DE3013627A1 - Verfahren zur gewinnung von cellulaseenzymen aus thielavia terrestris - Google Patents
Verfahren zur gewinnung von cellulaseenzymen aus thielavia terrestrisInfo
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Description
Dipl. Ing. Hans-Jürgem Müller 3013 3 2/
Dr. TVt. nat Thomas Bereedt - ^ ·
Dr.-Ing. Hans Leyh
Dr. Be/iia/Kä
SRI Ixiternational
Menlo Park, Californien, VStA
Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzymen aus Thielavia terrestris
030042/0860
301?"27
Beschreibung
Es wurde gefunden, daß die Cellulase-Aktivitäten der gemischten
Enzyme, die aus Thielavia terrestris gemäß der US-PS 4 081 328 gewonnen wird, zur Erhöhung der Aktivität gereinigt und/oder
aufgetrennt werden können. Überraschenderweise wurde gefunden, daß im Gegensatz eu früheren Berichten über andere, Cellulase
erzeugende Organismen, wobei Glyzerin eine Inhibitorwirkung haben soll, bei der Verwendung von Thielavia terrestris als Cellulase
erzeugender Organismus keine derartigen Ergebnisse gefunden werden. Vielmehr wurde gefunden, daß bei Verwendung dieses
Organismus in Verbindung mit Glyzerin es möglich wird, die Ausbeute von ß-Glucosidase um das etwa 5-fache zu erhöhen, während
die Erzeugung von C^/C^Cellulase nicht abnimmt.
Die folgenden Literaturstellen behandeln die Unterdrückung der Cellulase-Erzeugung durch Glyzerin oder Glucose bei Verwendung
anderer Organismen als Thielavia terrestris:
Mandels, 1975, Growth and Cellulase Production by Tricoderma,
Seiten 81-109, in Bailey et al, Symposium on the Enzymatic Hydrolysis of Cellulose, The Finnish National Fund for Research
and Development (SITRA), Helsinki, Finnland,
Nisizawa et al, 1972, Catabolite Repression of Cellulase Fermentation in Trichoderma Viride, J.Biol.Chem. Bd. 71,
Seiten 999-1007.
Hontenecourt et al, 1977, Preparation of Mutants of Trichodermia reisei with Enhanced Cellulase Production,
Appl. and Env. Microbiol., Bd. 34, Nr. 6, Seiten 777-782.
Diese letzte Untersuchung zeigte,daß 5 % GlyzBiindie Cellulase-Produktion
unterdrückt und ebenfalls die Menge von zusätzlichem
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ORIGfNAL
- 4 - 301:· 27
Zellprotein vermindert, die bezüglich zu derjenigen Menge synthetisiert
wird, welche bei Verwendung -von Cellulose als einzige Kohlenstoffquelle abgeschieden wird.
Im Gegensatz zu der Ergebnissen der Untersuchungen des Standes der Technik gemäß obiger Zusammenstellung wurde gefunden, daß
bei der Zugabe von Glyzerin zu einem Medium, das Thielavia terrestris enthält und verwendet wird, um Cellulasen aus diesen
Organismen herzustellen, überraschenderweise eine Erhöhung der Enzymproduktion erzielt wird. Es wurde weiterhin gefunden, daß
die Produktion von C^- und Cx-Enzymaktivitäten durch Zugabe des
Glyzerins nicht beeinträchtigt wird, sondern daß die Produktion von ß-Glucosidase-Wirkungen um etwa das 5-fache erhöht werden
konnte. Weiterhin wurde durch Gel-Filtration als Abtrennungsverfahren gefunden, daß in Gegenwart von Glyzerin die Zusammensetzung
der ß-Glucosidasen einen Unterschied zu derjenigen aufweist,
die in dem Standard-Medium als solchem gefunden wird. Somit wurde der Mengenanteil der wärmestabileren ß-Glucosidaen-Enzyme erhöht
bezüglich der weniger wärmestabilen Enzyme, was ein wichtiges praktisches Ergebnis ist, da die Wärmestabilität eine äußerst
erwünschte Eigenschaft ist, um die Ausbeute von Glucose zu erhöhen,
die aus Cellulose-Materialien hergestellt werden, wenn bei höheren Temperaturen gearbeitet wird. Außerdem ermöglicht
die WärmeStabilität der Cellulasen, daß die enzymatisch^ Aktivität,
die diesen Cellulasen zugeschrieben werden kann, durch erhitzen des Systems weitergeführt werden kann, während gleichzeitig
ein Abbau der relativ wärmeempfindlichen unerwünschten Enzyme, die vorhanden sein können, bewirkt wird. Beispielhafte unerwünschte
Enzyme, die in dieser Weise eliminiert werden können, während die wertvollen Cellulasen erhalten bleiben, sind solche, die unerwünschte.
