JPS59196100A - グリセロ−ルの測定法および測定組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグリセロールの測定法ならびにその測定組成物
に関する。さらに詳しくはグリセロールデヒドロゲナー
ゼを用いたグリセロールの測定において、ジヒドロキシ
アセトンまたはＤ−グリセルアルデヒドをリン酸化する
酵素を用い、グリセロールデヒドロゲナーゼが触媒する
反応を促進することを特徴とする測定法である。本発明
は特に生体液中のグリセロールまたはトリグリセライド
の測定に有用である。生体液中のグリセロールおよびト
リグリセライドの測定は、高脂血症の検査の一つとして
臨床上極めて重要な位置を占めている。特に高トリグリ
セライド血症は動脈硬化、冠状機能不全、心筋梗塞など
の早期診断、治療の目安として用いられるため、上記の
迅速かつ正確な測定方法が望まれている。

トリグリセライド測定の一方法であるリパーゼおよびグ
リセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法は次の反応式
で示されるように、まずトリグリセライドがリパーゼの
作用でグリセロールと脂肪酸に加水分解され、次いでグ
リセロールはＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下グリセロールデヒ
ドロゲナーゼの作用でジヒドロキシアセトン（またはＤ
−グリセルアルデヒド）とＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを生成し、
このときＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの紫外部における吸収または
螢光を測定することによりグリセロール、延いてはトリ
グリセライドが測定される。

リパーゼ トリグリセライド□グリセロール＋脂肪酸ここでＮＡＤ
　（Ｐ）＋はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
リン酸）を表し、ＧＤＨはグリセロールデヒドロゲナー
ゼを表す。

上記グリセロールデヒドロゲナーゼの触媒する反応は平
衡がＮＡＤ　（Ｐ）＋生成の方向に傾いているため正方
向に反応が充分進まず、従って反応時間が長くかかると
ともに測定精度および感度が低くまた測定できるグリセ
ロールの濃度範囲も狭いという欠点を有している。

この問題を克服するため従来はＮＡＤ　（Ｐ、）＋を過
剰量添加する、またはｐｔｕｏ〜１１の高いｐＨで反応
を行うといった酵素反応には不利な条件が強いられてき
た。上記グリセロールデヒドロゲナーゼの反応を進める
ためには、生成物であるジヒドロキシアセトンまたはＤ
−グリセルアルデヒドを反応系外に除去することが考え
られ、このような例としてヒドラジンを添加しジヒドロ
キシアセトンをヒドラゾンに変えることにより脱水素反
応を進める方法が試みられている（臨床病理、第２４巻
、８５５頁、　１９７６年）。しかしながらこの方法は
酵素が失活し易いという問題があり、本質的な解決法に
は至っていない。そこで本発明者らは酵素反応に好まし
い条件下でジヒドロキシアセトンまたはｌ１ｌｌ−グリ
セルアルデヒドを反応系外に除去する方法を鋭意検討し
たところ、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルア
ルデヒドをリン酸化する酵素を使用する方法を見いだし
本発明を完成したものである。

本発明法において用いるジヒドロキシアセトンまたはＤ
−グリセルアルデヒドをリン酸化する酵素の具体的な例
はトリオキナーゼまたはジヒドロキシアセトンキナーゼ
である。トリオキナーゼ（Ｔｒｉｏｋｉｎａｓｅ、系統
名　ＡＴＰ：Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスホトラン
スフェラーゼ、ＥＣ２，７，１，２８）は次式に示すよ
うに、アデノシン５′−三リン酸（以下ｒＡＴＰｊとい
う）などのリン酸化合物を供与体としてそのリン酸基を
Ｄ−グリセルアルデヒドに転移する反応を触媒する酵素
であり、ジヒドロキシアセトンもＤ−グリセルアルデヒ
ドとほぼ等速度でリン酸化することが知られている。

Ｄ−グリセルアルデヒド＋ＡＴＰ→ Ｄ−グリセルアルデヒド−３リン酸＋ＡＤＰ一方ジヒド
ロキシアセトンキナーゼ（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ａｃｅ
ｔｏｎｅ　ｋｉｎａｓｅ）はＡＴＰなどのリン酸供与体
のリン酸基をジヒドロキシアセトンに転移する反応を触
媒する酵素であるが、Ｄ−グリセルアルデヒドに対する
反応性は弱くトリオキナーゼとは異なる酵素であると考
えられている。。反応式を以下に示す。

