DE2162325B2 - Verfahren zur Bestimmung von Fettsäureglycerinestern und Reagens zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Fettsäureglycerinestern und Reagens zur Durchführung des Verfahrens

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
Die Bestimmung von Fcttsr.urcglyccrinestern ist in vielen Bereichen und insbesondere in der klinischen Biochemie von Wichtigkeit. Besondere Bedeutung kommt der Bestimmung von Fettsiiureglycerinestern im menschlichen Serum zu, da erhöhte Werte von großer diagnostischer Bedeutung sind. Die Fettsäureglycerinester im Serum werden im allgemeinen vereinfacht als Triglyccrkle bezel·■ hnet.
Bekannte Verfahren, die auf der Bestimmung des Fcttsiiurciintcils beruhen, haben ebenso wie Verfahren, bei denen aus anderen Quellen freigesetztes Glycerin bei der Glycerinbestimmiing mitbestimmt wird, verschiedene Nachteile.
Nach einem bekannten Verfahren werden die ettsiiurenlycerinester alkalisch ImlioUsicti. im.I das freigesetzte Glycerin wird anschließend enzymatisch bestimmt, vgl. R. Richterich, Klinische Chemie, 2. erweiterte Auflage, S. Karger, Basel 1968, Seiten 272 bis 278 mit weiteren Nachweisen. Auch diese Methode hat Nachteile, da die alkalische Hydrolyse bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden muß. Ein schnelles und genaues Verfahren zur ausschließlichen und vollständigen Bestimmung von Fettsäureglycerinestern ist im klinischen Bereich sehr erwünscht, da die bisher bekannten Verfahren im allgemeinen nicht völlig zufriedenstellend verlaufen.
Aus Comptes Rendus Acad Sa Paris, Bd. 259 (1964) Seiten 4394 bis 4396 ist bekannt, daß eine aus Rhizopus-Stämmen isolierte Lipase zur Spaltung von Triglyceriden geeignet ist. Nachteilig ist hierbei jedoch die geringe Spaltungsgeschwindigkeit. Zur Beschleunigung wird deshalb z. B. der Zusatz von Ci'.ciumionen empfohlen. Calciumionen bilden jedoch mit den freigesetzten Fettsäuren unlösliche Seifen, die zu Trübungen führen und damit die spektroskopische Messung erschweren und verfälschen. Die gleichen Nachteile weist der in der DE-PS 20 00 127 beschriebene Vorschlag auf, für die enzymatische Spaltung von lipoproteingebundenen Tri-, Di- u>id Monoglyceriden gegebenenfalls zusammen mit proteinfreien Nculralfetten eine aus Rhizopus arrhi/us gewonnene Lipase einzusetzen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und genaues Verfahren und ein Reagens zu schaffen, bei dem Glycerin aus Fettsäureestern, ζ. B. in wäßrigen Medien, wie Serum oder Milch, freigesetzt wird, und das es erlaubt, das Glycerin nach einer Vielzahl von Methoden ohne vorherige Isolierung aus der zu untersuchenden Flüssigkeit enzymatisch zu bestimmen.
Diese Aufgabe wird gemäß dem kennzeichnenden Teil des Patenta ,pruehs I gelöst. Das Reagenz zur Durchführung des Verfahrens geht aus Anspruch 7 hervor. Ausgestaltungen des Verfahrens und des Reagenz sind in den Ansprüchen 2 bis b bzw. 8 bis 11 beschrieben.
