DE2022311B2

DE2022311B2 - Negamycln, dessen Salze und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2022311B2
Application number: DE2022311A
Authority: DE
Inventors: Masa Hamada; Shinichi Yokohama Kanagawa Kondo; Kenji Maeda; Tomio Takeuchi; Hamao Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1969-05-08
Filing date: 1970-05-06
Publication date: 1975-06-26
Also published as: GB1315551A; CS178856B2; US3679742A; AU1491870A; IL34423A0; NL7006698A; SE360885B; CA926329A; DE2022311A1; PL80573B1; NL156751B; BE750096A; IL34423A; CH544808A; FR2070068A1; DK127931B; NO132240B; NO132240C; FR2070068B1

Description

und dessen Salze. to

2. Verfahren zur Herstellung von Negamycin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Streptomyces purpeofuscus ATCC 21 470 in einer wäßrigen Kohlehydratlösung gezüchtet wird, die ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, wobei das Züchten unter aeroben Bedingungen so lange durchgeführt wird, bis die Lösung eine anti bakterielle Aktivität besitzt, und an-

O CH₃

schließend das Negamycin aus der wäßrigen Lösung entweder durch Ausfällung mit einer wasserunlöslichen Säure oder durch Adsorption an einem Kationenaustauscherharz, an einem stark basischen Anionenaustauscherharz oder an Kohlenstoff und anschließende Eluierung abgetrennt wird und dieses gegebenenfalls in an sich bekannter Weise in die Salze abergeführt wird.

Die Erfindung betrifft das Antibiotikum Negamycin der Formel

CH₂ — CH — CH₂ — CH — CH₂ — C — NH — N — CH₂ — COOH

NH₂ OH

NH₂

CH₃

und dessen Salze und ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Gärung, Abtrennung und Reinigung desselben.

Diese Substanz vermag in wirksamer Weise Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella und Staphylococci zu inhibieren. Sie besitzt eine geringe Toxizität und übt eine therapeutische Wirkung auf Infektionen von Pseudomonas und anderen ansprechbaren Organismen in Mäusen aus. Diese Substanz eignet sich zur Heilung von Infektionen von Pseudomonas sowie anderen ansprechbaren Organismen in Menschen und Tieren.

Das Antibiotikum Negamycin ist in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Butanol, Butylacetat, Äthylacetat, Chloroform und Benzol praktisch unlöslich. Sie zeigt keine maximale Absorption von UV-Licht zwischen 220 und 400 nm und liefert auf Ninhydrin, rotes Tetrazolium und Rydon-Smith-Reagens positive Reaktionen, während die Reaktionen gegenüber Sakaguchi und Molisch negativ verlaufen. Die Substanz weist in dem Infrarotteil des Spektrums Absorptionsbanden auf, wenn sie mit Kaliumbromid in pelletisierter Form untersucht wird. Die Absorptionsbanden treten bei folgenden Wellenzahlen in cm"¹ auf: 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 und 720. Ferner ist die Substanz optisch aktiv ([aft» E + 2,5° (c 2, H₂O)). Sie entspricht der Formel C₉H₂₀N₄O₄ und zeigt drei pH-Werte von 3,55, 8,10 und 9,75.

F i g. 1 ist das Infrarotspektrum von Negamycin zusammen mit Kaliumbromid, während

F i g. 2 das NMR-Spektrum von Negamycin in D₂O wiedergibt.

Das Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums Negamycin besteht darin, einen Stamm von S. purpeofuscus in einen Nährmedium unter aeroben Bedingungen so lange zu züchten, bis eine merkliche Menge an Negamycin in der Lösung angereichert worden ist.

Negamycin ist ein neues Antibiotikum. Der Organismus, welcher das erfindungsgemäße Antibiotikum erzeugt, wurde ebenfalls zum ersten Male aufgefunden und aus einer Bodenprobe isoliert, die bei Myogisan, Gunma im Jahre 1964 (August) gesammelt worden ist. Dieser Stamm wurde mit der Laboratoriums-Nummer M89O-C2 versehen. Dieser Stamm M890-C2 wurde als Streptomyces purpeofuscus klassifiziert. Der Stamm Nr. M890-C2 wurde am 6. Mai 1969 unter der Nr. 306 in Kogyogijutsuin Hakko Kenkyujo hinterlegt. Er wurde ferner in der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 21 470 hinterlegt.

