DE2208451A1

DE2208451A1 - Verfahren zum Zuchten von Sauerteig bakterien

Info

Publication number: DE2208451A1
Application number: DE19722208451
Authority: DE
Inventors: Leo Kline; Takashi F Sugihara
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1971-02-26
Filing date: 1972-02-23
Publication date: 1972-09-14
Also published as: GB1362729A; FR2126452A1; CA973425A; JPS5618168B2; JPS5173153A; DE2228119A1; JPS5739734B2; JPS5858070B1; IT989502B; DK137901B; US3891773A; DK137901C; JPS5182748A; FR2126452B1

Description

eingegangen

ρ ₂₂ 08

Leo Kline und Takashi F. Sugihara

Verfahren zum Züchten von Sauerteigbakterien

Die Erfindung bezieht sich auf Bakterien und deren Kulturen, die sich insbesondere zur Herstellung von französischem Sauerteigbrot eignen. Dabei handelt es sich um bisher unbekannte Bakterienarten, die erstmalig isoliert worden sind. In den beschriebenen Versuchen, in denen Ausführungsbeispiele erläutert sind, sind die Mengenanteile, wenn nichts anderes gesagt ist, in Gewichtsprozenten angegeben.

Französisches Sauerteigbrot ist eine spezielle Brotart, die durch ihre einzigartigen Qualitäten, einschliesslich Knusperigkeit und dem ansprechenden sauren Geschmack, bevorzugt wird. Dieses Brot wird zur Zeit lediglich im Gebiet der Bucht von San Francisco hergestellt und wird von hier ausgeführt.

Wie für jeden Sauerteig wird zunächst ein Ausgangs- oder Mutterschwamm hergestellt, der nicht nur die Quelle der Gärungsund Säuerungskräfte ist, sondern auch die Grundsubstanz zum immerwährenden Fortführen des Verfahrens liefert. In der Praxis wird der Schwamm durchschnittlich alle 8 Stunden, oder mindestens bis 3-mal am Tage, 7 Tage in der Woche wieder aufgebaut. Das Verfahren wurde in dieser Weise seit 100 Jahren ausgeführt und der Ursprung des Ausgangeschwammes ist unbekannt.

Der genannte Schwamm wird aus einem bereits fertigen Schwamm, Wasser und einem sehr hochprozentigen Klebermehl (beispielsweise einem Mehl, das etwa 14 % Eiweiss enthält) hergestellt. Diese Bestandteile werden üblicherweise in den folgenden Mengenanteilen verwendet:

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50-100 Teile des bereits vorhandenen Schwämmes,

100 Teile Mehl (stark kleberhaltig), 45-52 Teile Wasser.

Nach dem Mischen wird der Schwamm (entwickelt) 7-8 Stunden bei etwa 25° bis 27° C gehalten. Dann ist er für die Herstellung des Teiges fertig. Der pH-Wert des Schwammes, wenn er hergestellt wird, liegt bei 4,4 - 4,5, während der End-pH-Wert 5,8 - 3,9 beträgt.

Ein wesentliches Merkmal bei der Herstellung dieses französischen Sauerteigbrotes ist der mikrobiologische Paktor. Es war allgemein bekannt, dass eine mikrobiologische Wirkung vorhanden und für die Gärung und die Säuerung verantwortlich ist. Die Natur dieses Organismus oder dieser Organismen war jedoch unbekannt. Es wurde nun gefunden, dass zwei verschiedene Organismen wirksam sind, die beide isoliert werden konnten.

Einer der Organismen ist eine Hefe, die für die Gärung verantwortlich ist. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass diese Hefe die unvollkommene (nicht sporenbildende) Form von Saccharomyces exiguus, nämlich Torulopsis holmii ist.

Aufgabe der Erfindung ist, den anderen Mikroorganismus zu finden, der einen wesentlichen Bestandteil bei der Herstellung des Sauerteigbrotes bildet und ein Verfahren zum Züchten dieses Mikroorganismus zu schaffen.

Der Mikroorganismus wurde gefunden und hat sich als Bakterienart erwiesen,die nahe verwandt ist mit dem Lactobacillus oder zu dieser Gruppe gehört. Dieser Mikroorganismus war bisher nicht bekannt. Er ist für die Säuerung z.B. des Brotteiges verantwortlich und es wurde hierfür der Name Lactobacillus sanfranclsco vorgeschlagen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Züchten dieser Bakterienart Lactobacillus sanfrancisco, das dadurch gekenn-

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zeichnet ist, dass ein Nährmedium, das Maltose enthält, mit lebensfähigen Zellen der Bakterienart geimpft und deren Wachstum und Wucherung durch Brüten gefördert wird.

Kulturen dieser Bakterienart eignen sich unter anderem für flüssige Stammsysteme zur Herstellung von französischem Sauerteigbrot.

