DE2202701B2

DE2202701B2 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von zitronensaeure

Info

Publication number: DE2202701B2
Application number: DE19722202701
Authority: DE
Inventors: Junichi; Ishii Kazumitsu; Nakajima Yoshikazu; Iwakura Tatsuya; lizuka Hiroshi; Tokio Shimizu
Original assignee: Joh. A. Benckiser Gmbh, 6700 Ludwigshafen
Priority date: 1971-07-23
Filing date: 1972-01-20
Publication date: 1978-02-23
Also published as: BE786617A; IE36581L; IE36581B1; FR2147131B2; DE2202701A1; FR2147131A2; JPS4826981A; IL39950A; AU458847B2; IL39950A0; ES405090A1; DE2202701C3; BR7204885D0; NL7210136A; AU4466972A; AT319875B; IT966665B; GB1354192A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure durch Züchten von Candida oleophila ATCC 20177 in einem pH-Bereich von 2 bis 8 unter aeroben Bedingungen in einer ü Kulturflüssigkeit, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und übliche Neutralisierungsmittel in Verbindung mit anderen anorganischen und organischen Bestandteilen enthält.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als 4« Kohlenstoffquelle η-Paraffine mit 5-35 Kohlenstoffatomen verwendet werden.

Bei bekannten Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure, die in der Technik praktisch ausgeübt werden, werden Schimmelpilze, insbesondere ·τ> Aspergillus niger, verwendet, und als Kohlenstoffquelle für das bei der Gärung verwendete Kulturmedium werden Saccharide, insbesondere Melasse, verwendet. Außerdem wird die Gärung im allgemeinen mit Hilfe einer Oberflächenkultur durchgeführt. Die Submerskul- >o tür gewinnt aber in neuerer Zeit eine immer größere praktische Bedeutung.

Die Submerskultur von Aspergillus niger bietet aber gewisse Schwierigkeiten. So erfordert die submerse Züchtung beispielsweise einen hohen technischen Aufwand zur Regulierung des Gärprozesses.

Aus der DT-OS 18 12 710 ist zwar bereits ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure durch einen Mikrobenstamm der Gattung Candida in zuckerhaltigen Nährsubstraten bekannt, ω Hier wird als Mikroorganismus Candida oleophila ATCC 20177 — der auch im vorliegenden Fall benutzt wird — unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit, die assimilierbare Kohlehydrate und übliche Neutralisierungsmittel, wie Calciumcurbonat, in Verbin- h--> dung mit anderen anorganischen und organischen Bestandteilen enthält, verwendet.

Die bei diesem Verfahren erhaltenen Ausbeuten

ließen jedoch noch zu wünschen übrig.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Candida oleophila ATCC 20177 nicht nur Kohlehydrate assimiliert, sondern auch bei der Züchtung in einem η-Paraffine mit 5-35 Kohlenstoffatomen enthaltenden Kulturmedium Zitronensäure in großer Menge zu bilden vermag.

Das ist um so überraschender, als der erfindungsgemäß verwendete Mikrobenstamm beispielsweise bei Verwendung von Kerosin als Kohlenstoffquelle, bei dem es sich bekanntlich um ein Gemisch der verschiedensten Kohlenwasserstoffe, einschließlich aromatischer, isocyclischer und verzweigter Kohlenwasserstoffe mit 10-16 Kohlenstoffatomen und mit einem Siedepunkt von 175-325°C handelt, praktisch keine Zitronensäure bildet.

Zwar sind aus den DT-OS 20 02 048 und 20 50 361 andere Candida-Arten bekannt, die paraffinische Kohlenwasserstoffe u. a. zu Zitronensäure vergären, dieses jedoch in geringer Ausbeute und nach langer Kulturdauer.

Zum Unterschied dazu bildet sich beim erfindungsgemäßen Verfahren Zitronensäure in besonders hohen Ausbeuten, die sogar denjenigen überlegen sind, die gemäßder DT-OS 18 12 710erhalten werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt η-Paraffine mit 9-20 Kohlenstoffatomen als Kohlenstoffquelle verwendet.

Die Kulturflüssigkeit enthält bevorzugt 5 — 20, bevorzugter 10— 15 Vol.-%, bezogen auf die Kulturflüssigkeit, n-Paraffine.

