DE3781007T2 - Verfahren zur messung von phenol und alpha-naphthol, sowie ein verfahren zur messung der aktivitaet von enzymen. - Google Patents

Verfahren zur messung von phenol und alpha-naphthol, sowie ein verfahren zur messung der aktivitaet von enzymen.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein höchstempfindliches Verfahren zur Messung von Phenol oder α-Naphtol sowie auf ein Verfahren zur Messung der Aktivität eines Enzyms durch die Messung von Phenol oder α-Naphtol.
  • Die Messung der Aktivität von alkalischer Phosphase, saurer Phosphatase, Kallikrein, Antithrombin III und ähnlicher Enzyme ist bei der klinischen Diagnose verschiedener Krankheiten sehr wichtig und wurde bereits weitläufig dafür verwendet.
  • Jeder der Messungen wurde durch eine Messung von Phenol oder α-Naphtol, welche durch Inkontaktbringen des Enzyms mit einem Substrat einer Phenyl- oder Naphtylradikal enthaltenden Verbindung freigesetzt werden, ausgeführt. Obwohl verschiedene Verfahren für die Messung von Phenol und α-Naphtol dargelegt wurden, sind die typischen im folgenden aufgeführt:
    • Qualitative Verfahren, die Phenol verwenden:
  • Nachweis durch Indophenol-Reaktion (Liebermann'sche Reaktion); Nachweis mit Millon'scher Reagenz; Nachweis mit 2,6- Dichlorchinonchlorimid; Nachweis mit 4-Aminoantipyrin; Nachweis mit Eisen (III)-Chlorid; Nachweis durch Fluoreszein-Reaktion mit m-Diphenol.
    • Quantitative Verfahren von Phenol:
  • Verfahren, das eine Diazo-Kupplung verwendet; Verfahren, das 2,6-Dibromchinonchlorimid verwendet; Verfahren, das 4-Aminoantipyrin verwendet; Verfahren, das das Folin-Ciocalten'sche Reagenz verwendet.
    • Qualitative Verfahren von α-Naphtol:
  • Nachweis mit einem Diazoniumsalz von p-Nitroanilin; Nachweis mit Cerammoniumnitrat.
    • Quantitative Verfahren von α-Naphtol:
  • Verfahren, das 2-Naphthylamin-5,7-Disulfonsäure verwendet; Verfahren, das 4-Aminoantipyrin verwendet.
  • Fast alle diese Verfahren, insbesondere die quantitativen Verfahren, weisen einen gemeinsamen Nachteil darin auf, daß die Funktionsvorgänge dahingehend störend sind, daß sie eine relativ lange Zeitspanne benötigen. Die am verbreitesten angewandten Verfahren unter diesen sind, hinsichtlich einer Erleichterung des Betriebes, die qualitativen und quantitativen Verfahren, die 4-Aminoantipyrin verwenden, die, sofern es das Phenol betrifft, eine Reaktion zwischen Phenol und 4-Aminoantipyrin unter alkalischer Bedingung und der Anwesenheit von Kaliumferricyanid zur Bildung eines Antipyrinfarbstoffes mit gelblich-roter Farbe zum Nachweis von Phenol verwenden, und das Ergebnis der Messung der Farbtönung der resultierenden gefärbten Lösung durch Messung des Absorptionsvermögens bei 510 nm zum quantitativen Bestimmen des Phenols verwenden, wie unten durch die Reaktionsformeln dargestellt.
  • Die Verfahren, die 4-Aminoantipyrin verwenden, welche bevorzugt wurden, weisen ebenso den Nachteil einer geringeren Empfindlichkeit auf, da der zu bildende Antipyrinfarbstoff einen niedrigeren molekularen Auslöschungskoeffizienten von 5000 bis 10000 besitzt. Deshalb sollte, wenn die Konzentration von Phenol oder α-Naphtol in der Probe relativ niedrig ist, der gebildete Antipyrinfarbstoff mit Chloroform extrahiert und konzentriert werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, was den Betrieb mühsam macht und wofür eine zusätzliche Zeitspanne nötig ist.
