DE2324717C3 - Verfahren zur Herstellung eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIII) - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIII)

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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIII) mit erhöhter Ausbeute aus Blutplasmafraktionen, die durch Cryo-Ausfällung gewonnen werden.
Das Verfahren der Blutkoagulierung ist ein komplizierter biologischer Vorgang und erfordert die Zusammenwirkung verschiedener, in normalem Gesamtblut auftretender Substanzen. Bekanntlich sind bei bestimmten Menschen bestimmte Faktoren, die mit dem Blutkoagulierungsmechanismus in Zusammenhang stehen, abwesend oder stark vermindert So ist bekanntlich die klassische Hämophilie (Hämophilie A) eine Mangelerkrankung aufgrund der Abwesenheit von AHF (Faktor VIII). Bei Patienten, die an angeborener Hämophilie, die als Hämophilie B bekannt ist, leiden, fehlt dem Blut die Plasmathromboplastinkomponente (PTC, Faktor IX). Verschiedene andere, für den Koagulierungsmechanismus wichtige Faktoren II, VII und X.
Bis vor wenigen Jahren bestand die Behandlung von Bluterpatienten in Transfusion mit Gesamtblut oder Blutplasma. Die verbesserte medizinische Praxis fordert jedoch, daß man dem Patienten, wenn möglich, nur solche Blutkomponenten verabreicht, an denen es ihm fehlt Aufgrund der allgemeinen Knappheit an Blut ist es auch vorteilhaft, dieses in verschiedene Komponenten zu fraktionieren, wodurch sie je nach Erfordernis für die Behandlung des Patienten verwendet werden können.
Es sind verschiedene Verfahren zum Fraktionieren von Blut und Blutplasma in seine getrennten Komponenten oder deren Konzentrate bekannt Besonders zu erwähnen ist die Arbeit von Edwin Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard Universität bei der Entwicklung des Alkoholfraktionierungsverfahrens. Mit besonderem Bezug auf die Produktion von AHF zeigen die neueren US-Patentschriften 36 31 018 und 36 52 530 verbesserte Verfahren zur Erzielung eines hochgradig reinen Konzentrates dieses Faktors.
Bei der Forschungsarbeit von Wagner, TheKn, Brinkhous und anderen, an der AHF-Produktion interessierten Gruppen wurde gefunden, daß die Anwesenheit von Prothrombin (Faktor II) und seines assoziierten Komplexes von Faktoren für die langzeitige und kurzzeitige Stabilität des Faktors VIII nachteilig war. Die übliche Behandlung zur Umgehung dieses Problems bestand in der Entfernung des Prothrombin-Komplexes mit verschiedenen Mitteln, wie Aluminiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Bariumcarbonat, Bariumsulfat, Rivanol (63-Diamino-2-äthoxyacridinlactat), IkC-50 Ionenaustauscherharz (»XE-64-Rivanol«) und Glycinithylester.
Wenn auch diese Mittel gewöhnlich wirksam sind, wurden bei ihrer Verwendung in klinischem Maßstab verschiedene ernste Nachteile offensichtlich. So wird z. B. der Einschluß von Spurenmengen von Aluminium
ίο klinisch als unsicher angesehen.
Seit der Cryo-Ausfällung und einstufigen Herstellung relativ hochwirksamer Konzentrate schien zunächst die Verwendung jeglicher Maßnahmen der Prothrombinkomplexentfernung umgangen zu sein (vgl. Pool et aL,
is »Nature«, Bd. 203, Seite 312 [1964]). In der Praxis wurde jedoch gefunden, daß eine hohe Schwankung von bis zu oder mehr als 50% der mittleren Werte der
AHF-Ausbeuten auftrat Die einzige Vorveröffentlichung, die tatsächlich
konkrete Schlußfolgerungen auf das nunmehr beanspruchte Verfahren vor dem Anmeldetag dieser Erfindung zuließ, war ein umfassender Artikel von A. E. Preston in »British Journal of Haematology« (Bd. 13, Nr. 1, Jan. 1967, Seite 42 ff.). Die auf gründlichen Versuchen beruhenden Ausführungen dieses Autors mußten jedoch ein ganz anderes Ergebnis der Wirkung eines Zusatzes von Heparin zu einer Blutplasmafraktion erwarten lassen, als sie erfindungsgemäß tatsächlich erhalten wird.
