NO142381B - Fremgangsmaate for fremstilling av den antihemofile faktor - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av den antihemofile faktor (AHF) ut av en blodplasmafraksjon som inneholder denne faktor.

Blodkoagulering er en komplisert biologisk prosess som innebærer samspill mellom atskillige stoffer som finnes i nor-malt blod. Det er kjent at mengden av visse faktorer som er knyttet til mekanismen ved blodkoagulering hos visse individer er sterkt nedsatt eller mangler helt. Det er således kjent at den klassiske hemofili (hemofili A) er en mangelsykdom som forårsakes av fravær av AHF (Faktor VIII)-. Hos individer som lider av med-født hemofili, kjent som hemofili B, har blodet for lite plasma-tromboplastin (PTC, Faktor IX). Enda andre faktorer som er vik-tige ved koaguleringen er faktorene II, VII og X.

Inntil de senere år besto behandlingen av blødere i trans-fusjon av blod eller blodplasma til pasienten. Når det overhodet er mulig bør ifølge den medisinske sakkunnskap pasienten kun inn-gis de blodkomponenter som han mangler. På grunn av den univer-selle mangel på blod er det også en fordel å fraksjonere blod i dets forskjellige komponenter, idet disse kan anvendes for behandling av pasienter i det omfang det er nødvendig.

Det er kjent forskjellige fremgangsmåter for fraksjonering av blod og blodplasma i disses separate komponenter eller konsentrater av disse. Spesielt er arbeidet til Edwin Cohen et al.

fra Harvard University ved utvikling av alkohol-fraksjonerings-metoden bemerkelsesverdig. Under særlig henvisning til fremstilling av AHF beviser de nyere US-patentskrifter 3.631.018 og 3.652.53 0 fremgangsmåter for fremstilling av et sterkt renset konsentrat av denne faktor.

Ifølge de undersøkelser som er utført av Wagner, Thelin, Brinkhous og andre med interesse i fremstilling av AHF, viste det seg at nærvær av protrombin (Faktor II) og det tilhørende kompleks av faktorer var skadelig for Faktor VIII's stabilitet, både på lang og kort sikt. Den vanlige behandling for eliminering av dette problem var å fjerne protrombinkompleks med forskjellige midler såsom aluminiumhydroksyd, magnesiumhydroksyd, barium-karbonat, bariumsulfat, rivanol (6,9-diamino-2-etoksyacridin-laktat) "IRC-50" ionebytterharpiks ("XE-64-Rivanol") og glyko-kolletylester.

Selv om de ovennevnte midler i alminnelighet er aktive er likevel forskjellige ulemper ved deres anvendelse til klinisk bruk blitt åpenbare. Faktor VIII stabiliseres faktisk ved bruk av disse midler idet fjerning av protrombin hindrer trombin-dannelse. Trombin er hovedansvarlig for nedbryting av Faktor VIII slik det er anført av Kisker i Thromb. Diath. Haemorrhagica, Vol.17, side 381 (1967) og av Penick og Brinkhous, Amer. J. Med. Sciences, Vol. 232, side 434 (1956). Ved fremstilling av Faktor VIII med alifatiske aminosyrer ble således anvendt i Wagners

et al<1>s opprinnelige arbeide aluminiumhydroksyd for (1) å redusere nedbryting av Faktoren VIII når det ble konsentrert, og (2) å

øke langtidsstabiliteten både etter lyofilisering og etter rekonstituering (The Hemoplilias, K. M. Brinkhous, utgitt av International Symposium, Washington, D..C. Univ. Norsk Carolina Press, side 81 (1964). Opptaket av spormengder aluminium ansås imidlertid for å være klinisk risikabel.

Fremkomsten av kryoutfelling og fremstillingen av relativt kraftig virkende konsentrater i ett trinn syntes å eliminere anvendelse av ethvert middel for fjerning av protrombinkom-plekset (Pool et al, Nature, Vol. 203, side 312 (1964)). Det har imidlertid vist seg i praksis at det eksisterte store forskjeller i AHF-utbyttene som varierte inntil og enda mer enn 50% av de offentliggjorte gjennomsnittsverdier.

Blomback et al "Proe. 7th Congress Europ. Soc. Haemat.

II: 587-593 (1960)" beskriver oppsamling av ufraksjonert hel-blod i heparin og etterfølgende fremstilling av et konsentrat av den antihemofile faktor (AHF), men det fremgår der at til-setningen av heparin senker in vivo utbyttet av AHF og sann-synligvis også in vitro utbyttet. Det finnes ingen antydning om at man kunne tilsette heparin til plasma eller en plasmafraksjon og enda mindre hva virkningen av det ville være.

