CH627348A5

CH627348A5 - Verfahren zur herstellung fermentierter, lebensfaehiger bifidobakterien enthaltender milch und verwendung der so erhaltenen milch.

Info

Publication number: CH627348A5
Application number: CH1644276A
Authority: CH
Inventors: Masahiko Mutai; Mitsuo Mada; Kei Nakajima; Kiyohiro Shimada; Takashi Iijima
Original assignee: Yakult Honsha Kk
Priority date: 1976-01-01
Filing date: 1976-12-29
Publication date: 1982-01-15
Also published as: NL176133B; CA1079112A; JPS6119220B2; IT1069111B; BE847883A; FR2336887A1; BG36042A3; DE2656160C2; AU503885B2; JPS5283975A; AU2022076A; NL176133C; US4087559A; NL7614631A; FR2336887B1; MX5036E; DE2656160A1; PL107206B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung fermentierter, lebensfähiger Bifidobakterien enthaltender Milch, die derart hergestellte Milch sowie deren Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken.

Bifidobakterien sind als Bakterien bekannt, die in der Magen-Darm-Flora mit Brustmilch ernährter Kinder vorherrschen. Es ist bekannt, dass Bifidobakterien eine ganze Reihe physiologischer Eigenschaften aufweisen:

(a) Unterdrückung fäulniserregender Bakterien;

(b) Hemmung der Bildung toxischer Amine;

(c) Förderung der Verdauung des Kaseins der Frauenmilch durch Einwirkung von Phosphorproteinphosphatase und

(d) Hemmung des Wachstums pathogener Bakterien in Verbindung mit Senkung des pH-Werts des Darmtraktes durch Bildung von Milchsäure, Essigsäure, Ameisensäure und ähnlicher Verbindungen.

Ein Kind, das mit der Flasche genährt wird (im folgenden als «Flaschenkind» bezeichnet), hat im Darmtrakt sehr wenig Bifidobakterien, die wie oben erwähnt verschiedene Wirkungen auf die Gesunderhaltung des Darms haben. Dies sieht man als Grund dafür an, dass ein Flaschenkind gegenüber Darmerkrankungen anfälliger ist als ein mit Muttermilch aus der Brust ernährtes Kind «(Brustkind»), Um die Darmflora eines Flaschenkinds in ähnlicher Weise umzuwandeln, wie bei einem Brustkind, wurde daher versuchsweise als Ersatz für Muttermilch ein modifiziertes Milchpulver mit Bifidobakterien hergestellt.

Das herkömmliche Verfahren der Kultivierung von Bifidobakterien in einem Medium wie Milch u.dgl. hat jedoch die folgenden Schwierigkeiten ergeben und wurde daher in der Praxis nicht in gewerblichem Massstab ausgeführt. Die Schwierigkeiten sind (im Vergleich zu Milchsäurebakterien, die bei der Milchherstellung weitgehende Anwendung finden):

(a) Die Kultivierungsbedingungen müssen streng anaerob sein;

(b) die bei der Kultivierung erforderlichen Nährbedingungen sind kompliziert und müssen streng eingehalten werden, daher vermehren sich die Bakterien in einem reinen Milchmedium, das eine wachstumsfördernde Substanz, wie beispielsweise Hefeextrakt, enthält, nicht, und

(c) es ist schwierig, die Bakterien in einer herkömmlich fermentierten Milch bei niedrigem pH-Wert längere Zeit lebensfähig zu erhalten, da die Säurewiderstandsfähigkeit der Bifidobakterien gering ist.

Falls einem Milchmedium eine wachstumsfördernde Substanz für Bifidobakterien zugesetzt wird, können die Bifidobakterien unter aeroben Bedingungen kultiviert werden. Das Produkt aus solchen Kulturen verschlechtert jedoch häufig den Geschmack und das Aroma. Ausser diesem Nachteil ist die wachstumsfördernde Substanz im allgemeinen teuer, und daher ist die Methode nicht praktisch.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung fermentierter, lebensfähiger Bifidobakterien enthaltender Milch ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.

