DE2239210B2

DE2239210B2 - Verfahren zur Herstellung von a- Galactosidase, die eine starke a- Galactosidase-Aktivität und eine äußerst geringe Invertase-Aktivität aufweist, und deren Verwendung zur Zerlegung von Raffinose

Info

Publication number: DE2239210B2
Application number: DE2239210A
Authority: DE
Inventors: Akira Kamibayashi; Harumi Kobayashi; Yoshiko Ozawa; Hideo Suzuki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1972-03-30
Filing date: 1972-08-09
Publication date: 1978-03-23
Also published as: PL88470B1; DE2239210A1; FR2177680A1; BE787430A; CA1004617A; FR2177680B1; SU584802A3; ES405697A1; DE2239210C3; US3832284A; CS194667B2

Description

a-Galactosidase ist weithin bekannt als Enzym, welches geeignet ist, zur Zersetzung von Raffinose, die in Zuckerrübenmelasse oder Zuckerrübensaft (im folgenden ebenfalls als Zuckerrübenmelasse bezeichnet) enthalten ist, in Saccharose oder Galactose. Es sind verschiedene Mikroorganismen bekannt, welche an der Gewinnung dieses Enzyms teilhaben.

Diese sind beispielsweise Aerobacter aerogenes und E. coli. Sobald jedoch die Enzyme, welche von diesen Mikroorganismen gewonnen werden, auf die Zuckerrübenmelasse einwirken, besitzt die Invertase, welche mit der a-Galactosidase existiert, eine solche Aktivität, daß nicht nur RafTinose, sondern auch Saccharose, weiche in der Zuckerriibenmelasse vorhanden ist, zersetzt wird. Aufgrund dessen haben die so gewonnenen Enzyme niemals praktische Bedeutung gewonnen.

Aufgrund eingehender Untersuchungen (DT-OS 1642 581) wurde erreicht, daß aus dem Erdboden ein Pilz, Mortierella vinacea var. Raffinose-Verwerter (ATCC 20034) gewonnen wurde, welcher die Erzeugung eines Enzymes mit starker a-Galactosidase-Aktivität und äußerst schwacher Invertase-Aktivität ermöglichte. Das Enzym, welches aus diesem Mikroorganismus gewonnen wird, kann erfolgreich bei der Zersetzung von Raffinose, welche in Zuckerriibenmelasse enthalten ist, zur Anwendung kommen, so daß der Gehalt an Saccharose steigt.

Wenn jedoch das Enzympräparat, welches aus dem genannten Mikroorganismus gewonnen wurde, bei der Zersetzung von Raffinose verwendet wird, ist das Zersetzungsverhältnis stark abhängig vom Brixgrad der verwendeten Zuckerrübenmelasse, d. h. das Zersetzungsverhältnis sinkt in dem Maße, wie der Brixgrad ansteigt. Hieraus folgt, daß bei der Behandlung von Melasse, welche einen hohen Brixgrad aufweist, das Zersetzungsverhältnis durch Vergrößerung der zugesetzten Enzymmenge zur Melasse erhöht werden muß. Allgemein kann bei der Herstellung von Rübenzucker - ausgenommen die Saccharat-Herstellung gesagt werden, daß bei der Behandlung der Zuckerrübenmelasse zur Zersetzung der Raffinose es notwendig ist, daß ein hoher Brixgehalt aufrechterhalten wird, um verschiedene Behandlungsschritte zu erleichtern, beispielsweise das Konzentrierungsverfahren der Zuckerlösung nach der Zersetzung und die Abtrennung des reinen Zuckers von der konzentrierten Zuckerlösung. Um nun das Zersetzungsverhältnis auf einer festgesetzten Höhe zu halten, ist es notwendig, daß eine große Menge eines Enzympräparates zugegeben wird. Die Kosten für das verwendete Enzym sind daher sehr hoch und das Verfahren ist kaum wirtschaftlich durchzuführen. Neben diesem wirtschaftlichen Problem kommt noch hinzu, daß aufgrund der großen zugegebenen Menge von Enzym die Gefahr besteht, daß die Myzel-Verbindung in die zersetzte Zuckerlösung sickert und eine Kristallisation der Saccharose verhindert.

