DE2264438B2

DE2264438B2 - Teststreifen zum Nachweis von Wasserstoffperoxid oder Wasserstoffperoxid erzeugenden Systemen

Info

Publication number: DE2264438B2
Application number: DE2264438*A
Authority: DE
Inventors: W Guthlein; H Tiedemann; P Vogel; W Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1972-02-08
Filing date: 1972-02-08
Publication date: 1975-06-26
Also published as: GB1365651A; DE2205733C3; CH577969A5; CH578528A5; AT327886B; FR2177735B1; AT320635B; CH578527A5; NL7301506A; NL149791B; CH580074A5; FR2177735A1; DE2205733B2; DE2205733A1; DE2264438A1; CA1014166A; US3822285A

Description

Die Testfilme werden wie folgt ^,^„,^.

Zu der Kunststoffdispersion werden die übrigen Bestandteile gelöst in Wasser hinzugegeben mit Ausnahme des Indikators I und o-Tolidin, die 'a Methanol oder Aceton gelöst werden. Die Dispersion wird gut gemischt und in einer Schichtdicke von 100 bis SOO μ, vorzugsweise 300 bis 400 μ, auf eine nicht saugende Unterlage aufgetragen und im wannen Luftsüom getrocknet Der Auftrag kann z. B. streifenweise auf eine steife Kynststoff-Folie erfolgen. Diese wird dann quergeschnitten, so daß rechteckige Kunststoff-Stäbchen entstehen, die am unteren Ende die reaktive Schicht enthalten.

Man kann aber auch ein wasserundurchlässig beschichtetes Papier oder eine dünne Folie flächig mit der Reagenzienmasse beschichten. Die so beschichtete Fläche wird in schmale Streifen geschnitten, diese werden an den unteren Rand von Folienb«\ndern aufgesiegelt oder aufgeklebt, welche wie oben quergeschnitten werden. Die letztgenannte Methode besitzt den Vorteil der kürzeren Bescbichtungszeit

Die so hergestellten Teststreifen können gemäß DT-OS 15 98153 zum Nachweis von Glucose in Blut verwendet werden. Der Farbumschlag erfolgt hierbei von Rot über Olivfarben nach Grün. Auf Grund der Temperaturunabhängigkeit der Farben eignen sich die Streifen besonders zur Auswertung im Remissionsphotometer.

Die Testpapiere zur Bestimmung der Harnglucose werden in Analogie zu bereits bekannten Streifen durch Tränken von saugfähigen Trägern, wie z. B. Fließpapier, mit den Reagenzien hergestellt

Die folgende Tabelle II gibt einen Überblick über einige für die Herstellung von Testpapieren geeigneten Rezepturen:

Tabelle Π

Die angegebenen Mengen sind, bezogen auf 100 ml Imprägnierlösung:

Bestandteil	Untere Grenze	Obere Gieoze	Bevorzugte Menge
Glucoseoxidase	10¹U	10» U	2 bis 4 · 10« U
Peroxidase	10¹U	WO	3 bis 5 · 10· U
Puffer	0,01 M	0,1 M	0,025 bis 0,05 M
Netzmittel		bis zu 2 g	0,1 bis 0,2 g
Verdickungsmittel		bis zu 5 g	0,1 bis 0,5 g
Indikator I	0,5 g	10 g	5 bis 7 g

Als Puffer kommen gebräuchliche Puffer wie: Phosphat- oder Zitrat-Puffer in Frage, und zwar vom pH 4,5 bis 7, vorzugsweise 5 bis 6.

Als Netzmittel sind sowohl uichtionogene (z. B,. Folyoxyäthylensorbitan-monolaurat) als auch anionische Vertreter (z. B. Dioctylnatrium-sulfosuccinat, Natriumlaurylsuif at oder Ammoniumperfluoroctanoat) brauchbar.

Als Verdickungsmittel haben sich niedermolekulare Polyvinylpyrrolidone bewährt, aber auch Alginate., Gelatine und ähnliche Stoffe sind brauchbar.

Die Bestandteile werden in einem geeigneten Lösungsmittel, meist Wasser-Äthanol-Gemisch, gelöst. Mit dieser Lösung wird Filterpapier imprägniert und getrocknet. Man kann aber auch die wasserlöslichen Bestandteile, wie Puffer, Enzyme, Netzmittel und Verdickungsmittel einerseits und die Indikatoren andererseits, in zwei getrennten Arbeitsgängen aufbringen. Die imprägnierten Testpapiere können in schmale Streifen geschnitten und zwischen zwei Kunststoff-Folien oder zwischen einer Kunststoff-Folie und einem feinmaschigen Netzwerk eingesiegelt werden. Man taucht die Testpapiere kurz in den zu untersuchenden Urin und vergleicht nach einer gewissen Zeit mit einer Farbvergleichsskala. Bei niederen Glucosekonzentrationen wird nach Va his I Minute, bei höheren nach 3 bis 5 Minuten abgelesen. Man kann die Farbe aber auch, wie bereits geschildert, mit Remissionsphotometern oder einfachen Teststreifen-Photometern messen.