Die Vorteile bei der Verwendung dieses Stammes von Bifidobakterien im erfindungsgemässen Verfahren sind die folgenden:

(a) Dieser Stamm kann leicht ohne Anwendung bestimmter Züchtungsbedingungen kultiviert werden. D.h. er kann unter aeroben Bedingungen ohne Zusatz einer wachstumsfördernden Substanz leicht vermehrt werden.

(b) Es ist möglich, eine ungünstige Beeinflussung des Geschmacks zu vermeiden, und das Schmackhaftmachen bzw. Würzen des gezüchteten Produktes ist leicht.

(c) Da das fermentierte erfindungsgemäss erhaltene Produkt keine Zusatzstoffe wie wachstumsfördernde Substanzen enthält, ist es als Säuglingsnahrung bzw. als Zusatzstoff zu Säuglingsnahrung von besonderem Vorteil.

(d) Der neue Stamm ist praktisch sauerstoffresistent, und die zur Züchtung erforderlichen Nährbedingungen sind einfach.

Folglich behält das gezüchtete Produkt (bzw. verarbeitete, gezüchtete Produkt) die hohe Lebensfähigkeit der Bakterien während der Konservierung bei, und es kann verhältnismässig leicht zu Nahrungsmitteln und Getränken verarbeitet werden, die lebensfähige Bakterien enthalten, ohne dass die Lebensfähigkeit der Bakterien wesentlich vermindert wird.

Der in dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete Stamm von Bifidobakterien, der die oben erwähnten Vorteile aufweist, ist «Bifidobacterium bifidum YIT-4002». Dieser Stamm wurde in der fortlaufenden Übertragungskultur von Bifidobakterien entdeckt, die aus den Faeces von gesunden Brustkindern entnommen wurden. Der Stamm hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften.

(1) Bakteriologische Haupteigenschaften

Der Stamm ist ein grampositiver, nicht sporenbildender Bazillus (0,5 x 2 bis 3 jum) und weist im Inneren der Zellen Granula auf, die mit Methylenblau anfärbbar sind. Unter dem Mikroskop zeigt dieses Bakterium verzweigte Kanten mit polymorpher Form, wie beispielsweise Y-Form, V-Form oder gekrümmte Form. Eine nach der Doppelschichtplattenme-thode gebildete Kolonie hat eine zylindrische, konvexe oder linsenförmige Form, und eine am Boden der Platte gebildete Kolonie ist in der Form unterschiedlich. Bei 72 Stunden langer Kultivierung im anaeroben VL-G-Flüssigmedium ist das Molverhältnis der sich bildenden Essigsäure zu Milchsäure 1,6 ± 0,5 (Essigsäure/Milchsäure). Die auf diese Weise in dem obigen flüssigen Medium gebildete Milchsäure wurde auf ihre optische Aktivität hin untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:

Spezifische Drehungsaktivität: — 0,038

Optische Aktivität: L (+) 76% + DL 24%

Die Ergebnisse der folgenden Tests waren wie folgt: Katalase (-), Kohlendioxydproduktion (—), Cystein-Milch-Koagula-tionsaktivität (+), Gelatinehydrolyse (—), reduzierende Wirs

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

627 348

kung auf Nitrat (-), Indolproduktion (-) und Schwefelwasser-stoffbildung (—).

Die obigen Ergebnisse leisten der Definition der Art Bifidobacterium Genüge.

(2) Temperatur- und pH-Wert-Optimum der Vermehrung

Temperaturoptimum der Vermehrung: 36 bis 38 °C

Das Bakterium vermehrt sich bei einer Temperatur unter 25 °C oder über 45 °C nicht.

pH-Optimum der Vermehrung 6 bis 7.

Das Bakterium vermehrt sich bei einem pH-Wert von.weniger als 5,0 nicht.

(3) Zuckervergärung

Das verwendete Bakterium zeigt positive Gärungsreaktion bei den folgenden Zuckern: Glucose, Fructose, Lactose und Galaktose.