Die Invertase-Aktivität des Enzympräparates, welches aus dem genannten Mikroorganismus gewonnen wurde, ist sehr niedrig. Da jedoch das Enzym in einer derart großen Menge verwendet werden muß, ist der Anteil von Saccharose, der durch Invertase zersetzt wird, nicht mehr vernachlässigbar klein.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, die genannten Nachteile zu beseitigen und aus einem Mikroorganismus ein Enzympräparat zu gewinnen, welches eine

J5 extrem hohe a-Galactosidase-Aktivität besitzt und eine auffallend niedrige Invertase-Aktivität pro Gewichtseinheit des Enzympräparates, so daß eine Zersetzung der Raffinose, welche in Zuckerrübenmelasse enthalten ist, in Galactose und Saccharose unter Verwendung dieses Enzyms stattfindet, wobei der Gehalt an Saccharose anwächst.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Geeignete Absidia-Stämme sind:

(1) Absidia lichtheimi (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 4009)

(2) Absidia lichtheimi (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 4010)

(3) Absidia reflexa van Tieghem (IFO 5874)

(4) Absidia hyalospora (Saito) Lendner (IFO 8082)

(5) Absidia ramosa (Vuillemin) Lendner (IFO 8083)

(6) Absidia regnierie (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 8084)

»IFO« ist die Abkürzung des Institute for Fermentation, Osaka, 54, 4 chome, Jusoo Nishinomachi, Higashi-Yodogawa-ku, Osaka, Japan.
In der Regel verwendet man Glucose als Kohlenstoffquelle. Gleichfalls können natürlich auch Substanzen, welche als Induzierer verwendet werden, als Kohlenstoffquelle bei der Aktivierung des Myzel-Wachstums dienen, obgleich es erwünscht ist, Glucose oder einige andere geeignete Kohlenstoffquellen zu-

b5 sätzlich zu den genannten Induzierern in den Nährboden einzubringen. Die Stickstoffquellen, welche geeignet sind für den Nährboden, enthalten organische Stickstoffquellen, wie Maiswasser, Malz, Malzextrakt,

Malzgrus, Nährhefe, Pepton, Reiskleieextrakt, Fischkuchen und Mais sowie inorganische Stickstoffquellen. Zur Anregung des myzelischen Wachstums ist es von Vorteil, eine anorganische Stickstoffquelle in Verbindung mit einer organischen Stickstoffquelle zu verwenden. Aufgrund seiner Dünnflüssigkeit ist insbesondere Maiswasser leicht zu handhaben. Die Mineralquellen, welche für den Nährboden in Frage kommen, sind allgemein gebräuchlich. Es kann sich hierbei beispielsweise um Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat oder Natriumchlorid handeln. Zusätzlich zu den genannten Züchtungsbeschleunigern kann noch Biotin od. dgl. dem Nährboden zugefügt werden. Dies hängt ganz von den Gegebenheiten ab. Die Zugabe eines derartigen Züchtungsbeschleunigers ist jedoch nicht notwendig, wenn eine organische Stickstoffquelle eingeführt ist. Was die Züchtungsbedingungen betrifft, soll der pH-Wert des Nährbodens im allgemeinen von 4 bis 8, vorzugsweise von 5 bis 7 reichen, um einen Mikroorganismus zu erhalten, dem a-Galactosidase einverleibt ist und der beschleunigt wächst. Die Züchtungstemperatur und die Zeit hängen von der Art des verwendeten Mikroorganismus und der Zusammensetzung des Nährbodens ab. Im allgemeinen genügen jedoch 40 bis 60 Stunden als Züchtungszeit bei einer Züchtungstemperatur von etwa 30°C. Betrachtet man den Mortierella vinacea var. Raffinose-Verwerter, so benötigt dieser 72 Stunden als Züchtungszeit. Es ist ersichtlich, daß die Züchtungszeit bei der Erfindung merklich reduziert ist.

