. Bei Mäusen können sie intraperitoneal In einer Dosis von 1 bis 50 mg pro kg Körpergewicht oder subcutan in einer Dosis von 2 bis 200 mg pro kg Körpergewicht verabreicht werden. Bei Meerschweinchen können sie intraperitoneal In einer Dosis von 1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht oder subcutan in einer Dosis von 0,05 bis 100 mg pro kg Körpergewicht verabreicht werden.

Die Stellen, an denen die N-I Substanzen verabreicht werden, können entweder Innerhalb des Tumors oder entfernt von dem Tumor liegen.

Für verschiedene Arten von Tumoren können die N-I Substanzen In einer Dosis verwendet werden, die von einem Zehntel bis zu dem gleichen Wert wie die Dosis der lebenden Zellen von BCG reicht, wobei eine antitu-

moraktlve Wirkung ähnlich der von lebenden Zellen von BCG erreicht wird. Beispielsweise Ist die bevorzugte Dosis, die gegen Line 10 hepatoma in Stamm 2 Meerschweinchen wirksam 1st, 100 μg pro Tier für die N-! Substanzen und 1 mg pro Tier fur lebende Zellen von BCG. Dies legt nahe, daß der aktive Bestandteil von lebenden Zellen von BCG In den N-I Substanzen konzentriert ist.

S Darüber hinaus haben die N-I Substanzen eine kräftige Antitumoraktlvltät sowohl an festen Tumoren als auch an Aszltes-Tumoren.

Die Arten von Tumoren, gegen JIe die N-I Substanzen wirksam sind, umfassen beispielsweise Ehrlich-Aszites-Tumor und festen Tumor, Sarcoma 180 Aszites-Tumor und festen Tumor. Melanoma B-16 und die anderen. Besonders tür Line 10 Heptoma In Stamm 2 Meerschweinchen hindern die N-I Substanzen nicht nur das

in Wachstum des primären Tumors, sondern verhindern auch Metastasen zu den regionalen Lymphknoten, was so zu einer vollständigen Heilung führt. Darüber hinaus wehren die Meerschweinchen die zweite Impfung von Line 10 ab, was die Bildung der tumorspezifischen Immunität durch die Behandlung mit N-I Substanzen nahelegt.
Da die N-I Substanzen von einem wäßrigen zellfreien Extrakt von Mycobacterlum (vgl. den PS I) hergestellt

is werden, bringen sie kein PJsiko der Infektion mit sich. Wenigstens soweit es Tiere betrifft, bewirken die N-I Substanzen keine Nebenwirkungen wie Geschwürsbildung an der Stelle der Verabreichung und Leberschädf.n oder Nierenstörungen, wie das bei lebenden Zellen von BCG üblich Ist. Darüber hinaus verursachen die N-I Substanzen selten eine allergische Reaktion In auf Tuberkulln empfindlich gemachten Tieren. Weiterhin Ist, auch wenn die N-I Substanzen Tieren über einen Monat in einer rfglichen Dosis, die gleich dem Zehnfachen derjenigen der lebenden Zellen von BCG Ist, intraperitoneal verabreicht werden, das Auftrev η von toxischen Wirkungen wie Hemmung des Wachstums. Tod, Anämie, Leberstörungen und Entzündung Seiten.

Zusätzlich besitzen die N-I Substanzen eine Adjuvansaktlvität, die gleich oder höher wie diejenige von getöteten Zellen von BCG ist. Wie allgemein bekannt ist, ist ein Adjuvans eine Substanz, die mit einem Antigen einem Tier injiziert wird und sein immunologisches Ansprechen auf das Antigen verstärkt. Verschiedene Mikro-Organismen und zellulare Bestandteile sind bisher auf Adjuvanscktivität untersucht worden. Unter anderem ist weitgehend bekannt, daß der Tuberkelbazillus eine starke Adjuvansaktlvität besitzt und für immunologische Experimente verwendet worden Ist. Kürzlich sind Versuche unternommen worden, um die Adjuvansaktivltät der Tuberkelbazillen oder Ihrer zellularen Bestandteile in der Immuntherapie von Tumoren auszunutzen.

Die N-I Substanzen besitzen eine hohe Adjuvansaktlvität und sehr niedrige Toxizltät. Die N-I Substanzen mil diesen Eigenschaften sind sehr brauchbar zum Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden Tieren.

