DE2043971C3

DE2043971C3 - Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen

Info

Publication number: DE2043971C3
Application number: DE2043971A
Authority: DE
Inventors: Saburo Koshimura; Hajime Okamoto; Susumu Shoin
Original assignee: OKAMOTO HAJIME KANAZAWA (JAPAN)
Current assignee: OKAMOTO HAJIME KANAZAWA (JAPAN)
Priority date: 1969-09-06
Filing date: 1970-09-04
Publication date: 1979-07-12
Also published as: CA928236A; DE2043971A1; DE2043971B2; JPS4843841B1; FR2070674A1; US3810819A; GB1286014A; FR2070674B1

Description

(a) durch Aussalzen eines wäßrigen, zellfreien Extrakts von haemolytischen Streptococcen mit Ammoniumsulfat bei einer 50prozentigen Sättigung, Abtrennen des erhaltenen Niederschlages, Aussalzen der erhaltenen überstehenden Lösung mit Ammoniumsulfat bei einer 80prozentigen Sättigung,

(b) Abtrennen des erhaltenen Niederschlags, Auflösen des Niederschlags in Wasser und Dialyse der Lösung gegen Wasser oder

(ai) durch Aussalzen des wäßrigen zellfreien Extrakts mit Ammoniumsulfat bei einer 80prozentigen Sättigung, Abtrennen des erhaltenen Niederschlags und anschließendes Auflösen in Wasser oder einer Pufferlösung, Aussalzen der Lösung mit Ammoniumsulfat bei einer 50prozentigen Sättigung,

(b|) Abtrennen des erhaltenen Niederschlages und Dialyse der erhaltenen überstehenden Lösung gegen Wasser und gegebenenfalls Gefriertrocknen der gemäß (b) oder (bi) erhaltenen wäßrigen Lösung (Retentat),

wobei das A '^salzen jeweils bei einem pH-Wert von bis 8,2 durchgeführt wird, hergestellt worden ist

2. Antitumorsubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(c) durch Behandlung der nach der Dialyse gegen Wasser erhaltenen wäßrigen Lösung (Retentat) mit einem Ionenaustauscher, Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel oder einer Kombination von wenigstens zwei dieser Mittel weiter gereinigt worden ist

3. Verwendung der Antitumcirsubstanz nach Anspruch 1 und 2 bei der Bekämpfung maligner Neoplasien.

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Es ist bekannt, daß lebende Zellen haemolytischer Streptococcen eine Antitumorakivität besitzen, doch ist diese Antitumorsubstanz in den Zellen gegenüber Temperaturen und anderen physikochemischen Bedingungen sehr instabil. Deshalb ist es schwierig, die Antitumorsubstanz aus den haemolytischen Streptococcen ohne Aktivitätsverminderung zu gewinnen.

Es ist ferner bekannt, eine Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen dadurch zu gewinnen, daß man einen wäßrigen zellfreicn Extrakt der haemolytischen Streptococcen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, versetzt und den erhaltenen to Niederschlag abtrennt; vgl. JP-AS 1647/63. Diese Substanz enthält große Mengen Proteine und zahlreiche andere Zellsubstanzen. Es besteht daher die Gefahr ungünstiger Nebenwirkungen, und die Heilwirkung gegenüber dem Tumor ist noch nicht zufriedenstellend

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen zur unterstützenden Behandlung maligner Tumore in reinerem Zustand ohne Aktivitätsverminderung zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird gemäß dem Kennzeichen der Ansprüche 1 und 2 gelöst

Einen zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Antitumorsubstanz verwendbaren wäßrigen, zellfreien Extrakt lebender Zellen haemolytischer Streptococcen erhält man durch Waschen der lebenden Zellen mit einer physiologischen Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser, mechanisches Zerkleinern oder Lyophilisieren, Behandeln mit Enzymen und Abzentrifugieren des Niederschlags. Beispielsweise werden bei der mechanischen Zerkleinerung die gewaschenen Zellen in einem Mörser zusammen mit Schmirgelpulver oder Aluminiumoxidpulver vermählen, dann mit destilliertem Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung vermischt und hierauf zentrifugiert Die überstehende Lösung enthält die gewünschte Substanz. Nach einem anderen. Verfahren kann man die gewaschenen Zellen in physiologischer Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser suspendieren, dann mit kleinen Glasperlchen vermischen und durch mechanisches Schütteln zerkleinern und schließlich nach dem Abzentrifugieren in der überstehenden Lösung die gewünschte Substanz erhalten. Bei Anwendung einer Enzymbehandlung läßt man ein auf die Zellwände der haemolytischen Streptococcen lösend wirkendes Enzym auf die Zellen einwirken. Nach dem Zentrifugieren enthält die überstehende Lösung die gewünschte Substanz.