Im erfindungsgcmäßcn Verfahren wird eine den zu bestimmenden Fcttsiiureglyccrincstcr enthaltende wäßrige Flüssigkeit mit einem Gemisch aus einer Lipase und einer Protease versetzt. Die erfindungsgemäß verwendete Lipase kann pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein. Vorzugsweise wird eine Lipase mikrobiellen Ursprungs. z. B. die rohe oder gereinigte Lipase aus Chromobacieritim viscosum, variant parulipolyticum, oder die gereinigte Lipase aus Rhizopus dclcmar (vgl. Fukumotoet al.. |.Gcn. Λ ppi. MicrobioL Band 10[19M]. Seiten 257 bis 265) eingesetzt. Als Protease kann erfindungsgemäß eine allgemein übliche Protease verwendet werden. Spezielle Beispiele solcher Proteasen sind Chymotrypsin, Trypsin, Strcptomyces griseus-Protease. Elastase, Papain und Bromelain. Eine besonders bevorzugte Protease ist (^-Chymotrypsin. Es können auch Gemische von Proteasen verwendet werden.
Zur Durchführung des erfiridungsgemäßen Verfahrens ist im allgemeinen ein Geniisch aus einer l.ipase und einer Protease ausreichend, obwohl die Hydrolyse im allgemeinen durch einen Zus.Hz eines Proteins, wie Serunialbtimin. Eialbiimin oder Globuline, etwas be schleunig! wird.
I),is erfindungsgemäU freigesetzte Glycerin kann nach einer Vielzahl von bekannten Verfahren bestimmt werden, l'.iniue Beispiele sind nachstehend beschrieben.
Gemäß diesem bevorzugten Verfahren wird die enzymatische Hydrolyse der Triglyceride mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Lipase-Protease-Gemisch in Gegenwart der Bestandteile von drei weiteren Enzymsystemen durchgeführt. Hierbei wird das freigesetzte Glycerin zunächst mit Adenosiniriphosphat mittels des Enzyms Glycero-Kinase in Glycerin-1 -phosphat umgewandelt, wobei Adenosindiphosphat gebildet wird.
Das entstandene Adenosindiphosphat wird mit Phosphoenolpyruvat mit Hilfe des Enzyms Pyruvat-Kinase wieder in Adenosintriphosphat überführt, wobei
II) aus dem Phosphoenolpyruvat Pyruvat gebildet wird. Das entstandene Pyruvat wird mit reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid mit Hilfe des Enzyms Lactat-Dehydrogenase zu Lactat und oxydiertem Nicotinamidadenindiriucleotid umgesetzt. Da sämtliche zur Durchführung der genannten Reaktionen notwendigen Bestandteile in dem Gemisch enthalten sind, nimmt mit fortschreitender Hydrolyse des Triglycerids die optische Dichte der Testlösung bei 340 nm wegen der fortschreitenden Oxydation des Nicotinamidadenindinucleotids ab. Diese enzymatischen Reaktionen sind nachstehend schematisch zusammengestellt:
I-lnzymalische I lydmlyse (Lipase-Prolease-Gemiseh Triglyceride » Glycerin -f freie Fettsäuren
Glycero-Kinase
Glycerin + Adenosintriphosphat · Glycerin-1-phosphat
-t- Adenosindiphosphat
Pyruval-Kinase Adenosindiphosphat -I- I'hosphoenolpyruvat - · Adenosintriphosphai
I- Pyruvat
Laclal-Di'hydrogenase
Pyruval + NAOlI > Lactat t NAH
NAD = Oxydiertes Nicolinamidadcnindinucicolid (absorbier! nichl bei 340 nm) NADH = Reduziertes Nicolinamidadcnindinucicolid (absorbiert stark bei 340nm; molarer Exlinktionskocffizicnl = 6.22 χ 10'').
Die zur Durchführung dieses Verfahrens erforderlichen Rcagcnticn werden vorzugsweise in zwei getrennten Behältern, wie Glasfläschchen, zur Verfügung i, gestellt. Ein Behälter A kann sämtliche /ur Durchführung der Bestimmung benötigten Bestandteile mit der Ausnahme von Glycero-Kinase enthalten. Die Glycero-Kinase kann in dem Behälter B enthalten sein. Hs sind auch andere Verteilungen der Bestandteile möglich, ι» wobei die Bestandteile,die nur an der Glycerinumwandlung und den nachfolgenden Rcaktionsstufcn beteiligt sind, in dem Behälter B enthalten sein können.
