DE2703620A1

DE2703620A1 - Verfahren zur herstellung eines konzentrats des antihaemophiliefaktors

Info

Publication number: DE2703620A1
Application number: DE19772703620
Authority: DE
Inventors: Edward Shanbrom
Original assignee: RECHERCHES HEMATOLOGIQUES
Current assignee: RECHERCHES HEMATOLOGIQUES
Priority date: 1976-01-30
Filing date: 1977-01-28
Publication date: 1977-08-04
Also published as: AR214625A1; SE442953B; DK146855C; ES455473A1; MX5197E; NL179290B; NL7700927A; NL179290C; NO770293L; DK146855B; NO145563B; GB1557609A; SE7700864L; DE2703620C2; AT354632B; ATA53277A; FR2339621B1; BE850852A; BR7700554A; JPS6242887B2

Description

HELMUT SCHKOETtK KLAUS LEHMANN

DlPL-PHYf. DIPL.-INC.

-5'

Recherches Hematologiques S.A. 27. Januar 1977

cn-rh-11 tM/*-h

RECHERCHES HEMATOLOGIQUES S.A.

Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Antihäniophiliefaktors.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII bzw. des Antihäniophiliefaktors.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung des Antihämophiliefaktors (AHF oder Faktor VIII) beschrieben worden, um die therapeutische Verwendung dieses Faktors zu ermöglichen. Diese Verfahren umfassen beispielsweise die selektive Ausfällung, die fraktionierte Absorption und Elution, die Extraktion in schwach

D-7O7 SCHWÄBISCH CMIIND GEMEINSAME KONTEN: D-8 MÖNCHEN 70

■JVlcfun: (07171) 56 90 U'uodu lljnk Miiiutn-n 70/17)69 (BIZ 700 700)0) Telefon: (019) 771« M

H. SCHROEIEK IVIrgrJiniiK·: .ylmJcp.ii Vtiwal.ixli ι iimiii.l 0l/c0 5JS (Bl Z 6IJ /00 86) K LEHMANN Telegramme: SJmqMt Ick, 7 24H86S p.^.1,1 P.msdwvlikonu. Μιιι..Ιηίι I6,"m i »i)4 Ι.ίρον/>ί>/κηβτ 10 Tel«: S312 24» fort <i

709831/0987

27D3620 -Ir-

ionischem Medium und die Chromatographie. Die am häufigsten für die Ausfällung verwendeten chemischen Produkte sind Alkohol, Gerbsäure, Ammoniumsulfat, Glycin und PoIyäthylenglykol. Obwohl die Reinigung des Faktors VIII die 5 Beseitigung einer Vielzahl von anderen Plasmaproteinen

umfaßt, stellt Fibrinogen das wichtigste und am schwierigsten zu beseitigende dieser Proteine dar, insbesondere wenn es denaturiert ist, beispielsweise durch Ausfällen mit Alkohol oder durch Gefrieren und Auftauen. Dieses denaturierte Fibrinogen beeinträchtigt die Filtration des Faktors VIII, verursacht erhebliche Verluste des Faktors VIII während der Reinigungsschritte und vermindert die Löslichkeit des gefriergetrockneten Produkts in der für die Herstellung einer Lösung eingesetzten Flüssigkeit.

Somit muß ein zufriedenstellendes Verfahren zur Reinigung des Faktors VIII in der Lage sein, erhebliche Mengen Fibrinogen zu entfernen. Die oben beschriebenen Verfahren zum selektiven Ausfällen sind für diesen Zweck entwickelt worden, besitzen jedoch den Nachteil, daß sie entweder das Fibrinogen und den Faktor VIII denaturieren oder unerwünschte Verluste des Faktors VIII verursachen.

Die Verfahren, bei denen lediglich eine Ausfällung in der Kälte ohne die Anwendung von chemischen Produkten durchgeführt wird (Kryopräzipitation) sind auf die Bildung geringer Mengen des Faktors VIII beschränkt, werden üblicherweise in Blutbanken durchgeführt und führen bei der therapeutischen Anwendung der Produkte zu hohen Fibrinogenspiegeln im Blut, einer Tatsache, die von gewissen Fachleuten als unerwünscht angesehen wird.

Die Verfahrensweisen, bei denen der Faktor VIII mit Hilfe

von Puffern mit geringer Ionenstärke aus dem Kryopräzipitat extrahiert wird, ergeben, obwohl sie zu einer gewissen Erniedrigung des Fibrinogengehalts des Endprodukts führen, Produkte mit einem noch unerwünscht hohen Proteingehalt,

709831/0 9 87

erfordern die Anwendung spezieller Vorrichtungen und Verfahrensweisen zum Zentrifugieren und sind in der Gesamtmenge, in der der Faktor VIII, ohne die Reinheit zu beeinträchtigen, aus dem Kryopräzipitat extrahiert werden kann, beschränkt.