Nachdem die Züchtung des Mikroorganismus unter den obengenannten Bedingungen beendet ist, wird das Myzel des Mikroorganismus durch Filtern von der Züchtungslösung auf bekannte Art und Weise gewonnen. Bei der Zubereitung des Enzyms in flüssiger Form oder in Pulverform wird das gefilterte Myzel mit Wasser gewaschen und durch Mahlen oder Selbstauflösen behandelt.

Das gefilterte Myzel- oder Enzympräparat, welches so gewonnen wird, kann dann direkt in die Zuckerrübenmelasse eingegeben werden, woraufhin die darin enthaltene Raffinose zersetzt wird. Andererseits kann das gefilterte Myzel, welches das Enzym enthält, in einer Säule oder einem Behälter angeordnet werden und die Zuckerrübenmelasse kann fortlaufend hindurchgeführt werden, wobei die Zersetzung der Raffinose erfolgt.

Da die Enzym-Aktivität pro Gew.-Einheit außerordentlich hoch ist, erfolgt eine ausreichende Zersetzung der Raffinose selbst wenn beispielsweise die Zuckerrübenmelasse eine hohe Konzentration von ungefähr 50°Brix aufweist. Infolgedessen kann die Zuckerrübenmelasse, welche von der Rübenzuckerherstellung abgezogen ist, zur Raffinosezersetzung so wie sie ist, beinahe ohne Verdünnung, behandelt werden. Die zersetzte Lösung kann in den Herstellungsprozeß zurückgeführt werden, beinahe ohne Konzentrierung. Das Verfahren ist daher sehr wirtschaftlich.

Die Temperatur zur Zersetzung der obengenannten Raffinose, welche in der Zuckerrübenmelasse enthalten ist, beträgt 20⁰C bis 70°C, bevorzugt 30⁰C bis 6O⁰C. Der pH-Wert der Zuckerrübenmelasse reicht von 4 bis 7, bevorzugt von 5 bis 6.

Die Eigenschaften des Enzympräparates, welches gemäß der Erfindung aus einem Pilz der Absidia-Gattung gewonnen wurde, sind in der Tabelle 1 verglichen mit den Eigenschaften des Enzyms, welches von einem Pilz der Mortierella-Gattung gewonnen wurde.

Tabelle 1

	Mortierella	Absidia
	vinacea	reflexa
	var. Raffi-
	nose-Ver-
	werter
ί -Galactosidase-Aktivität/g	207 · 10"	446 ■ 10⁴
von trockenem Myzel	(Ein	(Einheiten)
	heiten)
Invertase-Aktivität/g von	15 000	6538
trockenem Myzel	(Ein	(Einheiten)
	heiten)

Trockenes Myzel-Gewicht
mit 100 · 10⁴ Einheiten
von ti -Galactosidase

483 (mg) 224 (mg)

Gewicht des Myzels, welches zur Zersetzung
der Raffinose in der Melasse notwendig ist

	Brix	20°	(enthaltend	3,86 g	Mortierella	Absidia
			Raffinose)		vinacea	reflexa
	Brix	30°	(enthaltend	5,8 g	var. Raffi-
JG			Raffinose)		nose-Ver-
	Brix	40°	(enthaltend	7,74 g	werter
			Raffinose)		(g)	(g)
15	Brix	50°	(enthaltend	9,66 g	5,6	2,6
			Raffinose)
	Brix	60°	(enthaltend	11,6 g	8,4	3,9
			Raffinose)
				11,2	5,2
40
				14,0	6,5

				16,8	7,8
45

Wie aus dieser Tabelle 1 hervorgeht, benötigt man 1,150 · 10⁴ Einheiten a-Galactosidase zur effektiven Behandlung von Melasse von 20° Brix, welche 3,86 g so Raffinose enthält. Die a-Galactosidase-Aktivität, welche man von einem Pilz der Mortierella vinacea var. Raffinose-Verwerter-Gattung ableitet, ist bei einem normalen Verfahren 207 · 10⁴ Einheiten, wobei die Zugabe von 5,6 g des Myzels (auf trockener Basis) benötigt wird. Die a-Galactosidase-Aktivität, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielt wird, beträgt 446 · 10⁴ Einheiten, wobei die Zugabe von 2,6 g Myzel ausreicht. Der Unterschied in der Myzelmenge wird augenscheinlich, wenn der Brixgrad bo anwächst. Der Unterschied in der Menge beträgt bei 60° Brix nämlich 9 g.

Aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die «-Galactosidase-Aktivität pro Gew.-Einheit" des Myzels verbessert. Hieraus resultiert im gleichen Verbs hältnis eine Einsparung beim Enzyinverbrauch. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt daher nicht nur eine verbesserte Wirtschaftlichkeit, sondern es wird auch die nachfolgende Behandlung der zersetzten

Lösung erleichtert und eine Verkleinerung des Volumens des Zersetzungstankes erreicht. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus zur Indu.'.ierung von a-Galacte-iidase ist äußerst vorteilhaft aufgrun:! der Verkürzung der Züchtungszeit gegenüber bekannten Züchtungsverfahren.

Im folgenden soll die Erfindung an bevorzugten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Die Saccharide, welche in der Tabelle 2 aufgezählt sind, wurden jedes mit 1 % zu verschiedenen Nährböden zugegeben. Die Nährböden enthielten 1 % Glukose, 1 % Maiswasser, 1 %(NH₄)₂SO₄,0,3% KH₂PO₄, 0,2% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,2% NaCl und 3% CaCO₃. Sporen der Art Absidia reflexa (IFO 5874) wurden dem Nährboden eingeimpft und der Nährboden wird unter Schütteln auf eine Temperatur von 30"C während 72 Stunden gebracht. Der Schüttelapparat hat eine Geschwindigkeit von 140 Umdrehungen pro Minute. Nach Beendigung der Züchtung wurde jede Züchtungslösung gefiltert, um das Myzel zu entfernen. Das entfernte Myzel wurde gründlich mit Wasser gewaschen. Die Myzelia werden dann in einen Mörser gebracht und mit Seesand verrieben, bis die Mischung eine pastenartige Form annimmt. Die Mischung wird dann in destilliertem Wasser, welches das gleiche Volumen besitzt wie die Züchtungslösung, suspendiert. Die Suspension, welche als Enzymlösung erhalten wird, wird auf ihre a-Galactosidase-Aktivität hin geprüft. Die Werte der ö-Galactosidase-Aktivität sind in der Tabelle 2 wiedergegeben. In dieser Tabelle sind Werte der Enzym-Aktivität des Myzels wiedergegeben, welches von 1 ml Züchtungsmediums gewonnen wurde. Die Enzymaktivität der Suspension des Myzels wurde dadurch bestimmt, daß 1 ml Myzel-Suspension einer Mischung von 0,5 ml von 0,06 M Melibiose und 0,5 ml von 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung (pH 5,2) zugegeben wurde, um eine Reaktion bei 40⁰C während 2 Stunden in Gang zu setzen. Danach wird die Reaktionsmischung in einem kochenden Wasserbad erhitzt, und zwar während 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren und es werden zur Reaktionslösung 1 ml von 1,8% Ba(OUT₂ 8H₂O und 1 ml von 2% ZnSO₄ · 7H₂O dazugegeben, um der Lösung Protein zu entziehen. Danach wird die Lösung zentrifugiert und es wird der oben schwimmende Teil des Glucoseanteiles durch das Glukostatverfahren geprüft. Aufgrund der Tatsache, daß der Gehalt an Glukose, der von der Melibiose befrsit wird und die Enzymkonzentration proportional zueinander sind, bis zu 1000 μg Glukose, wurde die Suspension verdünnt, so di>P sie in einen Meßbereich fiel, welcher obiger Proportionalität genügte. Die Menge der freien Glukose wurde mit der Zahl der Verdünnungen multipliziert. Die tf-Galactosidase-Aktivität, welche Ιμ-g Glukose unter den genannten Bedingungen befreit, wird mit einer Einheit angenommen.