Die für die Taxonomie des beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stammes der Gattung Candida olephila ATCC 20177 charakteristischen Eigenschaften sind die folgenden:

1) Wachstum in Malzextrakt

Nach 3tägigem Wachstum bei 25°C sind ovale oder länglichovale Zellen entstanden, deeren Größe (2,5-5,0 μ) χ (3,0-15,0 μ) beträgt. Auf der Oberfläche des Kulturmediums hat sich ein schwerflüssiger ausgedehnter Ring bzw. eine entsprechende Haut gebildet. Dieser Ring bzw. diese Haut ist glatt oder runzlig und hellbräunlich cremefarben. Es werden keine Ascosporen, sondern es wird ein Pseudomyce! gebildet.

2) Aufstreichkultur auf Malz-Agar

Nach 3tägigem Wachstum bei 25°C ist die Aufstreichkultur glatt und hellbräunlich cremefarben. Die Form der Zellen ist die gleiche wie im Falle des Malzextraktes. Es werden keine Ascosporen, sondern es wird ein Pseudomycel gebildet.

3) Plattenkultur

Das Pseudomycel entwickelt sich gut auf Kartoffel-A gar.

4) Physiologische Eigenschaften

i) optimale Wachstumsbedingungen: pH 5,2;

Temperatur 30°C; aerobe Bedingungen;
ii) Assimilierung von Kaliumnitraten: keine;
iii) Koagulierung von Milch: keine;
iv) osmophile Eigenschaft

(in IO°/oigem NaCI-Medium): keine;
v) Verflüssigung von Gelatine: keine;
vi) Vitaminbedarf: keiner;
vii) Bildung von Karotinfarbstoffen: keine.

5) Assimilierbare Stickstoffquclle
Pepton, Ammoniumsulfat und Harnstoff

6) Assimilierbare Kohlenstoffquelle

Glukose +

Galactose +

Saccharose +

Maltose —

Lactose —
Stärke

7) Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle
Gutes Wachstum

8) Kerosin als einzige Kohlenstoffquelle
Gutes Wachstum

9) Gärungen von Glukose, Galactose, Saccharose,
Maltose, und Lactose

Keine

10)Arbutin-Spaltung
Keine

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroben-Stamm unterscheidet sich damit deutlich von anderen Stämmen der Gattung Candida.

Eine Kultur des lebenden Organismus ist bei der American Type Culture Collection unter der Registrierungs-Nr. 20177 am 13.11.1968 hinterlegt worden.

Die als Kohlenwasserstoffe verwendeten n-Paraffine können für sich allein oder im Gemisch angewendet werden.

Zu den Stickstoffquellen, die beim erfindungsgemäß verwendeten Kulturmedium benutzt werden, gehören beispielsweise Ammoniak, Harnstoff, anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumacetat, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maiseinweichwasser, Fischmehl, ein aufgeschlossenes Produkt desselben, Sojabohnenkuchen oder ein aufgeschlossenes Produkt desselben u.dgl. mehr. Diese Stickstoffquellen können für sich allein oder im Gemisch verwendet werden.

Gegebenenfalls kann ein anorganisches Material, wie ein Phosphat, ein Magnesiumsalz oder ein Mangansalz, und ein Vitamin, wie Thiamin oder Nikotinsäure, dem Kulturmedium einverleibt werden.

Um zu verhindern, daß der pH,-Wert des Kulturmediums schwankt, empfiehlt es sich, vorher Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat dem Kulturmedium zuzusetzen, um die während der Züchtung gebildete und angesammelte Zitronensäure zu neutralisieren. Die Salze oder Calciumhydroxyd oder Natriumhydroxyd können aber auch dem Kulturmedium während der Züchtung zugegeben werden.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Kulturmedium wird in der Weise hergestellt, daß man eine wäßrige Lösung der oben angeführten Nährstoffe sterilisiert und anschließend den Kohlenwasserstoff oder die Kohlenwasserstoffe zugibt. Man kann aber im Falle, daß eine Sterilisierung des Kohlenwasserstoffes erforderlich ist, den Kohlenwasserstoff vorher einer Sterilisierung durch Erhitzen oder Filtration unterwerfen. Der Kohlenwasserstoff bzw. die Kohlenwasserstoffe werden im allgemeinen dem Kulturmedium zu Beginn zugesetzt, doch können sie dem Kulturmedium wahrend der Züchtung auch portionsweise oder kontinuierlich zugesetzt werden.

Dann wird normalerweise eine wäßrige Anschlämmung von Calciumcarbonat durch Erhitzen sterilisiert und dem Kulturmedium als Netitralisationsmittel zugegeben.