Zum Aussalzen wird ein wäßriger, zellfreier Extrakt der lebenden Zelten in einen Zellglasschlauch gebracht und die Lösung gegen eine Ammoniumsulfatlösung dialysiert Man kann auch den wäßrigen, zellfreien Extrakt der lebenden Zellen unmittelbar in Teilmengen mit Ammoniumsulfat versetzen. Bei beiden Verfahren ist der pH-Wert neutral oder schwach alkalisch (pH 7 bis 8,2).

Um eine Fraktion einer 50 bis 80prozentigen Ammoniumsulfatsättigung zu erhalten, wird das nachstehende Verfahren bevorzugt

Der wäßrige, zellfreie Extrakt wird zuerst bei einer SOprozentigen Ammoniumsulfatsättigung ausgesalzt und der entstandene Niederschlag abgetrennt Die erhaltene überstehende Lösung wird anschließend bei einer 80prozentigen Ammoniumsulfatsättigung ausgesalzt und der entstandene Niederschlag gesammelt Gegebenenfalls kann man den wäßrigen, zellfreien Extrakt zuerst bei einer 80prozentigen Ammoniumsulfatsättigung aussalzen und den entstandenen Niederschlag in destilliertem Wasser oder einer Pufferlösung auflösen und dann diese Lösung bei einer 50prozentigen Ammoniumsulfatlösung weiter aussalzen und den erhaltenen Niederschlag abtrennen. Das Aussalzen kann ferner dadurch erreicht werden, daß man die untere Grenze des Ammoniumsulfatsättigungsgrades auf über 50% erhöht oder die obere Grenze auf unter 80% senkt

Die derart erhaltene Antitumorsubstanz wird dann gegen destilliertes Wasser oder eine Pufferlösung dialysiert, um das verbliebene Ammoniumsulfat zu entfernen. Die erhaltene Substanz kann dann im gefrorenen oder lyophilisierten Zustand aufbewahrt werden. Die Substanz kann gegebenenfalls weiter gereinigt werden. Zu diesem Zweck wird sie mit einem Ionenaustauscher, einem Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel behandelt. Als Ionenaustauscher eignen sich Kunstharze, Cellulose oder Dextrangele, die unter der Bezeichnung »Sephadex« erhältlich sind. Als Gelfiltrationsmittel eignen sich ebenfalls Dextrangeie.

Das Calciumphosphatgel kann als solches verwendet werden, jedoch ist es üblich, es in Form von Hydroxylapatit einzusetzen. Eine wäßrige Lösung der Antitumorsubstanz, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten worden ist, wird durch eine Säule geführt, die mit dem Ionenaustauscher, Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel beschickt ist Man kann auch die wäßrige Lösung auf einmal in ein Gefäß geben, das diese Mittel enthält, und sie mit diesen Mitteln behandeln. Man eluiert mit einer Pufferlösung mit geeigneter Salzkonzentration und geeignetem pH-Wert.

Der Ionenaustauscher, das Gelfiltrationsmittel oder das Calciumphosphatgel können auch in einer Kombination von wenigstens zwei dieser Mittel eingesetzt werden. Zum Beispiel kann man die Lösung zuerst mit Dextrangel in Berührung bringen und die daraus eluierte Lösung anschließend mit »DEAE«-Dextrangel behandeln. Dadurch kann der Reinigungseffekt noch gesteigert werden.