Weitere Probleme, die üblicherweise bei der großtechnischen Herstellung des Faktors VIII auftreten, sind insbesondere die Verunreinigung des Endprodukts durch pyrogene Substanzen, Isohämagglutinine und Hepatitis verursachende Viren (mit Hepatitis verbundenes Antigen, HAA). Gewisse chemische Ausfällungsmittel begünstigen die Anwesenheit dieser unerwünschten Verunreinigungen. Derzeit wird Polyäthylenglykol ganz allgemein zur Herstellung von Konzentraten des Faktors VIII mit großer Reinheit verwendet. Diese Methoden wenden jedoch so hohe Polymerkonzentrationen an, daß zusätzliche Wasch- und Ausfällungsstufen erforderlich sind, um aus dem Endprodukt die überschüssigen Mengen des Polyathylenglykols zu beseitigen. Diese Verfahren führen daher zu weiteren unerwünschten Verlusten des Faktors VIII. In diesem Zusammenhang sei auf die folgenden Literaturstellen hingewiesen: M.Wickerhauser "Large-scale fractionation of Factor VIII - Concentrate from cryoethanol precipitate" (Literaturstelle 1); E.Shanbrom und L.Fekete "Production of stable high-potency human AHF using polyethylene glycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF concentrate",US-PS 3 631 018 (Literaturstelle 2); J.T.Sgouris und M.Wickerhauser "Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate", Transfusion 13 (1973) 399 (Literaturstelle 3); Newman, A.J.Johnson, M.H.Karpatkin und S.Puszkin "Methods for the production of clinically effective intermediate and high-purity Factor VIII concentrates", Brit.J.Haemat (1971) 211 (Literaturstelle 4); und L.F.Fekete und S.L.Holst "Stabilization of AHP

709831/0987

using Heparin", US-PS 3 803 115 (Literaturstelle 5).

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, diese Probleme zu überwinden und ein Verfahren bereitzustellen, das nicht an den Nachteilen leidet, die durch die Verwendung von chemischen Ausfallungsmitteln auftreten, und das in einfacher Weise eine selektive Ausfällung des Fibrinogens und der davon abgeleiteten denaturierten und abgebauten Produkte in der Kälte ermöglicht.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß eine selektive Konzentration des Faktors VIII und eine Entfernung des Fibrinogens und der davon abgeleiteten Denaturierungs- und Abbau-Produkte dadurch erreicht werden kann, daB man geringe Mengen eines Polyols, beipielsweise Polyäthylenglykol oder die unter der Handelsbezeichnung "Pluronic" bekannten nichtionogenen Polyätherglykole zusetzt.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII bzw. des Antihämophiliefaktors, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine den Faktor VIII und etwa 6% eines Polyols enthaltende Pufferlösung bei einer Temperatur von etwa 0 bis 5°C hält, bis die Ausfällung erfolgt.

Die selektive Ausfällung des Fibrinogens ohne einen damit verbundenen Verlust des Faktors VIII ist bislang in einem in der Praxis durchführbaren Verfahren für die großtechnische Herstellung eines gereinigten Konzentrats des Faktors VIII nicht erreicht worden. In der Tat unterstreicht Wickerhauser die Bedeutung der Begrenzung der Zeitdauer und der Temperatur bei der Extraktion des Faktors VIII, indem er ausführt: "Etwas höhere Ausbeuten an dem Faktor VIII wurden durch längere Extraktion mit Tris-Puffer bei 30⁰C während mehr als 60 Minuten erzielt, wobei jedoch der Extrakt zunehmend mit Fibrinogen-

709831/0987

•\

aggregaten verunreinigt ist, was das Endkonzentrat schlecht filtrierbar macht".

Ein Verfahren, das zur Herstellung eines hochreinen Konzentrats des Faktors VIII mit hoher Ausbeute die selektive Ausfällung von Fibrinogen bei niedriger Temperatur umfaßt, ist Gegenstand der deutschen Patentanmeldung P 26 36 757.7 vom 14.8.1976 von Edward Shanbrom, Inc. mit dem Titel "Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen des Antihämophiliefaktors¹¹ (Literaturstelle 7) . Es ist dort angegeben, daß das Produkt noch weiter gereinigt und aufkonzentriert werden kann, indem man eine Ausfällung mitPolyäthylenglykol in der Kälte durchführt.

Bislang erfordern sämtliche Verfahren zur Herstellung von Konzentraten des Faktors VIII, bei denen Polyäthylenglykol angewandt wird, eine zusätzliche Stufe des Waschens und/oder Ausfällens mit Glycin oder Alkohol, da das Polymere in hohen Konzentrationen (von 10 bis 12%) angewandt wird (wozu auf die genannten Literaturstellen verwiesen sei). In jüngster Zeit wurde vorgeschlagen, die Ausfällung in der Kälte mit Polyäthylenglykol durchzuführen (C.Venneer, B.A.M.Soute und H.G.J.Brummelhuis "Improvement of the preparation of Factor VIII Concentrates", Proc. of Int. Soc. Haemostasis and Thrombosis, Paris (JuIi 1975) (Literaturstelle 8)).