Wirkungen verursachen, wie die Proteinhydrolyse, verschiedene Desaminierungen, Hydrolyse von Lipiden und dergleichen.
Hinsichtlich der Menge von Glyzerin, die zu dem Medium zugesetzt werden kann, damit positive und günstige Wirkungen bei der Erhö-
030042/0860
ORKfKNAL INSPECTED
ORKfKNAL INSPECTED
301?" 27
hung der Ausbeute der ß-Glucosidasen auftreten, wurde gefunden,
daß eine so geringe Menge wie etwa 0,5 Gew.-Ji wirksam ist, während
Mengen bis zu etwa 5 Gew.-J6 vorteilhaft angewendet werden
können. Dieses Phänomen ist eine einwandfrei überraschende Entdeckung, da es an sich aus dem Stand der Technik bekannt war,
daß die Herstellung von cellulolytisehen Enzymen von z.B.
Trichoderma der Catabolit durch Glucose und Glyzerin unterdrückt wird.
Um diesen überraschenden Effekt von Glucose und Glyzerin auf die Produktion von cellulolytischen Enzymen mit Thielavia terrestris
zu zeigen, wurden eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt, wobei verschiedene Zusammensetzungen des Nährmediums gemäß folgender
Tabelle verwendet wurden:
A) Zusammensetzung des Nährmediums
Nr. Grundmedium Zellulose- Pepton Mais- GIu- Cello- Glyzerin
pulver 105 maisch- cose biose flüssige.
1 100 ml 1g 2 g 2 g
2 100 ml 1g 0,5 g 0,5 g
3 100 ml 1g 0,1 g 0,1 g
4 100 ml 1g 0,5 g 0,5 g 5g
5 100 ml 1g 0,5 g 0,5 g 5g
6. 100 ml 1g 0,5 g 0,5 g 5 g
* Grundmedium: KH2PO4 6,8 g/l, (NH4J2SO4 1,3 g/l, MgCO4-7H2O
0,5 g/l, CaCl2 0,2 g/l, Spureneleraentlösung 2 ml/1.
B) Kultivierung:
Es wurde eine Vorkultur dadurch hergestellt, daß eine kleine Menge Myzel aus einer Schrjfekittur in einen Kolben von 250cbP Inhalt,
der 100 cm3 desMsdiums Nr. 2 enfcielt, überführt wurde. Der
Kolben wurde 48 Stunden auf 48 0C auf einem Schüttelgerät gehalten.
Die Hauptkultur wurde dadurch begonnen, daß 2 cm des Mediums aus der Vorkultur in einen Kolben von 250 cnr Inhalt x
überführt wurden, welcher 100 cm5 des Mediums enthielt. Die
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ORIGINAL INSPECTED
3Cn?r27
Kultivierung wurde auf einer Schüttelvorrichtung bei 48 0C
durchgeführt.
C) Ergebnisse:
Wie in den Figuren wiedergegeben, wird die Erzeugung von cellulolytischen
Enzymen aus Thielavia terrestris durch Glucose in ähnlicher Weise unterdrückt, wie dies bei Trichoderma der Fall
ist. Glyzerin hatte Jedoch keine Wirkung auf die Erzeugung von C1-Aktivität (Aktivität des Filterpapiers) und Cx-Aktivität.
Thielavia terrestris erzeugte etwa die 5-fache Menge von ß-Glu-Gosidase
im Medium, das 5 Gew.-% Glyzerin enthielt, gegenüber der Erzeugung von dem Enzym im Standardmedium Nr. 2 (vgl. US-PS
4 081 328). Es wurde ebenfalls gefunden, daß bei der Gel-Filtration Unterschiede der Zusammensetzung der ß-Glucosidasen
auftreten, die aus dem Standardmedium erhalten werden, verglichen mit dem das Glyzerin enthaltenden Medium.