Die erfindungsgetnäße Antituinorsubstanz hat ein hohes Molekulargewicht, wandert nicht durch eine semipermeable Membran und fällt beim Lycphilisieren als weißes Pulver an. Die Substanz ist leicht löslich in Wasser, jedoch unlöslich in organischen Lösungsmitteln. Bevor die Substanz mit Ionenaustauschern, Gelfiltrationsmitteln oder Calciumphosphatgel in Berührung gebracht wird, zeigt sie eine positive Ninhydrin-, Orcinol-, Molish- und Biuret-Reaktion. Ferner zeigt sie ein UV-Absorptionsmaximum bei 260 mu. Jedoch zeigt jo die Substanz, wenn sie mit Ionenaustauschern, Gelfiltrationsmitteln oder Calciumphosphatgel in Berührung gebracht und danach eluiert worden ist, eine sehr schwache Orcinol-Reaktion und ein UV-Absorptionsmaximum bei 280 mu. Weiter ist festzustellen, daß die Substanz vor einer Reinigung mit »DEAE«-Dextrangel IR-Absorptionsbanden bei 1650 cm-' und 1520 cm-' und außerdem Absorptionsbanden bei 1235 cm-' und 1070 cm-' zeigt, wobei die beiden letztgenannten Absorptionsbanden Nucleinsäuren angehören dürften. Jedoch zeigt die Substanz nach einer Reinigung an »DEAE«-Dextrangel Banden bei 1235 cm-' und 1070 cm-'. Die ähnliche Beobachtung macht man, wenn die Substanz mit einem anderen Ionenaustauscher, Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel behandelt wird.

Die erfindungsgemäße Antitumorsubstanz ist gegen Wärmeeinwirkung sehr instabil. Ihre Aktivität geht vollständig verloren, wenn sie mehr als 10 Minuten auf 70° C erhitzt wird. Weiterhin verliert sie fast ihre gesamte Aktivität, wenn sie 1 Stunde auf 37° C erwärmt wird. Jedoch geht ihre Aktivität nicht verloren, wenn sie 1 Stunde bei 23°C aufbewahrt wird. Die erfindungsgemäße Substanz ist auch gegenüber Säuren instabil. Eine beträchtliche Inaktivierung findet innerhalb 24 Stunden statt, wenn sie bei 5°C und einem pH-Wert von 5 gehalten wird, jedoch ist die Substanz verhältnismäßig stabil bei einem pH-Wert von 7 bis 8. in diesem Falle kann die Substanz etwa 1 Monat einen gefrorenen Zustand überdauern. Weiterhin ist ein lyophilisiertes w Präparat der Antitumorsubstanz bei niedriger Temperatur über einen langen Zeitraum stabil.

Die erfindungsgemäße Antitumorsubstanz hat pro Gewichtseinheit eine beträchtlich erhöhte spezifische Aktivität im Vergleich zu einer bekannten Substanz, die f>5 aus wäßrigen, zellfreien Extrakten lebender Zellen gewonnen worden ist Uli einer in-vitro-Antitumoraktivitätsbestimmung nach der Methode von Ayako M ο r i w a k i, »Chemical and Pharmaceutical Bulletin« (Tokyo), Bd. 10 (1062), Seite 462, ist die spezifische Aktivität der Substanz, etwa um das 2- bis 6fache erhöht, bevor sie mit Ionenaustauschern, Gelfütraüonsmitteln oder Calciumphosphat in Berührung gebracht worden ist Nach der Behandlung mit diesen Mitteln wird die Aktivität weiter erhöht, beispielsweise um mehr als das 5fache. Eine Verminderung der Antitumoraktivität der erfindungsgemäßen Substanz während der Gewinnung ist sehr gering. Da die Substanz nur geringe Verunreinigungen enthält, sind ungünstige Nebenwirkungen bei der Verabreichung kaum zu beobachten.

Die spezifische Aktivität pro Gewichtseinheit eines bekannten acetongetrockneten Pulvers, das aus dem wäßrigen, zellfreien Extrakt gewonnen worden ist, wird im Vergleich zur spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes praktisch überhaupt nicht erhöht Demgegenüber erhöht sich die spezifische Aktivität der Antitumorsubstanz der Erfindung um das 2- bis 6fache gegenüber derjenigen des wäßrige ν zellfreien Extraktes.

In den Zeichnungen sind in F i g. 1 das Infrarotabsorptionsspektrum der Antitumorsubstanz und in F i g. 2 die UV-Absorptionskurven aus dem Säulenchromatogramro gemäß Beispiel 3 gezeigt

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die Angabe »% Ammoniumsulfatsättigungsgrad« wird berechnet nach Hofmeister, in »Methods in Enzymology« Band 1, Seite 76 (herausgegeben von S. P. Colowick und N. O. Kaplan, Academic Press Ine, 1955).