Tabelle 2

Kohlehydrate

Einheiten der «-Galactosiduse

Kohlehydrate

Einheiten der
ff-Galactosidase

Rhamnose	0
Glucose	0
Mannose	0
Fructose	0
Galactose	14 900
Maltose	0
Cellobiose	0
Lactose	53 800
Melibiose	14 340
Sucrose	0
Raffi nose	37 240
Gelöste Stärke	0
Dextran	0

Die Ergebnisse dieser Tabelle zeigen klar, daß

Galactose, Melibiose, Raffinose und Lactose sehr wirkungsvoll bei der Gewinnung von a-Galactosidase eingesetzt werden können und daß Lactose das beste Ergebnis bringt.

Beispiel 2

Xylose
Arabinose

Sporen der in der Tabelle 3 aufgezählten Arten wurden in verschiedene Teile eines Nährbodens eingeimpft der 1 % Lactose, 1 % Glucose, 1 % (NH₄)₂SO₄, 1% Maiswasser, 0,3% KH₂PO₄, 0,2% MgSO₄-7 H₂O, 0,2% NaCL und 0,3% CaCO₃ enthielt. Die Züchtung wurde in der gleichen Weise durchgeführt wie in Beispiel 1. Die erhaltenen Züchtungslösungen wurden hinsichtlich der myzelischen cr-Galactosidase-Aktivität und der myzelischen Invertase-Aktivität untersucht. Die Invertase-Aktivität wurde dadurch bestimmt, daß ein ml Myzelsuspension mit 0,5 ml, 0,06 M Sacharose und 0,5 ml von 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH 5,0) zusammengebracht wurde. Die Reaktion ging unter den gleichen Bedingungen vonstatten, welche bei der Bestimmung der c-Galactosidase-Aktivität angewendet wurden. Um das Protein zu beseitigen, wurde die Lösung zentrifugiert und der oben schwimmende

so Anteil des Invertzuckers wurde durch die Somogyi-Nelson-Methode untersucht. Die Invertase-Aktivität, welche 1 μg Invertzucker unter den oben beschriebenen Bedingungen erzeugte, wurde als eine Einheit bezeichnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 dargestellt. Die Invertase-Aktivität, welche in dieser Tabelle wiedergegeben ist, bedeutet die Enzym-Aktivität eines Myzels, welches von 1 ml Züchtungsmedium herrührt.
Das trockene Myzelgewicht wurde dadurch be-

bo stimmt, indem eine Myzelmenge, welche auf 100 ml Nährboden gewachsen ist, bei 105°C getrocknet wurde und dann die getrocknete Myzelmasse gewogen wurde. Die ff-Galactosidase-Aktivitäl pro g von trockenem Myzel ist in der Tabelle 3 unter der Rubrik »c-Galacto-

b5 sidase/g von trockenem Myzel« zu finden. In gleicher Weise ist die Invertase-Aktivi tat in dieser Tabelle unter der Rubrik »Invertase/g von trockenem Myzel« zu finden.

Tabelle 3

Art	Trockenes Gewicht des Myzels in 100 ml (g)	Einheiten dern-Galaclo- sidase	u-Galaclo- sidase/g von trockenem Myzel	Einheiten der Invertase	Invertase/g des trockenen Myzels
Absidia rellexa (IFO 5874)	1,3	58 000	446 · 10"	85	6 538
Absidia regnierie (IFO 8084)	1,3	52 000	400 ■ 10"	84	6461
Absidia hyalospora (IFO 8082)	1,35	65 000	481 · 10"	87	6 444
Absidia lichtheimi (IFO 4010)	1,40	79 000	564 · 10⁴	92	6571
Absidia lichtheimi (IFO 4009)	1,40	72 000	514 · 10"	90	6 428
Absidia ramosa (IFO 8083)	1,30	39 000	300 ■ 10"	84	6 462
Mortierella vinacea var. Ra(Tinose utilizer (ATCC 20034)	1,40	29 000	207 ■ 10"	210	15 000

Zum Vergleich wurden Sporen des Mortierella vinacea var. RafTinose-Verwerters in der gleichen Weise gezüchtet und die erhaltene Züchtungslösung wurde untersucht. Die gewonnenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle 3 wiedergegeben. Es ergibt sich deutlich, daß die Arten der Absidia-Gattung höhere Werte der a-Galaclosidase-Aktivita't und geringere Werte von Invertase-Aktivität besitzen. Weiterhin ergibt sich, daß die ff-Galactosidase-Aktivität, welche ein Gramm trokkenes Myzel besitzt, höher ist bei den Arten der Absidia-Gattung als bei dem Mortierella vinacea, während die Invertase-Aklivität bedeutend niedriger liegt.