Der Stamm Nr. ATCC 21470 besitzt folgende Eigenschaften: Unter dem Mikroskop entwickelt ein verzweigtes Substratmyzelium gerade bis gebogene Luftmyzeln ohne eine Wirtelverzweigung noch eine Spiralenbildung. Die Oberfläche der Sporen ist glatt.

Die charakteristischen Eigenschaften in verschiedenen Medien (die Bezeichnung der Farbe wird in eckigen Klammern gemäß dem »Color Harmony Manual« der Container Corporation of America beschrieben) sind wie folgt:

1. Auf einem Glyzerin-Czapek-Agarmedium, inkubiert bei 27⁰C: Hellgelbes bis dunkelgelblichbraunes [Spice brown 4 ni] Wachstum bildet in überreichem Ausmaß Luftmyzeln mit einer hellgrauen Farbe. Es wird ein bräunliches bis hellrötlichbraunes lösliches Pigment erzeugt.

2. Auf einem Krainsky-Glucose-Asparagin-Agarmedium, inkubiert bei 27°C: Ein gelblichbraunes [Luggage Tan 4 ne] bis dunkelgelblichbraunes [Clove Brown 3 ni] Wachstum erzeugt Luftmyzeln mit einem gelblichweißen bis leichtbräunlichgrauen Farbton. Das lösliche Pigment ist schwachbraun.

3. Auf einem Calciummalat-Agarmedium, inkubiert bei 27°C: Ein gräulichbraunes Wachstum [Fawn 4 ig] erzeugt gräulichweiße bis hellgraue Luftmyzeln. Es wird kein lösliches Pigment festge-

stellt Das Calciummalat-Wachstum wird stark nach ^tägiger Inkubaüon solubilisiert. t S einer Peptonlösung, die 1,0% ^atriumnitrat S und bei 27°C inkubiert worden ist:

Pigment oder nur in geringem ^A"^s.^mf_Tm ^e£ ί rötlichbraunes lösliches Pigment Die Umkehr des Wachstums schlägt in Schwarz wahrend der Tage der Inkubation über. Auf einem Nahragar taWC

SS Ä

SS

< AueSbdir C inkubierten Kartoffelstück: Eigenschaften stimmen mit denjenigen vonj ⁵· Äe unzeTes hellgelblichbraunes [Lt Gold 2 ic] io myces purpeofuscus Yamaguchi und Sa fShbnes [Yellow Maple 3 ng], später schrieben im International Journal ^of

.nc. keine Luto^eln, jedoch ein _Steh,

!«gig™ Inkubaüon

3» peof»^s eine bekannte Spez.es ,si.

Methode „ Bestens der Negamycin^e

Auf eine?

bei 37"C inkubierten entrahmten als Standard

S _weise

bei einer 4tä

ion erfolgt eine lang-S5

enthält, wird in der

zwar infolge einer
eines löslichen Pigmentes

13. Auf Zellulose (Filterpapier), inkubiert bei 27 C Geringes Wachstum ohne Zersetzung von ZeIIu-

₁₄. Rwendung von Kohlehydraten auf einem Priaham-Gottlieb-Basalmedium »"kubierl ta 27⁰C: Positives Wachstum mit Starke, Dextrin, Glyzerin, Galaktose, Glukose, Rohrzucker,Ma tose und Mannose. Negatives Wachstum mit Inosit, Laktose, Mannit, Raffinose, Rhamnose inulin, Sorbit, Fruktose, Xylose, Arabmose, Salicin und Dulcit.

_Die cnarakuristischen Eigen^e» des Stands

moglg^&u: E«ug^g _Medium bevorzugt.