Preston "British Journal of Haemol" 13, 42-52 (1967)" beskriver forsøk, hvor heparin viste seg ikke å ha noen virkning på Faktor VIII aktiviteten av friskt plasma og tilsynelatende hadde skadelig virkning på Faktor VIII aktivitet under oppbe-varing ved 4 eller -40°C (side 47).

Endelig beskriver Soulier et al "Uber die Herstellung und klinische Anwendung von Gerinnungsfaktoren", Tagungsbericht der Sektion Innere Medizin in der deutschen Gesellschaft fur klinische Medizin, sider 311-317 (1964) at heparin kan tilsettes til en blodplasmafraksjon "PPSB", som inneholder koagulasjons-faktorer II, VII, IX og X for å stabilisere protrombinene, PPSB inneholdet ikke AHF.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at det som plasmafraksjon anvendes et kryobunnfallskonsentrat av AHF eller en fraksjon av et slikt konsentrat, og det til plasmafraksjonen tilsettes heparin i en mengde på fra 0,01 til 10 heparinenheter pr. ml oppløst plasmafraksjon.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse har det nå vist seg at AHF-utbyttet av produksjonsstørrelsesorden kan økes ved tilsetning av heparin under fraksjoneringen. I motset-ning til hittil anvendt praksis uten bruk av heparin har det vist seg at når heparin anvendes oppnås følgende: (1) forurensning med celler, såsom fra fraksjoneringen, bevirker ikke lavere utbytter, (2) forurensning med vev slik det kan skje ved intra-venøs administrering, bevirker ikke lavere utbytte, (3) lengre opparbeidelsestid reduserer ikke utbyttet, og (4) stabiliteten etter rekonstituering økes i forhold til ikke-hepariniserte plasmakonsentrater, minst til en størrelsesorden tretti ganger høyere. Ved den praktiske utøvelse av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er det således unødvendig å fjerne pro-trombinkomplekset for å oppnå stabile Faktor Vlll-konsentrater, og de normale utbyttetap som skyldes celle- eller vevsforurens-ning eller lang opparbeidelsestid unngås.

Under AHF-fraksjonering kan heparinmengden som anvendes ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse variere innenfor rimelige grenser. Det har vist seg at en konsentrasjon på en heparinenhet pr. ml plasmaoppløsning eller plasmafraksjon er nær den optimale mengde. Høyere konsentrasjoner enn 10 enheter pr. milliliter bør unngås idet disse er unødvendige og farlige. Konsentrasjoner på ca. 0,01 enhet pr. milliliter er også effek-tive. Det anvendte intervall ligger derfor fra 0,01 til 10 enheter pr. milliliter. En heparinenhet er her definert til å være en U.S.P. (United States Pharmacopoeia)-enhet. U.S.P. heparin-enheten er den mengde som vil hindre 1,0 milliliter citratbe-handlet fåreplasma i å størkne en time etter tilsetning av 0,2 ml.1:100 CaCl2-oppløsning. Slik som anvendt her omfatter beteg-nelsen "heparin" også heparins natriumsalt, idet sistnevnte stoff foretrekkes på grunn av dets gode vannløselighet.

Det antas at den foreliggende oppfinnelse vil kunne forstås bedre under henvisning til den medfølgende tegning, hvori figuren viser et diagram som fremstiller blodkoaguleringsmekanismen. Romertallene betegner de forskjellige blodkoaguleringsfaktorer. Det må imidlertid forstås at dette diagram bare betegner en arbeidshypotese som er basert på den nåværende kunnskap og at oppfinnelsen ikke skal være bundet til denne hypotese.

Som det har vært anført ovenfor har man i praksis ved produksjon av AHF oppnådd store forskjeller i AHF-utbyttet. Jo lengre tid konsentreringsprosessene tar desto mindre blir AHF-utbyttet. Tapet i utbyttet er i noen grad blitt utbedret ved å ofre fjerning av blodcellene den største oppmerksomhet. Disse resultater kan forklares under henvisning til størkningsdiagrammet i den medfølgende tegning. Av særlig interesse er tilbakekoplingsmekanismen som er vist med strekete linjer som indikerer virkningen av Faktor Ila (trombin) på Faktor V (proakselerin) og Faktor VIII (AHF). Virkningen består av to deler: (1) først frem-mes virkningene av VIII og V ved forandret tertiær struktur og deretter (2) hemmes disse virkninger for å stanse for kraftig størkning som kunne føre til kretsløpsvanskeligheter.