Beispiel 3

In 101 Wasser wurden 120g Lactose, 120g Glucose, 120 g (NH₄),SO₄, 120 g Maiswasser, 36 g KH₂PO₄, 24 g MgSO₄ · 7 H₂O, 24 g NaCI und 36 g CaCO₃ gelöst. Die Lösung wurde in einen Porzellan-Gärbottich eingebracht und bei 120'C während 30 Minuten sterilisiert. Dann wurde die Lösung auf 30"C abgekühlt und mit sterilisiertem destilliertem Wasser verdünnt, bis auf ein Gesamtvolumen von 12 Litern. Die Art des Absidia reflexa IFO 5874 wurde in der Lösung unter Schütteln bei 300 Umdrehungen/Min, gezüchtet, wobei Luft mit einer Geschwindigkeit von 3 Litern/M in. zugeführt wurde. Nach Verstreichen der Züchtungszeit wurden die Proben auf ihre a-Galactosidase-Aktivität und auf ihren pH-Wert hin untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 wiedergegeben.

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß 42 Stunden

als Züchtungszeit genügen für die Art des Absidia reflexa IFO 5874. Am Ende dieser 42 Stunden betrug das Gewicht des trockenen Myzels, welches von 100 ml

2ϊ Nährboden gewonnen wurde, 1,30 g.

Beispiel 4

Die Art des Absidia hyalospora IFO 8082 wurde jo unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 3 gezüchtet. Es wurde das Verhältnis der Züchtungszeit und des gewonnenen »-Galactosidase-Gehaltes untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 wiedergegeben.

Tabelle 5

Züchtungszeit

pH der Zuchtlösung

Einheiten der ff-Galactosidasc

0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
57

5,9

5,8

5,85

5,50

5,20

6,40

6,50

6,60

6,00

5,50

0 0 0 0

134

1 240

4 030

19 360

51360

68 500

69 000

Tabelle 4

Züchtungszeil

20
24
28
32
36
40
42
44

pll der Zuchllösung

6,1
6,1
6,6
6,3
6,1
5,8
5,8
5,8
5.8

Hinhcitcn der
ff-GuliiclQsiüusc

9 800
19 900
31 200
45 600
54 500
59 300

62 700

63 000

Die Tabelle zeigt, daß 54 Stunden für die Züchtungszeit dieser Art genügen. Am Ende der 54 Stunden Züchtungszeit betrug das Gewicht des trockenen Myzels, welches von 100 ml Nährmedium gewonnen wurde, 1,35 g

Beispiel 5

Eine nach dem Steffen-Verfahren gewonnene Melasse wurde mit Wasser auf 3O⁰BHx verdünnt und durch Zugabe von Schwefelsäure wurde ein pH-Wert von 5,2 eingestellt. In 200 g dieser Lösung (enthaltend 5,8 g Raffinose) wurde das Myzel des Absidia reflexa IFO 5874 (Trockengewicht von 3,9 g und 17400 000 Einheiten a-Galactosidasc), welches im Beispiel 2 erhalten

wurde, zugegeben und es wurde eine Reaktion bei 50"C während 2 Stunden und 30 Min. unter Schütteln durchgeführt. Am Ende der Reaktion wurde das Myzel abgefiltert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden miteinander verbunden. Ein vorgeschriebenes Volumen von dieser Mischung wurde mittels Papierchromatographie im Hinblick auf Raffinose-Rückstände und im Hinblick auf den angewachsenen Saccharose-Gehalt untersucht.