?_ede Gärungstemperatur kann dabei eingehalten wer-

Jede ^G"^u^^stemP^_{rhalb des} Bereiches, in welchem

^n^undjwar .nnejh^ ^^^ _{wachsen und}

NegamycirJ ^^^^ rt^nten 32 C^ wjrd ^b^^z ^, _{üze bestehen}, eignen sich ^f ^™'"^ _Negamycin. Beispielsweise eignen

zur Ewgg^JJ^J _PepU)n, Fleischextrakt, N-Z-ach als St^^kst^ _h ^ Maisflüssigkeit, Erd- ^!^enmehl, Natriumnitrat, Am- ^^ _Ainmoniumsu,_{fat sowie} andere stick-

_toffhaltige Materialien, wie beispielsweise Weizen-

schiedenen Medien bildet er ein dunkelgelbhchb raunes

trium, an

Die Gärung wird so lange fortgesetzt, bis sich eine erhebliche Negamycinmenge angereichert hat. Beispielsweise können Sporen und Myzeln auf einer Schrägkultur von S. purpeofuscus auf ein Medium aufgeimpft werden, das aus 2,0% Glukose, 2,0% Stärke, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% Natriumchlorid. 0,35% Calciumcarbonat, 0,0005% CuSO₄ · 5H₂O, 0,0005% MnCl₂ · 7H₂O und 0,005% ZnSO₄-7H₂O (eingestellt auf einen pH von 7,0) besteht. Dann erfolgt ein Züchten unter Schütteln bei 27° C. Man stellt eine Anreicherung von Negamycin während einer Zeitspanne von 3 bis 8 Tagen fest, beispielsweise in einer Menge von 20 μg/ml nach 3 Tagen, 108μg/ml (pH 7,4) am 6. Tag, 185 μg/ml (pH 7,6) am 7. Tag und 122 μg/ml (pH 7,8) am 8. Tag.

Negamycin ist in seiner wäßrigen Lösung relativ stabil. Nach einem Erhitzen von 5 mg/ml einer Negamycinlösung mit wechselnden pH-Werten (d. h. 1,8, 7,2 und 9,2) bei 6O⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten verbleiben 91 % ohne Zersetzung. Werden Negamycinlösungen mit 2 mg/ml bei verschiedenen pH-Werten bei 27° C während einer Zeitspanne von einer Woche gehalten, dann werden die folgenden Prozentsätze an Negamycin in unzersetzter Form festgestellt: 86% bei einem pH von 2,25, 80% bei einem pH von 4,90, 76% bei einem pH von 7,15, 89% bei einem pH von 9,0 und 79% bei einem pH von 10,2.

Durch die Erfindung werden ferner Methoden zur Extraktion und Reinigung von Negamycin zur Verfügung gestellt. Negamycin ist in Wasser löslich und liegt hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Gärungsbrühe vor. Negamycin in der Brühe wird nicht aus der Brühe in organische Lösungsmittel übertragen, beispielsweise in Butanol, Äthylacetat, Äther, Chloroform oder Benzol.

Bei Verwendung von Adsorptionsmitteln kann Negamycin aus der Gärbrühe oder aus seiner wäßrigen Lösung abgetrennt werden. Aktivkohle ist eines der bevorzugten Adsorbentien. An Aktivkohle adsorbiertes Negamycin kann in wirksamer Weise durch wäßriges Methanol, wäßriges Butanol oder wäßriges Aceton eluiert werden. Die Eluierung erfolgt noch leichter, falls die Eluierung in saurem Medium unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure erfolgt. Wenn auch Negamycin eine Carbonsäuregruppe aufweist, so ist das Molekül dennoch durch das Vorhandensein von zwei basischen Gruppen basisch und läßt sich von einem Kationenaustauscherharz adsorbieren. Ein Kationenaustauscherharz eignet sich am besten zur 5» Extraktion von Negamycin aus der Kulturbrühe oder aus seiner wäßrigen Lösung. Diese Harze können in der Η-Form, in der Natriumform, in der Kaliumfonn oder in der Ammoniumform oder in gemischten Formen verwendet werden. An dem Kationenaustauscherharz adsorbiertes Negamycin kann mit einer Säure eluiert werden, beispielsweise mit Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, wobei jedoch in bevorzugter Weise wäßriges Ammoniak verwendet wird. Negamycin, das eine Carbonsäuregruppe aufweist, kann ebenfalls von einem Anionenaustauscherharz adsorbiert werden. Dazu kann ein stark basisches Anionenaustauscherharz in der OH-Form verwendet werden. Das adsorbierte Negamycin kann mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eluiert werden. Anionenaustauscherharze mit schwach basischen Gruppen können in der OH-Form zur Neutralisierung einer sauren Negamycinlösung verwendet werden, ohne daß dabei merkliche Mengen dieses Antibiotikums adsorbiert werden.