Gemäß einer anderen Verfahrensweise kann das freigesetzte Glycerin auch dadurch bestimmt werden, r. daß man das reduzierte Nicolinainidadcnindinucleotid und die I.aetal-Dehydrogcnase aus dem vorstehend beschriebenen Gemisch wegliil.il, so daß nur die ersten drei Reaktionen des vorstehend aufgeführten Reaktionsschemas ablaufen. Das Gemisch wird hierbei mil >n einer zur Umsetzung des im dritten Reaklionsschrill entstandenen Pyruvals ausreichenden Menge Dinitrophenylhydrazin versetzt. Das so erhaltene Reaktionsprodukt ist im alkalischen Medium gefärbt und kann a'.if einfache Weise kolorimetrisch bestimmt werden. v.
Kino weitere Möglichkeit besieht darin, das Phosphoenolpyriival, die Pyruvat-Kinasc. die I.actat-Dehyilrogcna.se und das reduzierte Nicoiinamidadcnindiniicleotid aus dem vorstehend beschriebenen Gemisch weggelassen und dafür Glycerin-1 -phosphat-Dehydro- ι.ιι genäse und oxydiertes Nicotinamidadcnindinuclcotid ziiziisct/en, wobei Glycerin-1-phosphat und das oxydierte Nk'oiinamidadcnindinuclcotid in Dihydroxyacc lonphosphat und reduziertes Nicotin.imidadcnindiniiclcoliil umgewandelt werden. Die gebildete Menge an ι., reduziertem Nicoiinamidadcnindinuclcotid. die proporlional ist zur ursprünglich vorhandenen Me.ige an Triglycerid. kann in üblicher Weise i!iirch die /iniahme der Fluoreszenz bestimmt werden. Gemäß einer Abänderung kann dem vorstehend beschriebenen System eine ausreichende Menge Dinitrophenylhydrazin zugesetzt werden, das mit dem gebildeten Dihydroxyacetonphosphat unter Bildung eines gefärbten Produktes reagiert. Die Menge dieses Produktes läßt sich leicht kolorimetrisch bestimmen und ist gleichfalls ein Maß für die ursprünglich vorhandene Menge an Triglycerid.
Ferner kann die Glyccrinbcstimmung mit einem Gemisch durchgeführt werden, das nur die in der ersten Reaktionsstufe des vorstehenden Schemas beschriebene enzymatische Hydrolyse der Fettsäureglycerinester erlaubt. Das Gemisch enthält jedoch noch oxydiertes Nicotinamidadenindinucleotid und Glyccrin-Dehydrogenäse. Das freigesetzte Glycerin wird hierbei in Dihydroxyaceton unter gleichzeitiger Bildung von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid überführt. Der Anstieg der optischen Dichte bei J40 nm ist, wie vorstehend beschrieben, ein Maß für die ursprünglich vorhandene Menge an Triglycerid. Eine geeignete Glycerin-Dehydrogenasc ist aus Enterobacler aerogenes herstellbar; dieses Enzym ist im Handel erhältlich. Gemäß einer Abänderung kann das Reaktionsgemisch mit Dinitrophenylhydrazin versetzt werden, wobei ein gefärbtes Reaktionsprodukt mit Dihydroxyaceton entsteht, das kolorimetrisch bestimmt werden kann.