ジヒドロキシアセトン＋ＡＴＰ− ジヒドロキシアセトンリン酸＋ＡＤＰ トリオキナーゼの例としてはモルモット肝、ラット肝、
バチルス・ズブチリス（ｆｊａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ　）などに存在することが知られている〔メソッ
ド　イノ　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、）第５巻、３６２頁（１９６２）　、
ユーロピアンジャーナル　オブ　バイオケミストリー（
Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第３１巻、５９頁（’１９７
２）およびジエンザイム（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）
第２版、第６巻、７５頁（１９６２）　）。またジヒド
ロキシアセトンキナーゼの例としてはキャンシダ・メチ
リカ（Ｃａｎｄ　＋ｄａｍｅｔｈｙｌｉｃａ　）　　（
ツァイトシュリフト　アルゲマイネ　ミクロビオロジエ
（Ｚ、　Ａｌ１ｇ、　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、　）第２０
巻、３８９頁（１９８０）および同第２１巻、２１９頁
（１９８１）　）　、グルコノバクタ−・サブオキシダ
ンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　５ｕｂｏｘｙｄａ
ｎｓ）　　Ｃ日本農芸化学会、中部支部・関西支部合同
大会（昭和５６年１０月９日）講演要旨集、３頁〕、ア
セトバクター・キシリナム（八ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　
ｘｙｌｉｎｕｍ　）　　（ジャーナルオブ　バクテリオ
ロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）第１２７巻、
７４７頁（１９７６）　）　、緑藻類の一種であるデユ
ナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）　　（プラント　フ
イジオロジ−（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）第５９
巻、　１５頁（１９７７）およびバイオキミカ　バイオ
フィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、八ｃｔａ）第　６１５％、１頁（１９８０）　）およ
び本発明者らが新たにスクリーニングしてシゾサツカロ
ミセス属菌に見いだした酵素があげられる。

本発明には上記トリオキナーゼまたはジヒドロキシアセ
トンキナーゼはいずれも用いることができるが、特に好
ましいのは酵素の生産性および性質などから、本発明者
らが新しく見いだしたシダサツカロミセス属に属する菌
株の産生ずるジヒドロキシアセトンキナーゼである。上
記以外にもジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルア
ルデヒドをリン酸化する酵素であればいずれも本発明に
用いることができるのは言うまでもない。

シダサツカロミセス属に属するジヒドロキシアセトンキ
ナーゼ生産菌は、具体的にはシダサツカロミセス°ポン
ベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂ
ｅ）ＩＦＯｏａ４ｏ、同ＩＦＯＣｌ３５４、シダ”ｊ−
ｙヵロミセス・マリデポランス（Ｓ、　ｍａｌｉｄｅｖ
ｏｒａｎｓ　）　ＩＦｏ　１６０８、シゾサツカロミセ
ス・ヤボニヵス（Ｓ、　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＩＦＯ１
６０９、シゾサツカロミセス・オフトスポラス（Ｓ、　
ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ　）　ＩＡＭ　１２２５７などが
あげられる。

このうち特に好ましいのはシゾサツカロミセス・ボンベ
ＩＦ（１０３５４である。

シゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４が産生する
ジヒドロキシアセトンキナーゼは二種類のアイソザイム
（Ｄ　ＨＡ　Ｋ　Ｑ）およびＤ　ＨＡ　Ｋ　（１）とい
う〕からなり、その性質を以下に示す。

（１１旬月：　　ＡＴＰなどリン酸供与体のリン酸基を
基質ジヒドロキシアセトンに転移する反応を触媒する。

（２）基質特異性：　本酵素はジヒドロキシアセトンを
基質としてこれによく作用するが、ＤＬ〜グリセルアル
デヒドに対する作用は弱くまたグリセロール、１，２−
プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、アセト
ール、アセトイン、グリセロール３−リン酸、ＤＬ−グ
リセリン酸には作用しない。

（３）リン酸供与体の特異性二　本酵素はＡＴＰを最も
よいリン酸供与体として利用する。ウリジン５゛−三リ
ン酸は若干利用するがイノシン５゛−三リン酸、シチジ
ン５′−三リン酸、グアノシン５′−三リン酸は利用し
ない。