Jedoch beträgt die für die Ausfällung des Fibrinogens angewandte Polyäthylenglykolkonzentration lediglich 2,5%, was zu einem weniger reinen Produkt führt. Weiterhin haben diese Autoren die Proteinkonzentration nicht für bedeutsam erachtet und haben ein Mandelat zugesetzt, um eine irreversible Ausfällung des Fibrinogens zu vermeiden, was dazu geführt hat, daß sie ein erheblich weniger reines Produkt in geringeren Ausbeuten erhalten haben. In ähnlicher Weise wendet das Verfahren von Shanbrom und Fekete (siehe die oben erwähnte Literatur-

709831/0987

stelle 2) während der Ausfällung mit Polyäthylenglykol eine relativ geringe Proteinkonzentration an, das heißt ein Volumen des Niederschlags in 10 Volumen des zur Bildung der Lösung verwendeten Puffers; hierdurch wird wiederum eine sehr geringe Ausbeute und eine schlechte Reinheit verursacht. Diese Autoren haben ebenso wie Johnson et al (Literaturstelle 4) und Johnson et al "Antihemophilic factor prepared from blood plasma using polyethylene glycol", US-PS 3 652 530 (Literaturstelle 6) für das letztendliche Aufkonzentrieren des Faktors VIII 10 bis 12%iges Polyäthylenglykol verwendet, was eine zusätzliche Stufe der Wiederauflösung und des Wiederausfällens mit Glycin oder Äthanol in der Kälte erforderlich macht, um den Polyäthylenglykolgehalt des Endprodukts zu vermindern.

Ein weiterer Beweis, daß die Konzentration der Proteine und die Ausfällung mit Polyäthylenglykol in der Kälte von Bedeutung sind und zu einem geeigneten Produkt führen, ist in der Tatsache zu sehen, daß die "unvollständigen" Isohämagglutinine (Antikörper) praktisch vollständig beseitigt werden, wodurch das Risiko von hämolytischen Reaktionen vermieden werden kann, das dann auftritt, wenn massive Injektionen von derzeit im Handel erhältlichen Konzentraten notwendig sind (siehe R.A.Seeler, M.Telischi, P.L.Langehennig und J.B.Ashenhurst "Anti-A und Anti-B tiers in coagulation concentrates", Abst.of Int.Soc.of Blood Transf. Helsinki (1975) (Literaturstelle 9)).

Ein weiteres Kennzeichen des erfindungsgemäßen Produkts ist sein hoher Reinheitsgrad (das heißt sein geringer Proteingehalt), insbesondere was die Menge des meßbaren Fibrinogens anbelangt. Dieser hohe Reinheitsgrad führt zu einem sehr gut löslichen Produkt, das in der Tat so gut löslich ist, daß nach der Auflösung in dem Fläschchen kein ungelöstes Material verbleibt. Hierdurch wird die

709831 /0987

Notwendigkeit der Verwendung eines Spezialfilters oder einer Filtriernadel vermieden, die dazu dienen, das nichtgelöste Protein vor dem Injizieren des Materials in den Patienten zu beseitigen. In dieser Weise wird die Verunreinigung des Konzentrats des Faktors VIII durch metallische Teilchen vermieden (I.A.Couper, J.H.McAdam, M.S.MacKenzie und J.F.Davidson "Contamination of Factor VIII Concentrates with metal particles", Lancet (21. Dezember 1974), Seite 1515 (Literaturstelle 10)).

Das erfindungsgemäße Verfahren oder ein Teil davon kann auch zur "erneuten Behandlung" von pyrogenen Chargen von Konzentraten des Faktors VIII dienen, die mit Hilfe irgendeines anderen Verfahrens bereitet sind, wodurch der pyrogene und kostspielige, jedoch nicht verwendbare Faktor VIII in ein wertvolles, therapeutisch anwendbares Mittel umgewandelt wird. Das erneut behandelte Produkt wird entweder in einer einzigen Stufe der Ausfällung in der Kälte mit 6%igem Polyäthylenglykol oder mit Hilfe eines im folgenden genauer erläuterten zweistufigen Verfahrens von den pyrogenen Materialien befreit.

Die erfindungsgemäß erreichten unerwarteten und stark verbesserten Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Lehren und Vorschlägen des Standes der Technik und wurden eher zufällig als durch systematische Forschungen gefunden.

Die Erfindung betrifft - wie bereits ausgeführt wurde ein spezifisches Verfahren zur Herstellung eines Konzen trats des Faktors VIII mit sehr hoher Reinheit, welches Verfahren in großem Maßstab durchgeführt werden kann. Die wesentlichsten Maßnahmen des erfindungsgemäeen Verfahrens sind die selektive Ausfällung der überschüssigen Fibrinogenmengen und der davon abgeleiteten Denaturierungs und Abbau-Produkte, die Entfernung anderer unerwünschter Proteine, wie der Isohämagglutinine, und das Aufkonzen-