In den beiden letztgenannten Verfahrensweisen, die unter Verwendung von Glyccrin-1-Phosphal-Dchydrogenase bzw. Glycerin-Dehydrogenase durchgeführt werden, wird, wie bereits erwähnt, eine äquivalente Menge an reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid gebildet. Gemäß einer weiteren Abänderung, die auf beide dieser Verfahren angewendet werden kann, wird das bekannte Verhallen verschiedener Tetrazoliumsiilze ausgenutzt, die bei der Reduktion der ursprünglich
farblosen, wasserlöslichen Verbindungen in Farbstoffe umgewandeil werden. Das reduzierte Nicotinamidadenindinucleotid, dessen Menge proportional zu der Menge des ursprünglich vorhandenen Triglycerids ist, kann seinen Wasserstoff auf das Tetrazoliumsalz übertragen. Diese Reaktion lauft unter Bildung von oxydiertem Nicotinamidadenindinucleotid durch Vermittlung verschiedener bekannter Substanzen, vorzugsweise DLphorase oder Phenazinmethosulfat, quantitativ ab. Die so gebildete Farbstoffmenge kann auf einfache Weise kolorimetrisch, d. h., durch Bestimmung der Änderung der optischen Dichte im sichtbaren Bereich, bestimmt werden.
Die erwähnten Glycerinbestimmungsverfahren sind aus der Literatur bekannt.
Hierzu wird auf die nachfolgenden Literaturstellen verwiesen, in denen weitere Nachweise enthalten sind:
R. O. Briere. J. A. Preston und J.G. Batsakis,
American Journal of Clinical Pathalogy, Bd. 45, No. 5, Mai 1966, »Rapid Colorimetric (Tetrazolium Salt) Essay for Lactate Dehydrogenase«.und
H. U. Bergmeyer, »Methods of Enzymatic Analysis«, Academic Press, New York 196υ. S. 953 bis 955.
Die Mengenverhältnisse der Lipase oder des Lipasegemischcs und der Protease oder des Proteasegemisches betragen in dem Bestimmungsansatz vorzugsweise etwa 5 bis etwa 500 IU (Internationale Einheiten) Protease pro 1000 Lipase-Einheiten und insbesondere etwa 20 bis etwa 100 IU Protease pro 1000 Lipase-Einheiten.
1 Lipase-Einheit ist diejenige Enzymmenge, die aus Triolein nach 30minütiger Inkubation bei 370C so viel Fettsäure freisetzt, daß zu deren Neutralisation 1 ml 0.05 η Kalilauge erforderlich ist. Die Internationale Einheit für die proteolytische Aktivität ist die Proteasemenge, die pro Minute einen Umsatz von 1 Mikromol eines für die betreffende Protease spezifischen Substrats unter annäherungsweise optimalen Bedingungen bewirkt. Das Substrat für Chymotrypsin ist der Äthylester des Tyrosins. Der Umsatz kann in diesem Fall auf verschiedene Weise, z. B. durch Messing der Änderung der optischen Dichte bei 237 nm oder durch Bestimmung des freigesetzten Tyrosins als Phenolreagenz-Tyrosin-Äquivalente oder durch Titration mit Formaldehyd bestimmt werden. Dk NF-Einheit (National Formulary-Einheit) wird gelegentlich für Proteasen verwendet und erscheint auch im nachstehenden Beispiel. 1 NF-Einheit von «-Chymotrypsin ist diejenige Enzymmenge, die c ei der Inkubation mit N-Acetyl-l.-tyrosinäthylester linier den Testbedingungen pro Minute bei 237 nm eine Absorptionsänderung von 0,0075 hervorruft.
Das nachfolgende Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel
(1) Testkombination
Behälter A
Kaliumphosphat-Puffer. 0,1 m. pn7
Magnesiumasparaginaf 1.6 mg
Adenosintriphosphai, Dinatriumsalz 0,9 μ Mol
Phofphoenolpyruvat 0,9 μΜοΙ
Rinderserumalbumin 5,0 mg
Nieotinamidadenindinudeotid bis zu
einer Endabsurption von 0.8
(optische Dichte bei 340 nm)
Lactat-Dehydrogenase 2IU
Pyruvat-Kinase 6IU
fx-Chymotrypsin 1100 NF-Hin
heilen
Lipasp aus Rhi/opus deicmar 1200Lipasc-
Einheilcn
Gesamtvolumen
Behälter B
Glycero-Kinase
3 ml
2IU
Da 1 IU gleich 28 NF-Einh'. sn ist. entsprechen 1100 NF-Einheiten Λ-Chvmotrypsin 39 i'U. Da in der Testkombination 1200 Lipase-Einheiten enthalten sind, entfallen auf 1000 Lipase-Einheiten etwa 32 lU-Protease.
