DE2508396A1 - Verfahren zur gewinnung von virusproteinen, die dabei erhaltenen proteine und diese proteine als wirkstoffe enthaltende arzneimittel - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von virusproteinen, die dabei erhaltenen proteine und diese proteine als wirkstoffe enthaltende arzneimittel

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DE2508396A1 DE19752508396 DE2508396A DE2508396A1 DE 2508396 A1 DE2508396 A1 DE 2508396A1 DE 19752508396 DE19752508396 DE 19752508396 DE 2508396 A DE2508396 A DE 2508396A DE 2508396 A1 DE2508396 A1 DE 2508396A1
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Description

Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22
HtM/se
SCIENCE UNION ET Cie, SOCIETE FRANCAISE DE RECHERCHE MEDICALE 14, rue du' VaI d'Or, 92150 Suresnes / Frankreich
Verfahren zur Gewinnung von Virusproteinen, die dabei erhaltenen Proteine und diese Proteine als Wirkstoffe enthaltende
Arzneimittel
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Virusproteinen, insbesondere ausgehend von Grippeviren, die dabei erhaltenen Virusproteine und pharmazeutische Zubereitungen oder Arzneimittel, die diese Virusproteine als Wirkstoffe enthalten.
Es ist bekannt, daß die Hülle des Myxovirus Influenzae mindestens zwei spezifische Glycoproteine enthält, die entweder durch die Einwirkung von Detergenzien oder durch die Einwirkung von Proteasen oder durch die Behandlung mit einer Kombination aus diesen beiden Reagenzien isoliert werden können.
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_ 2 —
Andererseits hat eine jüngere Veröffentlichung von Skehel (Nature-New Biology 238 (1972), Seite 145) gezeigt, daß die Behandlung mit einer Protease, die zwar eine Trennung dieser beiden Bestandteile der Virushülle sicherstellt, einen vollständigen Abbau der Virusneuraminidase zur Folge hat. Das andere GIykoprotein oder Hämagglutinin, das unter diesen Bedingungen erhalten wird, ist teilweise denaturiert, obwohl es in kristalliner Form vorliegt, und verliert aufgrund dieser Tatsache seine Hämagglutinationseigenschaften.
Es besteht daher ein sehr großes Interesse dafür, diese beiden gereinigten Glykoproteinfraktionen zu isolieren und zur Verfügung zu haben, da sie wertvolle Antigenmaterialien darstellen, die eine Grippeimpfung ermöglichen, indem man entweder Virushämagglutinin oder Virusneuraminidase als solche verabreicht oder diese beiden Glykoproteinfraktionen zur Bildung eines Impfstoffs kombiniert, der stärkere Antigeneigenschaften besitzt.
Es besteht auch ein Bedürfnis zur Gewinnung einer aus Grippeviren gewonnenen Neuraminidase in reiner und aktiver Form, da die Neuraminidase die stabilste genetische Fraktion des Grippevirus darstellt. Andererseits besitzen die unter diesen Bedingungen gebildeten Anti-Virusneuraminidase-Antikörper, ohne in der Lage zu sein, den Grippevirus zu inaktivieren, die Eigenschaft, die Heftigkeit oder die Schwere der Grippeerkrankung zu vermindern oder die Verbreitung des Virus einzuschränken (Kilbourne, J. of Virology 2 (1968), Seiten 281 und 778).
Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Herstellung dieser beiden Glykoproteinfraktionen viralen Ursprungs anzugeben, mit dem man diese in reinem Zustand gewinnen und ohne sie zu denaturieren trennen kann.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Virusproteinen aus Grippeviren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das zuvor gereinigte Grippevirus, das aus infi-
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zierten bebrüteten Eiern oder infizierten Trägerzellen stammt, der Einwirkung eines proteolytischen Enzyms oder einer Mischung aus proteolytischen Enzymen, das bzw. die man aus Kulturen von Streptomyces fradiae gewonnen hat, unterwirft, die Neuraminidase und Hämagglutinin enthaltenden Fraktionen durch Diafiltration in wäßriger Lösung über eine Membran mit selektiver Permeabilität und vernetzter Sturktur konzentriert, die von der Membran der Diafiltrationszelle zurückgehaltene Fraktion gewinnt und sie mit physikalischen Methoden einer Fraktionierung unterzieht, um nacheinander eine im wesentlichen Virushämagglutinin enthaltende Fraktion und dann eine im wesentlichen Virusneuraminidase enthaltende Fraktion zu gewinnen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter durch die folgenden Ausführungsformen definiert werden.