Av størkningsdiagrammet fremgår det klart at fjerning av faktorene II, VII, X og IX (protrombinkompleks) ville eliminere tilbakekoplingsmekanismen idet det ikke ville være noe II til dannelse av Ila. Denne iakttakelse som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse, nemlig at cellefritt plasma muliggjør et forløp av konsentreringen som resulterer i fremstilling av AHF med høyere utbytte, kan også forklares med størkningsdia-grammet idet tromboplastin ikke dannes og størkningen derfor ikke kan starte.

Den foreliggende oppfinnelse har vist seg nyttig ved forskjellige fremgangsmåter for fremstilling av AHF-konsentrater og kan anvendes til alle plasmaer og plasmafraksjoner som inneholder AHF blandet med en vilkårlig av protrombinfaktorene. Den er således blitt tilpasset fremgangsmåter for fraksjonering av AHF

fra (1) plasma ved glykokollfelling, (2) kryobunnfall ved glyko-

kollfelling, (3) kryobunnfall ved polyetylenglykolfelling, (4) kryobunnfall ved polyetylenglykol- og glykokollfelling og (5) kryobunnfall, samt (6) kryobunnfall ved polyetylenglykoll- og glykokollfelling etterfulgt av "Ecteola"-kromatografi.

En foretrukket fremgangsmåte for produksjon av AHF som den foreliggende oppfinnelse er egnet for, er fremgangsmåten som er beskrevet i US-patentskrift 3.631.018, hvor polyetylenglykol (PEG) og glykokoll anvendes for fraksjonering av et kryobunnfall av AHF-konsentrat. Således tilsettes ca. 1 enhet heparin pr. ml av oppløsningen ifølge eksempel 4 i nevnte patentskrift på det trinn hvor kryobunnfallet oppløses i glykokoll- og citratholdig saltoppløsning. Etter utfellingen med polyetylenglykol ved konsentrasjonen 10% behandles det gjenoppløste bunnfall igjen, slik at det inneholder ca. 1 enhet heparin pr. ml oppløsning på grunn av heparintapet ved fraksjonering med 10% polyetylenglykol. Heparin kan bekvemt tilsettes ved inkorporering i den citrat-eller glykokoll- og citratholdige saltoppløsning som anvendes for gjenoppløsning av de respektive bunnfall.

Den foreliggende oppfinnelse vil bli nærmere belyst i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Et stabilt menneske-AHF-konsentrat med høy styrke og i høyt utbytte ble fremstilt på følgende måte:

Reagenser

Citratholdig saltoppløsning, en vektdel 0,1 molar natriumcitrat til fire vektdeler 0,9 prosentig saltoppløsning.

Glykokoll- og citratholdig saltoppløsning. Det ble tilsatt den ovenfor fremstilte citratholdige saltoppløsning nok glykokoll til dannelse av en 0,1-molar glykokolloppløsning.

Skyllevann innstilt med buffer. Destillert vann ble tilsatt 1 volumprosent citratbuffer fremstilt ved å innstille 0,5 molar natriumcitrat på pH-verdien 6,88 med 0,5 molar sitronsyre.

Heparin. U.S.P.-kvalitet ble anvendt ("Lipo-Hepin", vanlig natriumheparin for injeksjon).

Eddiksyre, ble fremstilt som både 1,0 og 0,1 normal vandige oppløsninger.

Glykokoll, fremstilt som både 1,3 og 1,0 molar vandige opp-løsninger .

Fremgangsmåte

Menneskeblodplasma ble mottatt nedfrosset (til under 4°C) fra en blodbank. Plasmaet ble helt i Pfeudler-kar, og mens tem-peraturen ble holdt ved -20°C til -40°C ble det sentrifugert kontinuerlig eller diskontinuerlig. Til kryobunnfallet ble det tilsatt glykokoll- og citratholdig saltoppløsning som inneholdt en heparinenhet pr. ml, idet mengden utgjør en tiendedel av det plasmavolum kryobunnfallet stammer fra. Oppløsning ble etablert ved å blande sammen kryobunnfallet og den glykokoll- og citratholdige saltoppløsning under lune betingelser (normal romtemperatur, men ikke over 3 0°C).

Det oppløste kryobunnfall ble innstilt på pH-verdien 6,5 med 0,1 normal eddiksyre. Det ble tilsatt oppløsningen polyetylenglykol (gjennomsnittlig molekylvekt 4000) til en poly-etylenglykolkonsentrasjon på ca. 3,5%. Blandingen ble omrørt forsiktig ved romtemperatur i 10 minutter, hvoretter den ble sentrifugert i 15 minutter ved 5000 omdreininger pr. minutt.