  • Als ein konventionelles Verfahren zur Messung der Aktivität von Enzymen, beispielsweise alkalischer Phosphatase und saurer Phosphatase, wurde das Kind-King'sche Verfahren weitläufig angewendet. Laut diesem Verfahren wird das Enzym mit einem Substrat einer Phenyl- oder Naphthylradikal enthaltenden Verbindung in Kontakt gebracht, um Phenol oder α-Naphtol von dem Substrat freizusetzen, das freigesetzte Phenol oder α- Naphtol reagiert mit 4-Aminoantipyrin in Anwesenheit von Kaliumferricyanid als einem Oxidationsmittel, um den Antiyprinfarbstoff mit gelblich-roter Farbe zu bilden, und die Farbtönung der resultierenden gefärbten Lösung wird zur Bestimmung der Aktivität des Enzyms vermessen.
  • Dieses Verfahren weist die Nachteile auf, auf die bei der Messung von Phenol hingewiesen wurde. Ferner zeigt dieses Verfahren einen bemerkenswerten Nachteil darin auf, daß die Maximalabsorption des Antipyrinfarbstoffs nahe 500 nm liegt, wie oben genannte, und ebensolche Wellenlänge wird zur Messung verwendet. Wenn nämlich die Aktivität von Enzymen auf dem Gebiet der klinischen Untersuchungen vermessen wird, wird gewöhnlich ein Serum als eine Testprobe gewählt, wobei dies eine mögliche anomale Probe einer hämolytischen, milchsaftartigen oder icterischen Probe ist, und im Fall solcher anomalen Proben wirkt Hämoglobin, Chymus oder Bilirubin als störendes Material, das Meßfehler verursacht, da die Maximalabsorption der Materialien mit oder nahe von 500 nm, als Meßwellenlänge für den Antipyrinfarbstoff, überlappt, wie folgt.
  • Hämoglobin: besitzt Doppelmaximalabsorption bei 430 nm und im Bereich von 530 bis 750 nm,
  • Chymus: absorbiert über einen weiten Wellenlängenbereich und zeigt ein höheres Absorptionsvermögen, wenn die Meßwellenlänge kürzer wird, und
  • Bilirubin: besitzt eine Maximalabsorption bei 465 nm.
  • Ein Ziel der Erfindung ist es, ein höchstempfindliches Verfahren zur Messung von Phenol und α-Naphtol zu schaffen, welches eine relativ kurze Zeitspanne für die Reaktion dazu benötigt.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Messung der Aktivität von Enzymen durch die Messung von Phenol oder α-Naphtol zu schaffen, welches eine relativ kurze Zeitspanne benötigt und große Genauigkeit zeigt, selbst wenn ein anomales Serum als eine Probe, die Enzyme beinhaltet, verwendet wird, um getestet zu werden.
  • Erfindungsgemäß schaffen wir ein Verfahren zur quanitativen Messung von Phenol oder α-Naphtol, die in einer Probe enthalten sind, umfassend die Umsetzung des Phenols oder des αNaphtols mit p-Diethylaminoanilin in Gegenwart eines chemischen Oxidationsmittels zur Bildung eines Chinonfarbstoffes und Messung der Farbintensität der resultierenden Lösung, um die Menge des Phenols oder des α-Naphtols zu bestimmen.
  • Als Oxidationsmittel können Kaliumferricyanid, Chloramin T, Natriummetaperiodat oder ähnliche chemische Oxidationsmittel verwendet werden.
  • Ferner schafft die Erfindung ein Verfahren zur Messung der Aktivität von Enzymen, die in einer Probe enthalten sind, enthaltend das In-Kontak-Bringen einer Verbindung, welche ein Phenyl- oder Naphtylradikal enthält mit dem Enzym in der Probe, um das Phenol oder α-Naphtol freizusetzen, Umsetzen des freien Phenols oder α-Naphtols mit p-Diethylaminoanilin in Gegenwart eines chemischen Oxidationsmittels, um einen Chinonfarbstoff zu bilden und Messen der Farbintensität der resultierenden Lösung, um die Enzymaktivität zu bestimmen.