Sauerteigbakterien

Proben von Ausgangeschwämmen für Sauerteig wurden von verschiedenen Bäckereien im Gebiet der Bucht von San Francisco erhalten und daraus in Reinkultur die vorher nicht isoliert und nicht beschriebenen Sauerteigbakterien gewonnen, für die, wie bereits erwähnt, der Name Lactobacillus sanfrancisco gewählt wurde.

Die Arbeiten, um diesen Organismus zu isolieren und zu züchten waren schwierig und zunächst erfolglos, da der Organismus besondere Nährstoffbedürfnisse hat und nicht auf irgendeinem der herkömmlichen Medien wächst, einschliesslich solcher die besonders für Milchsäurebakterien in Mehl- und Teigarten zutreffen. Die Nährstoffbedürfnisse der Bakterienart werden näher im Folgenden beschrieben.

Es wurde gefunden, dass die Bakterienart in den voll entwickelten Schwämmen vorhanden ist, und zwar in Mengen von etwa 1 χ 10·^ pro Gramm, was etwa dem JO - 100-fachen der Sauerteig-Hefe ze Ilen entspricht. Auch beim Untersuchen der Schwämme von den verschiedenen Quellen wurden fünf verschiedene Produkte des L.sanfrancisco isoliert, die hierin als B, C, L, P und T bezeichnet sind. Im allgemeinen unterscheiden sich diese Stämme nur sehr wenig voneinander. Die Stämme P und L sind einander ganz besonders ähnlich und können als identisch betrachtet werden.

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Kulturen mehrerer für den erfindungsgemässen Zweck geeigneter Stämme des Lactobacillus sanfranoisco wurden in der Kultur-Kollektion des US-Department of Agriculture, Northern Research Laboratory, Preoria, Illinois 6l604 gelagert, woher Proben dieser Stämme erhalten werden können.

Nachdem der Organismus identifiziert und seine Nährstofferfordernisse und andere Bedingungen für sein Wachstum erforscht waren, wurden auch die Mittel gefunden, wonach die Fachwelt den Organismus aus entsprechenden Quellen, wie Sauerteigschwämme und Sauerteigarten selbst isolieren kann.

Im Folgenden werden die Verfahren zum Züchten der Bakterienstämme beschrieben. Die STB-Nährbrühen sind das Medium, das erfindungsgemäss zum Züchten des Organismus verwendet wurde. Seine Zusammensetzung ist folgende:

Sauerteigbakterien (STB) Nährbrühe* %

Maltose 2

handelsüblicher Hefeextrakt 0,5

Frischhefe-Extraktstoffe (FHE)** 0,5 - 1,5

Sorbitanpolyoxyäthylenmonooleat (Wz.Tween 80) 0,0^ Caseinhydrolysat (Trypticase) 0,6

Wasser aufgefüllt auf 100.

* Die Nährbrühe mit den genannten Bestandteilen wird zur Bildung flüssiger Kulturen verwendet. Um die Kulturen auf einem festen Medium, z.B. Platten oder schräg im Reagenzglas angelegten Kulturen durchzuführen, wird der Nährbrühe eine geringe Menge (2 %) Agar zugegeben. Ein solches Medium wird im Folgenden als STB-Agar bezeichnet. Rutinemässig wurden die Kulturen auf STB-Nährbrühe oder STB-Agar bei ^O - Jl⁰ C 1 bis 2 Tage lang gebrütet, und zwar in einer COp-haltigen Atmosphäre. Dabei wurde so verfahren, dass der Raum oberhalb der Nährbrühe Kulturen mit COo gespült wurde. Bei den Agar-Kulturen wurden

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Die Platten oder Schräganlagen in einen Behälter gegeben, in dem die Luft durch ein CÜ^-Luft Gemisch ersetzt war, das etwa 25 - 95 Vol.-Ji CO₂ enthielt.

** Die Frischhefe-Extraktstoffe wurden so hergestellt·, dass

eine 20 #-ige Suspension handelsüblicher gepresster Bäckerei

hefe in destilliertem Wasser j50 Minuten bei 1,05 kg/cm im Autoklaven behandelt wurde. Die Suspension wurde über Nacht bei 1,11 - 1,67° C stehengelassen, um sich abzusetzen, anschliessend wurde dekantiert und die oben schwimmenden Stoffe wurden durch Zentrifugieren weiter geklärt. Der auf diese Weise hergestellte Extrakt enthielt 1,5 % Peststoffe. Wenn er nicht innerhalb einiger Tage verwendet werden sollte, wurde er sofort eingefroren oder gefriergetrocknet. Die PHE-Zubereitungen wurden in einem Mengenanteil verwendet, um 0,5 1,5 % der trockenen PHE-Peststoffe zu liefern.