Die Myzele in der Gärbrühe können durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden. Die Myzeln enthaltende Gärbrühe kann ferner direkt auf eine Harzkolonne aufgebracht werden, ohne daß dabei vorher die Myzeln entfernt werden, sofern große Teilchen, welche ein Durchfließen durch die Kolonne verhindern, durch Durchschicken durch ein Metallnetz entfernt werden. Nachfolgend wird eine Methode angegeben, die sich zur Isolierung von Negamycin aus der Gärbrühe von S. purpeofuscus eignet: Die Gärbrühe wird filtriert oder zentrifugiert, worauf das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit durch eine Kationenaustauscherharz-Kolonne (70% in der NH₄-Form) geschickt wird. Nachdem die Kolonne mit Wasser gewaschen worden ist, wird das adsorbierte Negamycin mit 2,0%igem NH₄OH in Wasser eluiert. Das Negamycin enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck zur Entfernung von Ammoniak konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird durch eine Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz in der OH-Form geschickt. Nach einem Waschen wird das Negamycin auf dem Harz mit 0,5n-HCl eluiert. Das Eluat, das Negamycin enthält, wird mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz in der OH-Form neutralisiert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Dabei wird ein rohes Pulver aus Negamycin-Hydrochlorid erhalten. Das rohe Pulver des Hydrochloride wird in Wasser gelöst und durch ein Harz in der NH₄-Form geschickt, worauf eine chromatographische Entwicklung mit Wasser oder 0,1 %igem NH₄OH erfolgt. Die Fraktionen, welche Negamycin enthalten, werden unter Vakuum eingedampft. Dabei wird ein weißes Pulver aus reinem Negamycin erhalten. Ist die Reinheit nicht ausreichend, dann wird die Chromatographie wiederholt. Ferner kann Negamycin durch Zugabe einer wasserunlöslichen Säure, beispielsweise Picrinsäure oder p-Hydroxyazobenzol-p'-sulfonsäure, ausgefällt werden. Negamycin kristallisiert als Salz von p-Hydroxyazobenzol-p'-sulfonsäure aus. Das in diesen wasserunlöslichen Salzen enthaltene Negamycin kann von den Säuren nach bekannten Methoden zur Freisetzung einer Base aus einem wasserunlöslichen Salz abgetrennt werden. Beispielsweise wird Negamycinp-hydroxyazobenzol-p'-sulfonat mit HCl in Äthanol behandelt, wobei Negamycin-Hydrochlorid ausgefällt wird. Eine in Wasser unlösliche Säure, wie beispielsweise anionische Tenside, sowie Natriumlaurylsulfonat können ebenfalls zur Ausfällung von Negamycin verwendet werden.

Nach einer der vorstehend beschriebenen Methoden gereinigtes Negamycin liegt in Form eines weißen Pulvers vor. Es ist in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Estern sowie in Benzolunlöslich. Negamycin in der wäßrigen Lösung zeigt eine Endabsorption, jedoch keine maximale Absorption von UV-Licht zwischen 220 und 400 nm. Es ist amphoter und zeigt stark basische und schwach saure Eigenschaften. Unter einer Spannung von 3500 V sowie bei einem pH von 1,8 (Puffer) (Ameisensäure / Essigsäure / Wasser, 25: 75: 900, bezogen auf das Volumen), bewegt sich Negamycin um 12 cm an die Kathode. Setzt man die Beweglichkeit von Alanin gleich 1,0, dann ist die Beweglichkeit von Negamycin 1,4. Es bildet Säureadditionssalze mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, ρ - Hydroxyazobenzol - p' - sulfonsäure oder

■ Picrinsäure. Das eine Carboxylgruppe aufweisende lococcus aureus 193 12,5 μg/ml (6,12 ^g/ml), Staphylo-

Megamycin bildet ferner Metallsalze und -ester. Es coccus aureus Smith 50 μg/ml₎ Sarcina lutea PCI-1001