Der Autor hat die Wirkung der Zugabe von Heparin zu Vollplasma quantitativ untersucht, und die dabei erhaltenen Werte wurden in Tabelle III auf Seite 47 des genannten Artikels niedergelegt Es ist ersichtlich, daß nach einer Lagerungszeit von 18 Stunden bei 4° C das mit Trinatriumcitrat versetzte Blut eine sehr dramatische Abnahme an Faktor VIII zeigt, welche um so höher ist, je mehr Heparin-Einheiten dem Blut zugesetzt wurden. Die gleiche Erscheinung wurde mit Blut erhalten, das ein Säure-Citrat-Dextrose-Antikoagulationsmittel enthielt und 30 Tage bei -40° C gelagert war.
Aus diesen Ergebnissen mußte also die eindeutige Schlußfolgerung gezogen werden, daß die Zugabe von Heparin praktisch keine Wirkung auf die AHF-Aktivität des frischen Blutplasmas hat und daß sie sich ferner auffällig nachteilig auf die AHF-Aktivität während der Lagerung bei beispielsweise 4° C oder -40° C auswirkt Nach diesen Ergebnissen ist die Verwendung von Heparin als Zusatzmittel zu Blutplasma schädlich, und es mußten aufgrund naheliegender Schlußfolgerungen angenommen werden, daß auch der Zusatz von Heparin zu Blutplasmafraktionen in gleichem oder sogar verstärktem Maße schädlich sein würde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die
Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines stabilen AHF-Konzentrates mit beachtlich verbesserter Ausbeute, insbesondere bei Herstellungsverfahren in großem Maßstab, wobei keinerlei klinisch unsichere Verunreinigungen im Konzentrat erhalten werden.
ω Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIII) mit erhöhter Ausbeute aus Bhrtplasmafraktionen, die durch Cryo-Ausfällung aus Plasma gewonnen und gegebenenfalls mit Polyäthylenglykol und/oder Glycin weiterfraktioniert werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem erhaltenen Cryopräzipitatkonzentrat Heparin in Mengen von 0,01 — 10 Einheiten pro ml Lösung zufügt
Das wesentlichste Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht also darin, zu einer durch Cryo-Ausfällung aus Plasma gewonnenen Plasmafraktion Heparin in einem bestimmten Mengenbereich zuzusetzen. Dabei erreicht man die besten Ergebnisse, wenn der Heparinzusatz unmittelbar nach der Cryo-Ausfällung, z. B. zu dem Cryopräzipitat, erfolgt
Das Cryöpräzipitat wird vorzugsweise einer weiteren Fraktionierung unterworfen. Fraktionierungsmittel für eine solche Weiterfraktionierung des Cryopräzipitats sind bereits bekannt Beispielsweise wurde die bekannte Cohn-Fraküonierungsmethode, welche Alkohol für diesen Zweck verwendet, bereits genannt Erfindungsgemäß wird bevorzugt für eine Weiterfraktionierung des Cryopräzipitats Polyäthylenglykol bzw. Glycin aus der Reihe der bekannten Fraktionierungsmittel ausgewählt
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat das als Fraktionierungsmittel verwendete Polyäthylenglykol ein durchschnittliches Molekulargewicht von 4000. Dabei kann das Cryopräzipitatkonzentrat mit etwa 3 bis 4% Polyäthylenglykol behandelt werden, wobei man die überstehende Flüssigkeit mit 10% Polyäthylenglykol ausfällt und das erhaltene überstehende Material dann mit Glycin fraktioniert
Bei Verwendung von Glycin als Fraktionierungsmittel hat dieses vorzugsweise eine Molarität von etwa 1,8.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das mit Heparin versetzte Cryopräzipitatkonzenirat gefriergetrocknet werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erreicht, daß die Ausbeute an AHF insbesondere bei der Herstellung in großem Maßstab verbessert werden kann. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß im Gegensatz zur bisherigen Praxis ohne Verwendung von Heparin bei seiner Verwendung (1) die Zellverunreinigung, z. B. aus dem Fraktionierungsverfahren, nicht zu niedrigeren Ausbeuten führt, (2) die Gewebeverunreinigung, wie sie z. B. während der intravenösen Verabreichung erfolgt, keine niedrigeren Ausbeuten liefert, (3) eine längere Behandlungszeit die Ausbeute nicht vermindert und (4) die Stabilität nach Rekonstituierung gegenüber nicht mit Heparin behandelten Plasmakonzentraten sehr beträchtlich erhöht wird. Erfindungsgemäß ist es daher nicht nötig, den Prothrombinkomplex zur Erzielung einer Stabilität der AHF-Konzentrate zu entfernen, und die üblichen Verluste der Ausbeute aufgrund von Zeil- und Gewebeverunreinigung oder längere Behandlungszeiten werden vermieden.