Beispiel 1

Streptococcus haemolytus Su ATCC Nr. 21060 wird 20 Stunden in 50OmI Fleischbrühe gezüchtet Die erhaltene Kulturbrühe wird in 10 Liter eines frisch zubereiteten, 3% Hefeextrakt enthaltenden Mediums (hergestellt durch Auflösen von Hefeextrakt in Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 7,4, einstündiges Erhitzen der erhaltenen Lösung auf 100° C, Entfernen des Niederschlags nach dem Abkühlen und lOminütigern Sterilisieren der Lösung unter einem Druck von 1 kg/cm²) überimpft und 20 Stunden bei 37° C kultiviert Sodann wird die erhaltene Kulturbrühe eisgekühlt und zentrifugiert Der Zellenniederschlag wird zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, hierauf mit 20 g Schmirgelpulver vermischt und in einem Mörser etwa 20 Minuten gemahlen. Dann werden 50 ml kaltes destilliertes Wasser zugegeben, und das Gemisch wird 5 Minuten gerührt und 20 Minuten bei 9000UpM zentrifugiert Der erhaltene Niederschlag wird danach mit 5OmI kaltem destilliertem Wasser versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten gerührt und in gleicher Weise zentrifugiert Die Gesamtmenge beider überstehenden Lösungen beträgt 90 ml. Die überstehende Lösung wird ir einen Zellglasschlauch gegeben und etwa 15 Stunden unter Eiskühlung gegen eine 80% gesättigte Ammoniumsulfatlösung, die mit 30prozentigem wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt worden ist dialysiert. Die dialysierte Lösung wird 2Q Minuten bei 90QQUpM zentrifugiert, Der erhaltene Niederschlag wird in 50 ml destilliertem Wasser gelöst und wiederum etwa !5 Stunden gegen eine kalte 50% gesättigte Ammoniumsulfatlösung, die mit 30prozentigem wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt worden ist, dialysiert Die dialysierte Lösung wird 20 Minuten bei 9000UpM zentrifugiert und die erhaltene überstehende Lösung anschließend etwa 15 Stunden gegen eine kalte 60%

gesättigte Ammoniumsulfatlösung die mit 30prozentigem wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt worden ist, dialysiert. Ute dialysierte Lösung wird 20 Minuten bei 900OUpM zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird in 30 ml kaltem destilliertem Wasser gelöst und etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert Es werden 0,18 g eines weißen Pulvers erhalten.

Das erhaltene lyophilisierte Pulver wird in kaltem destilliertem Wasser gelöst t ml dieser Lösung wird mit 2 ml Bernheimers Basalmedium, d. h. einer Lösung von 66 ml destilliertem Wasser, 675 mg Maltose, 6 ml einer 20prozentigen KHjPC^-Lösung und 12 ml einer 2prozentigen MgSO« · 7H2O-Lösung, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,9 eingestellt (im folgenden BBM genannt), und 1 ml einer Suspension gewaschener Ehrlich-ascites-Carcinomzellen in BBm (6 χ ΙΟ⁷ Zellen/ml) vermischt und 60 Minuten bei 37"C bebrütet. Dann werden jeweils 03 mi dieser Lösung uciY fviäusen intraperitoneal injiziert Zur Kontrolle wird die gleiche Menge destillierten Wassers anstelle der Antitumorsubstanz-Lösung verwendet und in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, behandelt Es wird die Anzahl der aberlebenden Tiere nach 60 Tagen seit der Injektion beobachtet Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt

Tabelle I

Versuch	Konzen	10,0	»	Anzahl der
	tration	5,0	Beispiel 2	überlebenden
			Mäuse/
		Anzahl der
		getesteten
	(mg/ml)	Mäuse
Antitumorsubstanz nach 20,0	10/10
der Erfindung
desgl.	10/10
desgl	0/10
Kontrolle	0/10
(destilliertes Wasser