1. Das verwendete proteolytische Enzym oder die verwendete Mischung aus proteolytischen Enzymen besteht im wesentlichen aus einer aus Kulturen von Streptomyces fradiae isolierten Protease, die eine Aktivität von mindestens 5000 Anson-Einheiten pro mg aufweist.
2. Als proteolytisches Enzym oder Mischung aus proteolytischen Enzymen verwendet man ein Material, das im wesentlichen aus einer Protease besteht, die aus Kulturen von Stämmen von Streptomyces fradiae isoliert ist, die unter den Bezeichnungen Wr. 1998 und Wr. 2019 bei dem Museum Wational d'Histoire Naturelle in Paris hinterlegt sind.
3. Die Behandlung der Viruskultur mit dem Enzym oder der Enzymmischung erfolgt bei einer Temperatur von 25 bis 45°C.
4. Man behandelt die Viruskultur bei einem pH-Wert von 5 bis 8 mit dem Enzym oder der Enzymmischung.
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-A-
5. Die Einwirkung des Enzyms oder der Enzymmischung erfolgt während einer Zeitdauer von 1 bis 7 Stunden.
6. Das Enzym oder die Enzymmischung wird mit einer Konzentration zwischen 1 und 30 % verwendet.
7. Die Trennung der Proteinfraktionen nach der Diafiltration erfolgt durch Zentrifugieren unter Anwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten.
8. Der diskontinuierliche Dichtegradient wird mit Hilfe von Natriumglutamatlösungen aufgebaut, deren Konzentrationen von 1 bis 40 % variieren.
9. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bewirkt die Verlängerung der enzymatischen Behandlung der Viruskulturen einen Abbau des Hämagglutinins und ermöglicht die Gewinnung einer einzigen Glykoproteinfraktion, die Virusneurarainidase enthält.
10. Der zum Animpfen verwendete Grippevirusstamm ist vorzugsweise der Hongkong-Virusstamm Ao/68 (Hr1N.,) , der NWS-Stamm des Virus AQ, die Mutante des Stammes RI/5 des Virus A2 oder der Stamm A~-XL des Virus A2.
Das Verfahren ist auch auf andere Grippevirusstämme anwendbar, beispielsweise das Humanvirus A2/Singapur/l/57, das Virus A2/ England/52/64, das Virus A2/England/76/66 oder das rekombinierte Virus X-7 (F-I).
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Neuraminidase viralen Ursprungs, die mit dem oben erhaltenen Verfahren erhalten werden kann. Die Erfindung erstreckt sich insbesondere auf die Neuraminidase des Virus A2/Hongkong/6 8 (H-JSI2) , die mit dem oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist.
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— ο —
Die Erfindung erstreckt sich auch auf das Hämagglutinin viralen Ursprungs, das mit Hilfe des oben erhaltenen Verfahrens erhalten wird und insbesondere auf das Hämagglutinin des Virus A„/ Hongkong/68 (H3N2), das mit dem oben beschriebenen Verfahren, erhältlich ist.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die pharmazeutische Anwendung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Neuraminidase viralen Ursprungs, die als heilendes oder vorbeugendes Arzneimittel zur Bekämpfung der Grippe geeignet ist. Die Erfindung erstreckt sich somit auch auf pharmazeutische Zubereitung oder Arzneimittel, die die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene Neuraminidase als Wirkstoff enthalten und in Form von festen oder flüssigen Präparaten oder gasförmigen Aerosolpräparaten vorliegen.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
Man inokuliert 200 während 11 Tagen bebrütete Hühnereier pro Ei mit 0,2 ml einer Suspension des Grippevirus A~/Hongkong/68 (H3N2) in gepufferter physiologischer Flüssigkeit, wobei die Suspension eine Konzentration von 1:1000 aufweist.
Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden gewinnt man etwa 900 ml infizierte Allantoisflüssigkeit, die pro ml etwa 2050 Einheiten Hämagglutinin und etwa 130 Einheiten Neuraminidase enthält. Man bewirkt eine erste Trennung durch ein halbstündiges Zentrifugieren bei 5000 g, um die Zellbruchstücke und die Mucoproteine abzutrennen. Die überstehende Flüssigkeit wird anschließend während zwei Stunden bei 105 000 g zentrifugiert, wobei man die Temperatur bei etwa 4°C hält. Die
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abzentrifugierten Feststoffe werden vereinigt und in physiologischem Serum suspendiert. Die in dieser Weise erhaltene Suspension wird während drei Minuten mit Ultraschall behandelt (12k Hz). Man erhält eine Suspension,die pro ml 12000 Einheiten Hämagglutinin und 190 Einheiten Neuraminidase enthält.
Man entnimmt dann 20 ml dieser Virussuspension und versetzt sie pro ml mit einem Milligramm aus Streptomyces fradiae gewonnener Protease. Man läßt während zwei Stunden bei 37°C einwirken. Dann wird die Mischung durch Diafiltration mit Hilfe einer, Diafiltrationszelle (Diaflo), die Moleküle mit einem Molekulargewicht oberhalb 10 000 zurückhält, gegen destilliertes Wasser konzentriert.
In dieser Weise gewinnt man in der Zelle 9 ml einer konzentrierten Lösung, die pro ml 280 Einheiten Neuraminidase enthält.
Man entnimmt drei Proben dieser Lösung, die insgesamt 7,5 ml ausmachen, und trägt sie auf drei diskontinuierliche Dichtegradienten auf, die 28 ml Natriumglutamatlösungen umfassen, deren Konzentrationen von 5 bis 40 % variieren. Man zentrifugiert während 30 Stunden bei 24 000 UpM, wobei man die Temperatur bei 100C hält. Nach dem Zentrifugieren gewinnt man 1,2 ml-Fraktionen, die man mit Hilfe eines Fraktionsanalysators (Modell 640 der Firma ISCO) behandelt.
In dieser Weise gewinnt man pro Gruppe drei aufeinanderfolgende Gradienten, d.h. 3 χ 3 ml der Lösung, die ausschließlich Neuraminidase enthält. Diese 9 ml enthalten etwa 750 Einheiten Neuraminidase und entsprechen 20 ml der mit dem proteolytischen Enzym behandelten Virussuspension. Durch Sammeln der anderen Banden der Fraktionen gewinnt man Hämagglutinin.
Die in Einheiten ausgedrückte Neuraminidaseaktivität wird dadurch bestimmt, daß man die Menge der freigesetzten Neuraminsäure nach der von C. Bottex, G. Chatot und R. Fontanges modifizierten Warren-Methode bestimmt,indem man als Substrat Fohlenserum verwendet. Der Hämagglutiningehalt wird mit Hilfe
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von Hämagglutinationsmethoden bestimmt, indem man Hühnererythrocyten und Humanerythrocyten O-Rh+ verwendet.
Die verwendete Protease des Streptomyces fradiae entspricht «
den folgenden analytischen Normen:
Gesamte proteolytische Aktivität 7000 Anson-Einheiten/mg Durch Iniprol nicht inhibierte
proteolytische Aktivität 5610 Anson-Einheiten/mg
Durch den aus Soja extrahierten
Trypsininhibitor nicht inhibierte
proteolytische Aktivität 5570 Anson-Einheiten/mg
Proteingehalt (nach der Methode
von Lowry) 45,7 %, bezogen auf die
Trockensubstanz
Enzymelektrophorese: überwiegende Anwesenheit des Bestandteils 2.
Man erhält die Protease nach dem Züchten von Streptomyces
fradiae und dem Eintrocknen der Kulturbrühe durch Absorption
an einem Ionenaustauscherharz und fraktionierte Elution.
Beispiel 2
Einfluß der Enzymkonzentration auf die Kinetik der Freisetzung von Hämagglutinin und Neuraminidase viralen Ursprungs.
