DE2731570B2 - Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharide mit therapeutischer Wirkung - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharide mit therapeutischer WirkungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharide mit therapeutischer Wirkung, das
insbesondere gegen Krebserkrankungen wirksam ist, aus submersen Kulturen von Fungi der Gattung
Coriolus der Klasse Basidiomycetes.
Es ist bekannt, daß Polysaccharide mit Antitumorwirkung aus Kulturen von Fungi der Klasse Basidiomycetes
in wäßrigen flüssigen Medien erhalten werden können. Es ist auch bekannt, daß, wenn man einen Fungus der
Klasse Basidiomycetes in einem flüssigen Medium submers kultiviert, das gewünschte Polysaccharid nicht
nur im Mycel, sondern auch im Kulturmedium angetroffen wird.
Für die Gewinnung eines Polysaccharids aus submersen
Kulturen von Fungi der Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes hat man daher allgemein ein
Verfahren angewandt, bei dem das Mycel zerkleinert wird, wobei man gegebenenfalls Wasser zum Kulturmedium
gibt, und darauf filtriert oder zentrifugiert, um den Mycelrückstand zu entfernen. Anschließend wird das
gewünschte Polysaccharid aus dem flüssigen Anteil gewonnen. Vergleiche die DE-OS 21 38 329.
Obgleich man diese Methode als rationell und praktisch bezeichnen kann, ist sie mit einigen schwerwiegenden
Nachteilen behaftet Wenn man zum Beispiel die submerse Kultur unmittelbar in Mycel und
Flüssigkeit aufteilt, läßt sich eine solche Auffcennung
nicht nur wegen der erhöhten Viskosität des Systems, sondern auch wegen des hohen Wassergehaltes des
Mycels nicht wirksam durchführen. Die Zugabe von Wasser verringert zwar die Viskosität des Kulturmediums,
verstärkt aber auch die Extraktion des Wirkstoffes in das Wasser. Die Verwendung eines Überschusses an
Wasser verlängert die für die Auftrennung erforderliche
Zeit und verringert natürlich auch nicht den Wassergehalt des Mycels.
Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharides aus den zuvor
genannten submersen Kulturen mit höherer Wirksamkeit und in höherer Ausbeute.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Das wesentliche Merkmal des ei findungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man den Wirkstoff nicht
direkt aus dem Kulturmedium gewinnt, sondern es erst trocknet und dann mit einem wäßrigen Lösungsmittel
extrahiert.
Die verwendbaren Fungi der Klasse Basidiomycetes gehören der Gattung Coriolus an und umfassen zum
Beispiel Coriolus versicolor (Fr.) Qu61, Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus hirsutus (Fr.) Qufel, Coriolus
pargamenus (Fr.) Pat, Coriolus pubescens (Fr.) Quel und
Coriolus conchifer (Schw.) Pat. Die morphologischen und mykologischen Eigenschaften dieser Basidiornyceten
sind in »Coloured Illustration of Fungi of Japan« von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, Band I, 1974, und
Band II, 1975, beschrieben. Von diesen Basidiomyceten
sind die nachstehend aufgeführten im Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science
and Technology hinterlegt.
Coriolus versicolor (Fr.) Quel:
Coriolus consors (Berk.) Imaz.:
Coriol'ss hirsutus (Fr.) Quel:
Coriolus pargamenus (Fr.) Pat:
Coriolus consors (Berk.) Imaz.:
Coriol'ss hirsutus (Fr.) Quel:
Coriolus pargamenus (Fr.) Pat:
Hinterlegungs- | Hinterlegungs |
Nr. | datum |
FERM-P-2414 | 25. Dez. 73 |
FERM-P-988 | 24. Juni 71 |
FERM-P-2711 | 6. Sept. 74 |
FERM-P-2712 | 6. Sept. 74 |
Der Ausdruck »submerse Kultivierung« bezeichnet die Kultivierung in einem flüssigen Medium unter
Belüftung und Rühren, so daß das Mycelwachstum nicht an der Oberfläche des flüssigen Mediums erfolgt,
sondern meist im tiefen Teil der Flüssigkeitsschicht. Die Belüftungsgeschwindigkeit beträgt bei dieser Art der
Kultivierung im allgemeinen etwa 0,1 bis 2,0 l/I/Min. (Medium) und die Rührgeschwindigkeit etwa 30 bis 800
U/Min.