Die erfindungsgemäß während der Fraktionierung von AHF verwendete Heparinmenge kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde gefunden, daß eine Konzentration von etwa einer Einheit Heparin pro ecm Plasmalösung oder -fraktion sehr gute Ergebnisse liefert Unter »Einheit Heparin« wird in der vorliegenden Anmeldung die »Ui>.P.-Einheh« (Unhed States Pharmacopoeia) verstanden. Die Ui5.P.-Emheh an Heparin ist die Menge, die 1,0 ecm crtratversetztes Schafsplasma 1 Stunde am Gerinnen hindert, nachdem 0,2 ecm einer 1 :100 CaCb Lösung zugegeben wurde. Die hier verwendete Bezeichnung »Heparin« umfaßt auch das Natriumsalz von Heparin, das aufgrund seiner Wasscrlöslichkeit bevorzugt wird.
Die vorliegende Erfindung hat sich bei verschiedenen Verfahren zur Herstellung von AHF-Konzentraten durch Cryo-Ausfällung als sehr vorteilhaft erwiesen und ist auf jede Plasmafraktion anwendbar, die AHF in Mischung mit irgendeinem der Prothrombinkomplexfaktoren enthält So kann es z.B. auf Verfahren zur Fraktionierung von AHF aus Crycprlzipitat durch Glycinausfillung, aus Cryoprlzipitat durch Polylthylenglykolausfillung, aus Cryoprlzipitat durch Polyithylenglykol- und Glycinausfällung, aus Cryoprizipitat und aus. Cryopräzipitat durch Polyäthylenglykol- und Glycinausfällung und anschließende »Ecteoiaa-Chromatographie angewendet werden.
ίο Eine bevorzugte Methode zur Herstellung von AHF-Konzentrat, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist, ist das in der US-Patentschrift 36 31 018 beschriebene Verfahren, bei welchem Polyäthylenglykol (PEG) und Glycin zum Fraktionieren eines Cryopräzipitates verwendet werden. So wird in Beispiel 4 der genannten Patentschrift in der Stufe, in welcher die Cryo-Ausfällung in mit Glycin und Citrat versetzter Kochsalzlösung gelöst wird, etwa eine Einheit Heparin pro ecm Lösung zugefügt Nach der Ausfällung mit
Polyäthylenglykol bei 10%iger Konzentration wird der erneut gelöste Niederschlag wiederum auf einer Menge von etwa einer Einheit Heparin pro ecm Lösung aufgrund des Verlustes an Heparin während der Fraktionie-ung mit 10%tigem Polyäthylenglykol behan-
delt Das Heparin wird zweckmäßig zu der mit Citrat
bzw. Glycin und Citrat versetzten Kochsalzlösung
zugefügt, die zum Lösen der jeweiligen Niederschläge
verwendet wird.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorlie-
gende Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
In folgender Weise wurde ein stabiles AHF Konzentrat von Menschen in hoher Ausbeute und von hoher Wirksamkeit erhalten:
Reagenzien
Citrat-versetzte Kochsalzlösung — 1 Teil O.lmolares Natriumeitrat zu 4Gew.-Teilen 0,9%iger
Kochsalzlösung
mit Glycin und Citrat versetzte Kochsalzlösung — zur oben hergestellten Citrat-versetzten Kochsalzlösung wurde ausreichend Glycin zugeführt, um die Lösung bezüglich Glycin 0,1 molar zu machen
gepuffertes Waschwasser — zu dest Wasser wurde Vioo Volumen gepuffertes Citrat zugefügt, hergestellt durch Einstellen von 0,5molarem Natriumcitrat mit 0,5molarer Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,88
Heparin — es wurde ein Material von U. S. Pharmacopoeia-Reinheit verwendet (»Lipo-Hepin« — wäßrige Natriumheparininjektion).