Streptococcus ht-imolyticus Su-Stamm wird in 160 ml des gleichen, 3% Hefeextrakt enthaltenden Mediums wie in Beispiel 1, 20 Stunden gezüchtet Die Kulturflüssigkeit wird bei 10 000 UpM zentrifugiert, und die Zellen werden gesammelt Die erhaltenen Zellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 1000 ml kalter 0,01 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 72 suspendiert Die Suspension wird mit 750 g kleinen Glasperlchen einer durchschnittlichen Größe von 0,11 mm vermischt Die Zellen werden in mehreren Ansätzen mittels eines Homogenisators 6 Minuten bei 4000 UpM unter Kühlen zerkleinert Die erhaltene Suspension wird 10 Minuten bei 7000 UpM zentrifugiert Die überstehende Lösung wird durch ein Membranfilter filtriert, um die unzerstörten Zellen abzutrennen. Von 900 ml des erhaltenen Filtrats werden 800 ml unter Rühren und Eiskühlung mit 312 g pulverisierten Ammonhimsulfatkristallen nach und nach während etwa 30 Minuten versetzt um anschließend weitere 30 Minuten unter ständigen Rühren gekühlt. Dann wird die Lösung 10 Minuten be 10 000 UpM zentrifugiert Die überstehende Lösunj wird anschließend durch Zugabe von 114 g feinpulveri siertem Ammoniumsulfat ausgesalzen und zentrifugiert Der erhaltene Niederschlag wird in 70 ml kalten destilliertem Wasser suspendiert und 3 Stunden gegei kaltes destilliertes Wasser dialysiert Es werden 80 m Dialysat erhalten. 17 ml der erhaltenen Lösung werdet lyophilisiert. Es werden 600 mg eines weißen Pulver: erhalten.

Das lyophilisierte Pulver wird in 0,01 molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst. Die?« Lösung wird zur Bestimmung der Wachstumshemmung von Yoshida-Sarcomzellen entsprechend den Angabei in Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), Bd. K (1962), Seite 462, verwendet Der reziproke Wert du Probenkonzentration bei einer 6öprozentigen Hern mung wird definiert als »in-vitro-Antitumoraktivität« Es wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität j« Gewichtseinheit (in-vitro-Antitumoraktivität/Gewich der lyophilisierten Probe) l,8mal höher ist als di( spezifische Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes.

Beispiel 3

Die in Beispiel 2 erhaltene Ammoniumsulfatfraktioi wird gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert 54 m von 80 ml der derart erhaltenen Ixisung wird an eine »DEAE-Sephadex-A-50«-Säule mit den Abmessungei 33 x 80 cm, die zuvor mittels einer O.Olmolarei Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 12 äquilibrier worden ist, absorbiert. Zum Eluieren werden 15 Lite 0,01 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,; kontinuierlich mit 1 m Natriumchloridlösung versetz! so daß die Natriumchloridkonzentration in der Phos phatpufferlösung linear ansteigt Die Eluierungsge schwindigkeit beträgt 1 ml/Minute. Es werden 10-ml Fraktionen aufgefangen. In jeder Fraktion wird dii in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wi< für das Produkt in Beispiel 2 bestimmt 128 ml de Fraktionen (Fraktionen Nr. 127 bis 139) werdei gesammelt. Das Säulenchromatogramm ist aus Fig.: ersichtlich. Die derart erhaltenen Fraktionen werdei etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasse dialysiert und dann lyophilisiert Es werden 206 mg eine: weißen Pulvers erhalten.

Analyse: gefunden: C 46,05%, H 7,40%, N 1432%.

Die Substanz wird in einer Phosphatpufferlösunj vom pH 72 gelöst Von dieser Lösung wird dii in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie ii Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität ji Gewichtseinheit liegt 53mal höher gegenüber de spezifischen Aktivität eines wäßrigen, zellfreien Extrak tes und 2,9mal höher gegenüber der spezifischet Aktivität der Ammoniumsulfatfraktionen vor dei Reinigung an »DEAE-Sephadex«.

Die nach den Beispielen 2 und 3 erhaltener Substanzen werden in einer 0,01 molaren Phosphatpuf ferlösung vom pH 72 gelöst Die Antitumoraktivitätei der Lösungen werden in der gleichen Weise wie ii Beispiel 1 bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt

Tabelle II Beispiel 5

jch Konzen	Anzahl der über
tration	lebenden Mäuse
	30 Tage nach der
	Injektion/Anzahl
	der getesteten
(mg/ml)	Mäuse

Antitumorsubstanz 13,4 8/10

nach Beispiel 3

desgl. 6.7 2/10

desgl. 3 A 0/10

Antitumorsubstanz 36,0 10/10

mu-ii Beispiel 2

desgl. 18,0 6/10

desgl. 9,0 4/10

Wäßriger zellfreier 74,0 10/10

Extrakt

ucsgl. 37,0 8/10

desgl. 18,5 6/10

desgl. 9,3 2/10

Kontrolle (0,01 molare 0 0/10

Phosphatpufferlösung

pH 7,2)