Die Genauigkeit der beschriebenen Testfilme und

Testpapiere entspricht den für praktische und klinische Untersuchungen geforderten Maßstäben.

Beispiel 1 Testfilm zum Nachweis von Glucose im Blut

Bestandteile Polyvinylacetatpropionat-

dispersion, 1,85 %ige Lösung von

Natriumalginat in 0,5 m 45,0 g Phosphatpuffer von pH 5,5 35,0 g Organische Natriumsulfonate 1,0 g Glucoseoxidase (104 U/mg), in

10 ml Wasser gelöst 0,114 g

Peroxidase (63,1 U/mg), in 10 ml Wasser gelöst 0,128 g

o-Tolidin, in 6 ml Methanol gelöst 0,2 g 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-

carbazol, in 6 ml Methanol gelöst 0,026 g

Indikator I

Die Bestandteile werden gut gemischt, in einer Schichtdicke von 300 μ auf PVC-Folie ausgestrichen und 35 Minuten bei 6O⁰C getrocknet. Auf tropf en von glucosehaltigem Blut und Abwischen desselben nach einer Minute liefert nach weiteren 2 Minuten folgende temperaturunabhängige Reaktionsfarben:

60 mg % Glucose — bräunlichrot

120 mg % Glucose — Oliv 180 mg % Glucose und mehr — Grün mit wachsender Farbtiefe.

Fig. 1 zeigt bei 20 und 30⁰C mit einem handelsüblichen Remissionsphotometer gemessene Eichkurven.

Ein Testfilm gleicher Zusammensetzung und Herstellung, der aber an Stelle von 0,026 g Indikator I 0,04 g 9-(Äthyl)-3-aminocarbazol enthält, zeigt praktisch die gleichen Reaktionsfarben, die jedoch temperaturunabhängig und daher nicht reproduzierbar sind.

F i g. 2 zeigt, daß sich die bei 20 und 30⁰C erstellten Eichkurven erheblich unterscheiden.

Beispiel 2
Testfilm zum Nachweis von Glucose im Blut

Bestandteile

Polyvinylacetatpropionatdispersion, 1,85 %ige Lösung von

Natriumalginat in 0,5 m 45,0 g

Phosphatpuffer vom pH 5,5 35,0 g

Natriumnonylsulfat, in 5,0 ml

Wasser gelöst 0,75 g

Glucoseoxidase (62,7 U/mg, in

10 ml Wasser gelöst 0,189 g

Peroxidase (68,8 U/mg), in 10 ml

Wasser gelöst 0,235 g

ο Tolidin, in 2,5 ml Aceton gelöst 0,6 g
9 -(y-Aminopropyl)-3-aminoca bazol-dihydrochlorid, in 2,5 ml
Wasser gelöst 0,026 g

Die Bestandteile werden gut gemischt, in einer Schichtdicke von 310 μ auf polyvinylidenchloridbeschichtetes Papier ausgestrichen und 35 Minuten bei 60⁰C getrocknet Die Handhabung entspricht Beispiel. Die bei 20 und 30⁰C mit einem Remissionsphotometer gemessenen Eichkurven weisen keine ins Gewicht fallende Abweichungen auf.

Reaktionsfarben:

60 mg % Glucose — Rosaocker
120 mg % Glucose — Oliv
180 mg % Glucose und mehr — Blaugrün mit wachsender Farbtiefe.

Bei einer Untersuchung des Blutes von 53 diabetischen Patienten, bei der die Reaktionsfarben mit einem Teststreifen-Photometer ausgemessen wurden, ergab sich im Vergleich zur GIucose-Bestiminung mit der Hexokinase-Methode ein Körrelatiönskoeffizieni von 0,9857. Die Standard-Abweichung (2s) betrug ± 15 mg % Glucose. Praktisch gleiche Ergebnisse (r = 0,982; 2s = ± 17 mg) wurden mit einem Tesi film aus folgenden Bestandteilen erhalten:

Polyvinylacetatpropionatdispersion, 1,85 %ige Lösung von

Natriumalginat in 0,5 m 45,0 g

Phosphatpuffer von pH 6,5 35,0 g

Ammonium-perfluoractanoat, in

10 ml Wasser gelöst 1,0 g

Glucoseoxidase (62,4 U/mg), in

10 ml Wassser gelöst 0,19 g

Peroxidase (100 U/mg), in 10 ml

Wasser gelöst 0,16 g

Gelber Pigmentfarbstoff 0,02 g

o-Tolidin, in 20 ml Methanol gelöst 0,4 g 9-(y-AminopropyI)-3-aminocarbazoldihydrochlorid, in 20 ml Methanol gelöst 0,026 g

Beispiel 3 Testpapier zum Nachweis von Glucose im Harn

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zu sammensetzung getränkt und bei 50⁰C getrocknet.