^r> Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine aerobe Züchtung angewendet. Es ist vorteilhaft, von einer submersen Züchtungsmethode unter Durchwirbeln mittels Einblasen von Luft mit anschließendem lebhaftem Rühren zwecks guter Dispergierung der Kohlen-Wasserstoffe in dem Kulturmedium Gebrauch zu machen. Die Luftmenge, die zu diesem Zweck in das Kulturmedium eingeblasen wird, beträgt das 'Λ- bis 2fache des Volumens des Kulturmediums pro Minute, und der Druck im Gärtank kann Normaldruck oder ein

i) erhöhter Druck sein.

Die Züchtung wird bevorzugt bei Temperaturen von etwa 20 bis 35⁰C und bei sinem pH-Wert von 2 bis 8, vorzugsweise 4 bis 8, und für eine Dauer von etwa 3 — 7 Tagen durchgeführt.

2(i Beim Ende der Kultur liegt die gebildete Zitronensäure in der Gärflüssigkeit bei Verwendung von Calciumcarbonat als Neutralisierungsmittel als Calciumzitrat vor, das von der Gärflüssigkeit durch Abfiltrieren gemeinsam mit der restlichen Hefe, versetzen der

2^r> Feststoffe nach dem Waschen mit einer bestimmten Menge Schwefelsäure, um die Zitronensäure freizumachen und in Lösung zu bringen, und anschließendem Abfiltriere.i der ungelösten festen Substanzen, die aus Calciumsulfat und Hefe bestehen, aufgearbeitet wird.

Das Filirat wird zwecks Entfärbung gegebenenfalls mit Aktivkohle oder lonenaustauschharzen behandelt und anschließend konzentriert, wodurch die Zitronensäure ausgefällt und gesammelt wird. Man kann auch zur Gärflüssigkeit direkt Schwefelsäure zusetzen, die Hefe

Γ) und das Calciumsulfat durch Filtrieren entfernen und das Filtrat — gegebenenfalls nach entsprechender Reinigung — konzentrieren, um die Zitronensäure zur Auskristallisation zu bringen.

Die mit der vorliegenden Erfindung verbundenen

4ii Vorteile lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1) Im Vergleich zu dem üblichen Fall der Verwendung von Sacchariden als Rohmaterial ist es beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich,

4-5 Ferrocyanid, Methanol u.dgl. zum Kulturmedium

zu geben, und außerdem sind Vorbehandlungsoperationen, wie das Entsalzen und das Reinigen des Saccharids als Rohmaterial unnötig, und die Zitronensäure wird in höherer Ausbeute erhalten.

5« 2) Das Säurebildungsvermögen des erfindungsgemäßen Mikroben-Stammes ATCC 20177 ist in hohem Maße beständig, und die Mikroorganismen sind einfach zu handhaben.
3) Bei der Gärung sind geringere Befürchtungen

γ-, hinsichtlich einer Verunreinigung durch Bakterien

oder Hefen zu hegen, selbst wenn die Gärvorrichtungen, das Kulturmedium und die Luft einmal nicht so sorgfältig sterilisiert worden sind. Ferner ist im Vergleich zu anderen Verfahren, die Melasse

W) u.dgl. als Rohmaterialien verwenden, die Bildung

von Schaum während der Züchtung beim erfindungsgemäßen Verfahren geringer, wodurch das erfindungsgemäße Verfahren besonders wirtschaftlich gestaltet werden kann sowohl im

h> Hinblick auf dessen praktische Durchführung als

auch im Hinblick auf die Einsparung von Antischaummitteln. Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren wirtschaftlicher in bezug auf die

betriebstechnische Durchführung der Fermentation im Vergleich zu anderen bekannten Verfahren.

4) Da die Fermentationsdauer beim erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise auf etwa 74 Stunden herabgesetzt werden kanr·, ist es möglich, das Verhältnis im Durchsatz zur Anlagegröße außerordentlich günstig zu gestalten. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren sowohl absatzweise als auch kontinuierlich durchgeführt werden.

5) Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Gewinnung von Zitronensäure in wirtschaftlicher Weise unter Verwendung eines Kohlenwasserstoffes als Kohlenstoffquelle mittels einer Subrnerskultur.

6) Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das η-Paraffin in einer hohen Konzentration, die 5 — 20% beträgt, in einem Kulturmedium fermentiert. Auch das η-Paraffin kann dem Kulturmedium diskontinuierlich oder kontinuierlich während der Gärung zugesetzt werden.

7) Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Zitronensäure in der erstaunlich hohen Ausbeute von 150 Gew.-%, bezogen auf das n-Paraffin, erhalten.

Um die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bekannten Verfahren zu zeigen, wurden folgende Versuche durchgeführt.

Es wurde ein Kulturmedium verwendet, das im Grundsatz

Harnstoff
KH₂PO₄
MgSO₄ · 7 H₂O
MnSO₄ · η H₂O
Maisein weich wasser
CaCO j

0,10Gew.-%
0,02 Gew.-%
0,02Gew.-%
0,025 Gew.-%
l,0Gew.-%
10,0Gew.-%

sowie entweder a) 15 Gew.-°/o Glucose oder b) 10 Vol.-% Kerosin oder c) 10 Vol.-% C,₀-C|₄-n-Paraffin im Gemisch, Rest Wasser, enthielt.

Je 25 ml dieses Kulturmediums wurden in 500 ml Schüttelflaschen eingefüllt, die mit Wattestopfen verschlossen waren, und 15 Min. bei 120"C sterilisiert. Die Kolben wurden mit 2,5 ml Inokulum von Candida oleophila ATCC 20177 in einer Hefe-MJzkultur (0 3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 1% Glucose, 0,5% Pepton) beimpft und im Falle a)4 Tage und in den Fällen b)undc)7Tagebei28°Cmit 135 UpM geschüttelt.

Anschließend wurden zum Kolbeninhalt 50 ml Wasser und 25 ml 2 n-HCI gegeben und die Niederschläge von Calciumsalzen auf dem Wasserbad in Lösung gebracht. Es wurde schnell abgekühlt und die Lösung auf 250 ml mit Wasser aufgefüllt. Die erhaltenen Flüssigkeilen wurden auf die Zahl der Mikroorganismen (Thoma-Zeiss-Zählkammer nach Verdünnung) nach Abzentrifugieren und Neutralisieren auf Restzucker nach Schaffer-Somogy (nur im Fall a)) und auf Zitronensäure durch Ausfällen von überschüssigem Ca mittels NH₂SO₄ und Bestimmung mittels Pentabromaceton geprüft.

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

20

•III

Versuch	Zahl der	Substrat-	Zitronen
(Substrat)	Mikro-	verbrauch	säureaus
	organismen-		beute, be
	zellen		zogen aul
			verwendetes
			Substrat

a) Glucose

b) Kerosin

8 χ 108
10 χ 10^s

c) n-Paraffine 14 χ 108

98%

erheblicher unverbrauchter Rest

fast quantitativ

65-68% nicht bestimmbar

120%

Es zeigt sich, daß bei Versuch c) (erfindungsgemäß) eine erheblich höhere Ausbeute von Zitronensäure als bei Versuch a) (gemäß der DT-OS 18 12 710) verbunden mit einer stärkeren Mikroorganismenvermehrung auftrat, während der Versuch b) keine merkliche Zitronensäurebildung trotz relativ guten Wachstums der Mikroorganismen ergab.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

Beispiel

Nach Einfüllen von 100 ml eines Kulturmediums, das 1% Glukose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt (die Prozente sind jeweils als Gewicht pro Volumen berechnet) enthält, in eine 500-ml-Flasche und Sterilisieren des Kulturmediums durch Aufkochen, wurde das Inokulum hergestellt durch Inkubation von Candida oleophila ATCC 20177 im Kulturmedium und Züchtung mittels 24 Stunden langem Schütteln des Kulturmediums bei 28°C. Von dem nach dieser Prozedur erhaltenen Inokulum wurden 400 ml zur Beimpfung des Gärmediums verwendet.

In etwa 9 Liter Wasser wurden 120 g Glukose, 60 g Pepton, 36 g Hefeextrakt und 36 g Malzextrakt gelöst, und die so erhaltene Lösung wurde durch 15 Minuten langes Kochen bei 120⁰C in einem Fermenter von 30 I sterilisiert und anschließend auf 28°C abgekühlt. Dann wurden 1,2 Liter eines Gemisches von η-Paraffinen mit 11—15 Kohlenstoffatomen, das vorher durch Filtrieren sterilisiert worden war, und 600 g CaCOj, die durch Erhitzen sterilisiert worden waren, zu der Lösung in dem Fermenter gegeben und außerdem sterilisiertes Wasser zum Gemisch gegeben, um das Volumen des

bO Gemisches auf 11,6 Liter einzustellen. Anschließend folgte ein gründliches Durchrühren.