709831/0987

•Al-

trieren des Faktors VIII in einer einzigen Stufe durch eine Ausfällung in der Kälte mit einem Polyol, ohne daß dabei eine unerwünschte Verminderung der Aktivität des Faktors VIII verursacht wird. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal ist die erstaunlich hohe Ausbeute von etwa 20 bis 40%, bezogen auf die eingesetzte, im Plasma theoretisch vorhandene Menge, in der der Faktor VIII erhalten wird. Weiterhin und trotz der erhöhten Ausbeute des Faktors VIII ist der Proteingehalt im Vergleich zu anderen Produkten in unerwarteter Weise vermindert, insbesondere was den Fibrinogengehalt anbelangt. Diese Tatsache wird durch die folgende Tabelle I verdeutlicht. Das Bedürfnis für eine erhöhte Ausbeute an einem gefriergetrockneten Konzentrat des Faktors VIII mit großer Reinheit ist allgemein anerkannt und von weltweiter Bedeutung. Hierzu sei auf "Recent Advances in Hemophilia", Ann.N.Y.Acad.Sci. (1975) 240 (Literaturstelle 11); J.G.Pool "Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein", West.J.of Med. 122 (1975) 406 (Literaturstelle 12) verwiesen.Es ist allgemein anerkannt, daß die handelsüblichen Konzentrate im allgemeinen weniger als 20% des theoretisch in dem Plasma vorhandenen Faktors VIII ergeben, wobei die Ausbeuten im Fall von hochgereinigten Produkten noch geringer sind (Literaturstelle 11, Seiten 156 und 208 und Literaturstellen 5 und 8).

Die Angaben der folgenden Tabelle I sind abgesehen von den erfindungsgemäßen Ergebnissen, dem Artikel von Robert Breckenridge "Recent advances in hemophilia", Ann.N.Y.Acad.of Science (1975) 240, entnommen.

709831 /0987

Tabelle I

Eigenschaften der Konzentrate des Faktors VIII (a)	Produkt	Einheiten des Fak tors Vlll/ml	verabreich tes Gesamt volumen (ml)	Gesamt einheiten des Fak tors VIII	Gesamt- Fibrino- gengehalt (g)	Gesamt- Protein- gehalt (g)	Gesamt- Natrium- gehalt (mSq)	Gesamt- Chlorid- gehalt (mSq)	Gesamt kosten ($)	Quellen
Frisches, gefrorenes Plasma	0,5	8000	4000	8,0	240	1200	800	480	Blutbank
Kryoprä- zipitat	10^(b)	400	4000	4,0	20	40	40	400	Blutbank j
Faktor VIII AHF HÄnophilie- faktor	10 10 25	400 400 160	4000 4000 4000	0,8 (C) 1,0	14 20 5,6	96 80 25	80 48 20	480 480 528	Armor Pharma ceutical Abbott Labora tory Hyland
AHF	10	400	4000		6,0				(d)
AHF	10	400	4000		2,0				(e)

O CO (J)

-J	b)
O
co	O
00
u>	d)
O	e)
CD
00

Fortsetzung Tabelle I:

a) Diese Zahlen basieren auf den Erfahrungen des Hemophilia Center of Rochester and
Monroe County und sind als Gesamtmenge ausgedrückt, die erforderlich ist, einen
Patienten mit einem Gewicht von 70 kg mit einer Einheit pro Milliliter zu behandeln.
Es wird dabei von einer in vivo-Ausnutzung von 80% ausgegangen.

Variabel, jedoch üblicherweise zwischen 7 bis 12 μ/ml.

Wegen einer Ausfällung bei 37°C ist die Bestimmung des Fibrinogens nicht möglich.

Produkt der deutschen Patentanmeldung P 26 36 757.7.

Produkt erhalten durch Ausfällung in der Kälte mit einem Polyol gemäß der vor- je: £
liegenden Erfindung. »

O CJ CD K) O

- ΛΑ -

Gegenstand der Erfindung ist, wie bereits ausgeführt wurde, ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Pufferlösung, die den Faktor VIII und etwa 6 Vol.-t eines Polyols enthält, bei einer Temperatur von etwa O bis 5°C hält, bis die Ausfällung erfolgt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Fibrinogen aus einer Lösung von Plasma oder eines Plasma kryopräzipitats in einem Puffer durch Zugabe von etwa 4 Vol.-% eines Polyols zu der Lösung selektiv ausfallt, den Faktor VIII in der Lösung aufkonzentriert, indem man die Polyolkonzentration bis auf etwa 6% erhöht und die 6% des Polyols enthaltende Lösung bei einer Temperatur von etwa 0 bis 5°C hält, bis die Ausfällung erfolgt, und anschliessend den ausgefällten Faktor VIII in einer Pufferlösung auflöst, so daß man eine Lösung erhält, die einen Faktor VIII mit sehr hoher Reinheit enthält, der im wesentlichen frei ist von verunreinigenden Fremdproteinen.

Gemäß weiteren bevorzugten AusfUhrungsformen wendet man die folgenden Maßnahmen getrennt oder in Kombination an: Man verwendet als Quelle für den Faktor VIII ein Kryopräzipitat, das in etwa der zweifachen bis der vierfachen Volumenmenge eines Puffers gelöst ist; man arbeitet bei einem Volumenverhältnis von Kryopräzipitat zu Puffer von etwa 1:3;

man wendet das Verfahren an, das weitere Schritte umfaßt, die darin bestehen, daß man den ausgefällten Faktor VIII erneut in einem Puffer löst, die erhaltene Lösung während etwa 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0,5 bis 5°C hält und anschließend das aus der Lösung abgeschiedene teilchenförmige Material abtrennt, so daß man einen Faktor VIII erhält, der praktisch frei ist von Fibrinogen, Fibrinogenfragmenten und Komplexen davon;