1 m Citratpuffer, pH 5 50,0 ml

Polyvinylpyrrolidon

(mitt. MG 12000) 0,1g

Polyvinylpyrrolidon

(mittl. MG40 000) 0,1g

9-(y-Aminopropyl)-3-amino-

carbazol-dihydrochlorid 3,12 g

Glucoseoxidase (104 U/mg) 0,3 g

Peroxidase (63 U/mg) 0,06 g

Wasser ad 100,0 ml

Das Testpapier reagiert mit glucosehaltigem Urir mit rosa- bis violettbraunen Farbtönen. Urine verschiedener Herkunft sowie acetessigsäurehaltige Urine der gleichen Glucosekonzentration zeigen im Farbtor keine ins Gewicht fallende Abweichung. Ein Testpapier gleicher Zusammensetzung, welches aii Stelle von Indikator I 3,0 g oTolidin enthält reagiert mil diesen Urinen mit stark unterschiedlichen Farbtönen. Störungsfreie Reaktionen erhält man auch mit einem Testpapier, welches wie folgt hergestellt wurde:

Filterpapier wird mit einer Lösung von 6,25 g 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol-dihydrochlorid in 100 ml Wasser imprägniert und bei 50° C getrocknet. Das so vorbehandelte Papier wird mit einer Lösung

so folgender Zusammensetzung nachimprägniert:

Glucoseoxidase (104 U/mg) 0,39 g

Peroxidase (63 U/mg) 0,06 g

Polyöxyäthylensorbitanmono

laurat : 0,2g

0*25 m Paosphatpuffer, pH 5,0 ad 100,0 ml

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Temperaturschwankungen, wie sie bei der Auswertung

Patentenspruch: ^_n Renüssionsphotometer auftreten, waren Testfilme

Teststreifen oder Testfilm zum Nachweis von zur Bestimmung von Glucose im Blut bisher aus den Wasserstoffperoxid iöder Wasserstoffperoxid er- genannten Gründen unbrauchbar, zeugenden Systemaf durch Oxidation eines Chro- 5 Der Gegenstand der Erfindung betrifft einen Testmogens in Gegenwärt von Peroxidase oder per- streifen oder Testfilm zum Nachweis von Wasserstoffoxidatisch wirkenden Substanzen, dadurch peroxid oder Wasserstoffperoxid erzeugenden Sygckennzeichnet, daß als Chromogen stemen durch Oxidation eines Chromogens in Gegen-9-(y-Anitoopropyi;M-aniino-carbazoI oder dessen wart von Peroxidase oder peroxidatisch wirkenden Salze enthalten sind. io Substanzen und ist dadurch gekennzeichnet, daß als

Chromogen 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol oder

dessen Salze enthalten sind.

9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol liefert zusam-

Schon seit längerer Zeit wird Glucose in Körper- men mit anderen Oxidationsindikatoren, insbesondere flüssigkeiten durch eine enzymatische Nachweis- »5 mit o-Tolidin, in weiten Grenzen temperaturunabreaktion quantitativ bestimmt, bei welcher Glucose hängige und damit !«produzierbare Farbwerte je nach mittels Glucose-oxidase und Luftsauerstoff zu Glucon- Konzentration der nachzuweisenden Substanz. Über säure oxidiert wird. Das bei dieser Reaktion frei die Temperatiuunabhangigkeit hinaus besitzt der werdende Wasserstoffperoxid reagiert mittels Per- erfindungsgemäße Indikator noch eine weitere wertoxidase mit einem möglichst farblosen Chromogen. ao volle und überraschende Eigenschaft, die dessen Die Extinktion des dabei entwickelten Farbstoffs Verwendbarkeit in Teststreifen erheblich erweitert Meiert ein Maß für die Menge der in der untersuchten Es hat sich nämlich herausgestellt, daß der erfindungs-Flüssigkeit vorhandenen Glucose. Da die im Reagenz- gemäße Indikator durch störende Bestandteile des glas und in der Küvette durchgeführten Reaktionen Urins nicht beeinflußt wird, so daß es nunmehr nur mittels teurer Geräte und durch ausgebildetes as möglich ist, mittels Teststreifen quantitative Be-Personal ausgewertet werden können, sind in den Stimmungen von z. B. Glucose im Harn durchzuletzten Jahren Teststreifen entwickelt worden, die die führen. Die bisher bekannten Teststreifen, die auf dem erforderlichen Reagenzien bereits in richtiger Dosierung Prinzip der enzymatischen Glucosebestimmung nach enthalten und die Farbreaktion nach dem Befeuchten der Glucose-oxidase/Peroxidase-Methode basierten, mit der zu untersuchenden Flüssigkeit unmittelbar 30 enthielten als Indikator meist o-Tolidin und wurden auf dem Reagenzienträger entwickeln. Solche Test- von bestimmten häufig auftretenden bekannten Harnstreifen können aus einem saugfähigen Träger, wie bestandteilen, wie z. B. Acetessigsäure oder Ascorbinz. B. Fließpapier, bestehen, es ist jedoch gemäß säure, aber auch von vielen unbekannten im Harn DT-OS 15 98 153 auch möglich, die Reagenzien in anwesenden Stoffen erheblich gestört Es war dadurch wasserfeste Filme einzuarbeiten. Diese Testfilme 35 zwar möglich, qualitative oder bestenfalls halbquantikönnen abgewischt werden unJ eignen sich deshalb tative Aussagen über die Glucosekonzentration zu besonders zur Untersuchung trüber Flüssigkeiten, machen, jedoch waren verläßliche quantitative Auswie z. B. Blut Wertungen nicht möglich. Testpapiere zur Bestimmung