Das Bakterium zeigt negative Vergärungsreaktion bei den folgenden Zuckern: Arabinose, Xylose, Salicin, Mannose, Man-nitol, Melezitose, Cellobiose, Sorbit, Inulin, Trehalose, Rham-nose, Maltose, Ribose und Sorbose.

Dieses Vergärungsmuster entspricht vollständig demjenigen eines Standardstamms der Bifidobakterien (Bifidobacterium bifidum E 319).

(4) Sauerstoffempfindlichkeit und Nährstoffbedingungen

Das verwendete Bakterium wurde in Mengen von 107 bis

108/ml unter aeroben Bedingungen bei 37 °C in einem reduzierten Magermilchmedium (Milchfeststoffgehalt =12%,

keine wachstumsfördernden Substanzen enthaltend), das mit Sauerstoff gesättigt war (etwa 6,5 ppm) gezüchtet. Bei einer 24 Stunden dauernden Inkubierung wurde eine Population von mehr als 109/ml erreicht.

Unter den gleichen Bedingungen wie oben vermehrten sich gewöhnliche Bifidobakterien kaum. Die Population blieb die gleiche oder war geringer (vgl. das folgende Beispiel 2).

Wie oben beschrieben entspricht das verwendete Bakterium taxologisch vollständig dem Bifidobacterium bifidum, ausser dass sich das erfindungsgemäss verwendete Bakterium in einem reinen Milchmedium unter aeroben Bedingungen gut vermehrt, während sich gewöhnliche Bifidobakterien unter diesen Bedingungen nicht vermehren können. Unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften wurde der verwendete Bakterienstamm als eine Variante von Bifidobacterium bifidum identifiziert und wurde als «Bifidobacterium bifidum YIT-4002» bezeichnet (diese Identifizierung erfolgte in Übereinstimmung mit Bargey's Manual von 1974). Dieser neue Stamm wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology of Nr. 8—1, Inage Higashi-5-chome, Chiba-shi, Chiba-ken, Japan, hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist FERM-P No. 3371 (Hinterlegungsdatum: 30. Dezember 1975).

Wie oben beschrieben hat der verwendete Stamm von Bifidobakterien sehr erwünschte Eigenschaften und kann daher leicht ohne Anwendung von speziellen Züchtungsbedingungen in gleicher Weise wie gewöhnliche Milchsäurebakterien gezüchtet werden. Demgemäss ist es möglich, eine gemischte Züchtung dieses Stammes von Bifidobakterien mit Milchsäurebakterien durchzuführen. Bei der Züchtung der herkömmlichen Bifidobakterien ist das Vorhandensein eines reduzierenden Mittels und eines wachstumsfördernden Mittels unbedingt erforderlich, bei der Züchtung des verwendeten Bifidobakte-rienstammes ist das Vorhandensein dieser beiden Stoffgruppen nicht erforderlich. Ein wachstumsförderndes Mittel kann jedoch bei dem erfindungsgemässen Verfahren vorhanden sein, um die Vermehrung möglichst zu fördern, solange dies nicht die Verwendung des erhaltenen Produktes stört.

Unter gewöhnlichen Bedingungen erreicht die Population der lebensfähigen Bifidobakterien nach 18 bis 24 Stunden Inkubationszeit ein Maximum, wenn die Züchtung jedoch fortschreitet, wird Säure gebildet, und dadurch wird der pH-Wert vermindert. Falls die Züchtung weiter fortgeführt wird, beginnt die Vermehrung nachzulassen, die Bildung von Säure erfolgt jedoch eine gewisse Zeit weiter und schliesslich wird die Säurebildung gesättigt. Demgemäss wird die Züchtung zu einem geeigneten Zeitpunkt unterbrochen, je nachdem, welche Verwendung für das Produkt vorgesehen ist.