Wenn die N-I Substanzen als Adjuvans verwendet werden, werden sie den Tieren in Form von Injizierbaren Lösungen mit antlgenlschen Substanzen verabreicht. Wie oben angegeben wurde, sind die N-I Substanzen In der Lage, entweder in Wasser oder in öl suspendiert zu werden.

Beispielswelse können die N-I Substanzen als Adjuvans in Form von entweder Suspensionen, die durch Ihr Dispergieren zusammen mit einer aniigenisehen Substanz in physiologischer Kochsalzlösung erhalsen werden, oder Emulsionen (vom Wasser-In-Öl-Typ), die durch Dispergieren dieser Suspensionen In einem pflanzlichen oder einem mineralischen öl erhalten werden, oder Emulsione (vom öl-in-Wasser-Typ), die durch ihr Suspendieren zusammen mit einer antigenisehen Substanz in einem pflanzlichen oder einem mineralischen Öl und

*> nachfolgendem Dispergieren der entstehenden Suspensionen In physiologischer Kochsalzlösung erhalten werden, verwendet werden.

Die Dosierung der N-I Substanzen, die als Adjuvans verwendet werden, kann In Abhängigkeit von der Tierart, dem Verabreichungsweg und dem Verabreichungszeltplan richtig bestimmt werden. Bei Mäusen können sie In einer Dosis von 0,5 bis 50 mg pro kg Körpergewicht subeutan verabreicht werden und bei Meerschweln-

4> chen können sie In einer Dosis von 0,05 bis 100 mg pro kg Körpergewicht subeutan verabreicht werden.

Die vorliegende Erfindung wird deutlicher und besser durch die folgenden Beispiele und Experimente verständlich werden. Die Beispiele beschreiben die Verfahren zur Herstellung von N-I Substanzen und zur Bildung von antltumoraktlven und Adjuvanszubereitungen aus solchen N-I Substanzen. Die Experimente zeigen die Brauchbarkelt dieser N-I Substanzen.

Beispiel 1

(Aktive Substanz, hergestellt von MycobaciiTUm smegmatls ATCC 607)
Mycobacterlum smegmatls ATCC 607 wurde In ein Glycerin-Boulllon-Medium:

Bouillon 20,0 g

Kaliumphosphat 0,5 g

Zitronensäure 2,0 g

^(l" Ammonium Elsen(III) Zltrat 0,05 g

Magnesiumsulfat 0,5 g

Glyzerin 60,0 g

Wasserzugabe, um das gesamte Volumen auf 1000 ml
zu bringen

eingeimpft und drei Tage lang bei 37° C kultiviert. Die Kultur wurde zentrifugiert, und die aufgesammelten Zellen wurden zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
Dann wurden 35Og dieser Zellen In 1,75 I einer 10 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und mil

einer Dyno-MUhle unter Kühlung mit Eis aufgerissen. Die Suspension aus den zerrissenen Zellen wurde mil 10 000 xg 20 Minuten lang bei 4° C zentrifugiert, um 1,5 I eines wäßrigen zellfreien Extraktes zu erhalten.

Zu 100 ml des so erhaltenen wüßrigen zellfreien Extraktes wurde jeweils eines der verschiedenen Flockungsmittel In der angegebenen Menge hinzugegeben. Die Mischung wurde gut gerührt und dann über Nacht bei 4° C stehen gelassen. Der so gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugleren unter Kühlen aufgesammelt und dann In 10 ml einer 10 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Wenn das Flockungsmittel ein Antibiotikum oder ein anorganisches Salz war, wurde diese Suspension gegen destilliertes Wasser dlalyslert und dann lyophllislert, um eine aktive Substanz nach der Erfindung zu erhalten. Die Art und die Menge des verwendeten Flockungsmittels und die Ausbeute an erhaltenen aktiven Substanzen sind in Tabelle 1 angegeben. Trotz der verschiedenen Arten der verwendeten Flockungsmittel zeigten die aktiven Substanzen keine merklichen Unterschiede In der Ausbeute oder der Zusammensetzung.