Das auf diese Weise erhaltene Kulturmedium wurde mit dem — wie oben angegeben — hergestellten Inokulum beimpft. In dem so erhaltenen Gärmedium betrug die Anfangskonzentration der n-Paraffine 10 VoI.-% und der Anfangs-pH 5,5.

Unmittelbar nach der Beimpfung wurde die Gärung in Gang gebracht und hierbei eine Belüftungsgeschwindigkeit von 12 Liter Luft/Minute, eine Rührgeschwindigkeit von 500 UpM und eine Temperatur von 28°C eingehalten. Unter diesen Bedingungen war die Gärung nach 96 Stunden abgeschlossen.

Nach Beendigung der Gärung betrug die Menge der Zitronensäure, die sich gebildet hatte, 1320 g, und die Mikroorganismen-Population belief sich auf 8,5 χ H)⁸ Zellen pro ml. Der Mengenwert entsprach einer Zitronensäureausbeute von 152 Gew.-%.

Aus der so entstandenen Gärbrühe wurden Calciumzitrat, die Mikroorganismen und überschüssiges Calciumcarbonat durch Filtrieren abgetrennt und gesammelt, und nach dem Waschen des abfiltrierten Gemisches

wurde dieses Gemisch mit Schwefelsäure versetzt, um die Zitronensäure in Freiheit zu setzen. Nach dem Entfernen der Mikroorganismen und des Calciumsulfates durch Filtrieren wurde das verbleibende Filtrat konzentriert und in einem Kristallisierapparat zur Kristallisation gebracht, um so Zitronensäurekristalle zu gewinnen.

Beispiel 2

In etwa 9 Liter Wasser wurden 24 g NH₄Cl, 2,4 g KH₂PO₄, 2,4 g MgSO₄ · 7 H₂O, 3,0 g MnSO₄ · η H₂O und 120 g Maiseinweichwasser gelöst, die Lösung wurde durch 15 Minuten langes Kochen bei 120°C in einem 30-Liter-Schüttel-Fermenter sterilisiert und anschließend auf 28°C abgekühlt. Zu der so erhaltenen Lösung wurden 1,2 Liter eines Gemisches von η-Paraffinen mit 11 — 15 Kohlenstoffatomen, das vorher durch Erhitzen sterilisiert worden war, und 600 g gepulvertes Calciumcarbonat, das gleichfalls durch Erhitzen sterilisiert worden war, zugesetzt. Anschließend wurde das Volumen des Gemisches durch Zugabe von sterilisiertem Wasser auf 11,6 Liter eingestellt, und dann folgte ein gründliches Durchrühren. Das so erhaltene Kulturmedium wurde mit 400 ml des Inokulums, das nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 hergestellt worden war, beimpft. In dem so erhaltenen Gärmedium betrug die Anfangskonzentration an n-Paraffinen 10 Vol.-°/o und der pH 5,5.

Unmittelbar nach der Beimpfung wurde die Gärung in Gang gebracht und hierbei eine Belüftungsgeschwindigkeit von 12 Liter Luft pro Minute und eine Rührgeschwindigkeit von 500 UpM eingestellt und eine Temperatur von 28°C eingehalten. Unter diesen Bedingungen war die Gärung nach 96 Stunden beendet.

Nach Beendigung der Gärung betrug die Menge der r> gebildeten Zitronensäure 1230 g, was einer Zitronensäureausbeute von 141 Gew.-% entspricht.

Durch Zugabe von Schwefelsäure zu der so erhaltenen Gärbrühe wurde die Zitronensäure in Freiheit gesetzt, und die Mikroorganismen und das id Calciumsulfat wurden hieraus durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde konzentriert und in einer Kristallisiervorrichtung zur Kristallisation gebracht, um Zitronensäurekristalle zu gewinnen.

Beispiel 3

In etwa 9 Liter Wasser wurden 24 g NH₄CI, 2,4 g KH₂PO₄, 2,4 g MgSO₄ ■ 7 H₂O, 3,0 g MnSO₄ · η H₂O und 120 g Maiseinweichflüssigkeit gelöst, und die Lösung wurde in einen 30 Liter fassenden Fermenter >o gefüllt. Anschließend erfolgte das 15 Minuten durchgeführte Sterilisieren durch Kochen bei 120"C, wonach auf 28"C abgekühlt wurde.