709831/0987

man wendet als Puffer Citratpuffer an; als geeignete Polyole kann man Polyäthylenglykole/ insbesondere Polyäthylenglykol 4000 und ^-Hydroxygruppen und kJ -Hydroxygruppen aufweisende Copolymere der Sequenz Poly(oxyäthylen)-poly(oxypropylen)-poly(oxyäthylen) verwenden. Als Sequenzcopolymere kann man insbesondere die unter der Bezeichnung Pluronic von der Firma Wyandotte Chemicals und Ugine-Kuhlmann erhältlichen Produkte nennen, insbesondere das Produkt Pluronic F 68, bei dem es sich um ein Copolymeres mit den folgenden Eigenschaften handelt: Molekulargewicht der Poly(oxypropylen) -Gruppe: Etwa 1750,-poly (oxyäthylen) -Gehalt etwa 80 Gew.-%;
die Ausfällung des Faktors VIII führt man vorzugsweise in Gegenwart von 6% des Polyols und vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 durch; die zuvor durchgeführte Fibrinogenausfällung in Gegenwart von 4% des Polyols erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis 30⁰C.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gelingt es insbesondere, die pyrogenen Anteile einer Lösung des Faktors VIII in einem Puffer zu beseitigen. Dieses Verfahren ist insbesondere durch die Tatsache gekennzeichnet, daß man der Lösung etwa 6% eines Polyols zusetzt und die erhaltene Lösung auf eine Temperatur von etwa 0 bis 5°C kühlt, um den Faktor VIII auszufällen, wobei das pyrogene Material in der Lösung verbleibt. Dieses Verfahren kann vorzugsweise wie folgt durchgeführt werden:

Man versetzt die Lösung des Faktors VIII in der Pufferlösung mit etwa 4% des Polyols, trennt den Niederschlag von der Lösung ab, gibt 2% des Polyols zu und hält die Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 5°C, bis die Ausfällung des Faktors VIII erfolgt;

709831/0987

vorzugsweise enthält die zu reinigende Lösung etwa 1 bis 3%, insbesondere 2 bis 3% Protein;

das Verfahren umfaßt vorzugsweise die folgenden Schritte, die darin bestehen, den ausgefällten Faktor VIII in einem Citratpuffer zu lösen, die erhaltene Lösung während einer Zeitdauer von etwa 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0,5 bis 5°C zu halten und anschließend das in der Lösung gebildete teilchenförmige Material abzutrennen, um den Faktor VIII zu gewinnen, der praktisch frei ist von Fibrinogen, Fibrinogenfragmenten und Komplexen davon.

Gegenstand der Erfindung ist ferner gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zum Konzentrieren des Faktors VIII, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung von etwa 1 Teil einer Blutfraktion, die den Faktor VIII enthält und durch Kryopräzipitation von Plasma erhalten worden ist, in etwa 3 Teilen Citratpuffer, der etwa 6% Polyol enthält, bei einer Temperatur von etwa O bis 5°C hält, um die Ausfällung des Faktors

VIII aus der Lösung zu verursachen, und den Faktor VIII

erneut in dem Puffer löst, um eine Lösung des Faktors VIII mit sehr großer Reinheit zu erhalten.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erf indung.

25 Beispiel 1

Man taut gefrorenes Plasma in einer Menge von beispielsweise 100 bis 3000 1 von etwa -5⁰C auf etwa +2⁰C auf und bringt das Material in einen geeigneten Behälter ein. Größere Volumina können ebenfalls verarbeitet werden, er schweren jedoch die Verfahrensmaßnahmen. Die in der Kälte unlösliche Fraktion (Kryopräzipitat) wird bei einer Temperatur von weniger als 3⁰C abgetrennt, vorzugsweise unter Anwendung von kontinuierlich betriebenen

709831/0987

- XA -

Zentrifugen (Sharpless oder ähnliche Zentrifugen). Man kann das Material auch mit anderen Methoden gewinnen, die jedoch weniger wirksam sind. Das Krypopräzipitat wird gewogen, in kleine Teilchen zerschnitten oder in einer Mischeinrichtung (des Typs Waring) während einiger Sekunden vermischt, um einen Brei oder eine Emulsion zu bilden. Die Krypopräzipitatteilchen oder dieser Brei werden dann bei einer Temperatur von 20 bis 30°C in 2 bis 4 Volumen eines Puffers gelöst, der 0,02 Mol/l Trinatriumcitrat und 0,1 Mol/l Glycin enthält und mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,9 eingestellt ist. Nach der vollständigen Auflösung fällt man das Fibrinogen selektiv bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 und bei einer Temperatur von etwa 25⁰C durch Zugabe von 4%

15 Polyäthylenglykol 4000 oder Pluronic F-68 aus. Man zentrifugiert den Niederschlag in einer kontinuierlich betriebenen Zentrifuge (Sharpless) ab und stellt die überstehende Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,2 ein. Dann gibt man eine zusätzliche Menge von 2% PoIy-

20 äthylenglykol oder Pluronic F-68 zu und kühlt die Suspension auf 0 bis 5°C, bis eine sichtbare Ausfällung erreicht ist.

Für sämtliche Stufen der Auflösung und der Ausfällung wendet man ein Reaktionsgefäß mit doppelter Wandung an und rührt ständig, wobei man die Schaumbildung vermeidet.