Das gezüchtete Produkt kann so wie es ist als Nahrungsmittel und Getränk, das lebensfähige Bifidobakterien enthält, verwendet werden, oder es kann wahlweise mit Süssungsmit-teln, Fruchtsaft, Wasser oder anderen Milchprodukten vermischt werden. Das erhaltene Produkt kann auch nach Ge-frier- oder Sprühtrocknung zu einem Pulverprodukt verwendet werden.

Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert. In den Beispielen wurde die Zahl der lebenden Bakterien nach einer di-mensionalen Diffusionsmethode unter Verwendung eines modifizierten Kulturmediums nach Rogosa gemessen, die «Azidität» zeigt eine Menge in Millilitern von 0,1 n Natriumhydroxyd an, die erforderlich ist, 5 ml der Kulturlösung zu neutralisieren. «Variante» bezeichnet dabei das Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (FERM-P Nr. 3371).

Beispiel 1

Die verwendete «Variante» und drei Arten Standardstämme von typischen Bifidobakterien (Vergleichsbeispiele) wurden anaerob gezüchtet.

Die Impfkultur wurde durch Züchtung des gewünschten Bakteriums in modifiziertem Rogosa-Medium (1 ml Brenztraubensäure und 0,2 g reduziertes Glutathion wurden einem Liter agarfreien Medium zugesetzt) hergestellt und die gezüchteten Bakterien wurden gesammelt und unter sterilen Bedingungen in einer Pufferlösung von 1/100 m Phosphat (pH-Wert 6,8) gewaschen, wobei eine Suspension erhalten wurde (OD 660 rryi = 1,5).

Ein für die Hauptvermehrung verwendetes Medium war reduzierte, nichtfette Milch (Milchfeststoffe: 12%). Das Medium wurde sterilisiert und in ein anaerobisches Gefäss gefüllt, dessen Atmosphäre durch ein Gemisch aus 95 % Stickstoff und 5 % Kohlendioxyd ersetzt war, um den anaerobischen Zustand zu schaffen. Die Menge an gelöstem Sauerstoff in dem Medium betrug 0,1 ppm am Beginn der Züchtung.

In Fig. 1 ist der Zusammenhang zwischen der Züchtungszeit und den Variationen der Population des lebensfähigen Bi-fidobakteriums, Säure und pH-Wert dargestellt. Im Falle der Variante erreichte die Population des lebensfähigen Bifidobak-teriums 24 Stunden nach der Beeimpfung 6,5 x 109/ml. Bei einer Zunahme der Population an lebensfähigem Bifidobakte-rium wird eine beträchtliche Menge an Säure produziert, wodurch der pH-Wert des Mediums verringert wird. Anderseits konnte im Falle der Vergleichs-Standardstämme nur in geringem Ausmass Vermehrung festgestellt werden, und es wurde bewiesen, dass die Vergleichsstandardstämme in einem reinen, fettfreien Milchmedium auch unter anaeroben Bedingungen sich nicht wesentlich vermehren.

Beispiel 2

Aerobe Züchtung wurde unter Verwendung derselben Impfkultur und desselben Mediums wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach Sterilisierung des Mediums wurde Sauerstoff durch das Medium geleitet, um dieses mit Sauerstoff zu sättigen (Menge an gelöstem Sauerstoff = 6,5 ppm).

Die Ergebnisse der Züchtung sind in Fig. 2 angegeben. Die erfindungsgemäss verwendete Variante vermehrt sich in gleicher Weise wie bei der oben erwähnten anaeroben Kultivierung, und die Population an lebensfähigem Bifidobakterium erreichte 24 Stunden nach der Beimpfung 5,0 X 109/ml. Anderseits wurde im Falle der Vergleichsstandardsstämme we5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

627 348

4

sentliche Vermehrung nicht festgestellt. In einigen Fällen verminderte sich die Population an lebensfähigem Bifidobakte-rium sogar unmittelbar nach der Beimpfung.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurden verschiedene Bedingungen zur Züchtung der erfindungsgemäss verwendeten Variante zur Herstellung von fermentierter Milch studiert.