Beispiel 4

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 120 ml eines wäßrigen, zellfreien Extraktes aus 20 Litern Kühlflüssigkeit erhalten. In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 46,8 g Ammoniumsulfat zu der Lösung zum Aussalzen gegeben. Zu der erhaltenen überstehenden Lösung werden zur Wiederholung der Aussalzung 17,2 g Ammoniumsulfat zugefügt Der derart erhaltene Niederschlag wird in kalter 0,005molarer Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen eine eine 0,005molare Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Es werden 40 ml Dialysat erhalten. 10 ml dieser Lösung werden an einer Säule (2 χ 50 cm) adsorbiert, die mit »TEAE-Cellulose« beschickt war. Die Cellulose wurde zuvor mittels einer 0,005molaren Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert. Zum Eluieren werden 125 Liter 0,005molare Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,0 kontinuierlich mit 1 m Natriumchloridlösung vermischt, so daß die Natriumchloridkonzentration in der Phosphatpufferiösung linear ansteigt Es wird mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/Minute eluiert Es werden tO-ml-Fraktionen aufgefangen. In jeder Fraktion wird die in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Es werden 5OmI der Fraktionen mit Aktivitäten (Fraktionen Nr. 68 bis 72) gesammelt Die derart erhaltene Lösung wird etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert Es werden 23 mg eines weißen Pulvers erhalten. Die derart erhaltene Substanz wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Es wird die in-vitro-Antitumoraktivität der Lösung in der gleichen Weise wie beim Produkt des Beispiels 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 20,0maI höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zeiifreien Extraktes und 2,7mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »TEAE-Cellulose«.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 42,5 ml eines wäßrigen, zellfreien Extraktes aus 120 Litern Kühlflüssigkeit erhalten. In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 350 ml dieser Lösung mit 136 g Ammoniumsulfat zum Aussalzen vermischt. Zu der erhaltenen überstehenden Lösung werden zur Wiederholung des Aussalzens 50 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die erhaltenen Niederschläge werden in einer kalten 0,01 molaren Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,2 gelöst und gegen eine 0,01 molare Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,2 dialysiert. Es werden 50 ml dialysierte Lösung erhalten. 10 ml dieser Lösung werden gesammelt und lyophilisiert. Man erhält 200 mg eines weißen Pulvers. ICmI der verbliebenen Lösung werden an einer Säule (3 χ 50 cm) adsorbiert, die mit »Sephadex G-200« beschickt war, das zuvor iiiiiicis 0,1 molarer rhosphaipufferiösung vom pH-"wert 7,2 äquilibriert worden war. Die Eluierung wird mittels 0,1 molarer Phosphatpufferiösung und mit einer Geschwindigkeit von 0,3 ml/Minute durchgeführt. Es werden 5-ml-Fraktionen aufgefangen. Die in-vitro-Antitumoraktivität jeder Fraktion wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt. 40 ml der Fraktionen mit einer Aktivität (Fraktionen Nr. 33 bis 40) werden gesammelt, etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Es werden 24 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Das derart erhaltene weiße Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,2 gelöst. Die in-vitro-Antitumoraktivität der Lösung wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 31,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 5,4mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »Sephadex«.

Beispiel 6

10 ml des durch die Ammoniumsulfatbehandlung des Beispiels 5 erhaltenen Dialysats werden an einer Säule (4,5 χ 50 cm) an Hydroxylapatit adsorbiert, der zuvor mittels einer 0,01 molaren Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 63 äquilibriert worden war (die Säule wurde aus Calciumphosphatgel nach Livins Methode in »Methods in Enzymology«, Band 5 [1962], Seite 17 hergestellt). Die Eluierung erfolgt stufenweise mit 1,1 Litern jeweils einer 0,01 molaren, 0,05molaren, O.lmolaren und 0,4molaren Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 63. Die derart erhaltenen Eliiate werden in 30-ml-Fraktionen unterteilt Die in-vitro-Aktivität der Fraktionen wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 gemessen. 390 ml der aktiven Fraktionen (Fraktionen Nr. 142 bis 154; die Konzentration der Phosphatpufferiösung war 0,1 molar) werden gesammelt Die Fraktionen werden etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert Es werden 31 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Das derart erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferiösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Dann wird die in-vitro-Antitumoraktivität der Lösung in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 26,0mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 5,1 mal höher gegenüber der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an Hydroxylapatit

Beispiel 7 Tabelle III

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 410 mg lyophilisiertes Pulver als intracellulare Substanz aus lebenden Zellen von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 erhalten. Das erhaltene trockene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst. Elei einem Teil der Lösung wird die in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit (in-vitro-Antitumoraktivität/Gewicht der lyophilisierten Probe) liegt l,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes.