An die zweite Stufe der Ausfällung schließt sich das kontinuierlich durchgeführte Zentrifugieren bei 1 bis 2°C an, wobei die überstehende Flüssigkeit abgetrennt wird. Anschließend löst man den Niederschlag in einem Glycin-citrat-Puffer oder einem Citrat-Puffer, wobei das Volumen des Puffers von der Qualität des Kryopräzipitats und der Anzahl der Faktor VIII-Einheiten abhängt, die in der Ausgangslösung vorhanden sind. Die beiden Verfahren zur Errechnung dieses Volumens sind die

709831/0987

folgenden:

1. Man löst den Endniederschlag in einem Puffervolumen, das gleich ist einem Hundertstel des Volumens des ursprünglichen Plasmas.
2. Man löst den Endniederschlag in einem Puffervolumen« das gleich ist dem 15- bis 25-fachen des Gewichts des

Niederschlags.

Die Lösung wird dann mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,7 bis 6,9 eingestellt, geklärt und anschließend sterilisiert, indem man die Lösung über Membranfilter mit Mikroporen führt (Höhe der Filter * 293 mm oder entsprechende Patronenfilter), die beispielsweise Poren mit einem Durchmesser von 1,2, 0,65, 0,45 oder 0|3 μη aufweisen. Die erhaltene sterile Lösung, die etwa 20 bis 40% des in dem als Ausgangsmaterial eingesetzten Plasma enthaltenen Faktors VIII enthält, wird in üblicher Weise zur Lagerung gefriergetrocknet.

Man kann das Verfahren auch abwandeln, insbesondere durch die Anwendung von erneut gefrorenem Krypopräzipität oder Varianten der Cohn-Fraktion I, obwohl in diesem Fall die Ausbeute an dem Faktor VIII geringer ist und von seiner Konzentration in dem Ausgangsmaterial abhängt. Die Lösung oder Anfangsextraktion des Faktors VIII kann in destilliertem Wasser oder in Puffern mit geringer Ionenstärke, wie Tris-Puffer erfolgen. Die Abkühlzeit kann ebenfalls ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen variiert werden und entweder erhöht werden oder stufenweise angewandt werden. In ähnlicher Weise kann man die Extraktionszeit bei dem beschriebenen Verfahren auf bis zu 24 Stunden verlängern. Schließlich kann das Verfahren an irgendeiner beliebigen Stufe unterbrochen und am nächsten Tag weitergeführt werden. Alle diese Abänderungen können eine gewisse Verminderung der Gesamtausbeute des Faktors VIII, bezogen auf das Ausgangsplasma, mit sich bringen.

709831/0987

Beispiel 2

Bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren kann man auch pyrogene Chargen des Konzentrats des Faktors VIII mit mittlerer Reinheit verwenden, die man mit Hilfe irgendwelcher anderer Verfahren erhalten hat, beispielsweise durch Extraktion mit einem Puffer mit geringer Ionenstärke, durch Ausfällen mit Glycin, durch Ausfällen mit Polyäthylenglykol etc. Das gefriergetrocknete Material wird mit pyrogenfreiern Wasser gelöst, das in einer solchen Menge eingesetzt wird, daß sich ein Proteingehalt von 1 bis 3 g% ergibt. Dann vereinigt man die gelösten Materialien in einem Behälter und unterzieht sie erneut den Behandlungsschritten,die in Beispiel 1 angegeben sind.

Wenn der Gehalt der Ausgangsmaterialien an pyrogenen Materialien nur gering ist und das Produkt bereits eine hohe Reinheit besitzt, kann eine einzige Ausfällungsstufe genügen. Dazu wird das Material in der oben beschriebenen Weise gelöst, mit 6% Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 versetzt und bei einer Temperatur von 0 bis 5°C gehalten. Anschließend wird der gebildete Niederschlag in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei die die pyrogenen Materialien enthaltende überstehende Flüssigkeit verworfen wird.

Beispiel 3

Man führt die Verfahrensweise des Beispiels 1 durch. Vor der Durchführung der endgültigen Filtration bringt man das Produkt jedoch in eine Kühlkammer (0,5 bis 5⁰C) ein und läßt es dort während 12 bis 24 Stunden stehen.

Das nach dieser Zeitdauer ausgeflockte weiße Material wird durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Vorfiltration entfernt. Das Endprodukt wird in der oben beschriebenen Weise durch Filtration sterilisiert und den gleichen Gefriergetrocknungsmaßnahmen unterworfen. Dieses Produkt

709831/0987

■Ιλ

ist noch reiner als die oben beschriebenen Produkte und kann daher noch leichter filtriert werden. Durch diese zusätzliche Stufe erfolgt kein Verlust des Faktors VIII.