Die optimale Temperatur für eine Cellulase-Aktivität wurde bei etwa 60 0C liegend bestimmt. Diese Aktivitäten können mittels
der folgenden biologischen Teste gemessen werden. Die thermostabilen Cellulasen, die durch Thielavia terrestris erzeugt
werden, bringen 10 bis 12 Einheiten Filterpapier-Aktivität
sowie 25 bis 30 Einheiten Aryl-ß-Glucosidase und 80 bis 90
Einheiten CMC-ai
sigkeit hervor.
sigkeit hervor.
Einheiten CMC-ase in 1 cm Zentrifugenprodukt der Kulturflüs-
03G042/0860
ORiGiMAL
"■ /
Enzymtest
1. Filterpapier-Aktivität
Es wurde ein Streifen von 100 mg von Filterpapier Whatman Nr. 1 (1 χ 12 cm) als Substrat verwendet.
Das Testgemisch im Reagenzglas (16 χ 150 mm) bestand
aus 1 cur 0,5 m Acetatpuffer von pH 5,0, einem Streifen Filterpapier, der wie ein Blasebalg gefaltet
war und 1 cm verdünnter Enzymlösung. Das Gemisch wurde eine Stunde im Wasserbad von 60°C gehalten. Nach der
Inkubierung wurden 2 cnr Dinitrosalicylsäure als Reagenz zum Testgemisch zugesetzt und die gebildeten
reduzierenden Zucker wurden nach dem DliS-Verfahren bestimmt
und als Glucoseäquivalent berechnet. Eine Einheit
Filterpapier-Aktivität ist definiert als diejenige Enzymmenge, die 1 mg Glucoseäquivalent an
reduzierenden Zuckern unter den genannten Bedingungen erzeugt.
2. CliC-ase
Das Testgemisch bestand aus 1 cnr einprozentiger Carboxymethylcellulose (SIGMA, Produkt Hr. C-8758),
die 0,5 m Acetatpuffer von pH 5,0 und 1 cur verdünnter Enzymlösung enthielt;. Das Gemisch wurde 30 Minuten
auf 600C gehalten. Nach der Inkubierung wurden 2 cnr Dinitrosalicylsäure-Reagenz dem Gemisch zugegeben und
die gebildeten reduzierenden Zucker wurden durch das DIJS-Verfahren gemessen und als Glucoseäquivalent berechnet.
Eine Einheit CI-iC-ase ist als diejenige Enzymmenge definiert, die 1 mg Glucoseäquivalent reduzierende
Zucker unter den genannten Bedingungen erzeugt.
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ORIGINAL INSPECTED
3013C27
3. Aryl-(S-glucosidase
Als Substrat wurde o-Nitrophenyl-^ -D-glucopyranosid.
verwendet. Das Testgemisch enthielt 0,5 cm eine Lösung
von 10 ι Hol o-Nitrophenyl- } -D-glucopyranosid'.·, 0,5 cnr
0,5 m Acetatpuffer von pH 5,0 und 1 cm verdünnte Enzymlösung. Nach dem Inkubieren 30 Minuten bei 600C wurden
2 cm 0,2 m Natriumcarbonatlösung zum Gemisch zugefügt.
Das freigesetzte o-Kitrophenol wurde durch Absorbtion
bei 410 nm gemessen. Eine Einheit Aryl-^-glucosidase
ist definiert als diejenige Enzymmenge, die 1 u-mol
o-Nitrophenol unter den genannten Bedingungen erzeugt.