Zu der so erhaltenen Lösung wurden 480 ml eines Gemisches von η-Paraffinen mit 11 — 15 Kohlenstoff v> atomen, das vorher durch F.rhiizen sterilisiert worden war, und 600 g gepulvertes ( alcinmcarbonal, das ebenfalls durch Erhitzen sterilisiert worden war gegeben. Dann wurde das Volumen des Gemisches durch Zugabe von sterilisiertem Wasser auf 11,6 Liter eingestellt und gerührt. Das so erhaltene Kulturmedium wurde mit 400 ml eines Inokulums, das aus Candida oleophila ATCC 20177 analog Beispiel 1 hergestellt worden war, beimpft. Hierdurch wurde die Anfangskonzentration an η-Paraffinen auf 4,0 Vol.-% und der Anfangs-pH des Kulturmediums auf 5,5 eingestellt.

Unmittelbar nach der Beimpfung wurde die Gärung in Gang gesetzt und zu diesem Zweck eine Belüftungsgeschwindigkeit von 12 Liter Luft/Min., eine Rührgeschwindigkeit von 500 UpM und eine Temperatur vor 28°C eingehalten. Nachdem die Gärung in Gang gebracht worden war, wurden 2 Vol.-% n-Paraffinc periodisch in drei Stufen zugegeben, und die Gärung war nach 74 Stunden beendet.

Die Zitronensäure, die sich nach Beendigung det Gärung gebildet hatte, betrug mengenmäßig 1350 g was einer Zitronensäureausbeute von 155 Gew.-% entspricht.

Aus der Gärbrühe wurden Zitronensäurekristalle analog Beispiel 1 gewonnen.

Beispiel 4

Drei Fermenter von einem Fassungsvermögen von je 30 Liter wurden miteinander in Serie verbunden. Danr wurde in dem ersten Fermenter die Gärung vor Candida oleophila ATCC 20177 analog Beispiel 2 ir Gang gebracht. Danach wurde ein sterilisierte; Kulturmedium, das 0,2% (Gewicht/Volumen) NH₄CI 0,02% (Gew./Vol.) KH₂PO₄, 0,02% (Gew./Vol. MgSO₄ · 7 H₂O, 0,025% (Gew./Vol.) MnSO₄ ■ π H₂O 1,0% (Gew./Vol.) Maiseinweichwasser, 10 VoL-⁰A η-Paraffine mit 11-20 Kohlenstoffatomen und 5,0°/( (Gew./Vol.) CaCO3 enthielt, kontinuierlich in den erster Fermenter in einer Dosierung von 12 Liter pro 2< Stunden gegeben, und zwar 24 Stunden nach Ingangset zen der Gärung. Anschließend wurde die Gärbrühi kontinuierlich in den zweiten Fermenter und darar anschließend in den dritten Fermenter befördert Nachdem der erste, zweite und dritte Fermenter in der stationären Zustand gebracht worden war, wurde du Gärbrühe aus dem dritten Fermenter kontinuierlich mi einer Geschwindigkeit von 12 Liter pro 24 Stundet abgezogen, und es wurde die gebildete Zitronensäure bestimmt.

Wenn die Gärung 20 Tage fortgesetzt wurde, wäret bezüglich der Fermentation keine besonderen Umstän de erforderlich. Außerdem wurde — nachdem da: System den stationären Zustand erreicht hatte Zitronensäure in einer Menge von 107 g/Liter erzeugt Dieser Wert entspricht einer /.itronensäureausbeuK von 148 Gew.-% bezogen auf die zugesetzte Menge at ü i'i'.rafl'inen.

Aus der so erhaltenen Garbrühe wurden Ziimnensäu rekristalle analog Beispiel 1 gewonnen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure durch Züchten von Candida oleophila ATCC 20177 in einem pH-Bereich von 2 bis 8 unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und übliche Neutralisierungsmittel in Verbindung mit anderen anorganischen und organischen Bestandteilen ent- ι ο hält, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle η-Paraffine mit 5-35 Kohlenstoffatomen verwendet werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle η-Paraffine mit i> 9 — 20 Kohlenstoffatomen verwendet werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturflüssigkeit 5 — 20, vorzugsweise 10—15 Vol.-%, bezogen auf die Kulturflüssigkeit, η-Paraffine enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur zwischen etwa 20-35°C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch 2^r> gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von CaCO) als Neutralisierungsmittel züchtet.