Kefert positive Reaktionen auf Ninhydrin, Rydon- 12,5 μg/ml (1,56 μg/ml), Bacillus subtilis NRRL-B 558

; Smith-Reagens und negative Reaktionen auf Anthron 25 μg/ml (12,5 μ§/ηι1), E. coli K12 3,12 μg/ml (1,56 μg/

: und Sakaguchi-Reagens. Erhitzt man es auf 105⁰C 5 ml), E. coli NlHJ 12,5 μg/ml (3,12 μ§/ΐη1), Shigella

in 6n-HCl während einer Zeitspanne von 6 Stunden, flexneri 12,5 μg/ml, Salmonella typhosa 3,12μg/ml,

dann zeigt das Hydrolysat mehr als drei Ninhydrin- Klebsieila pneumoniae PCI 60212,5 μg/ml(6,25μg/ml),

; Produkte (die Hauptprodukte bestehen aus drei Seratia marscescens 12,5 μg/ml (6,25 μg/ml), Proteus

Produkten). Die drei Haupthydrolyse-Produkte sind vulgaris, OX19 6,25 μg/ml, Proteus rettgeri (GN 311)

ι τ -Hydroxy -β -lysin, N₁N' - Dimethylhydrazin und io 12,5 μg/ml (6,25 μg/mί), Pseudomonas aeruginosa

ι Methylamin. Sarkosin sowie 1-Methylhydraginocssig- (Nr. 2) 12,5 μg/ml, Pseudomonas aeruginosa Nr. 3

ί läure werden als in kleineren Mengen anfallende 25 μg/ml (12,5 μg/ml), Pseudomonas fluorescens

j Hydrolyse-Produkte erhalten. 6,25 μg/ml (3,12 μg/ml), Mycobacterium smegmatis

; Hochreines Negamycin schmilzt allmählich be- 607 100 μg/ml. Wird die 20 Stunden alte Nähr-

j ginnend bei 75°C und zersetzt sich unter Schäumen 15 brühenkultur auf das lOOOfache verdünnt und wird

bei 110 bis 12O⁰C. Die Elementaranalyse liefert i'ol- eine in eine Schleife gehende Menge auf gestrichen,

gende Werte: dann wird die Wachstumsinhibierung um die Hälfte

! Analyse für C₉H₂₀N₄O₄ · 2H₂O: £er vorstehend angegebenen lnhibierung vermindert.

Berechnet ... C 38,02, H 8,51, N 19,71, O 33,77; *» Verwendung eines aus 0,5% Pepton bestehenden

! gefunden ... C 37,78, H 8,62, N 18,94, O 31,70. ²⁰ ^^gar'^ ^1Elhlbierende Wirkung starker als im Fall

ι des Nahrmittelagars. Die nachstehend angegebenen

j Es wird ein Titrationsäquivalent von 287 erhalten. Organismen werden bei den angegebenen Konzen-

Negamycin-p-hydroxyazobenzol-p'-sulfonat fällt in trationen inhibiert (die Werte in den Klammern sind

j Form gelboranger Kristalle (F. 180 bis 182°C, Zer- die Konzentrationen der jeweiligen lnhibierung):

! Setzung) an. Diese Verbindung zeigt eine antibak- 25 S. aureus 209p 1,56 ^g/ml, S. lutea PCI 1001

terielle Aktivität, die etwa V₃ der Aktivität von Nega- 5,0μο/ΐη1 (2,5 μg/ml), B. subtilis NRRL-B 558

; mycin entspricht. Die Analyse liefert folgende Er- 12,5 μg/ml, E. coli K12 1,56μ§/ηι1, E. coli NlHJ

j gebnisse: 1,56 μίί/ΐηΐ, S. flexneri 3,12 μ£/ΐη1_> Κ. pneumoniae

Analyse für C₉H₂₀N₄O₄(C₁₂H₁₀N₄O₄S)₂ · 2H₂O: ^P^ «« 6,25 ,xg/ml (3,12 μβ/rnl), S. typhosa <0,78μ₈/

Berechnet . . C 47,13, H 5,27, N 13,33, O 26,64, 3° ml Pr rettgen CN 311 1,56 ng/ml, S marscescens

_s η ₆₃. 12,5 μg/ml (3,12 μg/ml), Ps. aeruginosa Nr. 3 6,25μg/

gefunden ... C 47,09, H 5,16, N 13,20, 0 25,53, "I¹' ^Ps- ^aerußi"°^sa, ^N,ⁿ f⁶ ^? ^^ml ^⁵W*⁰' S 8 01 M. segmatis 607 50 μg/ml. Die inhibierende Wirkung

' ' von Negamycin wird durch Serum nicht reduziert.