Es wurden folgende allgemeine Eingenschaften des L.sanfrancisco beobachtet. Im Stadium des frühen Wachstums, entweder im Schwamm oder in der reinen Kultur und bevor die gesamte Azidität entwickelt 1st, erscheint der Mikroorganismus in Form von kurzen bis mittleren, dünnen Stäben oder sehr kurzen Ketten mit nur sehr geringer Neigung, gekrümmte oder fadenartige Formen anzunehmen. Unter schlechten Nährbedingungen jedoch, oder in älteren Kulturen, nehmen die Bakterien verwickelte oder fadenartige Formen, manchmal von immenser Länge an. Manchmal bilden sie gequollene oder ausgebeulte vielgestaltige Formen. Auf Platten-Agarkultüren, wenn sie kräftig sind, wachsen die Bakterien als glatte, runde, durchsichtige Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 1 mm oder weniger.

Der Bakterienstamm ist in den Anfangsstadien des Wachstums gram-positiv, ohne Eigenbewegung und katalasenegativ, wie das Fehlen von Gasbildung zeigt, wenn eine 10 #-ige HpOpsung auf die Kolonien einer ausgebreiteten Agarplatte gegossen wird.

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In Schwämmen und im Teig sind etwa 70 - 80 % der gesamten durch den Organismus erzeugten organischen Azidität Milchsäure, der Rest Essigsäure. In reinen Nährbrühe-KuItüren ist das Verhältnis von Milch- zu Essigsäure variabel und hängt von der Atmosphäre ab, der die Kultur ausgesetzt wird. Wegen der Bildung von Essigsäure wird angenommen, dass die Bakterien eine heterofermentative Art des Lactobacillus sind. Es kann angenommen werden, dass die Bildung von Essigsäure nicht nur für das einzigartige Aroma des französischen Sauerteigbrotes verantwortlich ist, sondern auch den Ausgangs-Sauerteig vor Verunreinigungen schützt, da Essigsäure viele Mikroorganismen tötet.

In reinen Kulturen wird von allen Stämmen Gas (COp) erzeugt. Das Wachstum wird durch Sorbinsäure gehemmt, nicht aber durch Actidlone, ein durch Streptomyces griseus gebildetes Antibiotikum. Der Organismus ist mesophil, d.h. wächst bei mittlerer Temperatur und zeigt keine ungewöhnliche Wärme- oder Salztoleranz.

Hitzebeständigkeit und Salztoleranz wurden wie folgt ermittelt: 12- und 24-Stunden STB-BrUhekultüren von drei verschiedenen Stämmen (B, L und T) wurden 15 Minuten lang in ein Bad von 60° C getaucht, wobei eine Auftauchzeit von 3-4 Minuten eingeschlossen war. Die Zählung der 12-Stunden-Kulturen schwankte von 19 - 34 χ 10' Zellen pro ml, vährend die 24-Stunden-Kulturen I50 - I60 χ 10' pro ml. ergaben. Es wurden in keinem Fall bei grösster Verdünnung ( 1 χ 10 ) lebensfähige Überlebende gefunden, was drauf hinweist, dass diese Bakterien keine ungewöhnliche Wärmebeständigkeit aufweisen.

Vier Stämme (B, L, T und C) wurden auf Wachstum in einer STB-Nährbrühe untersucht, die 4 % oder 6,5 % NaCl enthielt. Auch nach 6-tägiger Inkubationszeit wurde keine Trübung festgestellt, was darauf schliessen lässt, dass keine ungewöhnliche

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Salztoleranz vorliegt. Salz fördert das Wachstum in wässrigen Mehlsuspensionen aber nur bei einer Konzentration von etwa 0,5 ^

Ein besonders unterscheidendes Merkmal der Bakterienart L. sanfrancisco ist, dass sie für ein schnelles und starkes Wachstum Maltose benötigt. Andere Zuckerarten, wie Xylose, Arabinose, Galactose, Lactose, Sucrose, Raffinose und Rhamnose werden nicht verwendet. Einige Isolierungsprodukte der Bakterienart kann an Glucose gewöhnt werden, aber nur nach einer langen Anlaufperiode.

Die Vorliebe des Organismus für Maltose wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht.

Beispiel 1

Proben von STB-Agar wurden wie oben beschrieben hergestellt und andere modifiziert, indem die Maltose durch die gleiche Menge (2 %) anderer Zuckerarten ersetzt wurde. Diese Proben wurden mit verschiedenen Stämmen der Bakterien angelegt, 2 Tage lang bei 31° C gehalten und auf Wachstum untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle I
Wachstum auf Kohlehydraten geprüft

Stamm Xylose Arabi- Glucose Galac- Sucrose Mal- Rham- Raffinose tose tose nose nose

B- _

P NT - - L-- __ T-NT __

*Wachstum festgestellt + kein Wachstum

+	—	—
+	NT	NT
+	NT	NT

Beispiel 2

Um die Wirkung verschiedener Maltosespiegel auf das Wachstum und die Säurebildung zu untersuchen, wurden zwei Stämme der Bakterien·bei 31° C auf einer STB-Nährbrühe gezüchtet, wobei die Maltosemenge variiert wurde. Das Wachstum wurde durch das Zeilvolumen und die Trübung geschätzt, die Säurebildung durch pH-Wertmessung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle II