(1) Zusammenhang zwischen der Menge an Starterkultur und Vermehrung

Starterkultur wurde durch 20 Stunden lange Züchtung in reduziertem, nichtfettem Milchmedium (Milchfettstoffgehalt 8%) hergestellt und 3 Tage lang bei niedriger Temperatur konserviert. Der so hergestellte Starter wurde in verschiedenen Mengen von 1 bis 10% reduzierter, nichtfetter Milch zugesetzt und dann aerob gezüchtet. Wenn der Starter in einer Menge von bis zu 3 % zugegeben wurde, erfolgte Säurebildung in einer Menge proportional der Erhöhung der zugesetzten Startermenge. Wenn jedoch der Starter selbst in einer Menge von mehr als 3 % zugegeben wurde, war die Menge an Säurebildung praktisch die gleiche.

Nach einer Versuchsreihe zur Ermittlung der Startermenge wurde ein Zusatz von 1 bis 2% Starter als hinreichend festgestellt. Nach den bekannten Berichten wurde der Starter im allgemeinen in einer Menge von 5 bis 10% verwendet. Um solch eine grosse Menge an Starter herzustellen ist ein Starter nötig, um den «Starter» herzustellen.

2) Zusammenhang zwischen Temperatur und Vermehrung der Kultur s Reduzierte, nichtfette Milch (Milchfeststoffgehalt 16%) wurde hergestellt, und das Medium wurde dann sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde auf 37 °C abgekühlt, indem sterilisierte Luft durchgeleitet wurde. Das Medium wurde mit

2.0 % des wie oben beschrieben hergestellten Starters beimpft io und wurde bei 30, 34, 37,40 bzw. 43 °C kultiviert. Die Vermehrung war in der 37 °C-Kultur am besten und bei den 34- ' und 40 °C-Kulturen war sie gut; die Vermehrung bei den 30-und 43 °C-Kulturen waren merkbar geringer.

3) Zusammenhang zwischen Aufrechterhaltung der Popu-15 lation von lebensfähigen Bifidobakterien und pH-Wert

Die erfindungsgemäss verwendete Variante wurde in verschiedenen nichtfetten Milchmedien (Milchfeststoffgehalt 12%) gezüchtet, bis der pH-Wert des Mediums 5,0, 4,6, 4,3 bzw.

4.1 erreichte. Die vier Medien wurden rasch auf 5 °C abge-20 kühlt, und zur Bestimmung der Unterschiede der Population von lebensfähigen Bifidobakterien in Abhängigkeit von der Zeit konserviert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben (diese Zahlenwerte sind Population an lebensfähigen Bifidobakterien pro ml Kulturmedium).

Tabelle 1

pH-Wert Azidität Konservation (Tage)

0 3 5 7 10

5.0 9,0 4,4 X109 3,2 X109 9,6 xlO8 4,2 xlO8 6,8 xlO7 4,6 9,8 5,4 xlO9 7,2 XlO8 2,3x10® 8,0 xlO7 1,2 XlO7 4,3 11,5 3,0 xlO9 1,7 xlO7 5,7 xlO5 2,6 xlO3 1,5x10'

4.1 13,4 6,0 xlO8 8,5 XlO5 4,7 XlO3 <101 ClO1

Die Abnahme der Population der lebensfähigen Bifidobakterien in Abhängigkeit von der Konservierungszeit variiert je nach dem pH-Wert des Mediums. Wenn das Medium einen pH-Wert von 3,4 oder weniger hat, nimmt die Population an lebensfähigen Bifidobakterien mit der Zeit rasch ab, während die Population an lebensfähigen Bifidobakterien nicht so schnell abnimmt, wenn der pH-Wert des Mediums 4,6 oder mehr beträgt. Der obige Versuch wurde an Hand von reduzierter, nichtfetter Milch beschrieben; die gleichen Ergebnisse wie oben werden mit Vollmilch, Magermilch und Gemischen davon erhalten.