Im einzelnen ging man so vor, daß die Proben in eine Lösung, welche aus 6 Teilen n-Butanol, 4 Teilen Pyridin und 3 Teilen Wasser bestand, eingebracht wurden. Die Raffinosezone und die Saccharosezone, welche sich anschließend bildeten, wurden getrennt und mit Wasser ausgewaschen. Die Untersuchung wurde mit dem Zystein-Karbazol-Verfahren durchgeführt. Es wurde gefunden, daß 78% des ursprünglichen Raffinose-Gehaltes zersetzt waren und daß der Saccharose-Gehalt um 2,41 g angewachsen war.

Beispiel 6

In 20 g Melasse mit 30° Brix, welche in der gleichen Weise zubereitet worden war wie im Beispiel 5, wurde das Myzel des Absidia reilexa IFO 5874 (17 400 000 Einheiten a-Galactosidase-Aktivität) eingegeben, und es wurde in der gleichen Weise eine Reaktion durchgeführt wie im Beispiel 5. Nach der Reaktion wurde das Myzel mit Wasser gewaschen und das gewaschene Myzel wurde in eine neue verdünnte Melasse eingebracht und zur Reaktion gebracht. Auf diese Art und Weise wurde das Myzel wiederholt verwendet, und zwar insgesamt fünfmal. Die Zersetzungslösungen, welche bei all diesen Behandlungen gewonnen wurden, wurden hinsichtlich der Raffinose-Rückstände und des angewachsenen Saccharose-Gehaltes untersucht. Die Resultate sind in der Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6

Nach Ver- suchs-Nr.	Saccharose zuwachs	Zersetzung der RafTinose	Verbliebene a-Galacto- siciase- Aktivität
	(g)	(%)	(%)
1 2 3	2,45 2,58 2,41	78,5 79,0 77,8	90 88 86
	Tabelle 7

Nach Vcr-	Saccharose	Zersetzung	Verbliebene
suchs-Nr.	zuwachs	tier Raffinosc	ff-Galucto-
			sidase-
			Aktivität
	(g)	(%)	(%)

2,37
2,41

III

76,0

75,1

Beispiel 7

86
84

Es wurde eine Steffen-Melasse auf 50° Brix verdünnt und durch Schwefelsäure wurde ein pH-Wert von 5,2

r> eingestellt. Zu 200 g dieser Lösung, welche 9,66 g RafTinose enthielt, wurde das Myzel des Absidia reflexa IFO 5874 (Trockengewicht 6,5 g und 28 980000 Einheiten tr-Galactosidase), welches im Beispiel 2 erhalten wurde, hinzugegeben. Die Reaktion wurde bei 50"C während 20Std. und 30 Min. durchgeführt. Am Ende der Reaktion wurde in der Zersetzungslösung der Zersetzungsgrad der Raffinose und der Zuwachs an Saccharosegehalt untersucht. Das Zersetzungsverhältnis der Raffinose betrug 56,2% und

2) der Zuwachs an Saccharose betrug 3,03 g.

Beispiel 8

100 ml Melasse, welche 3,87 g Raffinose enthielt und auf 50° Brix verdünnt war, sowie einen ph-Wert

ι» von 5,2 aufwies, wurde das Myzel des Absidia reflexa IFO 5874 (Trockengewicht 1,734 g und 7 740000 Einheiten a-Galactosidase-Aktivität) zugegeben. Die Reaktion wurde während 10 Stunden bei 50⁰C durchgeführt. Nach Beendigung der Zersetzung wurde die

J^r) Myzel-Komponente, welche vom Myzel entwickelt wurde, bei Wellenlängen von 280 ηιμ untersucht. Die Zersetzungslösung wurde gefiltert und das Filtrat mit Wasser verdünnt, wobei das ursprüngliche Volumen lOOOfach vergrößert wurde. Es wurde die optische Dichte bei Wellenlängen von 280 ιτιμ und 260 πιμ gemessen. Getrennt davon wurde in die gleiche Melasse das Myzel eines Mortierella vinacea var. Raffinose-Verwerters (Trockengewicht 3,730 g und 7740000 Einheiten a-Galactosidase-Aktivität) eingebracht. Die

4> Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben durchgeführt. Die Zersetzungslösung wurde im Hinblick auf ihre optische Dichte bei Wellenlängen von 280 m;¹ und 260 πιμ untersucht. Zur Kontrolle wurde die Melasse in ihrer unveränderten Form hin-

^r)0 sichtlich ihrer optischen Dichte ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 wiedergegeben.