  • Beispiele für das Enzym, dessen Aktivität zu messen ist, sind alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Kallikrein und Antithrombin III. Als Substrate können konventionelle Verbindungen, die imstande sind, Phenol oder α-Naphtol freizusetzen, verwendet werden, beispielsweise Dinatrium und L-Propyl-L-Phenylalanyl-L-Alginin-1-Naphtylesterdihydrochlorid und derartige Verbindungen.
  • Die folgenden Gleichungen stellen die in den obigen erfindungsgemäßen Verfahren auftretenden Reaktionen dar, in denen die folgenden Substanzen verwendet werden.
  • Enzyme, deren Aktivität zu messen ist: Alkalische Phosphatase (ALP)
  • Substrat: Phenylphosphat
  • Der resultierende Chinonfarbstoff besitzt seine Maximalabsorption nahe 670 nm, weshalb solch eine große Wellenlänge zur Messung verwendet werden kann.
  • Deshalb können, selbst wenn ein anomales Serum als Probe verwendet wird, die durch Hämoglobin und Bilirubin verursachten Störungen infolge der Unterschiede der Maximalabsorption vermieden werden und die durch Chymus verursachte Störung kann ebenso auf ein niedriges Niveau gehemmt werden. Ferner besitzt der Chinonfarbstoff einen molekularen Auslöschungskoeffizienten von ungefähr 20000, welcher ungefähr 2 bis 4-mal größer ist als der des Antipyrinfarbstoffs (ungefähr 5000 bis 10000), gemessen mit dem konventionellen Kind-King'schen Verfahren, so daß das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr hohe Empfindlichkeit zeigt und jede der Enzym- und Oxidationsreaktionen ist in ungefähr 5 Minuten abgeschlossen, was ungefähr Drittel der Zeit ist, die bei dem konventionellen Kind- King'schen Verfahren benötigt wird.
  • Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Testbeispiele und Meßbeispiele erklärt, die sich auf die Zeichnungen beziehen können, in denen
  • Fig. 1 ein Diagramm ist, das den Zusammenhang zwischen dem Absorptionsvermögen und der Meßwellenlänge einer Probelösung, die einen Chinonfarbstoff beinhaltet, und einer Kontrollösung zeigt;
  • Fig. 2 eine Calibrierungskurve ist, die verwendet werden kann, wenn Phenol erfindungsgemäß zu vermessen ist;
  • Fig. 3 ein Graph ist, der den Effekt von Hämoglobin, das zu einem normalen Serum gegeben wird, auf die Messung der Aktivität alkalischer Phosphatase zeigt;
  • Fig. 4 ein Graph ähnlich Fig. 3 ist, jedoch zum Testen des Effektes von Bilirubin;
  • Fig. 5 ein Graph ähnlich Fig. 3 ist, jedoch zum Testen des Effektes von Chymus;
  • Fig. 6 ein Graph ähnlich Fig. 3 ist, jedoch zum Testen des Effektes von Ascorbinsäure; und
  • Fig. 7 ein Graph ist, der die Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem konventionellen Kind-King'schen Verfahren zeigt.
    • Testbeispiel 1 a) Testprobe:
  • Ein blaugefärbte wäßrige Lösung, die einen Chinonfarbstoff enthält, der durch Reaktion von Phenol mit p-Diethylaminoanilin als Diaminverbindung in Gegenwart von Kaliumferricynad als Oxydationsmittel hergestellt wurde.
    • b) Kontrollprobe:
  • Eine wäßrige Lösung, die die Diaminverbindung und das Oxidationsmittel wie in der genannten Testprobe enthält, allerdings kein Phenol enthält.