Tabelle 1

Aktive Substanzen, hergestellt mit verschiedenen Flockungsmitteln

	Flockungsmittel	Menge	Aktive Substanz	: Bezeich
		(g)	Ausbeute	nung
			(g)	N-S-I
Antibiotikum	Streptomyclnsulfat	0,3	1,15	N-S-2
	Kanamyclnsulfat	0,3	1,02	N-S-3
Anorganisches	Aluminiumsulfat	1,0	1,32	N-S-4
Salz	Calciumchlorid	1,0	1,18	N-S-5
	ElsendIDChlorid	1,0	1.24	N-S-6
	Manganchlorid	1,0	1,27

Beispiel 2
(Aktive Substanzen, hergestellt von Mycobacterlum avlum IFO 3153)

Mycobacterium avlum IFO3153 wurde In ein Glyzerln-Boulllon-Medium mit dergleichen Zusammensetzung, wie sie In Beispiel 1 beschrieben Ist, eingeimpft und 6 Wochen lang bei 37° C kultiviert und gebildet. Die Kultur wurde durch Mullgewebe filtriert, und die aufgesammelten Zellen wurden zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

Dann wurden 293 g dieser Zelten In 1,5 1 einer IömM-Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und mit einer Dyno-Mühle unter Kühlen zerrissen. Die Suspension aus zerrissenen Zellen wurde mit 20 000 χg 20 Minuten lang bei 4° C zentrifugiert, um 1,2 1 eines wäßrigen zellfrelen Extraktes zu erhalten.

Zu diesem Extrakt wurden 3,6 g Streptomycinsulfat hinzugegeben. Die Mischung wurde gut gerührt und dann bei 4° C über Nacht stehen gelassen. Der so gebildete Niederschlag wurde durch 20 Minuten langes Zentrifugleren bei 10000xg bei 4⁰C aufgesammelt und dann in KIOmI einer 10 mM-Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, suspendiert. Diese Suspension wurde bei 4° C unter Verwendung von Zellglas-Rohrmaterial (cellophane tubing) einen Tag lang gegen 21 der oben beschriebenen Pufferlösung, bei 4° C einen Tag lang gegen 21 einer 1OmM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) und schließlich bei 4° C einen Tag lang gegen destilliertes Wasser dlalyslert. Die so behandelte Suspension wurde lyophilislert, um 8,7 g einer aktiven Substanz nach der Erfindung zu erhalten.

Diese aktive Substanz wird hier im folgenden als »N-A-l« bezeichnet.

Experiment 1 (Zusammensetzung von N-I Substanzen)

Die Zusammensetzung der N-I Substanzen Ist in Tabelle 3 angegeben. Sie wurden durch die folgenden Verfahren analysiert.

(1) Zucker:

Bestimmt durch die Phenol-Sulfat-Reaktion (M. Dubois, K.A. Giiies, J.K. Hamilton, P.A. Rebers, und F. Smith: Analytical Chemistry 28, 350, 1956).

(2) Protein:

Bestimmt durch das modifizierte Verfahren von Lowry (CD. Stauffer Analytical Biochemistry, 69, 646, 1975).

(3) Lipide:

Bestimmt durch das Verfahren von Bleigh und Dyer (E.G. Bleigh und WJ. Dyen Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911, 1959).

(4) Nucleinsäure:

Fraktioniert nach dem Verfahren von Schmidt, Thannhauser und Schneider (W. C. Schneider: J. Biol. Chem., 164, 747, 1946) und bestimmt durch die Diphenylaminreaktion (K. Burton: Biochem. J., 62, 315, 1956) und durch die Orcinolreaktion (W. Mejbaum: Z. Physiol. Chem., 258, 117, 1939).

55 I

Tabelle 2

Zusammensetzung von N-I Substanzen

Bei- Probenbe- Zusammensetzung 5fi
spiel zeichnung Zucker Protein Lipide Nucleln-

sllu re

1	N-S-I	14,8	33,0	23,5	10,5
1	N-S-?	16,3	21,5	20,4	7,4
2	N-A-I	14,6	35,0	18,3	8,9

Aus den In Tabelle 2 angegebenen Daten Ist deutlich ersichtlich, daß die N-I Substanzen aus Zucker, Protein, Llplden und Nuclelnsäure In im wesentlichen konstanten Verhaltnissen bestehen, unabhängig von den verschle-IS denen verwendeten Flockungsmitteln.