Als Medium für die submerse Kultur kann jedes für die Kultivierung von Mikroorganismen bekannte
natürliche oder synthetische Medium verwendet werden, oder geeignete Modifizierungen dieser bekannten
Medien. Mit einem solchen Medium ist eine Wachstumzeit von cLwa 3 bis 10 Tagen ausreichend, um das
gewünschte Polysaccharid in zufriedenstellend hoher Ausbeute zu gewinnen.
Bei der submersen Kultivierung in einem wäßrigen Medium tritt das Mycel nicht an die Flüssigkeitsoberfläche
unter Bildung ausgedehnter Massen wie im Falle stationärer Kulturen, sondern fällt aufgrund der
Scherwirkung durch das Rühren in Form von verhältnis-
mäßig kleinen Pellet-ähnlichen oder faserartigen Stükken an. Bei dieser Verfahrensweise wird das Polysaccharid nicht nur im Inneren des Mycels, sondern auch außen
gebildet, daß heißt es befindet sich auch im Medium.
Erfindungsgemäß wird das bei der submersen Kultiviening eines Fungus der Gattung Coriolus der
Klasse Basidiomycetes gebildete Kulturmedium getrocknet Diese Trocknung wird gewöhnlich bei
Temperaturen von 60 bis 1500C durchgeführt. Die
Trocknung und die hierfür verwendeten Vorrichtungen können beliebiger Art sein. Gewöhnlich verwendet man
die hierfür üblicherweise angewandten, zum Beispiel Trommeltrockner, Abflußtrockner oder Dünnschichtverdampfer.
Diese Trocknungsbehandlung erleichtert die nachfolgende Extraktion mit einem wäßrigen Lösungsmittel
sowie die Gewinnung des Polysaccharids durch Reinigung der Extraktionslösung außerordentlich. Dabei ist darauf hinzuweisen, daß bei Durchführung der
Trocknung unter 600C nicht nur die Trocknungsgeschwindigkeit gering ist, sondern auch die oben
angestrebten Wirkungen nicht in zufriedenstellender Weise erreicht werden. Außerdem ist zu beachten, daß
das Polysaccharid mit steigender Trocknungstemperatur zur Zersetzung neigt, so daß die Trocknung nicht bei
einer Temperatur von über 1500C durchgeführt werden
sollte.
Die wie vorstehend angegeben getrocknete Kulturbrühe wird dann in üblicher Weise mit einem wäßrigen
Lösungsmittel extrahiert Der Ausdruck »wäßriges Lösungsmittel« bezeichnet vorliegend Wasser oder eine
wäßrige, ein Alkalisalz, wie zum Beispiel Natriumchlorid oder Natriumacetat, oder ein polares organisches
Lösungsmittel, wie zum Beispiel Methanol, Äthanol und
dergleichen, enthaltende Lösung. Im erfindungsgemäßen Verfahren ist jedoch die Extraktion unter Erhitzen
mit Wasser oder einer verdünnten alkalischen Lösung am wirksamsten. Am vorteilhaftesten für die technische
Anwendung ist die Mehrfachextraktion unter Verwendung einer solchen Extraktionslösung.
Der erhaltene Extrakt wird dann zur Entfernung der Substanzen mit einem Molekulargewicht von unter 5000
gereinigt, um das gewünschte Polysaccharid zu erhalten.
ίο Diese Reinigung kann in jeder bekannten geeigneten
Weise erfolgen, zum Beispiel durch Aussalzen, Dialyse, Ultrafiltration, Umkehr-Osmose, ionenaustauschbehandlung, Gelfiltration, oder Ausfällung mit einem
organischen Lösungsmittel. Diese Techniken können
allein oder in Kombination angewandt werden.
Am wirksamsten für die erfindungsgemäßen Zwecke ist die Ultrafiltration und die Umkehr-Osmose.
Nach der Entfernung der Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht von unter 5000 aus der
Extraktlösung wird diese sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet und dann in Handelsprodukte übergeführt
Das in erfindungsgemäßer Weise erhaltene Polysaccharid stellt eine leberbraune Substanz mit einem
Stickstoffgehalt von 2 bis 8%, in den meisten Fällen von
2r> 3 bis 6% dar, die keinen ausgeprägten Schmelzpunkt
besitzt, sondern allmählich schwarz wird und sich bei Temperaturen von über etwa 1200C zersetzt. Sie ist in
Wasser löslich, in Alkohol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan aber nahezu unlöslich. Ferner ist sie nahezu
jo geschmack- und geruchlos.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse
verschiedener Farbreaktionstests mit der erfindungsgemäßen hergestellten Verbindung zusammengestellt.