Bei Anwendung dieser Tests auf die folgenden Fraktionsver fahren wurden die C- und Cv- und ^--Glucosidasen von-
1 X
einander getrennt nach dem folgenden Schema:
einander getrennt nach dem folgenden Schema:
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INSPECTED
— G —
KuIturfiltrat
Ausfällung mit bei 90 % Sättigung
Fällung
Lösen in Wasser, Entsalzung
durch Gelfiltration auf Bio-Gel P-2
entsalzte Lösung
auf Säule aus DEAE-Bio-Gel A eim pH 5,0
l·
nicht absorbierte Stoffe
auf Ci,-Bio-Gel A
beim pH 5,0 absorbierte Stoffe
eluiert mit iiaCl
Eluat
absorbierte
nicht absor-Stoffe bierte Stoffe
eluiert mit ^Gel-Filtration
IJluate
NaCl
auf Bio-Gel P-150 V GeIfiltrati on
auf Bio-Gel P-150
(3 Fraktionen)
Fraktion mit
- und Cv-Aktivität
Gelfiltration
auf Bio-Gel P 150
auf Bio-Gel P 150
Fraktionen ß-Glucosidase,
mit
und C
Fraktionen ß-Glucosidase, Fraktionen mit C^ und Cx
0300A2/0860
ORlGJNAL
3 013 e 2 7
Wie in Fig. 1 angegeben, war die Abtrennung dieser Enzyme bis zu einem Grad erfolgreich, das 2 homogene β-Glucosidasen
voneinander isoliert werden konnten.
Fig. 1 erläutert die Wirkung des pH-Werts auf die Aktivität von 2· ß-Glucosidasen.
Unter Anwendung des genannten FraktionierSchemas und
unter Verwendung van. Bio-Gel F-150 wurden die ß-Glucosidasen
in zwei homogene Fraktionen aufgetrennt durch Eluieren mit 0,5 m Natriumacetatpuffer vom pH 5,0. Die Strömungsgeschwindigkeit
betrug 27 cnr/h. Es wurden Fraktionen von
-ζ.
7 cm gesammelt.
7 cm gesammelt.
Die Werte bezüglich des überraschenden Befundes, daß im Gegensatz zu früheren Berichten mit anderen Organismen,
die Cellulase erzeugen, Glycerin, 'bei Thielavia terrestris
in der Lage ist, die Ausbeute von (i-Glucosidase enzym etwa 5-fach zu erhöhen, anstatt dessea Produktion zu inhibieren,
während die Produktion vom C^/Cy-Enzym unverändert ist, sind
in den Figuren 2, 3, 4 und 5 wiedergegeben.
Die Zusammensetzung der ß-Glucosidasen wurde ebenfalls
geändert in Gegenwart von Glycerin gegenüber derjenigen, die beim Standardmedium gefunden wurde (Fig. 4). Das
wärmestabilere der ß-Glucosidaseenzyme(Fig.5) wurde in
erhöhter Ausbeute gewonnen bezüglich der weniger wärmestabilen Enzyme, was ein wesentliches praktisches Ergebnis
ist, da die WärmeStabilität eine wichtige Eigenschaft
ist, um die Ausbeutung von Glucose auf Cellulosematerial zu erhöhen.
Die Untersuchung der Wirkung von Glycerinkonzentrationen in den Medien auf die Ausbeuten der ß-Glucosidasen zeigt,
daß nur 0,5 Gew.% Glycerin bereits eine positive Wirkung hat.
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ORIGINAL INSPECTED
3 01 3 ί 2
Fig. 2 erläutert die pH-Wert-Änderungen und die C^-
Aktivität mit der Kultivierungsdauer bei Verwendung unterschiedlicher Medien. Bei Vervrendung des Mediums
von Beispiel Nr. 1 sind die Wirkungen auf die Cj-Aktivität
und die pH-Wert-Änderungen mit der Kultivierungszeit aufgezeichnet. Diese Werte zeigen, daß
die Glucose die Produktion von Cellulaseenzymen unterdrückte,aber das Glycerin keine Wirkung auf die
CL- oder Cx-Aktivitäten hatte, obwohl es die Ausbeute von β-Glucosidase erhöhte.
Fig. 3 zeigt die Wirkung von anderen Medien auf (^-Glucosidase und C-^-Aktivitäten.
Fig. 4 gibt das Ergebnis der Gelfiltration als Trennmethode von (I-Glue ο si da s en aus einem Standardmedium
und einem Glycerin enhaltenen Medium wieder, wobei deutlich wird, wie die Ausbeuten der beiden verschiedenen
£>-Glue ο si das en durch Zugabe von Glycerin zum
Standardmedium beeinflußt werden. Die Fraktion von IJr. 80 wird durch Zugabe von Glycerin erhöht, welche
die wärmestabilere der beiden gereinigten f^-Glucosidasen
ist.