Experiment 2 (Antltumorwlrkung an Mäuse-Sarcoma)

10 mg N-S-I bzw. N-A-I wurden mit 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung In einem Mörser fein gemahlen. Nach Zugabe von 25 ml physiologischer Kochsalzlösung wurde die Mischung gut gerührt, um eine Suspension aus der N-I Substanz In physiologischer Kochsalzlösung zu bilden. Dann wurden jeweils 0,5 ml von jeder Zubereitung 6 weiblichen Mausen des ICR-Stammes intraperltoneal verabreicht, und nach 3 Tagen wurden 2xl0⁴ Zellen von Mäuse-Sarcoma 180 In die Perltonealhöhle jedes Tieres eingeimpft. Nach weiteren 3 Tagen wurde die gleiche Zubereitung In der angegebenen Dosis intraperlton.eal verabreicht. Die Anzahl der überlebenden Tiere 2ί wurde 30 Tage nach der Einimpfung von Tumorzellen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Es wurde gefunden, daß die aktiven Substanzen der Erfindung das Wachstum von Tumorzellen unterdrücken und die Überlebensdauer von tumortragenden Tieren verlängern. Darüber hinaus wurden keine Nebenwirkungen beobachtet.
Die physiologische Kochsalzlösung wurde als Vergleich verwendet.

Tabelle 3

Antitumorwirkung an Mäuse-Sarcoma

Proben- Dosis Anzahl der Überlebenden/

bezelchnune fug/Tier) Gesamte Anzahl der Tiere

N-S-I	200	X	2	6/6
N-A-I	200	X	2	5/6
Lebende Zellen	1000	X	2	5/6
von BCG
Kontrolle	__			0/6

■'S Experiment 3 (Antitumorwirkung an Meerschwelnchen-Hepatoma)

Verschiedene antitumoraktlve Zubereitungen von aktiven Substanzen der Erfindung wurden hergestellt. Dann wurden 1 χ 10⁶ Zellen von Line 10 Hepatoma syngenetlsch (d. h. gleichzeitig entstanden) mit Stamm 2 Meerschweinchen Intradermal an der linken Flanke von Stamm 2 Meerschweinchen in einer Gruppe von fünf elngeimpft. Als der Durchmesser des Tumors etwa 10 mm erreicht hatte, wurde die angegebene Menge jeder Zubereitung in den Tumor Injiziert. 6 Wochen nach der Einimpfung von Tumorzellen wurden die mittleren Durchmesser des primären Tumors und der Metastasen In dem regionalen Lymphknoten gemessen. Zusätzlich wurde die Anzahl der überledenden Tiere 8 Wochen nach der Impfung untersucht. Die Ergebnisse sind In Tabelle 4 angegeben.

Die aktiven Substanzen der Erfindung verhinderten die Wucherung des gebildeten Tumors und verhinderten Metastasen und führten so zu einer vollständigen Hellung. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet.

Lebende Zellen (die als »WC« bezeichnet werden) des Mikroorganismus wurden zum Vergleich getestet. Die Öl-in-Wasser- und die Wasser-in-Öl-Zubereitungen ohne die aktive Substanz wurden als Vergleich verwendet.

¹I

Tabelle 4

Antltumorwirkung von N-I Substanzen an Meerschweinchen-Hepatoma

Verwendeter	Probe Dosis	Anzahl d.	Mittlerer	Mittlerer
Mikroorganismus	(Mg/Tler)	Überleben	Durchmes	Durchmesser
		den/Gesam	ser des	von meta
		te Anzahl	primären	stasischem
		der Tiere	Tumors (mm)	Tumor (mm)
		) ·)	) *)	*) ")

Mycobacterlum
bovls BCG
(Japanisch)

Mycobacterium
smegmatis
ATCC 607

Kontrolle

N-B-I 200

WC 2000

N-S-I 200

WC 2000

4/5 5/5

4/5 3/5

1/5 O/S

5/5 4/5

2/5 O/S

4
14

21
23

10

11
14

40

0
11

25

*) Die Zubereitung wurde hergestellt:

10 mg N-S-I wurden mit einer kleinen Menge Drakeol 6VR (Sanko Junyaku Co., Japan)
homogenisiert. Nach Zugabe von 5 ml physiologischer Kochsalzlösung, die 0,2% Tween 80
enthielt, wurde die Mischung homogenisiert, um eine Öl-In-Wasser-Zubereltung herzustellen, die die N-I Substanz enthielt.