Die erhaltenen Produkte können während einer längeren Zeit von 1 bis 2 Jahren bei einer Temperatur von +5⁰C gelagert werden und können dann in destilliertem Wasser oder physiologischem Serum aufgelöst werden. Aufgrund seiner sehr hohen Reinheit und seinem sehr geringen Fibrinogengehalt läßt sich das gefriergetrocknete Produkt sehr schnell auflösen (1 bis 2 Minuten). Da die Gesamtbehändlungsdauer im Vergleich zu anderen Herstellungsverfahren von dem Augenblick an, wo die Plasmabehälter geöffnet werden, sehr kurz ist, ist die Verunreinigung mit Bakterien stark eingeschränkt. Da die anfängliche Auflösung nur in geringen Mengen des Puffers erfolgt, wird die Menge, in der y^-Globuline in die Lösung eindringen können, auf einem Minimum gehalten. Weiterhin wird die optimale Ausfällung des überschüssigen Fibrinogens dadurch erreicht, daß man eine Polyolkonzentration von 4% an wendet. Weiterhin schließt der flockige, schwere Fibrino- genniederschlag offenbar das vorhandene pyrogene Material ein und vermindert die Mengen des mit Hepatitis verbundenen Antigens (HAA oder Hepatitisvirus). Da man in der Stufe der Ausfällung in der Kälte nur 6% des Polyols verwendet, werden die unerwünschten Proteine, insbesondere die Isohämagglutinine, die sich selbst in den sehr geringen Puffervolumina gelöst haben können, nicht zusammen mit dem Faktor VIII ausgefällt und werden als überstehende Flüssigkeit beseitigt. In dieser Weise erhalt man ein in Bezug auf das Plasma um den Faktor 200 bis 400 gereinigtes Produkt, das sehr wenig Fibrinogen und Isohämagglutinine enthält. Die Konzentrate des Faktors VIII, die mit größeren Volumina des für die Extraktion verwendeten Puffers hergestellt sind, beispielsweise

Volumina (Literaturstelle 2), besitzen nicht den glei-

709831/0987

•η-

chen Reinheitsgrad oder ergeben nicht die gleiche Ausbeute an dem Faktor VIII (Literaturstellen 1, 2, 3, 4 und 8), was offenbar eine Folge der Tatsache ist, daß das für die Copräzipitation optimale Verhältnis von Protein zu 5 Polymerem nicht erreicht wird. Gewünschtenfalls kann dieses Produkt unter Anwendung üblicher Verfahren oder mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter gereinigt und aufkonzentriert werden. Ein erheblicher Vorteil der Erfindung beruht auf der Tatsache, daß man den Faktor 10 VIII mit sehr großer Reinheit in großem Maßstab in der Hälfte oder zwei Dritteln der Zeit herstellen kann, die für andere Verfahren erforderlich ist.

Die obigen Beispiele verdeutlichen optimale Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Es versteht sich jedoch, daß das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung üblicher Behandlungstechniken und üblicher Materialien durchgeführt werden kann. Beispielsweise kann man, wenn es im allgemeinen auch nicht wirtschaftlich ist, von weniger als etwa 1CX) 1 Plasma oder der dieser Plasmamenge entsprechenden Menge des Kryopräzipitats auszugehen, auch größere oder geringere Volumina als die in den Beispielen angegebenen verwenden, beispielsweise 50% oder dergleichen, ohne daß dadurch die Vorteile der Erfindung nicht erreicht würden. Die in den Beispielen erläuterten optimalen Verfahrensweisen werden unter

Verwendung bekannter und leicht verfügbarer Vorrichtungen durchgeführt, beispielsweise einer Zentrifuge (Sharpless), einer Mischeinrichtung (Waring) etc; es ist jedoch ersichtlich, daß neben der erfindungsgemäßen Verfahrens-

weise die dazu einzusetzenden Vorrichtungen nicht wesentlich sind und der Fachmann ohne weiteres dazu in der Lage ist, geeignete Vorrichtungen zur Durchführung des beanspruchten Verfahrens auszuwählen.

709831 /0987

Nachdem man die den Faktor VIII enthaltende Lösung mit guter Ausbeute erhalten hat, bereitet man sie in üblicher Weise für die Lagerung und die Wiederherstellung vor. Beispielsweise wird sie geklärt, durch Filtration über übliche Filter mit Mikroporen sterilisiert, zum Aufkonzentrieren des Faktors VIII auf ein geringes, leicht lager·* fähiges Volumen gefriergetrocknet und wieder in die Form einer Lösung gebracht, indem man geeignete Flüssigkeiten verwendet, beispielsweise pyrogenfreies destilliertes Wasser oder physiologisches Serum.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt zeichnet sich gegenüber den herkömmlichen Konzentraten des Faktors VIII durch folgende Eigenschaften aust 1.) Es besitzt eine größere Reinheit und damit eine höhere "spezifische Aktivität";

2.) es ist besser löslich, was die Geschwindigkeit der Auflösung und die Endlöslichkeit anbelangt, so daß das Material für die Behandlung in Notfällen besonders gut geeignet ist;
3.) es besitzt einen geringeren Proteingehalt, wodurch

die unerwünschten Nebenreaktionen vermindert werden; 4.) es besitzt einen geringeren Gehalt an Immunoglobuline!!»

wodurch allergische Reaktionen vermindert werden} 5.) es weist einen vernachlässigbaren Gehalt an Isohämagglutininen auf, wodurch hämolytische Reaktionen

vermieden werden;

6.) es besitzt einen geringeren Fibrinogengehalt, wodurch die Gefahr von Komplikationen durch eine Hyperfibrinogenämie verringert wird; 7.) es sind keinerlei Filtrationsnadeln erforderlich, so daß das Risiko des Vorhandenseins von Fremdkörpern beseitigt wird; und

8.) durch die Entfernung der pyrogenen Materialien während des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Faktor VIII therapeutisch anwendbar gemacht.