（４）二価金属イオンの特異性二　本酵素はＭ　ｇ　２
＋、Ｃａ２＋、Ｃ０２＋、Ｍｎ２＋などの二価金属イオ
ンが存在しないと酵素活性を示さない。ＤＨＡＫ（Ｉ）
はＣａ２＋イオンで、ＤＨＡＫＧＤはＭｇ２＋イオンで
最大の活性を示す。

（５）至適ｐＨ：　　約７．３ （６）安定ｐＨ範囲：　　Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（Ｉ）はｐＨ
約５〜１１．ＤＨＡＫα）はｐＨ約６〜１１の範囲で安
定である。

（７）至適温度：　　Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（Ｉ）は６０°Ｃ
付近、ＤＨＡＫ■は５５°Ｃ付近が至適である。

（８）温度安定性：　　Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（Ｉ）は約５０
°Ｃ以下、ＤＨＡＫ（Ｉ［）は約４０℃以下で安定であ
る。

（９）基質親和性：　　ｐＨ７，５，２５°Ｃの反応条
件におりるジヒドロキシアセトン、Ｉ）Ｌ−グリセルア
ルデヒド、ＡＴＰに対するミバエリス定数（Ｋｍ値）は
Ｄ　ＨＡ　Ｋ（１）の場合それぞれ８．４Ｘ　１０−６
　Ｍ、２．１ｘｌＯ−５Ｍ、　２．２ｘ　１０−４Ｍ、
　Ｄ　ＨＡ　Ｋ（ＩＤの場合はそれぞれ２．ＯＸ　１０
−５　Ｍ、３．２Ｘ　１０−５　Ｍ、９、ｌＸ１０−４
Ｍであった。またＭｇ２＋イオンは反応系において４ｍ
Ｍ以上の濃度であれば十分な酵素活性が得られた。

００）分子量：　セファデックスＧ−２００（ファルマ
シア社！Ａ）を用いたゲルろ過性により測定したところ
Ｄ　Ｈ，Ａ　Ｋ　（Ｉ）、Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（１０ともに
約１４５，０００と算出された。

次ぎに本発明法によるグリセロールの測定法について具
体的に説明すると、まずグリセロールはピリジンヌクレ
オチド補酵素の存在下グリセロールデヒドロゲナーゼの
作用で脱水素されジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリ
セルアルデヒドとなる。このときリン酸供与体の存在下
トリオキナーゼまたはジヒドロキシアセトンキナーゼを
作用せしめることにより、ジヒドロキシアセトン、Ｄ−
グリセルアルデヒドはそれぞれジヒドロキシアセトンリ
ン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸となって系外
に除去される結果グリセロールデヒドロゲナーゼの触媒
する反応がすみやかに進行する。

ピリジンヌクレオチド補酵素の例としてはＮＡＤ”また
はＮＡＤＰ＋が用いられる。ｄＰＪえばエセエリヒア・
コーリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、ク
レブシェラ・ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕｍｏｎ−１ａｅ）、アセトバクター・サブオキ
シダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　５ｕｂｏｘｙｄａ
ｎｓ）およびゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒ
ｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　）のグリセロールデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，６）　　（ジャーナル
　オブ　バイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、）第　２０３巻、１５３頁（１９５３）
　、同第２３５巻、　１１３２０頁（１９６０）および
アグリカルチュラル　アンド　バイオロジカル　ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）第４
６巻、　３Ｑ２９頁（１９８２）　）はＮＡＤ＋を補酵
素としてジヒドロキシアセトンを生成し、ウサギ骨格筋
のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，ｔ、ｉ、７
２＞　　（バイオキミカ　バイ矛′フィジカ　アクタ　
（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）第
２５８巻、４０頁（１９７２）　）はＮＡＤＰ＋を補酵
素としてＤ−グリセルアルデヒドを生成し、また緑藻デ
ユナリエラ・パルプｙ　　（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｐ
ａｒｖａ）のグリセロール２−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１，１，１゜１５６）（フェブス　レター（ＦＥＢＳ　
Ｌｅｔｔ、）第２９巻、１５３頁（１９７３）　〕ばＮ
ＡＤＰ＋を補酵素としてジヒドロキシアセトンを生成す
る。本発明には上記グリセロールデヒドロゲナーゼはい
ずれも使用することができるが、好ましくはグリセロー
ルに対するミバエリス定数（Ｋｍ値）の小さいゲオトリ
カム・カンディダムの産生ずるグリセロールデヒドロゲ
ナーゼがよい。