*) Die Zubereitung wurde hergestellt:

10 mg N-S-I wurden mit 2,5 ml physiologischer Kochsalzlösung In einem Mörser fein
gemahlen. Nach Zugabe von 2,5 ml flüssigem Paraffin, das \5% Ariacel A (Sanko Junyaku
Co., Japan) enthielt, wurde die Mischung homogenisiert, um eine Wasser-In-Öl-Zubereltung
herzustellen, die die N-I Substanz enthielt.

Experiment 4 (Antltumorwirkung an Ehrilch'schem Mäusetumor)

Unter Verwendung des Verfahrens von Experiment 2 wurden verschiedene antitumoraktive Zubereitungen von aktiven Substanzen der Erfindung hergestellt. 0,5 ml jeder Zubereitung wurden intraperitoneal 6 weiblichen Mäusen vom ddY-Stamm verabreicht, und 3 Tage später wurden 2x10'' Zellen von Ehrlich'schem Tumor In die Pcrücncalhöh's jedes Tieres eingeimpft. Nach weiteren 3 Tagen wurden die gleichen Zubereitungen in der angegebenen Dosis Intraperitoneal verabreicht. Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde 30 Tage nach der Einimpfung von Tumorzellen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben.

Die aktiven Substanzen der Erfindung hemmten das Wachstum von Tumorzellen und verfangenen die Überlebensdauer von tumortragenden Tieren. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet.

Die physiologische Kochsalzlösung wurde als Vergleich verwendet.

Tabelle 5

Antltumorwirkung an Ehrlich'schem Mäusetumor

Probe	Dosis	Anzahl der Überlebenden/
	(pg/Tler)	Gesamtzahl der Tiere
N-S-I	300x2	3/6
N-A-I	300x2	4/6
Lebende	1000 χ 2	3/6
BCG
Kontrolle		0/6

Experiment 5 (Adjuvanswirkung auf verzögert-artige Überempfindlichkeit)

5 mg N-S-I bzw. N-A-I und 5 ml flüssiges Paraffin, das 15% Tween 80 enthielt, wurden homogenisiert, um ein Adjuvanspräparat herzustellen, das die N-I Substanz enthielt. Eine Lösung von 100 mg vom Rind stammendem Serumalbumin in 5 ml physiologischer Kochsalzlösung wurde Tropfen um Tropfen zu 5 ml jeder Zubereitung hinzugegeben, und die entstandene Mischung wurde homogenisiert, um eine Wasser-In-Öl-Emulsion herzustellen. Dann wurden 0,5 m! der Emulsion intramuskulär 4 weiblichen Meerschweinchen vom Hartley Stamm mit einem Alter von 5 Wochen verabreicht. Vier Wochen später wurde eine Lösung von i00 μg vom Rind stammendes Serumalbumin in 0,05 ml pLysioIogischer Kochsalzlösung in die Rückenhaut Injiziert, und die Größe (größerer Durchmesser χ kleinerer Durchmesser in mm) der Rötung an der Stelle der Injektion wurde nach 48 stunden gemessen. Die durchschnittliche Größe der Rötung für jede Gruppe ist in Tabelle 6 angegeben.

Es wurde eine ähnliche Wasser-In-Öl-Emulslon, die abgetötete Zellen von BCG anstelle der N-I Substanz enthielt. In der Vergleichsgruppe verwendet, und eine ähnliche Wasser-In-Öl-Emulslon ohne aktive Substanz wurde In der Kontrollgruppe verwendet.

Es wurde gefunden, daß die aktiven Substanzen der Erfindung alle eine bemerkenswerte Adjuvanswlrkung besaßen.