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Enzymatische Kinetik
Zeit zur Bildung Zeit des zur BiI- Optimale eines optimalen dung eines opti- Enzym-Hämagglutinin- malen Neuramini- konzengehalts dasegehalts tration
Bromelain 1 mg/ml
(+ 4°C)		 3 Std. 30 Min. 1 %
Bromelain 1 mg/ml
(37°C)		 30 Min. 30 Min. *1 Q.
I "Q
Trypsin 1 mg/ml
(+ 37°C)		 30 Min. 30 Min. 1 %
"X-Chymotryps in
1 mg/ml (+ 37°C)		 30 Min. 60 Min. 5 %
Aus Streptomyces fradiae gewonnene Enzyme 1 mg/ml (+ 37°C)
60 Min.
60 Min.
10 %
Das aus den Kulturen von Streptomyces fradiae gewonnene Enzym ist das Enzym, das bei der geringsten Enzymkonzentration in einer sehr kurzen Zeit die maximale Freisetzung der beiden Virusproteine ermöglicht.
Beispiel 3
Einfluß der Zeitdauer des Kontakts des proteolytischen Enzyms auf die Möglichkeit der Trennung der Virusneuraminidase und des Virushämagglutinins nach dem Zentrifugieren in Gegenwart eines diskontinuierlichen Dichtegradienten.
Zur Bildung des Dichtegradienten werden Kaliunitartratlösungen mit Konzentrationen von 1 bis 40 % verwendet. Das Zentrifugieren erfolgt während 20 Std. bei 10°C. Es werden 2,5 ml der behandelten Virussuspension eingesetzt.
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Virus-Protease-
Kontaktzeit		 1 Std. 3 Std. 5 Std. 20 Std.
Bromelain
1 mg/ml
(+ 4OC)		 nur nur
Neurainini- Heuramini-
dase dase
Bromelain
1 mg/ml '
(+ 37°C)		 + ++
Trypsin
1 mg/ml 10 %
(+ 37°C)		 nur
Heurami-
nidase		 +++
Aus Kulturen von Streptomyces fradiae gev/onnene Enzyme 1 mg/ml 5 % bei 37°C bei 10°C
(während 30 Std. Zentrifugierzeit)
+++ sehr gute Trennung von Neuraminidase und Hämagglutinin ++ mittel gute Trennung + teilweise Trennung
Beispiel 4
Aktivität der proteolytischen Enzyme für die Freisetzung von Neuraminidase und Hämagglutinin aus dem Virus A2 Hongkong.
Die folgenden Ergebnisse stehen für die Mengen an freigesetztem Hämagglutinin und freigesetzter Neuraminidase, bezogen auf den Titer des Ausgangsvirus, und sind bei einer optimalen Virus-Protease-Kontaktzeit ermittelt worden.
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freigesetztes freigesetztes Hämagglutinin Neuraminid^se
ßromelain 4°C
Bromelain 37°C
Trypsin 375C
<*-Chymotrypsin 37°C
Rohe Enzyme aus Streptomyces fradiae 37°C
Gereinigte Enzyme aus Streptomyces fradiae 37°C
χ 12 χ 2 χ 8 χ 3 χ 5 χ 10
Aus der obigen Tabelle geht hervor, daß die aus Kulturen von Streptomyces fradiae gewonnenen Enzyme eine höhere Ausbeute an Virusneuraminidase und Virushämagglutinin ermöglichen.