リン酸供与体の例としては、ＡＴＰ、ウリジン５゛−三
リン酸（ＵＴＰ）　、イノシン５゛−三リン酸（ＩＴＰ
）、シチジン５′−三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン５
゛−三リン酸＜ＧＴＰ）などがあげられる。シゾサツカ
ロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４のジヒドロキシアセト
ンキナーゼはＡＴＰを最もよいリン酸供与体とする。

上記反応においてグリセロールを測定するには、グリセ
ロールデヒドロゲナーゼの触媒する反応におけるＮＡＤ
　（Ｐ）＋の変化、好ましくは生成するＮＡＤ　（Ｐ）
Ｈを３４０ｎｍ付近における紫外部吸収により測定する
のが最も簡便である。その他螢光強度を測定する方法、
フェナジンメトサルフェートとニトロテトラゾリウムブ
ルーなどのテトラゾリウム塩を使用して比色する方法〔
クリニカキミカ　アクタ（Ｃ１ｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉ
ｃａ　Ａｃｔａ）第８１巻、１２５頁（１９７７）　）
　、ジアホラーゼとテトラゾリウム塩を使用して比色す
る方法〔特公昭５６−３８１９９号公報〕などもの方法
も利用できる。

＼ 本発明のグリセロール測定組成物はジヒドロキシアセト
ンまたはＤ−グリセルアルデヒドをリン酸化する酵素、
グリセロールデヒドロゲナーゼ、ピリジンヌクレオチド
補酵素およびリン酸供与体を必須として含んで成り、各
成分の具体例は前述のとおりである。各成分の使用量は
幅広く変えて用いることが可能である。例えばグリセロ
ールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応の初速度からグ
リセロールを求める場合には０．０１〜０．５ｕ／ｍＥ
、グリセロールを完全に生成物に変化させることにより
求める場合には０．５ｕ／、ｍ以上用いることが好まし
い。トリオキナーゼまたはジヒドロキシアセトンキナー
ゼの使用量は０．１ｕ／＋＋＋ｆｆ以上が好ましい。

反応の条件は、ｐＨ７〜９、温度２５〜４０℃が特に有
効であるが、この範囲を越えて行うことも可能である。

また反応液のｐＨを一定に保持するために緩衝液を含む
のが好ましい。緩衝液は上記ｐＨ範囲を示すものであれ
ばいずれでもよいが、より好ましくはトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０〜８．５）である。

以下に実施例をもって本発明を具体的に説明するが、使
用した酵素の調製法および各酵素の活性の表示は次のと
おりである。

（１）　　ジヒドロキシアセトンキナーゼの調製麦芽エ
キス１％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．１％、リ
ン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水塩　０
．０５％、塩化カリウム　０．０５％および硫酸第一鉄
７水塩ｏ、ｏｏｉ％から成る組成の培地（ｐＨｅ、２：
＋にシゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯＯ３５４を接種
し、３０℃で４８時間培養した。

培養液１０βを遠心分離して菌体を集め、２０ｍＭ　）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁後、ダイノミルに
て菌体破砕を行い酵素を抽出した。抽出液を遠心分離し
て固型物を除去し、得られた上清液にポリエチレンイミ
ン溶液を最終濃度０．０２％になるように添加し、沈澱
物を再度遠心分淵により除去した。次に得られた上清液
を硫安塩析し、４０−７０％飽和画分の酵素沈澱を取得
した。沈澱を上記同緩衝液に熔解したのちセファデック
スＣ，−ＺＳ＜ファルマシア社製）を使用したゲルろ過
法により脱塩したのち、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−セファロース（ファルマシア社製）カラムに吸着させ
、カラムを洗浄後Ｏ〜０．３Ｍの食塩濃度勾配により酵
素を溶出した。酵素活性は二つのピークに分れ、約０．
１２Ｍ食塩で溶出される画分をＤ　ＨＡ　Ｋ　（’Ｉ）
、約０．１６Ｍ食塩で溶出される画分をＤＨＡＫ（Ｉ［
）としてそれぞれ別に集めた。

Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（１）、ＤＨＡＫ（１）画分はそれぞれ
硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加えて酵素
を沈澱させたのち、遠心分離により集め、上記同緩衝液
に溶解してセファデックスＧ−２５により脱塩した。次
に得られた酵素溶液を４（ｉｍＭのトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化したブルーセファロース（ファル
マシア社製）カラムに通し、吸着されずに溶出してきた
活性画分を限外ろ過法により濃縮したところ、１２　ｕ
／　７の活性を有するＤ　ＨＡ　Ｋ（Ｉ）溶液１０ｍＥ
ならびに２０　、　ｕ／　ｍＩ２の活性を有するＤＨＡ
　Ｋ　（ｎ）溶液１８ｍｆを得た。なお本Ｄ　ＨＡ　Ｋ
　（１）とＤＨＡ　Ｋ　（ｎ）は混合状態でも有効であ
り、以下に示す実施例では混合物を使用した。

活性測定法：　２．５ｍ門ＡＴＰ、４ｍＭ硫酸マグネシ
ウム、Ｏ，，２ｍＭ　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈｌｌ、０ｍＭジヒ
ドロキシアセトンおよび２．５ｕ／ｍＲグリセロールー
３−リン酸デヒドロゲナーセ（ベーリンガー・マンハイ
ム社製）を含む０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）　１．０　ｍｌと酵素溶液０．０ｆｉ’を混合し２５
°Ｃで反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測
定する。酵素活性の表示は、上記条件で１分間に１Ｍモ
ルのＮＡＤＨを減少させる酵素量を１単位とした。以上
の反応式を示せば次の通りである。

ジヒドロキシアセトン＋Ａ　Ｔ　、Ｐ　−ジヒドロキシ
アセトンリン酸＋ＡＤＰ ジヒドロキシアセトンリン酸＋ＮＡＤＨ−グリセロール
３−リン酸＋ＮＡＤ＋ （２）トリオキナーゼの調製 メソッド　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ　、）第５巻、３６２頁（１９６２）記
載の方法に準じてブタ肝臓より調製した。活性の測定は
、上記ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性の測定法にお
ける基質ジヒドロキシアセトンの代わりにＤ−グリセル
アルデヒドを用いて同様に操作した。

（３）　　グリセロールデヒドロゲナーゼの調製ゲオト
リカム・カンディダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ
は　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　第４６
巻、　３０２９頁（・−１９８２＞に準じ、またウサギ
骨格筋のグリセロールデヒドロゲナーゼは　Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　　第２５８巻、４０頁（
１９７２）に準じそれぞれ一製した。酵素活性は、グリ
セロールとＮＡＤ　（Ｐ）＋を基質として、ｐＨ８，０
，２５℃の反応条件で１分間に１μモルのＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈを生成する酵素量を１単位とした。

（４）　　リパーゼ活性の表示 オリーブ油乳化液と牛血清アルブミンとの混合液を基質
として、ＰＨ７，０，３７℃の反応条件で１分間に１μ
モルの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。

実施例１ 硫酸マグネジうム・７水塩　１　、０４ｍｇ／　ｍｌ！
、ＮＡＤ　２．Ｏｍｇ／ｍｆおよびＡ　Ｔ　Ｐ　　１．
５ｍｇ／　＋−を含む０．１５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）　０．９６ｍｆと試料としてトリオレイン換
算７５〜１０５０ｍｇ／　ｄｉの既知濃度のグリセロー
ル溶液０．０’２ｒｎｆ！を１ｉ容のキュベツトに入れ
て混合し、３７℃で３分間保持した。その後ゲオトリカ
ム・カンディダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ８．
７５ｕ／−およびジヒドロキシアセトンキナーゼ２５ｕ
／ｎｆを含む０．０２Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５＞　０．０２ｉｆを添加して反応させ、３４０ｎｍ
における吸光度の１分間当りの増加を測定した。

なお比較のためジヒドロキシアセトンキナーゼを除いた
系についても同様に操作した。

反応時間と吸光度の関係を第１図（本発明法）および第
２図（比較例）に、また本発明法の検量線を第３図に示
す。本発明法では１０００ｍｇ／ｄ１以上の試料に対し
ても反応速度は一定であり、高感度で定量的な測定が可
能であるが、比較例では反応速度が遅く、また時間とと
もに低下することがわかる。