    • c) Messung des Absorptionsvermögens und des molekularen Auslöschungskoeffizienten:
  • Das Absorptionsvermögen jeder der Test- und Kontrollproben wurde bei verschiedenen Wellenlängen vermessen, um die in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse zu erhalten. Anhand der Figuren ist es offensichtlich, daß eine Maximalabsorption des Chinonfarbstoffes in der Testprobe nahe 670 nm liegt. Weiterhin zeigt der Chinonfarbstoff einen molekularen Auslöschungskoeffizienten von ungefähr 20000, dessen Wert das Zwei- bis Vierfache des mit dem konventionellen Kind-King'schen Verfahren gemessenen Antipyrinfarbstoffs ist. Dies zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine Empfindlichkeit besitzt, die der des Kind-King'schen Verfahrens überlegen ist.
    • Beispiel 1 (Messung von Phenol) [I] Reagenzien 1) Carbonatpuffer:
  • Eine wäßrige Lösung, hergestellt durch Vermischen von 50 mmol/l Natriumcarbonatlösung mit 50 mmol/l Natriumhydrogencarbonatlösung und Einstellung des pH der Mischung auf 10,0.
    • 2) Kaliumferricyanid:
  • Eine wäßrige Lösung von 30 mmol/l Kaliumferricyanidlösung.
    • 3) p-Diethylaminoanilin:
  • Eine wäßrige Lösung, hergestellt durch Zugabe von p-Diethylaminoanilindihydrochlorid zu 0,1 N Hydrochlorsäurelösung, so daß die Konzentration an p-Diethylaminoanilin 15 mmol/l betrug.
    • [II] Betriebsvorgang (1) Meßvorgänge:
  • a) 40 ul jeder der Probelösungen (T), eine reine Reagenz als Kontrolle und eine Standardphenollösung (St) wurden entnommen.
  • b) Zu jeder der obigen entnommenen Lösungen wurden 2,0 ml Carbonatpuffer, 0,2 ml Kaliumferricyanidlösung und 0,2 ml einer p-Diethylaminoanilinlösung zugegeben und vermischt, und jeder der erhaltenen Mischungen wurde dann für 5 Minuten stehengelassen.
  • c) Das Absorptionsvermögen der gemischten, die Probe enthaltenden Lösung und der gemischten, die Standardphenollösung enthaltenden Lösung wurden bei 670 nm vermessen (Absorptionsvermögenswerte von Et und Es), wobei selbige mit dem Absorptionsvermögen der reinen Reagenz zur Kontrolle verglichen wurden.
  • (2) Quantitative Berechnung:
  • Eine Konzentration (C) von Phenol in der Probelösung kann gemäß der folgenden Gleichung berechnet werden.
    • C = (Et/Es)·(Konzentration der Standardphenollösung)
  • Das Volumenverhältnis zwischen der Probelösung und den Reagenzien kann, abhängig vom Zweck der Messung, modifiziert werden, beispielsweise bei einer Reinheitsmessung für Rohmaterialien von Drogen, wie z. B. Propanolhydrochlorid oder einer Messung von Phenol in einer Abfallösung einer Fabrik, wobei die Konzentration der letztendlich reagierenden Lösung in Betracht zu ziehen ist.
    • Testbeispiel 2 (Kalibrierungskurve für Phenol)
  • Der Zusammenhang zwischen der Menge von Phenol und dem Absorptionsvermögen der Lösung wurde an verschiedenen Standardphenollösungen, die Phenol in verschiedenen Mengen, die von 0 bis 30 ug reichen, beinhalten, durch Reaktion von Phenol mit Reagenzien ähnlich den in Beispiel 1 beschriebenen bestimmt, um die in Fig. 2 gezeigten Resultate zu erhalten. Beide besitzen einen linearen Zusammenhang, was bedeutet, daß der Graph aus Fig. 2 als Calibrierungskurve verwendet werden kann.