Fig. 5, zeigt, daß die Produktion der stabileren
jl>-Gluoosidase begünstigt wird, wenn Glycerin zum
Medium zugesetzt wird.
Fig. 6 zeigt die Wirkung der Glycerinkonzentration auf die Erzeugung von ß-Glucosidasen. Es ist offensichtlich
daß die Ausbeuten dramatisch erhöht werden, wenn Glycerin zum Standardmedium zugesetzt wird. Selbst
eine Menge von nur etwa 0,5 Gew.% Glycerin hat eine
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ORIGINAL INSPECTED .
3Q13F27
Positive Wirkung auf die Enzymausbeute aus Cellulose als Substrat.
Die Wichtigkeit des Vorhandenseins leicht zugänglicher Glucosequellen wurde bereits hier und in der US-PS
4 081 328 dargestellt.
Durch die neuen Verfahrensweisen gemäß der Erfindung werden erheblich größere Hengen Anteile |>-Glucosidase
aus Thielavia terrestris erzeugt werden können. Durch die neuen Trennverfahren wird darüberhinaus die Reinigung
und/oder Auftrennung der ^-Glucosidasen ermöglicht. Die abgetrennte ß-Glucosidase kann nun in
wirksamer und wirtschaftlicher Weise zur Überführung von Cellulosematerialien, z. 3. teilweise umgewandelter
Cellulosematerialien,eingesetzt werden,was zu erhöhter
Glucoseproduktion führt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die (b -Glucosidase auf einem fixierten
Träger verwendet oder in eine Polymermatrix eingeschlossen sein in einer Lage, daß konzentrierte Ströme der
cellulosehaltigen Rohmaterialien aufgenommen werden, um wirksam in die erwünschte Glucose überführt zu
werden.
Die Erfindung wurde hinsichtlich einer bevorzugten Ausführungsform
beschrieben, wobei jedoch anzumerken ist, daß Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Erfindungsgedankens
liegen.
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ORiGiNAL INSPECTED
-/13-
Leerseite
Claims (5)
- Patentanwälte
Dipl. Ing. Hans-Jürgen Müller
Dr. TVt. nat Thomas Berendt 3013627Dr.-Ing. Hane LeyhLudle-Grahn-Stroe· 38 D 6 Mdndien 80Patentansprüche;/ νί. 1. Verfahren zur Gewinnung von Cjillulase-Enzymen durch Kultivieren;r .C( von Thielavia terrestris auf einem üblichen Kulturmedium und Iso-- i/γ J lieren der Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß man etwaij~ ί 0,5 bis etwa 5 Gew.% Glyzerin zum Nährmedium zusetzt. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in erhöhter Ausbeute gebildete Cellulase-Enzym die thermisch stabilere ß-Glucosidase ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebildeten Enzyme dadurch reinigt und trennt, daß man1. das Kulturmedium filtriert,2. die Enzyme mit einer gesättigten Amaoniumsulfat-Lösung ausfällt,3. durch Gel-Filtration die Enzyme solubilisiert und anschließend entsalzt,
- 4. das erhaltene Produkt mit Natriumchlorid-Lösung eluiert,
- 5. die Eluate weiterhin einer erneuten Gel-Filtration unterwirft und die verschiedenen Fraktionen nach ß-Glucosidase,C-j-und Cx-Enzymaktivität auftrennt.4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgetrennte ß-Glucosidase weiter zur Überführung von Cellulose-Material in Glucose verwendet, wobei ein Strom des Cellulose-Materials über die ß-Glucosidase, die sich auf einem fixierten Träger befindet oder in eine Polymer-Matrix eingeschlossen ist, geleitet wird.030042/0860
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| US06/028,500 US4243752A (en) | 1979-04-09 | 1979-04-09 | Production of increased yields of cellulolytic enzymes from Thielavia terrestris and separating methods therefor |
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|---|---|---|---|
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: MUELLER, H., DIPL.-ING., PAT.-ANW., 8000 MUENCHEN |
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