実施例２ 実施例１におけるジヒドロキシアセトンキナーゼ、ゲオ
トリカム・カンディダムのグリセロールデヒドロゲナー
ゼおよびＮＡＤに代えてそれぞれトリオキナーゼ、ウサ
ギ骨格筋のグリセロールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤ
Ｐを用いて同様に操作したところ、実施例１と同様の結
果を得た。

実施例３ 実施例１における硫酸マグネシウム代えて塩化カルシウ
ム、塩化コバルトまたは塩化マンガンを用いて同様に操
作したところ、いずれも実施例１と同様の結果であった
。

実施例４ 硫酸マグネシウム・７水塩　１　、０４ｍｇ／　ｍ、ｆ
！、ＮＡＤ　２．Ｏｍｇ／ｍｅおよびＡ　Ｔ　Ｐ　　１
．５ｍｇ／　ｒｎＥを含む０．１５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐｌ！　８．５）　１．９軸ｐとゲオトリカム・カン
ディダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ７５ｕ／ｍｃ
およびジヒドロキシアセトンキナーゼ２５ｕ／フｎ！を
含む０．０２Ｍ　＋−リス塩酸緩衝液（ｐｔ＋　７．５
）　０．０２＋＋＋ｎを試験管に入れて混合し、３７℃
で３分間保持した。その後試料としてトリオレイン換算
７５〜９００ｍｇ／ａの既知濃度のグリセロール溶液０
．０２７を添加して２０分間反応させ、３４０ｎｍにお
ける吸光度の増加を測定した。なお比較のためジヒドロ
キシアセ１〜ンキナーゼを除いた系についても同様に操
作した。

結果は、第４図に示すように本発明法ではグリセロール
デヒドロゲナーゼの反応が終点まで達することにより少
なくとも９００ｍｇ／　ｄｌまでは検量線は直線であり
、感度良く測定できることがわかる。

一方比較例では反応性が低くて、感度が悪く、検量線は
直線性を示さない。

実施例５　　トリグリセライドの測定 試料にリパーゼ（リポプロティンリパーゼ）を作用させ
て含有するトリグリセライドを加水分解し、住じたグリ
セロールを測定することによりトリグリセライドの測定
を行った。即ち、リポプロティンリパーゼ（大野製薬社
製）　５００ｕ／＋＋＋ｅ、硫酸マグネシウム・７水塩
　１．０４ｍｇ／ｍ、ＮＡＤ２．Ｏｍｇ／ｍｅ、　ＡＴ
Ｐ　　１’、５ｍｇ／ｎ＋ＥおよびトリトンＸ−１００
０，１％を含む０．１５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）０．９６ｍｎと血清試料０．０２ｍＪ！を混合し３
７°Ｃで５分間保持したのち、ゲオトリカム・カンディ
ダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ８．７５ｕ／ｍｆ
およびジヒドロキシアセトンキナーゼ２５ｕ／ｍｅを含
む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　０．０
２ｍｆｆを添加して反応させ、３４０ｎｍにおける吸光
度の１分間当りの増加を測定した。別に、既知濃度のト
リグリセライドを含む標準血清を試料として上記と同様
に操作して得た検量線と上記測定値を対比して前記血清
試料中のトリグリセライドを求めた。検量線を第５図に
示す。