    • Beispiel 2 (Messung der Aktivität an alkalischer Phosphatase) [I] Reagenzien 1) Erstes Reagenz:
  • Zu 100 ml von 50 mmol/l Carbonatpuffer (pH 10,0), der 0,1% Polyoxyethylenoctylphenylether beinhaltet, wurden 380 mg Dinatriumphenylphosphat, 100 mg Kaliumferricyanid und 100 mg Magnesiumchlorid (Hexahydrat) zugegeben und gelöst, um dieses Reagenz herzustellen. Dieses Reagenz kann wirkungsvoll über einen Monat verwendet werden, wenn es in einem Kühlschrank gelagert wird.
    • 2) Zweites Reagenz:
  • Dieses Reagenz wurde durch Zugabe und Lösen von 36 mg p-Diethylaminoanilindihydrochlorid in 1 ml 1N-Hydrochlorsäure und Zugabe von raffiniertem Wasser, um eine gesamte Menge von 20 ml zu ergeben, hergestellt.
    • [II] Meßverfahren 1) Meßvorgänge:
  • a) 2,0 ml der ersten Reagenz wurden in jedes Teströhrchen gegeben und auf 37ºC erwärmt.
  • b) 40 l jedes der Probeseren (T), raffiniertes Wasser als Kontrolle und ein Standardserum (St) wurde entnommen und zu jedem der genannten Teströhrchen zugegeben und auf 37ºC für 5 Minuten erwärmt, um eine Reaktion zu verursachen.
  • c) Beide der reagierten Lösungen wurden einer Messung des Absorptionsvermögens bei 660 nm unterzogen, wobei selbige mit dem raffinierten Wasser als einer Kontrolle verglichen wurden, um die Absorptionsvermögenswerte Eo(T) und EO(St) zu erhalten.
  • d) Sofort nachdem die Absorptionsvermögensmessung durchgeführt wurde, wurden 0,4 ml der zweiten Reagenz zu den reagierten Lösungen gegeben, darin vermischt und für 5 Minuten stehengelassen, um die Reaktion zu verursachen.
  • e) Beide der resultierenden Lösungen wurden einer Messung des Absorptionsvermögens bei 660 nm unterzogen, wobei selbige mit raffiniertem Wasser als Kontrolle verglichen wurden, um die Absorptionsvermögenswerte Ef (T) und Ef (St) zu erhalten.
    • 2) Quantitative Berechnung
  • Die Aktivität (C) der alkalischen Phosphatase in dem Probeserum wird gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
  • C = Ef(T) - [Eo(T) · (2.04/2.44)]/Ef(St) - [Eo(St) · (2.04/2.44)] (Aktivität des Standardserums)
    • Beispiel 3 (Messung der Aktivität an Harnkallikrein) [I] Reagenzien 1) Testproben:
  • Ein Reagenz wurde durch Lösen von 10 mg p-Diethylaminoanilindihydrochlorid und 6 mg Pro-Phe-Arg-ONap·2HCl (L-Propyl-LPhenylalanyl-L-Alginin-l-Naphtylesterdihydrochlorid) in 10 ml eines 0,2 M Phosphatpuffers (pH 6,5) hergestellt. Ein Filterpapier wird in die Reagenzlösung getaucht, dort herausgenommen und unter Vakuum gefriergetrocknet.
  • Das behandelte Testpapier wurde in Teile einer Größe von 5·5 mmol/l zerschnitten und jedes Teil wurde an ein Ende eines Polyvinylchloridfilmstreifens mit Hilfe eines anderen Teiles, das eine Klebeschicht auf beiden Seiten besitzt, angebracht, um eine gewünschte Testprobe herzustellen.
    • 2) Farbentwicklungslösung:
  • 6 mmol/l Chloramin T Lösung.
    • [II] Meßverfahren
  • a) Das Testpapierteil der Testprobe wurde in eine Harnprobe getaucht oder ein Tropfen der Harnprobe wurde auf das Testpapierteil getropft, um eine Absorption dorthinein zu bewirken, und dann sanft auf der oberen Oberfläche der Testprobe verwischt.
  • b) Die resultierende Testprobe wurde auf einer Platte angeordnet und bei 37ºC gehalten und so wie sie war für 5 Minuten belassen.