Negamycin weist drei titrierbare pK-Werte auf, 35 Beispielsweise wird E. coli durch 3,12 μg/ml Nega- und zwar wie folgt: 3,55, 8,10 und 9,75. Im Infrarot- mycin in allen Medien inhibiert, die Serum in Mengen Spektrum von Negamycin, das unter Verwendung von von 0, 5,10, 20 und 40 % enthalten. Negamycin besitzt Kaliumbromid aufgenommen wird, werden Absorp- eine stärkere antibakterielle Wirkung im alkalischen tionsbanden bei folgenden Wellenzahlen in cm-¹ Medium, beispielsweise sind die inhibierenden Konbeobachtet: 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 40 zentrationen gegen E. coli in 0,5%igem Pepton in 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 und 720. Nega- Wasser bei verschiedenen pH-Werten wie folgt: pH 5,0 mycin-p-hydroxyazobenzol-p'-sulfonat zeigt Absorp- 12,5 μg/ml (3,12 μg/ml) pH 6,012,5 μg/ml (3,12 μg/ml), tionsbanden bei folgenden Wellenzahlen in cm"¹: pH 7,0 3,12μg/ml (l,56μg/ml) pH 8,0 l,56μg/ml 3550, 3400, 3350, 3250, 3200, 3050, 2950, 1730, 1690, (0,78 μg/ml), pH 9,0 1,56 μg/ml (0,78 μg/ml). Bei der 1600, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280—1100, 45 Durchführung einer Zylinderplattenmethode unter 1060. 1030, 1010, 990, 960, 945, 900, 880, 850, 800, Verwendung eines aus 0,5% Pepton bestehenden 715 und 680. Bei diesem Salz tritt die Bande für die Agars und E. coli K12 zeigen 25 μg/ml Negamycin Carbonsäure bei 1730 cm"¹ auf. Das Infrarotspektrum folgende inhibierende Durchmesser bei folgendem von Negamycin-Methylester besitzt die Banden bei pH: pH 6,0 16 mm, pH 7,0 20 mm, pH 8,0 21 mm. folgenden Wellenzahlen in cm"¹: 3400, 3200, 3000, 50 Negamycin besitzt eine geringe Toxizität. Die 2950, 1740, 1665, 1600, 1485, 1445, 1400, 1200, 1140, intravenöse Injektion von 400 mg/kg verursacht der 1050, 1000, 960, 890 und 720. Die Bande für die Tod von Mäusen. Keine toxische Wirkung wird beob Estergruppe liegt bei 1740 und 1220 cm"¹. achtet, wenn 200 mg/kg täglich intraperitoneal wan

Die bereits gezeigte Struktur wird auf Grund einer rend einer Zeitspanne von 30 Tagen in Mäuse injizier Massenspektrometrie von Negamycin-Methylester und 55 werden. Negamycin besitzt auch keine verzögerti Triacetyl- Negamycin -Methylester sowie durch Be- Toxizität.

Stimmung der Strukturen der Hydrolyse-Produkte Die intramuskuläre Injektion von 50 mg/kg ai

nahegelegt. Kaninchen ergibt eine hohe Blutkonzentration, bei

Negamycin hemmt ein Wachstum von gramnega- spielsweise 100 μg/ml 1 Stunde nach der Verab tiven und -positiven Organismen. Wird die anti- 60 reichung, wobei 80% in den Urin nach 24Stundei bakterielle Wirkung durch Agarstrichmethoden unter abgeschieden werden, wie eine hohe Urinkonzen Verwendung von Fleischextrakt/Pepton-Agar getestet, tration zeigt, beispielsweise 4480 μg/ml im Urin, de dann werden folgende Organismen bei den angegebe- 1 bis 2 Stunden nach der Injektion gelassen worde nen Konzentrationen inhibiert (es wird eine in eine ist. Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkun Schleife gehende Menge einer 20 Stunden alten Nähr- 65 auch in vivo. Negamycin ist wirksam gegen ein brühenkultur auf gestrichen; die Werte in den Klam- Infektion durch Pseudomonas aeruginosa Nr. 1'. mern sind die Konzentrationen der jeweiligen lnhi- Klebsiella pneumoniae S-1802, Salmonella typhosa 6 bierung: Staphylococcus aureus 209 ρ 50 μg/ml, Staphy- und Staphylococcus aureus Smith S-424 in Mäusei