なお、公知のトリグリセライドの測定試薬であるＴＧキ
ット−Ｋ（日本商事社製、リボプロテインリバーセ、グ
リセロールキナーゼ、グリセロール３−リン酸オキシダ
ーゼを含む）を用いた方法と本発明法との血清試料測定
結果の関係をみたところ、第６図に示すように極めて有
意な相関が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるグリセロールの測定における反応
時間と吸光度の関係を表す図であり、第２図はその比較
例を表す図である。第３図および第４図は本発明による
グリセロールの測定の検量線を表す図である。第５図は
本発明を利用したトリグリセライドの測定の検量線を表
す図であり、第６図はそれによる血清試料中のトリグリ
セライドの測定値と公知法による測定値との相関を表す
図である。 特許出願人　天野製薬株式会社 第１図 ０　　　　　　１’　　　　　２　　　　　３　　　　
　４反応時間（分） 第　２　図 ０　　　　　　　１　　　　　　２　　　　　　３　　
　　　　　４反応時間（分） 第３図 ０　　　　　　　　　　５００　　　　　　　　１００
０クリセロール（トリオレイン換ａ、ｍｇ／ｄｉ）第　
４　図 ０　　　　２００　　　　４００、　　５００　　　８
００クリセロール（トリオレイン換算＋　ｍ　ｇ　／（
１’　ｉ　）第５図 ■ ０　　　　　２００−ゝ　　　４００　　　６００　　
　８００１−リグリセライド（トリオレイン換算１ｍｇ
／ｄｌ）０　　　　　２００　　　　４００　　　　６
００　　　　８００公知法（ｍｇ／ｄｉ’） 手　続　禎　正　＠（自発） 昭和５９年５月９日 特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第７０７３０列・ ２、発明の名称 グリセロールの測定法および測定組成物３、補正をする
壱 事件との関係　　特許用１頭人 住所　愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号５、補正の
対象 明細書の発明の’ａｌｌ′：Ｉｌｌな説明の柵６６ネｉ
ｌｉ正の内容 （１）明細書第３頁第８行目の「測定法」の後に「およ
び測定組成物」を挿入します。 （２）同第４頁下から第３行目に「従って」とあるを「
また」と補正します。 （３）同第４頁下から第２行目に「長くかかると、とも
に」とあるを「長くかかり、従って」と補正＼します。 （４）同第７頁第１行目に「考えられている。。」とあ
るを１考えられている。」と補正します。 （５）同第８頁第１５行目の「見いだした」を削除しま
す。 （６）同第８頁第１６行目に「菌株の産生ずる」とある
を「保存菌株の中に見いだした」と補正しまず。 （７）同第１３頁第１行目の「補酵素として」の後に「
グリセロールより」を挿入し、ます。 （８）−同第１４頁第１５行目に１なともの方法」とあ
るを「などの方法」と補正しまず。 （９）同第１５頁第４行目の「場合には」の後に［反応
液中の濃度が」を挿入します。 （１０）同第１５頁第６行目にｒ　Ｏ，５ｕ／１正以上
」とあるを「０．５〜５０ｕ／ｍβ」と補正します。 （１１）同第１５頁第８行目に「０．１　’ｕ／ｍβ以
上」とあるを「０．１〜１００ｕ／ｍｅＪと補正しまず
。 （■２）同第１９頁第１２〜１３行目、第２０頁第１５
行目、第２１頁第５〜６行目、および第２２頁第１０行
目に「ＮΔＤ」とあるをｒＮＡＤ”Ｊと袖正します。 り１３）同第２０頁第１７行目にｒＮＡＤＰＪとあるを
ｒＮＡＤＰ＋Ｊと禎正しまず。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　グリセロールデヒドロゲナーゼを用いたグリセロー
   ルの測定において、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グ
   リセルアルデヒドをリン酸化する酵素を用いることを特
   徴とするグリセロールの測定法。 ２　ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルアルデヒ
   ドをリン酸化する酵素がトリオキナーゼまたはジヒドロ
   キシアセトンキナーゼである特許請求の範囲第１項記載
   のグリセロールの測定法。 ３　グリセロールがトリグリセライドの加水分解に由来
   するものである特許請求の範囲第１項記載のグリセロー
   ルの測定法。 ４　ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルアルデヒ
   ドをリン酸化する酵素、グリセロールデヒドロゲナーゼ
   、ピリジンヌクレオチド補酵素およびリン酸供与体を含
   んで成るグリセロール測定組成物。 ５　ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルアルデヒ
   ドをリン酸化する酵素がトリオキナーゼまたはジヒドロ
   キシアセトンキナーゼである特許請求の範囲第４項記載
   のグリセロール測定組成物。 ６　ピリジンヌクレオチド補酵素がニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチドリン酸である特許請求の範囲第４項記載のグ
   リセロール測定組成物。 ７　リン酸供与体がアデノシン５′−三リン酸である特
   許請求の範囲第４項記載のグリセロール測定組成物。 ８　前記組成物がさらに二価金属イオンを含む特許請求
   の範囲第４項記載のグリセロール測定組成物。 ９　二価金属イオンがマグネシウム、カルシウム、コバ
   ルトまたはマンガンである特許請求の範囲第８項記載の
   グリセロール測定組成物。 １０　　前記組成物がさらに緩衝液を含む特許請求の範
   囲第４項記載のグリセロール測定組成物。