Essigsäure — hergestellt in 1,0 normaler und 0,lnormaler wäßriger Lösung
Glycin — hergestellt in 1,3. und l,8molarer wäßriger Lösung.
Verfahren
Aus dem Spendenzentrum wurde gefrorenes mensch-
bches Blutplasma (bei unterhalb 4° C) geliefert Das
Plasma wurde in Pfaudler-Kessem gepooh und bei einer Temperatur von 2° C bis 4° C durch kontinuierliche FKeB- oder Becherzentrifugierung zentrifugiert Zum Cryoprizipitat wurde mit Glycin und Citrat versetzte Kochsalzlösung, die eine Einheit Heparin pro ecm
enthielt, zugefügt, wobei die Menge ein Zehntel der
Menge des das Cryopräzipitat enthaltenden Plasmas
betrug.
Das Lösen erfolgte durch Mischen von Cryopräzipitat und mit Glycin und Citrat versetzter Kochsalzlösung in einer warmen Umgebung (normaler Zimmertemperatur, jedoch nicht über 30°C)
D«s gelöste Cryoprazipitat wurde mit 0,1 normaler Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt Zur Lösung wurde Polyäthylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 4000) bis zu einer PEG Konzentration von etwa 3£% zugefügt Die Mischung wurde tO Minuten bei Zimmertemperatur mild bewegt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdr./min zentrifugiert Die Oberstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und mit 0,1 normaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 638 eingestellt Zur Lösung wurde weiteres Polyäthylenglykol bis zu einer endgültigen PEG Konzentration von etwa 10% zugefügt Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 30 Minuten mild bewegt und dann eine halbe Stunde bei 5000 Umdr./min zentrifugiert Die fiberstehende Flüssigkeit wurde al dekantiert und verworfen. Der Niederschlag wurde in kaltem Wasser (2°C) gewaschen, dann erfolgte 5 Minuten bei 5000 Umdr7min und einer Temperatur von —4° C ein Rotationswaschen. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Niederschlag erneut in mit Glycin und Citrat versetzter Kochsalzlösung, die eine Einheit Heparin pro ecm enthielt, gelöst Wiederum ist die Menge des zur erneuten Lösung verwendeten Lösungsmittels etwa ein Zehntel des Plasmavolumens, das den Niederschlag ergab.
Der erneut gelöste Niederschlag wurde mit 0,1 normaler Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,88 eingestellt und erneut mit wäßrigem Glycin einer Molarität von 1,8 ausgefällt Während dieser Ausfällungsstufe wurde ausreichend Glycin zugefügt, um die Mischung bezüglich Glycin l,8molar zu machen. Die Mischung wurde 45—60 Minuten mild bei einer Temperatur von 2—100C bewegt und dann durch kontinuierliches Fließ- oder Becherzentrifugieren zentrifugiert Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und vorsichtig mit gepuffertem Waschwasser gewaschen und erneut in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung gelöst Die Lösung wurde durch Filtration unter Verwendung eines 293-mm-Milliporen-Filters (verwendete Membrane: 1,2 Micron, 0,45 Micron und 0,3 Micron) geklärt
Dann wurde das flüssige Produkt durch »Shell«-Einfrieren (-600C) und mindestens 3-stündiges Lagern in einer Blitzeinfriervorrichtung (-200C bis — 300C) eingefroren.
Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei kein Heparin zur mit Glycin und Citrat versetzten Kochsalzlösung zugeführt wurde, die zum Lösen des anfänglichen Cryopräzipitates oder zum Lösen des Niederschlages aus der Fraktionierung mit 10%igem Polyäthylenglykol oder an irgendeinem anderen Punkt während der Fraktionierung verwendet wurde.
Die obigen Verfahren wurden sowohl mit als auch ohne Heparinzugabe wiederholt.
Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse aus den vier Fraktionierungsversuchen. Dabei gibt die Spalte »Cryo-Ausbeute« die aus dem Ausgangsplasma gewonnene AHF Menge an; die Spalte »Endproduktausbeute« gibt die endgültige AHF Ausbeute an.
AHF-Ausbeute Cryo-Ausbeute
%		 Endprodukt
ausbeute
Vo 		Wirksamkeit
d. Verfahrens
Vo 		Ges. VoL d.
Ausgangs
plasmas: 1
Angew. Verfahren 35
35
32
33		 13,6
17
12,5
17		 38
49
39
52		 6000
300
6000
300
Ohne Heparin
Mit Heparin
Ohne Heparin
Mit Heparin
die
von
Aus der obigen Tabelle geht hervor, daß
endgültige AHF Ausbeute bei Verwendung
Heparin 17% betrug, während sie ohne Heparin durchschnittlich zwischen 12,5 und 13,6 lag. Daher erhöhte die Heparinzugabe die Ausbeute gegenüber dem Verfahren ohne Heparin um 15-35%. Indem die Endproduktausbeute durch die Cryo-Ausbeute dividiert wurde, ist ersichtlich, daß sich die Wirksamkeit des Verfahrens von 38 und 39% (ohne Heparinzugabe) auf 49 und 52% (mit der Heparinzugabe) verbessert hatte.
Wurde im obigen Beispiel Polyäthylenglykol 6000 für eine äquivalente Menge Polyäthylenglykol 4000 ersetzt, dann erhielt man praktisch ähnliche Ergebnisse.
Beispiel 2
Das Verfahren von Beispiel 1 wunfc bis zur Stufe des erneuten Suspendierens des anfänglichen Cryopräzipitttes in der mit Glycin und Citrat versetzten Kochsalzlösung mit und ohne Heparin in der Lösung wiederholt Die endgültige AHF-Ausbeute in diesen beiden Cryopräzipitatkonzentraten von AHF betrug ohne Verwendung von Heparin 34% und mit Heparinverwendung 41%. Dies entsprach einer Verbesserung der Ausbeute von 21%.
Beispiel 3
Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch die Cryopräzipitatkonzenlrate mit und ohne Heparin lyophilisiert, dann mit Wasser rekonstituiert und bei Zimmertemperatur (etwa 25° C) 24 Stunden stehen gelassen wurden. Die mit Heparin behandelte Probe bewahrte 98% ihrer anfänglichen AHF Aktivität vor dem Stehenlassen, während die nichtheparinisierte Probe nur 72% ihrer anfänglichen AHF Aktivität bewahrte.
60

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Herstellen eines stabilen AHF-Konzentrates (Faktor VIH) mit erhöhter Ausbeute aus BIu plasmafraktionen, die durch Cryo-Ausfällung aus Plasma gewonnen und gegebenenfalls mit Polyäthylenglykol und/oder Glycin weiterfraktionieit werden, dadurch gekennzeichnet, daß man dem erhaltenen Cryopräzipitatkonzentrat Heparin in Mengen von 0,01 — 10 Einheiten pro ml Lösung zufügt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man weiteres Heparin im Laufe der anschließenden Fraktionierungen zufügt
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit Heparin versetzte Cryopräzipitatkonzentrat gefriertrocknet
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