20 22

ίο

Die CD₅₀-Werte gegen diese Infektionen betragen 4,4, 5,0, 2,5 bzw. 12,5 mg/kg, falls 10 MLD intraperitoneal infijiert werden. Negamycin wird subkutan unmittelbar danach sowie 6 Stunden nach der Infizierung injiziert.

Wie vorstehend erwähnt, ist Negamycin eine antibakterielle Substanz mit einer geringen Toxizität, die grampositive und -negative Bakterien einschließlich Pseudomonas zu inhibieren vermag. Diese sAntiebiotikum läßt sich in einfacher Weise von bekannten Antibiotika auf Grund seiner Analyseergebnisse, seines Infrarotspektrums, seiner amphoteren Eigenschaften, seines Verhaltens bei einer Hochspannungs-Elektrophorese sowie seiner Struktur unterscheiden. Daher ist Negamycin definitiv ein neues Antibiotikum.

Wie aus der Struktur hervorgeht, liefert eine Hydrolyse von Negamycin 1-Methylhydrazino-Essigsäure, welche sich in N,N'-Dimethylhydrazin umwandelt. 1-Methylhydrazino-Essigsäure vermag, wie erfindungsgemäß ermittelt wurde, eine Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase zu inhibieren und übt eine Lebertoxizität aus. Negamycin besitzt jedoch keine derartige Toxizität. Erwägt man jedoch eine mögliche Hydrolyse, dann sollte Negamycin zur Behandlung von empfindlichen Stellen nur kurzzeitig verabreicht werden. Negamycin läßt sich auch lokal zur Behandlung von Oberflächeninfektionen verwenden, beispielsweise von Infektioren der Haut und der Mucosamembran.

Darüber hinaus e^:gnet sich Negymcin zur Synthese von Nepamycin-Analoga.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

125 ml eines Mediums, das 2% Glukose, 2% Stärke, 2% Sojabohnenmehl. 0.5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl, 0,35% CaCO₃, 0.0005% CuSO₄-SH₂O, 0,0005% MnH -7HO "nri 0 0005% ZnSO₄-7H₂O enthält, ν ird in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben. Nach dem Einstellen des pH auf 7,0 wird das Medium bei 120⁰C während einer Zeitspanne vcn 20 Minuten sterilisiert. Auf dieses Medium werden 2,5 ml einer 2 Tage alten geschüttelten Kulturbrühe des Stammes Nr. ATCC 21 470 aseptisch a'jfge'mpft. Das Medium für die Impfkultur enthält 1 % Glukose. 1 % Stärke, 0,75% Fleischextrakt, 0,75% Pepton, 0.3% NaCl, 0,1% MoSO₄-7H,O, 0,0007% CuSO₄-'H₂O, 0,0001% FeSO₄-7H₂O, 0,0008% MnCl₂-7H₂O und 0,0002% ZnSO₄-7H₂O. Das Schütteln erfolgt mit 130 Hin- und Herbewegungen pro Minute während der Gärungsperiode (5 Tage). Die Temperatur wird bei 27° C gehalten. Diese Kulturbrühe wird zur Abtrennung von Myzeln zentrifugiert Man erhält 6000 ml eines Filtrats aus den 60 Kolben. Das Filtrat enthält 35^g/ml Negamycin. Das Filtrat wird durch eine Säule (Durchmesser 30 mm) geschickt, die 400 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (70% in der Na-Form) enthält. Nach einem Waschen mit Wasser wird Negamycin mit 20%igem Ammoniak in Wasser eluiert. Die aktive Fraktion (600 ml) wird unter vermindertem Druck konzentriert. Man erhält 144 ml einer konzentrierten Lösung (pH9,4,800 μg/ml).