Wirkung des Maltosespiegels auf das Wachstum und den pH-Wertabfalls in Nährbrühekultüren (1,5 % PHE in STB Nährboden)

Maltose	Stamm	L 24 Stunden	TrU-*	Stamm	C 41 Stunden	TrU-*	0,09
Spiegel	pH-	Zellvolumen	bung	pH-	Zellvolumen	(ral/10ml Kultur) bung	0,15
%	Wert	(ml/10ml Kultur)	0,08	Wert	0,01	0,30
0,10	4,50	0,02	0,23	5,07	0,02	0,35
0,25	4,45	0,03	0,47	4,80	0,04	0,39
0,50	4,40	0,07	0,63	4,48	0,06	0,39
1,00	4,15	0,11	0,60	4,17	0,08
1,50	5,15	0,11	0,62	4,10	0,07
2,00	4,15	0,10	4,10

Optische Dichte gemessen bei 525 /U im Bausch und Lomb Spektronik 10 nach einer ersten Verdünnung der Kultur mit destilliertem Wasser 1 : 5. Die Trübungszahlen sind korrigiert für die Trübung in nicht geimpfter STB-Nährbrühe als eine Punktion des pH-Wertes.

Aufgrund der obigen Daten wurde ein Kulturmedium verwendet, das Maltose enthielt. Im allgemeinen wurde dieser Zucker in einer Konzentration von mindestens 0,5 % vorzugsweise 2 % zugegeben.

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Die Maltose kann als solche oder mit irgendeinem Kohlehydrat, das Maltose enthält, zugesetzt werden. So eignen sich beispielsweise Getreidesirup oder Getreidesirup-Peststoffe, Malzextrakt und andere Maltose enthaltende Substanzen, hergestellt durch enzymatische oder chemische Hydrate von Reis-, Weizen-, Kartoffel-, Gersten-, Haferstärke oder dergleichen.

Ein anderes Merkmal von L. sanfrancisco besteht darin, dass bestimmte Hefe-Extraktstoffe erforderlich sind, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Es wurde gefunden, dass die entsprechenden Hefe-Extraktstoffe so wirksam sind, wie es mit handelsüblichen Hefe-Extrakten und Autolysa^ten, mit Caseinhydrolysaten oder Vitamin B^ nicht erreicht werden kann. Die erfindungsgemäss verwendeten Substanzen werden im allgemeinen als Frischhefe-Extraktstoffe (FHE) bezeichnet, um sie vom herkömmlichen Produkt zu unterscheiden. Sie können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden, wie noch näher erläutert wird.

Bäckerhefe wird in Wasser suspendiert und die erhaltene Sus-

pension unter einem Dampfdruck von etwa 0,70 - 1,75 kg/cm in einem Autoklaven erwärmt. Nach dem Abkühlen der Suspension wird die obenschwimmende Masse durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt. Die so gewonnenen Frischhefe-Extraktstoffe (FHE) werden sofort oder innerhalb weniger Tage verwendet. Wenn sie über eine längere Zeltspanne aufbewahrt werden sollen, werden sie gefroren oder gefriergetrocknet. Die FHE werden im Kulturmedium in einer Menge verwendet, um mindestens 0,5 Jf, vorzugsweise etwa. 1,5 Jf der trockenen Frischhefe-Extraktfeststoffe zu liefern.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Frischhefe-Extraktstoffe ist die Autolyse von Bäckerhefe, wobei eine 1 : 1 Sus pension H«f· in destilliertem Wasser, unter Toluol (um Luft ausatuechlitssen), 3 Ta*;· lang bei 50-55° C gehalten wird, an-

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schliessend bis zum Sieden erwärmt und durch Zentrifugieren oder Filtrieren geklärt wird, um die klare Flüssigkeit abzusondern.

Es wurde gefunden, dass ohne FHE das Wachstum von L. sanfrancisco sehr langsam vor sich geht, und beispielsweise 4-6 Tage erforderlich sind, um gerade ein leichtes Wachstum zu erzielen.

Wie bereits erwähnt, können handelsübliche Hefe-Extrakte und Caseinhydrolysate die Frischhefe-Extraktstoffe nicht ersetzen. Aber es ist möglich, in der Kultur einen der Stoffe oder beide zusammen mit FHE zu verwenden, um eine zusätzliche Wachstumsfördernde Wirkung zu erzielen. Von den beiden sind Caseinhydrolysate die besseren Stimulatoren.

Diese Beobachtungen zeigen, dass die erfindungsgemässen Kulturmedien Frischhefe-Extraktstoffe als wichtige Komponente enthalten und vorzugsweise auch herkömmlichen Hefe-Extrakt in einer Menge von etwa 0,3 % und Caseinhydrolysat in einer Menge von etwa 0,2 - 1 Ji aufweisen. Die Verwendung von Caseinhydrolysat 1st besonders erwünscht. Das Kulturmedium kann auch andere übliche Anregungsstoffe enthalten, wie beispielsweise Biotin, Vitamine der B-Gruppe, Soyabohnen-Hydrolysat, Qetreldeeinwelchllquor, lösliche Stoffe der Brennerei, oder andere Quellen für organische, stickstoffhaltige Nährstoffe.