Optische Dichte bei 260 μ
Optische Dichte bei 280 μ

Die Tabelle zeigt, daß bei Anwendung der zwei Arten des Myzels, welche die gleiche a-Galactosidase- η^γ> Aktivität besitzen, bei der Zersetzung von Raffinose die Menge der ausgeschiedenen Myzel-Komponente beim Absidia reflexa IFO 5874 geringer war.

Kontrolle	Mortierella	Absidia reflexa
	vinacea var.	IFO 5874
	RafTinose-
	Verwertcr
0,414	0,5 !5	0,430
0,302	0,348	0,310

Beispiel 9

Das Myzel des Absidia reflexa IFO 5874 (17400000 Einheiten cr-Galactosidase-Aktivität), welches im Beispiel 2 erhalten wurde, wurde zu 200 g

Anteilen eines Rübensaftes (jeder enthielt 5,8 g Raffinose) zugegeben. Der Rübensaft war auf 30°Brix verdünnt und besaß einen pH-Wert von 5,2. Die Reaktion wurde während 3 Stunden durchgeführt und bei Reaktionstemperaluren, welche in der Tabelle 8 dargestellt sind. Am Ende der Reaktion wurde das Zersetzungsverhältnis der Raffinose untersucht. Die Resultate sind in der Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8	Zersetzungsverhältnis
Reaktions	der Raffinose
temperatur	(%)
CC)	43,1
20	75,7
30	78,5
40	80,2
50	79,0
60	55,6
70

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß, wenn die Reaktionstemperatur über 30"C liegt, das Zerseizungsverhältnis der Raffinose spürbar ansteigt, jedoch wenn mehr als 70¹C angewendet werden, das Zersetzungsverhältnis wieder abnimmt, da das Enzym inaktiviert ist.

Beispiel 10

Das Myzel des Absidia reflexa IFO 5874 (17 400 000 Einheiten a-Galactosidase-Aktivität)

wurde zu Anteilen eines Rübensaftes, welche auf 30°Brix verdünnt waren, hinzugegeben. Unter Verwendung einer Mcllvaime Pufferlösung wurden pH-Werte, welche in der Tabelle 9 dargestellt sind, eingestellt und es wurde die Reaktion während 3 Stunden bei 50¹C durchgeführt. Nach Beendigung der Zersetzung wurde die Zersetzungslösung hinsichtlich des Zersetzungsverhältnisses der Raffinose untersucht.

Tabelle	9	Zersetzungsverhiillnis
pH	der RafTinose
	11,5
3	68,2
4	80,2
5	77,4
6	39,2
7	19,0
8

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß bei pH-Werten von 4 bis 8 bessere Resultate erzielt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von ff-Galactosidase, die eine starke ar-Galactosidase-Aktivität und eine äußerst geringe Invertaie-Aktivität aufweist, durch aerobes Züchten eines Pilzes in einem Nährmedium, das eine Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralsalzquelle sowie einen entsprechenden Enzym-Induzierer enthält, und durch Gewinnen der ff-Galactosidase in Form des Myzels oder eines

hiervon erhaltenen a-Galactosidase-Präparates, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilz einen Pilz der Gattung Absidia und als Induzierer des Enzyms wenigstens einen Stoff aus der Gruppe Lactose, Melibiose, Raffinose und Galactose in einer Menge von 0,5 bis 1,5 Gew.-%, bezogen auf das Zuchtmedium, einsetzt.

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen ir-Galactosidase zur Zerlegung von Raffinose in einer Zuckerrüben-Melasse in Galactose und Saccharose.