  • c) Ein Tropfen der Farbentwicklungslösung wurde auf das Testpapierteil auf der Testprobe getropft und für 2 Minuten stehengelassen.
  • d) Eine blaue Farbe wurde auf dem Testpapierteil entwickelt und dessen Farbtönung wurde mit einem vorher hergestellten standardkolorimetrischen Diagramm [das beispielsweise die Farbtönungen zeigt, die einer Harnkallikreinkonzentration von 0, 20, 40 und 80 NU/l (NU : Naphtyleinheit) entspricht] verglichen, um die Aktivität des Kallikrein in der Harnprobe zu bestimmen.
    • Testbeispiel 3 (Einfluß der störenden Substanzen)
  • Tests wurden in Verbindung mit Messungen der Aktivität an alkalischen Phosphatasen durchgeführt, um zu bestimmen, ob oder ob nicht Hämoglobin, Bilirubin, Chymus und Ascorbinsäure einen schlechten Einfluß auf das erfindungsgemäße Verfahren, das durch die Messung des Chinonfarbstoffs durchgeführt wird, ausüben, da die Substanzen als Ursachen für einen Meßfehler bei dem konventionellen Kind-King'schen Verfahren betrachtet werden. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3 bis 6 gezeigt. Wie anhand der Figuren offensichtlich ist, üben diese Substanzen nahezu keinen Einfluß auf die Messung aus.
    • Testbeispiel 4 (Reproduzierbarkeit)
  • Die Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde überprüft, um die in der folgenden Tabelle enthaltenen Ergebnisse zu erhalten. Wie anhand der Tabelle zu entnehmen ist, besitzt das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr große Reproduzierbarkeit. Serum 1 (K-A Einheit) Mittelwert prozentuale quadratische Steuung (%)
    • Testbeispiel 5 (Korrelation mit dem Kind-King'schen Verfahren)
  • Die Aktivität einer alkalischen Phosphatase in verschiedenen Proben wurde gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem konventionellen Kind-King'schen Verfahren vermessen, um die Korrelation zwischen diesen zu überprüfen. Wie anhand der in Fig. 7 gezeigten Ergebnisse zu entnehmen ist, weisen beide Verfahren eine gute Korrelation auf, was die Verläßlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.

Claims (4)

1. Verfahren zur quantitavien Messung von Phenol oder α-Naphthol, die in einer Probe enthalten sind, um fassend die Umsetzung des Phenols oder des α-Naphthols mit p-Diethylaminoanilin in Gegenwart eines chemischen Oxidationsmittels zur Bildung eines Chinonfarbstoffes und Messung der Farbintensität der resultierenden Lösung, um die Menge des Phenols oder α-Naphthols zu bestimmen.
2. Verfahren zur Messung der Aktivität von Enzymen, die in einer Probe enthalten sind, enthaltend das Inkontaktbringen einer Verbindung, welche ein Phenyl- oder Naphthylradikal enthält mit dem Enzym in der Probe um das Phenyl oder α-Naphthol freizusetzen, Umsetzen des freien Phenols oder α-Naphthols mit p-Diethylaminoanilin in Gegenwart eines chemischen Oxidationsmittels um einen Chinonfarbstoff zu bilden und Messen der Farbintensität der resultierenden Lösung um die Enzymaktivität zu bestimmen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Enzym alkalische Phosphatase ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Oxidationsmittel Kaliumferricyanid, Chloramin T oder Natriummetaperiodat ist.
DE19873781007 1986-04-19 1987-04-16 Verfahren zur messung von phenol und alpha-naphthol, sowie ein verfahren zur messung der aktivitaet von enzymen. Expired - Fee Related DE3781007T2 (de)

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JP8920286A JPS62245961A (ja) 1986-04-19 1986-04-19 酵素活性の測定法
JP8920186A JPS62245948A (ja) 1986-04-19 1986-04-19 フエノ−ル及びα−ナフト−ルの新規な高感度測定法

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