Beispiel 3

Ub die Wirkung der verschiedenen FHE-Spiegel auf das Wachstum zu untersuchen» wurden zwei Bakterienstamme bei 31° C auf einem STB-Nährboden gezüchtet, in dem die Menge der FHE variiert wurde. Die Wachstuasrate wurde durch Messen des ZeIlvolunena der Kulturen geschätzt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

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Tabelle III
Wirkung des FHE-Spiegels auf das Wachstum in Nährbrühekulturen

FHE Zellvolumen (ml/10 ml Kultur)

* Stamm - B Stamm - L

24 Stunden 24 Stunden

0,25 0,03 0,04

0,50 0,04 0,08

1,00 0,07 0,12

1,25 0,10 0,13

1,50 O,1J 0,18

Die Untersuchungen haben ergeben, dass ungesättigte Fettsäure für das Wachstum von L. sanfrancisco erforderlich ist. Dieser Nährstoff kann dem Kulturmedium in Form eines Derivates einer ungesättigten Fettsäure (beispielsweise Olein-, Linol-, Linolen-, Rizinusölsäure oder dergleichen) zugegeben werden. Es soll in Wasser löslich oder zumindest damit emulgierbar aän. So können Natrium- oder Kaliumsalze oder ungesättigte Fettsäuren oder Substanzen, die solche enthalten verwendet werden. Beispiele hierfür sind Natrium- oder Kaliumseifen hergestellt aus Olivenöl, Baumwollsamenöl. Leinöl, Soyaöl, Safloröl, Getreideöl oder anderen Fetten oder ölen, die ungesättigte Glyceride enthalten. Andere brauchbare Derivate sind Teilester ungesättigter Fettsäuren und Zucker oder mehrwertige Alkohole, z.B. Sucrosemonooleat, Sucrosedioleat, Glycerinmonooleat, Mannitolmonooleat und dergleichen. Besonders bevorzugte Ester mehrwertiger Alkohole sind ungesättigte Fettsäureester des Sorbitan, wie Sorbitanmonooleat, Kondensationsprodukte von A'thylenoxyd mit Sorbitanfettsaureester, wie Sorbitanpolyoxyäthylenmonooleat; und Kondensat!onsprodukte des Äthylenoxids mit ungesättigten Fettsäuren, wie Polyoxyäthylenmonooleat. Andere Derivate, die verwendet werden können, sind

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Leeithine, die ungesättigte Fettsäureanteile, wie Oleinsäure, enthalten. Im allgemeinen wird nur eine geringe Menge des ungesättigten Pettsäurederivates benötigt, beispielsweise etwa 0,01 - 0,1 %.

Beispiel 4

Um die verschiedenen Sorbitanpolyoxyäthylenoleat (SPO)-Spiegel auf das Wachstum zu untersuchen, wurde der Bakterienstamm B auf STB-Agar gezüchtet, in dem die Menge des SPO variiert wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle	IV
Konzentration von Sorbi-	Koloniegrösse nach
tanpolyoxyäthylenoleat	2 Tagen bei 31° C
0	keine
0,0075	sehr klein (nicht zählbar)
0,02	mittel
0,035	gross
0,05	gross

Die Bakterien sind gegen Sauerstoff unempfindlich. Sie können daher unter unaeroben oder aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Die Anwesenheit von Kohlendioxid ist im allgemeinen vorteilhaft und kann das Wachstum sogar fördern. Demzufllge wird bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens in einer Atmosphäre gearbeitet, die dieses Gas enthält. Dabei kann die Luft aus dem oberen Raum des Kulturbehälters ganz oder teilweise mit COp weggespült werden. Ein unbedingter Ausschluss von Luft ist nicht nötig und die Atmosphäre oberhalb des Kulturnährbodens kann beispielsweise etwa 25 Vol.-# CO₂ enthalten, wobei der Rest Luft ist. Andererseits kann die Kultur mit CO₂ oder C0₂-Luft-Gemischen, die 25 - 95 .-# CO₂ enthalten, besprüht werden.

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Wie bereits erwähnt wurde, sind die Bakterien mesophil. Sie wachsen am besten bei einer massigen Temperatur von etwa 25 - 35° C, obwohl sie auch in einem Bereich von etwa-15 - 4O⁰C gedeihen. Kein Wachstum wurde bei 45° C beobachtet.

Beispiel 5

Um die Wirkung der Temperatur zu untersuchen, wurde der Stamm L auf STB-Agar oder -Brühe bei verschiedenen Temperaturen gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle V
Wirkung der Temperatur auf das Wachstum *

Temperatur	1	Wachstum	auf	SDB-Agar **
⁰C			Tage
	+2	2		3
13	+3	+		+1
24	-	+3		+4
31	+4		+4
37	+1		+2

* Die Angaben betreffen den Bakterienstamm L. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Stämmen B und T erhalten, mit der möglichen Ausnahme eines etwas längeren Wachstums bei 13° C.