Beispiel 5
Man wiederholt in schwach abgewandelter Form das Verfahren des Beispiels 1. Man inokuliert unter ähnlichen Bedingungen 200 Hühnereier mit einer Suspension des Grippevirus A2/Hongkong/ 68 (H3W2). Nach einer Inkubationszeit von zwei Tagen gewinnt man 1500 ml infizierte Allantoxsflüssigkext, die pro ml 400 Einheiten Hämagglutinin und 350 Einheiten Neuraminidase enthält (was der Freisetzung von 0,107 g Sialsäure pro ml entspricht). Man zentrifugiert zweimal und suspendiert die abzentrifugierten Feststoffe in einem Phosphatpuffer. Man erhält in dieser Weise 500 ml einer Suspension von gereinigten Viren, die pro ml 12 000 Einheiten Hämagglutinin und 520 Einheiten Neuramini-
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dase enthält (was der Freisetzung von 0,157 g Sialsäure pro ml entspricht). Man entnimmt dieser Suspension aliquote Anteile und behandelt sie während zwei Stunden bei 37°C mit aus Streptomyces fradiae gewonnener Protease. Die Fraktionen werden danri vereinigt und durch Diafiltration auf 60 ml eingeengt. Diese 60 ml werden in sechs Fraktionen von 10 ml aufgeteilt, die dann auf sechs aufeinanderfolgende Dichtegradienten aufgetragen werden, die durch Natriumglutaminatlösungen in Konzentrationen von 5 bis 40 %, die 1 % Natriumdodecylsulfat enthalten, gebildet werden. Nach der Diafiltration erhält man eine behandelte, konzentrierte und gereinigte Virussuspension, die pro ml 48 000 Einheiten Hämagglutinin und 710 Einheiten Neuraminidase enthält (was der Freisetzung von 0,212 mg Sialsäure pro ml entspricht).
Nach dem Zentrifugieren bei 60 000 g während 30 Std. bei 15°C gewinnt man in sechs Ansätzen 144 ml einer Suspension, die pro ml 1600 Einheiten Hämagglutinin, d. h. insgesamt 228 000 Einheiten Hämagglutinin, enthält und 2 8 ml einer Suspension, die pro ml 310 Einheiten Neuraminidase, d. h. insgesamt 13800 Einheiten Neuraminidase, enthält.
Die Suspensionen werden dann über eine mit einem chemisch vernetzten Dextran (Sephadex G 15) gefüllte Kolonne geführt und fraktioniert, um die Verunreinigungen, wie Natriumglutamat und Natriumdodecylsulfat zu beseitigen. Die nach dem Eluieren erhaltenen Fraktionen besitzen Aktivitäten, die im wesentlichen identisch sind mit den oben erwähnten Aktivitäten.
Schließlich ist es ausgehend von 1500 ml der infizierten Allantoisflüssigkeit möglich, mit erhöhten Ausbeuten eine Fraktion von gereinigtem Hämagglutinin und eine Fraktion von gereinigter Neuraminidase zu erhalten.
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Die Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat in einer Konzentration von 1 % in dem Natriumglutamat-Dichtegradienten ermöglicht eine sehr scharfe Trennung der Untereinheiten Hämagglutinin und Neuraminidase. Die Hämagglutininfraktion wird in den ersten EIu-* tionsfraktionen aus der mit dem chemisch vernetzten Dextran (Sephadex G 15) gefüllten Säule eluiert, während die Neuraminidase in den sich daran anschließenden Fraktionen erhalten wird, was eine sehr saubere Trennung sicherstellt.
Die auf Polyacrylamidgel durchgeführte Elektrophorese zeigt nach dem Anfärben 0,25 % Coomassieblau, daß die Neuraminidase in Form einer einzigen Bande auftritt, die einem einzigen PoIypeptidtyp entspricht, v/ährend das Hämagglutinin in Form von zwei Polypeptidketten vorhanden ist.
Das Infrarotspektrum der Neuraminidase (KBr) ist gekennzeichnet durch eine starke Absorptionsbande bei 3333 cm (-NH-- und monosubstituierte NH-Gruppe), die auf die Anwesenheit von Polypeptidketten hinweist; eine schwache Bande bei 2849 cm , die -CH -Valenzschwingungen entspricht; eine breite Bande mit
-1
einem Maximum bei 1613 cm , die wahrscheinlich die Folge der Absorption von Carbonylgruppen, primären Amid.gruppen und sekundären Amidgruppen ist; eine schwächere Bande bei 1379 cm (-CHt); und eine breite Bande mit einem Absorptionsmaximum
— 1
bei 1050 cm , die den C-OH-Valenzschwingungen der Polysaccharide zugeordnet werden kann.