Beispiel 4 Herstellung von fermentierter Milch 1.160 g Magermilchpulver wurde in Wasser zu einem Liter gelöst, und die Lösung wurde durch 30 Minuten langes Erhitzen auf 100 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen der sterilisierten Lösung wurden 2% der Starterkultur der Variante (vorher unter reinen Bedingungen gezüchtet) zugesetzt, und die Mischung wurde 16 Stunden lang bei 37 °C kultiviert. 525 ml der kultivierten Lösung wurden mit 475 ml Sirup vermischt, der 35 g Zucker und 35 g Sorbit enthielt. Dann wurde die Mischung mit Gewürz versetzt, und die Mischung wurde zu einem fermentierten Milchprodukt homogenisiert. Das so erhaltene Produkt hatte einen Säuregrad von 3,5 und einen pH-Wert von 4,7, und die Population an lebensfähigen Bifidobakterien betrug 2,9 x 109/ml.

2. Vollmilch wurde mit Magermilchpulver versetzt, so dass die Mischung einen Magermilchfeststoffgehalt von 16% hatte.

Die Mischung wurde durch Erhitzen sterilisiert. Es wurden 5 % Lactobacillus-acidophilus-Starter und 1 % der Starterkultur der Variante zugegeben, und die Mischung wurde 20 Stunden lang 40 bei 37 °C kultiviert. 525 ml der kultivierten Lösung wurden mit 472 ml Sirup vermischt, der 20 g Glucose und 35 g Fructose enthielt. Nach Zugabe von Würze zur Mischung wurde die Mischung zu einem fermentierten Milchprodukt homogenisiert. Das so erhaltene Produkt hatte eine Affinität von 3,3, 45 und einen pH-Wert von 4,8. Die Population an lebensfähigen Bifidobakterien der Variante betrug 1,9 x 109/ml und die an Acidophilus-Bakterien betrug 5,0 x 108/ml.

3.100 g Magermilchpulver und 60 g Vollmilchpulver wurden in Wasser zu einem Liter Lösung gelöst. Nach dem Steriliso sieren der Lösung wurden 3 % Starterkultur der Variante zugesetzt, und die Lösung wurde 12 Stunden lang bei 37 °C kultiviert. 525 ml der kultivierten Lösung wurden mit Sirup vermischt, der 100 g Fruchtsaft (Mandarinen und Äpfel), 40 g Zucker und 35 g Sorbit enthielt. Zu der Mischung wurde 55 Würze gegeben, und die Mischung wurde zu einem fermentierten Milchprodukt homogenisiert. Das so erhaltene Produkt hatte eine Affinität von 4,0 und einen pH-Wert von 4,6 und die Population an lebensfähigen Bifidobakterien war 1,5 x Ì09/ml.

60 Unter dem Ausdruck «Population» ist in einigen Fällen die Keimzahl zu verstehen. Unter dem Ausdruck «reduzierte, nichtfette Milch» bzw. «reduziertes, nichtfettes Milchmedium» o.ä. ist eine teilentrahmte Vollmilch, eine im Wassergehalt verminderte Milch oder eine verdünnte Milch zu verstehen.

s

1 Blatt Zeichnungen

Claims

627 348

1. Verfahren zur Herstellung fermentierter, lebensfähige Bifidobakterien enthaltender Milch, dadurch gekennzeichnet, dass eine sich unter aeroben Bedingungen in einem reinen, keine wachstumsfördernden Substanzen enthaltenden Milchmedium vermehrende Variante von Bifidobakterien in einem Milchmedium kultiviert wird.

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bifidobakterium-Variante Bifidobacterium bifïdum YIT-4002 (Hinterlegungsnummer FERM-P 3371) ist.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentierung in Gegenwart von Milchsäurebakterien durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine fermentierte Milch hergestellt wird, die neben lebensfähigen Bifidobakterien organische Säuren, vorzugsweise Essigsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Molverhältnis von 1,6 ± 0,5 (Essigsäure/Milchsäure) enthält.

5. Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestellte fermentierte Milch.

6. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestellten fermentierten Milch zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken, die lebensfähige Bifidobakterien enthalten.