Farbe
a-Naphthol-Schwefelsäure Reaktion (Molish's purpur
Reaktion)
Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit purpur-blau
ChlorwasserstofFsäure
Saccharide, bestätigt
Saccharide, bestätigt
Saccharide, bestätigt
Saccharide, bestätigt
Peptidbindungen, bestätigt
«-Aminosäuren, bestätigt
Die Testergebnisse in der obigen Tabelle zeigen an, daß es sich bei der erfindungsgemäßen hergestellten
Substanz um ein stickstoffhaltiges Polysaccharid handelt. Ihr durch Ultrazentrifugation ermitteltes Molekulargewicht lag im Bereich von 5000 bis 300 000 und das
mittlere Molekulargewicht betrug 10 000 bis 100 000. Die unter Anwendung anderer Methoden ermittelten
Werte, zum Beispiel durch Fraktionierung oder durch Ultrafiltration lagen sämtlich im Bereich von 10 000 bis
100 000. Man kann daher in berechtigter Weise annehmen, daß das durchschnittliche Molekulargewicht
der erfindungsgemäßen Substanz im Bereich von 10 000
bis 100 000 liegt.
br)
Das erfindungsgemäß erhältliche stickstoffhaltige
Polysaccharid zeigt ausgezeichnete Antitumorwirksamkeit bei Mäusen, und zwar nicht nur bei intraperitonealer, sondern auch bei oraler Verabreichung. Es stellt also
ein oral wirksames Mittel für die Behandlung von Krebserkrankungen dar. Außer der oralen Antitumorwirkung zeigt es hohe Wirksamkeit bei der Wiederherstellung unterdrückter Immunreaktionen. Das heißt, die
erfindungsgemäße Substanz eignet sich nicht nur für die Verhinderung der unerwünschten Nebenreaktionen bei
der Krebsbehandlung mit chemotherapeutischen Mitteln und der erhöhten Empfindlichkeit bei der
Radiotherapie, sondern auch zur Verhinderung eines
Abfalls der Immunreaktionen oder der physischen
Widerstandsfähigkeit eines Patienten nach chirurgischen Eingriffen oder Bluttransfusionen und zur
Behandlung oder Verhinderung von Virus- oder Bakterieninfektionen bei verringerter Immunreaktion
bzw. physischer Widerstandskraft eines Patienten. Die orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz
führte auch zu einer ausgezeichneten Wirkung in Bezug auf die Verbesserung der Leberfunktion, die Förderung
des .Appetits, die Heilung von Magen-Darm-Erkrankungen
und die Förderung der Urinausscheidung. Sie eignet sich auch zur Behandlung der Lepra.
Die erfindungsgemäßen Saccharide sind hinsichtlich ihrer Anti-Tumorwirkung den Glucanen der bereits
10 genannten DE-OS 21 38 329, die keinen Stickstoff enthalten und aus dem Kulturmedium der Züchtung von
Fungi der Gattung Coriolus durch Abfiltrieren des Mycels und Ausfällung aus dem mycelfreien Kulturmedium
mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gewonnen werden, überlegen.
Dies wurde anhand von Vergleichsversuchen nachgewiesen, die mit dem nach Beispiel 2 der DE-OS
21 38 329 unter Verwendung von Coriolus versicolor FERMP-1022 erhaltenen Glucan sowie dem nach
Beispiel 1 (Nr. 3) gemäß der Erfindung erzeugten Polysaccharid durchgeführt wurden. Die Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
Elementaranalyse CHN
Intraperitoneale Verabreichung
Dosis')
1. R.J)
Orale Verabreichung
Dosis3) 1. R.-1)
Polysaccharid gem. Beisp. 2 der 40.2 7,0 0 IO mg/kg 92 1000 mg/kg
DE-OS
Polysaccharid nach Beisp. 1 (Nr. 3) 42,0 5,9 3,4 10 mg/kg 95 1000 mg/kg
der Erfindung
') 10 mg/kg ein über den anderen Tag, 10 Dosen in 20 Tagen
2) Hemm-Verhältnis gegen
Gewicht des Tumors der Kontrolltiere - Gewicht des Tumors der behandelten Tiere
Sarcoma 180 = -—ττ—.—= :—r.—7-777.
x '00
24
70
3) 1000 mg/kg, 20 Tage lang jeden Tag
Die erhaltenen Werte zeigen, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid bei oraler Verabreichung dem
bekannten weit überlegen ist. Die Vorteile einer oralen 4»
Therapie gegenüber einer, die parenterale Injektionen erfordert, liegen auf der Hand.