In jüngster Zeit ist man dazu übergegangen, die von Glucose im Harn mit dem erfindungsgemäßen an sich nur halbquantitative Auswertung der Test- 40 Indikator zeigen in den verschiedenartigsten Urinen streifen an Hand von Farbtafeln dadurch zu ver- (pH, Begleitstoffe, Eiweißgehalt usw.) mit gleichem bessern, daß Teststreifen nach erfolgter Nachweis- Glucosegehait stets die gleichen Reaktionsfarben, reaktion optisch ausgemessen werden. Hierfür sind Dieser Befund war nicht vorhersehbar und führte zu relativ unkomplizierte Remissionsphotometer ent- einem Harndiagnostikum von hohem praktischem wickelt worden, die eine quantitative Auswertung von 45 Wert.

Testfilmen erlauben. Die Erfindung wird durch die in den nachfolgenden

Bei der Entwicklung von Testfilmen stellte es sich Tabellen und Beispielen dargelegten Ausführungsheraus, daß die Nachweisreaktionen relativ stark beispiele näher erläutert: temperaturabhängig sind, so daß es kaum möglich _T h 11 1 war, ohne Berücksichtigung der Temperaturverhält- 50 ^iaDeiie ^l

nisse reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Be- Die angegebenen Mengen sind, bezogen auf 100 g sonders störend macht sich dies im Remissionsphoto- Beschichtungsmasse, für Testfilme:

meter bemerkbar, da der Meßlichtstrahl die Reak-

tionszone schnell stark erwärmt Bestandteil Untere Obere Bevorzugte

Als Chromogen wurde bisher für Testfilme ein 55 Grenze Grenze Menge

Gemisch der Oxydationsindikatoren o-Tolidin und «·.*«,« on _Λη u- cn

3-Amino-9-äthylcarbazol eingesetzt Dieses Gemisch ^K.^unstst°^ff- 2° 8 80 g 40 bis 50 g

hat sich auf Grund seines besonders günstigen Färb- aspersion

Umschlags von Rot nach Grün bewährt, jedoch Quellstoff 0,1g 2,0 g 0,5 bis 0,6 g

haftet ihm der beschriebene Nachteil einer starken 60 Netzmittel 0,1 g 2,0 g 0,5 bis 1,0 g

Temperaturabhängigkeit an. Puffer 0,5 g 5,0 g 2,5 bis 3,5 g

Bisher sind trotz intensiver Forschung überhaupt Glucose- 10» U 10⁵U 10» bis 10* U keine Indikatoren gefunden worden, die temperatur- oxidase

unabhängigreproduzierbareFarbwerte geliefert hätten. „ ., _{1ftSTT 1Λ8ΤΤ} ,_Λ. ,. _1Λ._ΤΤ

Vielmehr traten je nach Reaktionstemperatur und 65 ^{Peroxidase 10}*^{u 10}'^{υ 10}° ^{bls 10}*^υ abhängig von der Temperatur, bei der die Teststreifen o-Tolidin 0,1g 1,0 g 0,2 bis 0,7 g

abgelesen wurden, Farbabweichungen auf, die die Indikator I·) 0,01 g 0,5 g 0,02 bis 0,03 g

Ergebnisse zum Teil erheblich verfälschten. Bei ♦) = 9-(y-Aminopropyl)-3-amino<arbazol.