Erklärungen der Symbole:

= kein Wachstum

- = sehr schwaches Wachstum

+1 = sehr geringes Wachstum

+2 = geringes Wachstum

+3 = mittleres Wachstum

+4 = starkes Wachstum

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Tabelle VI

Wirkung auf das Wachstum

Tempe	1	Wachstum in	ml Kultur)	3	einer ί	07	3TB-Nährbrühe (0,	2	5	2	?	%	PHE)
ratur	O	Zellvolumen	Tage	0,04		14		2		4,5	4,
0	O,	(ml/10		0,15				1	pH-Wert	3,9	3,
^UC	O		,03	0				Tage	5,2	5,
		2	,14	6	1			6
13	0		O₁	5,	2	5,9
31	09 0		0,	4,	8	3,7
^5	0	0	5,	2	5,3

Die Angaben betreffen den Bakterienstamm L. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Bakterienstämmen B und T erhalten, mit der möglichen Ausnahme eines etwas langsameren Wachstums bei 13° C.

Bei der Untersuchung der Wirkung des pH-Wertes wurde gefunden, dass L. sanfranclsco am besten in einer deutlich sauren Umgebung wächst, d.h. bei einem pH Wert unter 6. In dieser Hinsicht ist der Mikroorganismus ein scharfer Gegensatz zu bekannten Arten der Lactobacilli.

Da der Mikroorganismus Säure erzeugt, wird das Medium auch dann sauer, wenn dies vorher nicht der Fall war. Es wird aber eine bessere Wachstumsrate erzielt, wenn das Medium angesäuert wird, sobald das Züchten beginnt. Daher wird bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens das Medium beim Anlegen der Kultur auf einen pH-Wert von etwa 5-6 eingestellt. Zu diesem Zweck kann Milchsäure, Essigsäure, Salzsäure oder eine andere nicht toxische Säure verwendet werden. Im allgemeinen werden Salzsäure und Essigsäure bevorzugt.

Beispiel 6

Um die verschiedenen Ausgangs-pH-Werte zu untersuchen, wurden Proben von STB-Nährbrühe (0,5 % PHE) mit HCl auf verschiedene

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pH-Werte eingestellt und verschiedene Bakterienstämme bei 3I ( gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle VII
Wirkung des Anfangs-pH-Wertes auf das Wachstum *

Anfangs-	Bakte ri ens t amm	T	4,2	Bakterienstamm	0,10	L	4,1
pH-Wert	Ze11volumen (ml/10ml Kultur) 24 Std. 48 Std.	pH-Wert 24 48 Std. Std.		Ze11volumen 24 44 Std. Std.
6,5	0,01 0,04	5,6	3,8	0,00	0,12	pH-Wert 24 44 Std. Std.	3,8
(nicht el	ngestellt)		3,8		0,13	5,9	3,8
6,0	0,02 0,05	4,3	3,7	0,07	0,17		2,7
5,5	0,03 0,08	4,1	0,15		4,3
5,0	0,07 0,19	4,1	0,19		4,2
	4,1

Anfangseinstellung des pH-Wertes der STB-Nährbrühe (0,5 % FHE) mit HCl.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Bakterienstämmen B und C erhalten.

Wie bereits oben erwähnt ist, bilden die Bakterien sowohl Milchsäure als auch Essigsäure, und zwar die erstgenannte in grösseren Mengen. Diese Eigenschaft des L. sanfrancisco wird im folgenden Beispiel verdeutlicht.

Beispiel 7

Der Bakterienstamm B wurde auf STO-Nährbrühe (1,5 % FHE) 2 Tage bei 31 C gezüchtet. Anschliessend wurde auf die Menge und die Art der gebildeten Säure analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

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Tabelle VIII

Bildung von Milchsäure und Essigsäure in einer STB-Nährbrühe

Gesamtazidität, yU-Mol/ml 67,8 Milchsäure, % der Gesarntsäure 75 Essigsäure, % der Gesamtsäure 25

Korrigiert für Milchsäure und Essigsäure in nicht geimpftem Medium.

Wenn die oben beschriebenen Faktoren in Betracht gezogen werden, ergibt sich beispielsweise folgende Zusammensetzung des erfindungsgemässen Kulturmediums:

Bestandteil Menge

Maltose (oder ein anderes Kohle- mindestens 0,5 % vorhydrat, das Maltose ent- zugsweise etwa 2 % hält) (Maltose)

ungesättigtes Fettsäurederivat etwa 0,01-0,17 % vorzugsweise etwa 0,03 %

Frischhefe-Extraktstoffe

Caseinhydrolysat (wahlweise) Herkömmlicher Hefeextrakt (wahlweise) mit Wasser aufgefüllt auf pH-Wert auf etwa 5-6 eingestellt.