(2) Durchführung des Verfahrens
Ein aliquoter Teil der das Trigl^ccrid enthallenden, zu untersuchenden Flüssigkeit. z.B. 50 μ! Serum, wird zu dem Inhalt des Behälters A (3 ml) gegeben. Dieses Gemisch wird anschließend annähernd 10 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von 25 b,\ 37CC inkubiert. Sodann wird die optische Dichte bei 340 nm bestimmt. Anschließend wird das Gemisch mit dem Inhalt des Behälters B (2 IU Glycero-Kinase) versetzt und 10 Minuten bei derselben Temperatur stehen gelassen. Darauf wird wiederum die optische Dicht*■ bei 340 nm bestimmt. Die Differenz der erhaltenen Werte ist propotional zu dem Gehall an Triglycerid in der Probe.
Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß die bevorzugte Testkoinbination im Behälter A mindestens eine Lipase und eine Protease und im Behälter B mindestens Glycero-Kinase enthalten sollte. Die übrigen Bestandteile können in den beiden Behältern wahlweise verteilt werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird festgestellt, daß die Fettsäureglycerinester vollständig hydrolysiert werden, so daß eine stöchiornetrische Glycerinmenge freigesetzt wird. Der dieser Reaktion zugrunde liegende Mechanismus ist nicht bekannt; es ist jedoch sicher, daß der Grund tür den erfindungsgemäßen Ablauf der Reaktion auf der gemeinsamen Anwesenheit der Lipase und der Protease beruht. Wenn z. B. in menschlichen; Serum das aus Triglyceriden freigesetzte Glycerin gemäß dem vorstehenden Beispiel bestimmt wird, wird festgestellt, daß der erhaltene Glycerinwert dem bei vollständiger Hydrolyse der TrigiyCeride zu erwartenden Wert entspricht, wöbe' die letzteren nach bekannten Methoden bestimmt werden.

Claims (11)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Feusäureglycerinestern in wäßrigen Flüssigkeiten durch Hydrolyse der Fettsäureglycerinester und enzymatische Bestimmung des Glycerins, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Flüssigkeit mit einer Lipase und einer Protease versetzt und den bzw. die Fettsäureglycerinester vollständig hydrolysiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lipase mikrobiellen Ursprungs einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lipase aus Rhizopus delemar oder Chromobacterium viscosum oder ein Gemisch dieser Lipasen einsetzt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gelkennzeichnet, daß man als Protease Chymotrypsin, Trypsin, Strcptornyccs griscus-Pro tease. Elastase, Papain oder Bromelain oder ein Gemisch diesfir Proteasen einsetzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 5 bis etwa 500 IU Protease je 1000 Lipase-Einheiten einsetzt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß man die Triglyceride im Serum bestimmt.
7. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche I bis 6. gekennzeichnet durch ein Gemisch aus einer Lipase und einer Protease.
8. Reagenz nach Anspruch 7. gekennzeichnet durch ein Verhältnis der Protease zu der Lipase von etwa ^bisetwii 300 IU je 1000 Lipase-Einheiten.
9. Reugen/ nach Anspruch 7 oder 8. dadurch gekennzeichnet, daß die Lipase mikrobiellen Ursprungs ist.
10. Reagenz nach einem der Ansprüche 7 bis 9, gekennzeichnet durch den Gehalt an Lipase aus Rhizopus dclcmar. x-Chymotrypsin. Magncsiumasparaginat und Kaliumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7.
11. Reagenz nach Anspruch 10. gekennzeichnet durch ein Verhältnis der Protease zu der Lipase von etwa 5 bis etwa 500 IU je 1000 Lipase-Einheiten.
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