Den oppåliggende væske ble fradekantert og innstilt på pH-verdien 6,88 med 0,1 normal natriumhydroksyd. Oppløsningen ble tilsatt mer polyetylenglykol for å bringe den endelige konsentrasjon opp på ca. 10%. Blandingen ble omrørt forsiktig ved romtemperatur i 30 minutter og sentrifugert k time ved 5000 omdreininger pr. minutt. Den oppåliggende væske ble dekantert fra og kastet. Bunnfallet ble vasket med kaldt vann (2°C) og deretter skylt 5 minutter i sentrifugen ved 5000 omdreininger pr. minutt og -4°C. Den ovennevnte væske ble dekantert fra, og bunnfallet ble opp-løst igjen i glykokoll- og citratholdig saltoppløsning som inneholdt en heparinenhet pr. ml. Mengden av oppløsningsmiddel var her igjen ca. en tiendedel av det plasmavolum som bunnfallet stammer fra.

Det gjenoppløste bunnfall ble innstilt på pH-verdien 6,88 med 0,1 normal eddiksyre og utfelt med 1,8 molar vandig glykokoll. Under fellingen ble det tilsatt blandingen nok glykokoll til å gjøre denne 1,8 molar med hensyn på glykokoll. Blandingen ble omrørt forsiktig i 45 til 60 minutter ved en temperatur på 2°C til 10°C, og deretter ble den sentrifugert kontinuerlig eller diskontinuerlig. Det fremkomne bunnfall ble oppsamlet og vasket forsiktig med bufferbehandlet skyllevann og deretter gjenoppløst i citratholdig saltoppløsning. Oppløsningen ble klaret ved bruk av et 293 mm Millipore filter (anvendte membraner:

1,2 mikron, 0,4 5 mikron og 0,3 mikron).

Deretter ble produktet frosset ved såkalt skall-frysing ("snell freezing") (-60°C) og oppbevart i en lyn-fryser ("flash freezer") (-20°C til -30°C) i minst 3 timer.

Ovennevnte fremgangsmåte ble gjentatt bortsett fra a't den glykokoll- og citratholdige saltoppløsning som ble anvendt for oppløsning av første kryobunnfall, eller for oppløsning av bunnfallet fra fraksjoneringen med 10% PEG eller på et vilkårlig annet tidspunkt av fraksjoneringen ikke ble tilsatt heparin.

Begge ovennevnte fremgangsmåter ble gjentatt med og uten heparintilsetning.

Den etterfølgende tabell viser resultatene av disse fire fraksjoneringer:

I tabellen sees det at når det ble anvendt heparin, var utbyttet av sluttproduktet 17%, mens utbyttet uten heparin gjennomsnittlig lå på fra 12,5 til 13,6%. Heparintilsetning økte således utbyttet med 25% til 35% i forhold til fremgangsmåten hvor heparin ikke ble anvendt. Når utbyttet av AHF-sluttprodukt ble dividert med AHF-utbyttet ved kryobunnfelling sees det at frem-gangsmåtens effektivitet økes fra 38% til 3 9% uten heparintilsetning til 49% og 52% med heparintilsetning.

Når polyetylenglykol med molekylvekt 6000 ble anvendt i ovennevnte eksempel istedenfor en ekvivalent mengde polyetylenglykol med molekylvekt 4000 ble det oppnådd praktisk talt samme resultater.

Eksempel 2

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble gjentatt inntil det punkt hvor første kryobunnfall ble resuspendert i glykokoll- og citratholdig saltoppløsning både med og uten heparin i oppløs-ningen. Utbyttet av AHF-sluttprodukt i disse to kryobunnfall-konsentrater av AHF var 34% når heparin ikke ble anvendt og 41% når det ble anvendt heparin. Dette tilsvarer en forbedring av utbyttet på 21%.

Eksempel 3

Fremgangsmåten ifølge eksempel 2 ble gjentatt bortsett fra at kryobunnfall-konsentratene, både med og uten heparin, ble lyofilisert og deretter rekondisjonert med vann, hvoretter man lot dem stå ved romtemperatur (ca. 25°C) i 24 timer. Prøven som var tilsatt heparin bibeholdt 98% av den AHF-begynnelses-aktivitet som eksisterte før bortsettingsperioden, mens den prøve som ikke var tilsatt heparin bare bibeholdt 72% av AHF-begynnelsesaktiviteten.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av den antihemofile faktor (AHF) ut av en blodplasmafraksjon som inneholder denne faktor, karakterisert ved at det som plasmafraksjon anvendes et kryobunnfallskonsentrat av AHF eller en fraksjon av et slikt konsentrat, og det til plasmafraksjonen tilsettes heparin i en mengde på fra 0,01 til 10 heparinenheter pr. ml oppløst plasmafraksjon.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at plasmafraksjonen er et kryobunnfallskonsentrat av AHF som ytterligere fraksjoneres med både polyetylenglykol og glykokoll.