Vor der Verwendung wird das Medium im Autoklaven bei 1,05 kg/cm

15 Minuten lang sterilisiert.

Bei verschiedenen erfindungsgemässen Anwendungsarten können die Kulturen von L. sanfrancisco direkt verwendet werden. So kann beispielsweise beim Ansetzen einer neuen Kultur ein Teil einer früheren Kultur als Impfstoff verwendet werden. In den meisten Fällen wird aber bevorzugt, die Bakterienzellen aus der Kultur zu sammeln und diese in isolierter Form einzusetzen.

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mindestens	0,5	%	vor-
zugsweise	etwa	1,	5 %
etwa 0,2 -	1 %
0 - 1 %
100 %

Das Sammeln erfolgt gewöhnlich durch Zentrifugieren der Nährbrühe, um die Zellen abzutrennen. Das dabei erhaltene Zellkonzentrat wird dann vorzugsweise gewaschen, um die Nährstoffe und StoffWechselprodukte zu entfernen. Zum Waschen wurde meistens eine verdünnte wässrige NaCl-Lösung verwendet.

Wenn das Zellkonzentrat nicht bald nach seiner Herstellung verwendet wird, kann es durch Einfrieren konserviert werden. Um beste Ergebnisse zu erzielen, wird dem Konzentrat vor dem Einfrieren ein stabilisierender Träger zugegeben. Als solcher eignet sich beispielsweise Glycerin, Dimethylsulfoxid, Magermilch, Micheiweisshydrolysate, Sucrose, Getreidesirup und dergleichen. Teil des gesamten Trägers ist vorzugsweise frisches Medium, d.h. STB-Nährbrühe oder ein anderes flüssiges Nährmedium wie es Herin bereits als geeignet für die Kultur von Lt sanfranclsco genannt wurde. In typischen Fällen werden 100 Teile des Zellkonzentrats mit 100 - 200 Teilen eines stabilisierenden chemischen Lösemittels, das etwa jj - j50 % Glycerin und Rest flüssiges Nährmedium z.B. STB-Nährbrühe, enthält, zugegeben. Um Verunreinigungen des Zellkonzentrats zu vermeiden, wird das zugefügte Trägermaterial vor der Zugabe sterilisiert. Das mit dem Träger versetzte Zellkonzentrat wird vorzugsweise durch Entspannen eingefroren, beispielsweise durch Verwendung eines unterkühlten Kühlmittels, wie flüssigem Stickstoff, und wird bei einer Temperatur unter 0° C aufbewahrt, wobei es seine Lebensfähigkeit über lange Zeiträume beibehält.

Typische Verfahren zum Sammeln und Konservieren der Bakterienpr&parate sind in den folgenden AusfUhrungsbeispielen erläutert.

Beispiel 8

L. aanfranci3co wurde wie oben beschrieben auf einer Nährbrühe gezüchtet und die Zellen durch Zentrifugleren der Nährbrühe gesammelt, wobei vorzugsweise eine gekühlte Zentrifuge verwendet wurde. Der Zentrifugenkuchen wurde dann mit gekühlter 1 £-lger Salzlösung gewaschen, um Nährstoffe, Stoffwachselpro-

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BAD ORKSlNAL

dukte und dergleichen zu entfernen. Die gewaschenen Zellen konnten dann als Bakterienimpfstoff für flüssige Ausgangspräparate verwendet werden.

Wenn die Zellen nicht bald nach ihrer Herstellung benötigt werden, können sie konserviert werden. Dabei werden die gewaschenen Zellen (100 Teile) in 200 Teilen eines stabilisierenden Trägers (ein Gemisch aus 60 Teilen Glycerin und 140 Teilen steriler STB-Nährbrühe) suspendiert. Die Suspension wird durch Entspannen eingefroren, wobei flüssiger N₂ oder trockene Eis-Aceton-Brühe verwendet werden können. Die Kultur wird dann im eingefrorenen Zustand (bei etwa -28° C oder darunter) aufbewahrt, wobei ihre Lebensfähigkeit mindestens zwei Monate lang erhalten bleibt. Wenn das Produkt verwendet werden soll, wird es rasch auf etwa 21 - 27° C aufgetaut und sofort verbraucht.

Die erfindungsgemässen Kulturen, isolierten Bakterienzellen, Zellkonzentrate oder dergleichen eignen sich für verschiedene Anwendungen, so beispielsweise zum Umwandeln von Maltose in Milch- und Essigsäure. Besonders bevorzugt werden die Bakterienpräparate zur Herstellung flüssiger Stammprodukte für französisches Sauerteigbrot verwendet.

Beispiel 9

Der Lactobacillus sanfrancisco kann aus einem Sauerteig-Ausganges chwamm oder einem daraus hergestellten Brotteig isoliert werden.