Beispiel 8

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 540 mg lyophilisiertes Pulver als intracellulure Substanz aus lebenden Zellen von Streptococcus haemolyticus ATCC 21 548 (»Blackmorew-Stamm) erhalten. Das erhaltene trockene Pulver wird in einer 0,001 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst. Bei einem Teil der Lösung wird die in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt l,4mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes.

Beispiel 9

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 des Beispiels 7 wird an einer Säule mit »DEAE-Sephadex« in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 chromatographiert Es werden 135 mg lyophilisiertts Pulver erhalten. Das erhaltene Pulver wird in einer O.Olmolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 eluiert Eine Probe wird zur Bestimmung der in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 verwendet Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 5,2mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität eines wäßrigen, zellfreien Extraktes und 2,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vorder Reinigung an »DEAE-Sephadex«.

Beispiel 10

Die in Beispiel 8 erhaltene Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548 (»BIackmore«-Stamm) wird in der gleichen Weiss wie in Beispiel 3 an einer »DEAE-Sephadex«-Säule Chromatographien. Es werden 190 mg lyophilisiertes Pulver erhalten. Die Bestimmung der in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 zeigt, daß die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit 4,8mal höher liegt gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 23mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »DEAE-Sephadex«.

Die in den Beispielen 7, 8, 9 und 10 erhaltenen Substanzen werden jeweils in einer O.Olmolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 geiöst Die Antitumoraktivität wird in der gleichen We\se wie in Beispiel 1 bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

Versuch

Konzentration

(mg/ml)

Anzahl der überlebenden Mäuse 30 Tage nach der Injektion/Anzahl der getesteten Mäuse

Antitumorsubstanz
nach Beispiel 9

Antitumorsubstanz
nach Beispiel 10

Antitumorsubstanz
nach Beispiel 7

Antitumorsubstanz
nach Beispiel 8

Wäßriger, zellfreier
Extrakt von Streptococcus haemolyticus
ATCC Nr. 21 546

Wäßriger, zellfreier
Extrakt von Streptococcus haemolyticus
ATCC Nr. 21 548

Kontrolle (0,01 molare
Phosphatpufferlösung
vom pH 7,2)

13,4 6,7 3,4

36,0

18,0

9,0

Λ C

36,0

18,0

9,0

4,5

74,0

37,0

18,5

9,3

74,0

37,0

18,5

9,3

8/10 2/10 0/10 7/10 1/10 0/10

10/10 6/10 3/10

n/in

Wi IV/

9/10 5/10 2/10 0/10

8/10 6/10 4/10 1/10

9/10 6/10 4/10 1/10

0/10

Beispiel 11

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 54o wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 beschrieben an einer Säule mit »TEAE-Cellulose« Chromatographien. Es werden 15 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer O.Olmolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 18,7mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 2,5mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »TEAE-Cellulose«.

Beispiel 12

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548 (»Blackmorew-Stamm) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 an einer Säule mit »TEAE-Cellulose« Chromatographien. Es werden 21 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das Pulver wird in einer O.Olmolaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt i4,8niai höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 2^mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »TEAE-Cellulose«.

Beispiel 13

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 w^;rd in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 an einer »Sephadex«- G-200-Säule chromatographiert. Es werden 16 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst. Die in- vitro- Antitumoraktivität v/ird in der gleichen Weise ι η wie in Beispiel 2 bestimmt. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 30,7mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 5,3mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an κ, »Sephadex«.

Beispiel 14

Die Amnoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolytia. η ATCC Nr. 21 548 (»Blackmorew-Stamm) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 an einer »Sephadex«-G-200-Säule chromatographiert. Es werden 22 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst. Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 26,3mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 4,4mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität ω der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »Sephadex«.

Beispiel 15

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 an einer Hydroxylapatit-Säule chromatographiert Es werden 20 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 25,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 5,1 mal höher gegenüber der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an Hydroxylapatit

Beispiel 16

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548 (»Blackmore«-Stamm) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 an einer Hydroxylapatit-Säule chromatographiert Es werden 28 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0.01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit war um 22,1 mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 4,1 mal höher gegenüber der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an Hydroxylapatit

Inzwischen ist festgestellt worden, daß es sich bei dem gemäß Beispiel 3 hergestellten gereinigten Präparat um ein Protein handelt, das ein Molekulargewicht von etwa 200 000 — bestimmt durch Säulenchromatographie an einem Dextrangel — besitzt.