Das Infrarotspektrum des Hämagglutinins unterscheidet sich nur wenig von dem der Neuraminidase. Dennoch ist die Bande bei 2849 cm wesentlich stärker als im Spektrum der Neuraminidase. Andererseits weist das Auftreten einer Schulter bei 2778 cm auf die Anwesenheit von Valenzschwingungen der gebundenen 0-H-Bindungen hin.
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Claims (7)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    QA Verfahren zur Gewinnung von Virusproteinen aus Grippeviren, dadurch gekennzeichnet, daß man Grippeviruskulturen der Einwirkung eines proteolytischen Enzyms oder einer Mischung aus proteolytischen Enzymen, das bzw. die man aus Kulturen von Streptomyces fradiae gewonnen hat, unterwirft, die Neuraminidase und Hämagglutinin enthaltenden Fraktionen durch die Diafiltration in wäßriger Lösung über eine Membran mit selektiver Permeabilität und vernetzter Struktur konzentriert, die von der Membran der Diafiltrationszelle zurückgehaltene Fraktion gewinnt und sie mit physikalischen Methoden einer Fraktionierung unterzieht, um nacheinander eine im wesentlichen Virushämagglutinin enthaltende Fraktion und dann eine im wesentlichen Virusneuraminidase enthaltende Fraktion zu gewinnen.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) als proteolytisches Enzym oder als Mischung aus proteolytischen Enzymen ein Material verwendet, das überwiegend aus einer aus Kulturen von Streptomyces fradiae gewonnenen Protease besteht und eine Aktivität von mindestens 5000 Anson-Einheiten pro mg aufweist,
    b) als Kulturen von Streptomyces fradiae jene Stämme verwendet, die in dem Museum National d'Histoire Naturelle de Paris unter den Bezeichnungen Nr. 1998 und Nr. 2019 hinterlegt sind,
    c) die Behandlung der Viruskultur mit dem Enzym oder den Enzymen bei einer Temperatur von 25 bis 45°C durchführt,
    d) das Enzym oder die Enzyme bei einem pH-wert von 5 bis 8 auf die Viruskultur einv/irken läßt,
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    e) das Enzym oder die Enzyme während einer Zeitdauer von 1 bis 7 Std. auf die Viruskultur einwirken läßt,
    f) das aus Streptomyces fradiae gewonnene Enzym oder die aus Streptomyces fradiae gewonnenen Enzyme mit einer Konzentration von 1 bis 30 % einsetzt,
    g) die Trennung der Proteinfraktionen nach der Diafiltration durch Zentrifugieren in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten bewirkt,
    h) den diskontinuierlichen Dichtegradienten mit Hilfe von Natriumglutamatlösungen mit Konzentrationen von 1 bis 40 %
    bildet,
    i) einen diskontinuierlichen Dichtegradienten anwendet, der
    zusätzlich ein oberflächenaktives Mittel enthält, j) als oberflächenaktives Mittel Natriumdodecylsulfat mit
    einer Konzentration zwischen 0,5 und 2 % verwendet und/oder k) als Grippevirusstamm den Hongkong-Virusstamm A2/68 (HoN-) verwendet.
  3. 3. Neuraminidase viralen Ursprungs, erhältlich nach dem Verfahren der Ansprüche 1 oder 2.
  4. 4. Neuraminidase des Virus A2/Hongkong/68 (H3N2), erhältlich nach dem Verfahren der Ansprüche 1 oder 2.
  5. 5. Hämagglutinin viralen Ursprungs, erhältlich nach einem Verfahren der Ansprüche 1 oder 2.
  6. 6. Ilämagglutinin des Virus A2/Hongkong/68 (H3N2) , erhältlich nach dem Verfahren der Ansprüche 1 oder 2.
  7. 7. Pharmazeutische Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet , daß sie aus einer Verbindung der Ansprüche 3 bis 6 als Wirkstoff und einem pharmazeutischen inerten Bindemittel oder Trägermaterial bestehen.
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DE19752508396 1974-03-05 1975-02-26 Verfahren zur gewinnung von virusproteinen, die dabei erhaltenen proteine und diese proteine als wirkstoffe enthaltende arzneimittel Withdrawn DE2508396A1 (de)

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