Tabelle 6

Adjuvanswlrkung auf verzögerte Überempflndllchkelt

Gruppe	Probe	Größe der ROiung (mm χ mm)
Experimentelle Gruppe '	N-S-I N-A-I	17x 16 15 χ 18
Vergleichsgruppe	abgetötete Zellen von BCG	16x16
KnntrnÜR		*Sx. β*

Experiment 6 (Adjuvanswlrkung auf humorale Antikörperproduktion)

10 mg N-S-I bzw. N-A-I wurden mit 2,5 ml. physiologischer Kochsalzlösung in einem Mörser fein gemahlen. Nach Zugabe von 2,5 ml flüssigem Paraffin, das 15* Arlacel A (Sanko Junyaku Co., Japan) enthielt, wurde die

Mischung homogenisiert, um eine Wasser-in-Öi-Zubereltung herzustellen, die die N-I Substanz enthielt. Dann wurden 0,5 ml jeder Emulsion 4 weiblichen Meerschweinchen vom Hartley-Stamm mit einem Alter von 5 Wochen intramuskulär verabreicht. Vier Wochen nach der Injektion wurde der Antlkörper-Tlter In Serum gegen vom Rind stammendes Serum-albumln durch die quantitative Präzipitin-Reaktion bestimmt. Die Ergebnisse sind In Tabelle 7 angec.aben.

W Eine ähnliche Wasser-In-Öl-Emulsion, die abgetötete Zellen von BCG anstelle der N-I Substanz enthielt, wurde In der Vergleichsgruppe verwendet, und eine ähnliche Wasser-in-Öl-Emulslon ohne aktive Substanz wurde In der Kontrollgruppe verwendet.

Tabelle 7

Adjuvanswlrkung auf humorale Antikörperproduktion

*> Gruppe Probe Antlkörper-Tlter

fog N/ml)

Experimentelle N-B-I 950

Gruppe N-T-I 923

N-S-I 947

N-A-I 939

Vergleichs- abgetötetes BCG 1116

gruppe

Kontrolle — 230

Experiment? (Test von N-I Substanzen auf Tuberkelbazillen)

Verschiedene N-I Substanzen wurden auf die Anwesenheit von lebenden Tuberkelbazillen gemäß dem Verfahren getestet, das in »A Guide to Tubercle Bacillus Test (1972)« (herausgegeben unter Überwachung des Ministry of Health and Weifare, Japan) beschrieben ist.

Zu einer Suspension jeder N-I Substanz In steriler physiologischer Kochsalzlösung wurde eine 156 Natriumhydroxidlösung hinzugegeben. Die entstandene Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37° C stehen gelassen und dann mit 1556 Schwefelsäure neutralisiert. 0,1 ml der Mischung wurden auf eine schräg im Reagenzglas angew legte Agrarkultur eingeimpft, die Ogawa's Medium (Elken Kagaku Co., Japan) enthielt, und 3 Wochen iang bei 37° C stehen gelassen, und dann wurde das Vorhandensein von Kolonien untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben.

Tabelle 8 Test von N-I	Substanzen auf Tuberkelbazlllen	Anzahl von Kolonien	Beurteilung
Probenbe zeichnung	Konzentra tion (mg/ml)	0 0	Negativ Negativ
N-S-I N-A-I	20 20

Es ist deutlich, daß die aktiven Substanzen der Erfindung keine lebenden Zellen des Tuberkelbazillus enthalten.

Experiment 8 (Akute Toxizität)

De N-I Substanzen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und 6 männlichen Mäusen vom
ddY-Stamm mit einem Alter von 6 Wochen intraperitoneal verabreicht. Dann wurde die LD 50 (oder mittlere
letale Dosis) bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben.

Tabelle 9

Akute Toxizität von N-I Substanzen

Probe	LD50
	(mg/kg)
N-S-I	1200
N-A-I	1000
Abgetötetes BCG	20(MOO
Abgetötetes H37Ra	200-400
Abgetötetes Mycobacterium smegmatls	200-400

Claims

Patentansprüche:

1. Zum Vergrößern der tumorspezifischen Immunität von tumortragenden Tieren geeigneter Bakterienzellenextrakt, der dadurch erhalten worden ist, daß ein wäßriger zellfreier Extrakt aus zerrissenen Zellen von Nh'cobacterium smegmatis ATCC 607 oder Mycobacterium avium IFO 3153 hergestellt, dazu ein Flockungsmittel hinzugegeben, der entstehende Niederschlag aufgesammelt, der aufgesammelte Niederschlag in Wasser oder Pufferlösung suspendiert, die entstandene Suspension zur Entfernung des darin enthaltenen Flockungsmittels dialysiert und dann die Suspension gefriergetrocknet wird.

2. Verfahren zur Herstellung des Bakterienzellenextrakts des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß ίο man die im Anspruch 1 genannten Maßnahmen in der dort angegebenen Reihenfolge durchführt.