Sine geringe Menge dieses Grundstoffes, beispielsweise 1 g, wurde alt sterilem Wasser oder sterilem wässrigen Pepton (1 Jf) innig gemischt. Sin Teil der erhaltenen Suspension wurde weggenommen und mit einer zusätzlichen Menge sterilem Wasser oder Peptonlösung gemischt. Dieser Verdünnungsvorgang wurde mehrere Male wiederholt, bis der Ausgangsstoff etwa 1 : 10 verdünnt

BAD ORIGINAL

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1/10 - 1 ml der verdünnten Flüssigkeit wurde dann zum Impfen einer Plattenkultur STB-Agar (wie oben beschrieben) verwendet und die Plattenkultur 1-2 Tage bei 31° C gebrütet. Die gewünschten Bakterien erschienen als zahlreiche durchsichtige, kugelige, farblose Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 1 mm oder kleiner. Wenn etwas von der Sauerteighefe (eine Komponente des ursprünglichen Ausgangsstoffes) aus der Plattenkultur auswächst, kann diese von den Bakterien leicht in der folgenden Weise unterschieden werden: Die Sauerteig-Hefekolonien sind in geringer Zahl vorhanden, nämlich etwa 1/50 - 1/100 der Zahl der Bakterienkolonien. Sie weisen einen viel grösseren Durchmesser auf (etwa 5 nun oder mehr). Sie haben ein milchiges oder opakes Aussehen, im Gegensatz zu den durchsichtigen Bakterienkolonien.

Mit einer sterilen Nadel wird eine Bakterienkolonie von der Plattenkultur abgepflückt, auf eine schräg angelegte STB-Agar-Kultur gebracht, 1-2 Tage bei 31° C gebrütet und dann auf 7 - 10° C gekühlt und bei dieser Temperatur gehalten.

Das gewonnene Produkt ist die gewünschte reine Kultur aus L. sanfrancisco.

Wenn ein Teil der Kultur alle k - 6 Wochen auf eine Frische, schräg angelegte STB-Agar-Kultür gebracht, wieder gebrütet und bei 7 - !0° C aufbewahrt wird, kann der Organismus unendlich lange in einem lebensfähigen Zustand gehalten werden.

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Claims

JHHJl·'« 5 eingegangen Patentansprüche

1. Verfahren zum Züchten der Sauerteig-Bakterienart Lactobacillus sanfrancisco,

dadurch gekennzeichnet, dass ein Nährmedium, das Maltose enthält, mit lebensfähigen Zellen der genannten Bakterienart geimpft und deren Wachstum und Wucherung durch Brüten gefördert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium ein ungesättigtes Fettsäurederivat enthält.

3- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Pettsaurederivat ein in Wasser löslicher oder darin emulgierbarer Ester der Olein- oder Linosäure, ein teilweise mit Oleinsäure veresterter mehrwertiger Alkohol oder Sorbitanpolyoxyäthylenmonooleat verwendet wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass dem Nährmedium auch Frischhefe-Extraktstoffe zugegeben werden.

5· Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium im wesentlichen frei ist von stärkehaltigen Stoffen.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium zu Beginn auf einen pH-Wert von 6 oder darunter eingestellt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6,dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur von etwa 25 - 35° C durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Atmosphäre mit etwa 25 - Vol.-% CO₂ gearbeitet wird.

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Eingegangen chilü

5-Vv,

9, Verfahren nach einem oder mehreren 3 er Ansprüche 1 t:l.? durch gekennzeichnet, dass n^r mit dsm Mikroorgar·.:¹ £.rrUT L. sanfrancisco geimpft wird.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche Γ. ";.-;.;· durch gekennzeichnet., dass die Bakterienzellen d'i:-$: Z fugieren der Kultur abgetrennt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet.» clo: abgetrennten Zellen mit einer verdünnten wässrigen Lös der die Konzentration der gelösten Stoffe einem .%u±\rf von 0,5 - 1,0$ NaCl entsprechen, gewaschen weröer,

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennseici-.. ";. dass die gewaschenen Zellen in einem stabilisierenden - -,,: suspendiert und die erhaltene Suspension eingefroren v,: : diesem Zustand gelagert wird.

13· Zusammensetzung hergestellt nach dem Verfahren gemäss ?· :e: oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch ge-lrennse- .-J. "", dass sie aus einem Gemisch aus (a) lebensfähigen Zellen ιι? Lactobacillus sanfrancisco und (b) einem stabilisierenden Ii a ger besteht.

14. Zusammensetzung nach Anspruch Ij5> dadurch gekennzeichn<3;._t uas es ein Nährmedium enthält.

15. Zusammensetzung nach Anspruch IJ oder 14, dadurch gekernteich net, dass sie als Mikroorganismus nur Lactobacillus saiifranoi enthält.

16. Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche IjS bis

15, dadurch gekennzeichnet, dass sie frei ist von stärkehalti gen Stoffen.

17. Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1,3 bis

16, dadurch gekennzeichnet, dass der stabilisierende Träger Glycerin oder Dimethylsulfoxid enthält.

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