709831/0987

Erfindungsgemäß verfügt man somit über ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII, das darin besteht, daß man eine Pufferlösung, die den Faktor VIII und etwa 6% Polyol enthält, bei einer Temperatur von etwa O⁰C bis etwa 5°C hält, bis eine Ausfällung des Faktors VIII erfolgt, wodurch man diesen Faktor mit sehr hoher Reinheit und praktisch frei von verunreinigenden Fremdproteinen erhalten kann.

709831/0 987

Claims

Patentansprüche

(T\ Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII, dadurch gekennzeichnet, daß man eine den Faktor VIII und etwa 6% eines Polyols enthaltende Pufferlösung bei einer Temperatur von etwa O bis 5°C hält, bis die Aus

fällung erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß man Fibrinogen selektiv aus einer Lösung des Plasmas oder des Kryopräzipitats des Plasmas in einem Puffer durch Zugabe von etwa 4 Vol.-% eines Polyols zu der Lösung selektiv auefällt, den Faktor VIII in der Lösung konzentriert, indem man die Polyolkonzentration auf etwa 6% steigert und die das Polyol in einer Konzentration von 6% enthaltende Lösung auf einer Temperatur von etwa O bis 5°C hält, bis die Ausfällung erfolgt, und anschließend den ausgefällten Faktor VIII in einer Pufferlösung löst, so daß man eine Lösung erhält, die einen Faktor VIII mit sehr großer Reinheit enthält, der praktisch frei ist von verunreinigenden

Fremdproteinen.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, d a durch gekennzeichnet, daß man als Quelle für den Faktor VIII ein Kryopräzipitat verwendet, das in einem Puffervolumen gelöst ist, das dem 2- bis 4-fachen seines Volumens entspricht.

709831/0987

ORIGINAL INSPECTED

2703520 - «a* -
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e kennzeichnet, daß man ein Kryopräzipitat/ Puffer-Volumenverhältnis von etwa 1 zu 3 anwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4,

dadurch gekennzeichnet, daß man den ausgefällten Faktor VIII erneut in einem Puffer löst und die erhaltene Lösung während etwa 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0,5 bis 5°C hält und anschließend das in der genannten Lösung gebildete teilchenförmxge Material abtrennt und in dieser Weise einen Faktor VIII erhält, der praktisch frei ist von Fibrinogen, Fibrinogenfragmenten und Komplexen davon.
6. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch g e -

15 kennzeichnet, daß man zur Entfernung von pyrogenen Materialien aus einer Lösung des Faktors VIII in einem Puffer etwa 6% eines Polyols zu der Lösung zusetzt und die erhaltene Lösung bei einer Temperatur von etwa 0 bis 5⁰C hält, um den Faktor

VIII auszufällen und eine Lösung der pyrogenen Materialien zu erhalten.
7. Verfahren nach Anspruch 6,dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe des Polyols zu der Lösung des Faktors VIII in dem Puffer in der Weise erfolgt, daß man etwa 4% des Polyols zusetzt, den Niederschlag von der Lösung abtrennt, zusätzlich 2% des Polyols zugibt und die Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 5"C hält, bis die Ausfällung des Faktors VIII erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7,dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung einsetzt, die etwa 1 bis 3% Protein enthält.

709831/0987
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, d adurch gekennzeichnet, daß man den ausgefällten Faktor VIII erneut in einem Citratpuffer löst, die erhaltene Lösung während etwa 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0,5 bis 5°C hält und anschließend das in der Lösung gebildete teilchenförmige Material abtrennt, so daß man den Faktor VIII erhält, der praktisch frei ist von Fibrinogen, Fibrinogenfragmenten und Komplexen davon.
10. Verfahren zum Aufkonzentrieren des Faktors VIII, dadurch gek ennzeichnet, daß man eine Lösung von etwa 1 Teil einer Blutfraktion, die den durch Kryopräzipitation von Plasma gewonnenen Faktor VIII enthält, in etwa 3 Teilen Citratpuffer, der etwa 6% Polyol enthält, bei einer Temperatur von etwa 0 bis 5⁰C hält, um die Ausfällung des Faktors VIII aus der Lösung zu bewirken, und den Faktor VIII erneut in dem Puffer löst, um eine Lösung des Faktors VIII mit sehr großer Reinheit zu erhalten.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer Citratpuffer verwendet.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyol ein Polyathylenglykol verwendet.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gek ennzeichnet, daß man als Polyol ein o(-Hydroxy-ft>-hydroxy-poly-(oxyäthylen)-poly(oxypropylen)-poly(oxyäthylen)-Sequenzcopolymer verwendet.

709831/0987

- 24 -

■»■I'
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 6, 7 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausfällung des Faktors VIII bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 bewerkstelligt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die vorherige Ausfällung des Fibrinogens bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis 30°C durch

führt.

70^*3 1 /i;:'87