Das nachfolgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren. In ihm beziehen sich alle Prozentsätze,
sofern nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht. 4 r>
1600 Liter eines Mediums aus 10% Glukose, 1,5% Hefeextrakt, 0,1% KH2PO4 und 0,1% MgSO4 ■ 7 H2O
wurden in einen senkrecht stehenden 2-m3-Fermenta- w
tionsbehälter gegeben. Dieses Medium wurde mit 20 Liter einer Aufschlämmung von Coriolus versicolor
(Fr.) Quel FERM-P-2414 beimpft, die aus einer Schüttelkultur nach 7tägiger Kultivierung bei 26° C bei
einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 l/Min, je Liter Medium und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/Min,
erhalten worden war.
Das so erhaltene Kulturmedium (Aufschlämmung) wurde in etwa 500 Liter Anteile aufgeteilt. Jeder dieser
Teile wurde in einem Doppeltrommel-Trockner ge- to trocknet. Die Oberflächentemperatur des Trommeltrockners
wurde so eingestellt, daß die Temperatur der Oberfläche der Kulturbrühe (die Brühe befindet sich in
Form einer dünnen Schicht auf der Trommeloberfläche) 65° C, 8O0C, 90° C, 110°C bzw. 145° C betrug und der b5
Wassergehalt jedes getrockneten Produkts weniger als 20 Gew.-% ausmachte, vgl. Tabelle 2 unten.
Dann wurden zu jedem dieser getrockneten Produkte 250 Li r heißes Wasser gegeben, und es wurde drei
Stunden bei 95±1°C extrahiert. Nach dem Kühlen wurde in Mycelrückstand und Extraktlösung getrennt,
wofür man eine Schrauben-Dekantiervorrichtung und eine Plattenzentrifuge verwendete. Die scheinbare
Viskosität der Mischung und die für die Zentrifugalabscheidung erforderliche Zeit sind in der nachstehenden
Tabelle 2 zusammengestellt.
Der in der oben beschriebenen Weise erhaltene Extrakt wurde durch eine PM-5-Membran eines
HF-Ultrafilters der Amicon Company geführt, um aus dem Extrakt die Verbindungen mit einem Molekulargewicht
von unter 5000 zu entfernen. Man erhielt etwa 100 Liter gereinigte Lösung. Da die Konzentration der
gereinigten Lösung nur etwa 1% betrug, wurde sie auf eine für die nachfolgende Sprühtrocknung geeignete
Konzentration gebracht. Nachdem bei einer Konzentrierung über einen bestimmten Wert die gereinigte
Lösung geliert und die Behandlung schwierig macht, ist der Grenzwert der Konzentration, unterhalb dem keine
Gelierung eintritt, als kritische Konzentration in der Tabelle 2 angegeben.
Die für die Sprühtrocknung der oben genannten konzentrierten Lösung erforderliche Zeit und die
erzielte Ausbeute an Polysaccharid ist ebenfalls in der Tabelle 2 aufgeführt.
Für Vergleichszwecke wurde eine in gleicher Weise erhaltene Kulturbrühe bei 45°C bzw. 1600C bzw.
überhaupt nicht getrocknet. Die mit diesen Proben erzielten Ergebnisse sind gleichfalls in der Tabelle 2
angegeben.