Die gemäß Beispiel 3,9 und 10 aus drei verschiedenen Species haemolytischer Streptococcen unter sonst gleichen Bedingungen hergestellten Präparate stimmen in ihren physikochemischen Eigenschaften weitgehend überein. Dies berechtigt zu der Aussage, daß aus beliebigen Species haemolytischer Streptococcen die Antitumorsubstanz gewonnen werden kann. In Tabelle IV sind die Eigenschaften der Präparate gemäß Beispiel 3,9 und 10 zusammengefaßt.

Tabelle IV	Präparat gemäß Beispiel 3	Präparat gemäß Beispiel 9	Präparat gemäß Beispiel 10
	+ + H- +	±	+ -H + +
Farbreaktionen Ninhydrin Orcin Molisch Burette	280	280	280
UV-Absorption (max; πιμ)	1650 1520	1650 1520	1650 1520
IR-Absorption Hauptbande, cm-'	46,05 7,40 1432	45,85 738 14,40	463 7,45 14,10
Elementaranalyse (%) C H N

Säulenchromatographie an DEAE-Sephadex NaCl-Konzentration in Moi/Liter, bei der produkthaiiige Fraktion eluiert wird

Maximum bei Bereich bei

0,60 0,45-0,68 0,60 0,42-0,65

0,60 0.46-0.65

Der überraschende technische Fortschritt der Antitumorsubstanz ergibt sich aus folgendem:

Die AnCtumorsubstanz der Erfindung ist reiner als das gemäß JP-AS 1647/1963 hergestellte Präparat

Die gemäß Beispiel 2 und 3 hergestellten Präparate, d. h. ohne und mit zusätzlicher Reinigung an DEAE-Sephadex-A-50 hergestellten Präparate, haben die nachstehend angegebenen pharmakologischen Eigenschaften. Ihre akute Toxität ist deutlich geringer und ihre in-vitro-Antitumoraktivität erheblich verbessert gegen- ι ο über dem Präparat der JP-AS1647/1963.

Im Gegensatz zu dem sehr wärmeempfindlichen Präparat der JP-AS 1647/1963 ist das gemäß Beispiel 2 — als das ohne zusätzlichen Reinigungsschritt — hergestellte Präparat bei 23° C innerhalb 1 Stunde unverändert aktiv. Aus der JP-AS 1647/1963 ergibt sich, daß das Präparat sehr wärmeempfindlich ist, da ausdrücklich angegeben ist, den wäßrigen zellfreien Extrakt bei Temperaturen von 2 bis 4° C mit dem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Aceton, zu versetzen, und das Präparat auszufällen.

Aus deni Vergleich des Verfahrens gemäß Beispiel 2 mit dem Verfahren gemäß JP-AS 1647/1963 ergibt sich die höhere Reinheit, die zwangsläufig zu einer geringeren Sensibilisierung und einer geringeren Gefahr des Auftretens eines anaphylaktischen Schocks führt

1. Akute Toxizi tat

6 Wochen alten ddY-Mäusen mit einem Körperge- m wicht von 18,5 bis 21,5 g werden die zu untersuchenden Präparate intraperitoneal verabiolgt Die LD₅₀-Wertf (mg/kg) werden nach der Methode von Litchfield-Wil coxon berechnet Dabei wird die Mortalität innerhall: von 7 Tagen nach Verabfolgung einer einzigen Dosü berücksichtigt

2. in-vitro-Antitumoraktivität

Gemäß Ayako M ο r i w a k i, Chemical and Pharma ceutical Bulletin (Tokyo), Bd. 10 (1962), Seite 462, wire die in-vitro-Antitumoraktivität bestimmt Die in folgen der Tabelle angegebenen Werte sind Relativwerte wobei die Antitumoraktivität von 1 mg Trockensubstanz des zellfreien Extraktes als 1 gesetzt ist

Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt Tabelle V Substanz Substanz Substanz

gemäß gemäß gemäß

JA-AS Beispiel 2 Beispiel 3 1647/1963

etwa 300

Akute Toxizität (mg/kg)	etwa 80	138 *(73-202))**
Antitumor- aktivität	0,88	1,8
*) 95 Prozent	Vertrauensbereich.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

10 Patentansprüche:

1. Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen zur unterstützenden Behandlung maligner Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß sie entweder