Tabelle 2 | Beispiele | 2 | 27 31 | 570 | 5 | 8 | 2 | Verunreini | 3 fi | |
7 | Probe, | 1 | 80 | 145 | 160 | gungen |
keine
Trocknung |
|||
Nr. | 65 | 20 | 6 | Vergleichsbeispiele | 2 | |||||
Trocknungstemperatur, CC | 20 | 1 | ||||||||
Wassergehalt nach dem | 31 | 3 | 4 | 27 | 45 | 26 | - | |||
Trocknen, Gew.-% | 31 | 90 | 110 | 50 | ||||||
Menge der getrockneten | 250 | 17 | 12 | 250 | 250 | 0 | ||||
Kultur, kg | 250 | 50 | ||||||||
Menge des für die Extraktion | 150 | 30 | 28 | 100 | 100 | 250 | ||||
verwendeten heißen Wassers, I | 150 | 350 | ||||||||
Scheinbare Viskosität der zu | 35 | 250 | 250 | 30 | 30 | 90 | ||||
extrahierenden Mischung, cps | 35 | 200 | ||||||||
Für die Trennung erforderliche | 5,5 | 100 | 100 | 5 | 5 | 20 | ||||
Zeit, Min. | 5,5 | 60 | ||||||||
Für die Ultrafiltration erforder | 15 | 35 | 30 | 15 | 15 | 4 | ||||
liche Zeit, Stunden | 15 | 10 | ||||||||
Kritische Konzentration der | 10 | 5,5 | 5 | 10 | 10 | 37 | ||||
gereinigten Lösung, Gew.-% | 10 | 8 | ||||||||
Für die Sprühtrocknung erforder | 900 | 15 | 15 | 900 | 800 | 950 | ||||
liche Zeit, Stunden | 900 | 24 | ||||||||
Ausbeute, g | 10 | 10 | ||||||||
Antitumorwirkung (Tumor- | 97 | 97 | 950 | 60 | 95 | |||||
Hemmung, %): | 96 | 67 | 900 | 900 | 62 | 10 | 71 | |||
Intraperitoneale Verabreichung | 65 | enthält | ||||||||
Orale Verabreichung | 93 | Verunreini | ||||||||
- Bemerkungen | 95 | 98 | 65 | gungen | ||||||
70 | 60 | enthält | ||||||||
Aus den Zahlenwerten der Tabelle 2 geht hervor, daß bei Trocknung der Kultur im angegebenen Temperaturbereich, insbesondere bei Temperaturen von 60 bis
150° C, die Extraklionsbehandlung, die Reinigung des
Extrakts, die Einengen der gereinigten Lösung und die
Sprühtrocknung sehr rationell und zweckmäßig durchgeführt werden kann.
Alle erhaltenen Polysaccharidprodukte bestanden aus einem braunen, in Wasser leicht löslichen Pulver. Das
Produkt des Vergleichsbeispiels 3 enthielt eine Spur unlöslicher Stoffe. Die Elementaranalysen der Produkte
zeigten, daß diese aus C, H, N und O bestanden, wobei
der Stickstoff etwa 3 bis 3,5% ausmachte. Auch die Ergebnisse der verschiedenen Farbreaktionstests in der
Tabelle 1 zeigen, daß die erhaltenen Produkte aus Stickstoff enthaltenden Polysacchariden bestehen.
Die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Substanz gegenüber festen Sarcoma-180-Tumoren bei Mäusen,
sowohl nach intraperitonealer als auch nach oraler Verabreichung, geht aus der Tabelle 2 hervor, die eine
ausgezeichnete Hemmwirkung in allen Fällen anzeigt, die Probe ausgenommen, bei der die Trocknungsbehandlung bei einer Temperatur über 150° C durchge
führt wurde. Die Tumor-Hemmwirkung wurde unter Anwendung einer üblichen Methode bestimmt, die
nachfolgend beschrieben ist:
Die Sarcoma- 180-TumorzeHen wurden intraperitoneal in Mäuse transplantiert und nach 7tägigem Wachstum
wurden 106 dieser Zellen weiter unter die Achselhaut anderer Mäuse transplantiert, um feste Tumoren zu
bilden. Die Proben wurden 24 Stunden nach der Transplantation verabreicht Bei intraperitonealer Verabreichung wurden die Substanzen einmal je Tag in
einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht, und zwar insgesamt 20 Tage, so daß eine Gesamtmenge von 0,2
so ml/20 g (Körpergewicht der Maus) verabreicht wurde.
Bei oraler Verabreichung wurde die Substanz einmal je Tag in einer Menge von 1000 mg/kg verabfolgt,
ebenfalls insgesamt 20 Tage lang, so daß eine Gesamtmenge von 0,2 ml/20 g (Körpergewicht der Maus)
verabfolgt wurde. Jede Geschwulst wurde 25 Tage nach der Transplantation herausgeschält und die Tumor-Hemmwirkung aus dem durchschnittlichen Gewicht der
Tumoren bei den Mäusen, denen die Substanz verabfolgt worden war und dem durchschnittlichen
Claims (4)
1. Verfahren zur Gewinnung eines therapeutisch wirksamen Polysacrharids durch Züchtung eines
Fungus der Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes
in einem wäßrigen flüssigen Medium unter submersen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet,
daß man die erhaltene Kultur bei einer Temperatur von 60 bis 1500C trocknet, dann mit
einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert und den erhaltenen Extrakt durch Entfernung der Substanzen
mit einem Molekulargewicht von unter 5000 reinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Extraktion mit einem wäßrigen Lösungsmittel in mehreren Stufen durchführt
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Lösungsmittel aus
Wasser und/oder einer verdünnten alkalischen Lösung besteht
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß man die Reinigung des Extrakts
durch Ultrafiltration und/oder Umkehr-Osmose bewirkt
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