Die konzentrierte Lösung wird durch eine Säule (Durchmesser 16 mm) geschickt, die 60 ml eines stark basischen Anionenaustauschers (OH-Form) enthält Nach einem Waschen mit 200 ml Wasser wird Negamycin mit 0,5 n-HCl eluiert. Nach einer Neutralisation mit einem schwach basischen Anionenaustauscher (OH-Fonn) wird die aktive Fraktion unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält ein Rohpulver aui Negamycin-Hydrochlorid in einer Menge von 300 mj (Reinheit 21 %).

Be i s pi e 1 2

300 mg eines Rohpulvers von Negamycin-Hydrochlorid, das gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, werden in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule (Durchmesser 16 mm) geschickt,

ίο die 60 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (NH₄-Form) enthält. Anschließend wird destilliertes Wasser durchgeschickt. Der Abfluß wird in 10-ml-Fraktionen eingeteilt. Der aktive Abfluß findet sich zwischen den Fraktionen 57 und 96. Aus den Fraktionen 57 bis 74 erhält man 25 mg (Reinheit 68 μg/me) eines leicht gelblichen Pulvers, das aus Negamycin besteht. Aus den Fraktionen 75 bis 85 erhält man 20 mg eines farblosen Pulvers aus reinem Nesamycin. Die Fraktionen 86 bis 96 liefern 19 mg (Reinheit 9^/)

Beispiel 3

Es werden verschiedene Arten von Austauscherharzen zur Isolation von Negamvcin getestet. Das

as gemäß Beispiel 1 erhaltene Brühefiltrat (200 ml) wi-d durch eine Säule geschickt (Durchmesser lOrrm), die 10 ml eines Harzes enthält. Die Säule wird mit 50 ml Wasser gewaschen und anschließend in der nachstehend geschilderten Weise eluhrt. In al'en Fällen wird in den Abflüssen sowie in dem 7 m Waschen der Säule verwendeten Wasser keine Akti· ität festgestellt. Es werden folgende Ergebnisse erhalten:

Kationenaus- 35 tauscherharz	40	Schwach sauer	45	Sschwach sauer	5o	Stark sauer	Typ	Eluierung	Gewin nung von
						Nega
	Schwach sauer	Stark sauer			mycin
Schwach sauer	H-Form	2%-ges	45%
	NH₄OH
70%	2%iges	52%
Na-Form	NH₄OH
70%	1 n-HCl	29%
Na-Form
70%	2%iges	55%
NH«-Fonn	NH₄OH
H-Form	2%iges	45%
	NH₄OH
H-Form	2%iges	50%
	NH₄OH

B e i s ρ i e 1 4

Negamycin wird in einer Menge von 102 mg in 8 ml Wasser, das 15% Äthylenglykolmonomethylather enthält, gelöst. Dieser Lösung werden 106 mg P - Hydroxyazobenzol - p' - sulfonsäure zugesetzt.

Die Mischung wird auf 50⁰C zum Auflösen erwärmt, worauf 0,5 ml 1 n-HCl zur Einstellung des pH auf 3 zugesetzt werden. Nach einem Lagern in einem Kühlschrank erhält man 49 mg gelborangegefärbter Kristalle. Diese Kristalle werden aus einem

gemischten Lösungsmittel (4,5 ml Wasser und 0,5 ml Methanol) umkristallisiert. Man erhält 28 mg gelborangegefärbter Kristalle (F. 180 bis 182°C, Zersetzung). Die Kristalle weisen 34°/ /W An;,rMt

/on freiem Negamycin gegenüber E. coli K12 auf. Analyse für C₉H₂₀N₄O₄(C₁₂H₁₀N₂O₄S)₂ · 2H₂O:

Berechnet ... C 47,13, H 5,27, N 13,33, O 26,64, S 7,63;

gefunden ... C 47,09, H 5,16, N 13,20, O 25,53, S 8,01.

Beispiel 5

1301 eines Mediums, das 3% Glukose, 1% Stärke, 2% Sojabohnenmehl, 0,5% getrocknete Hefe, 0,35% CaCO₃, 0,0005% CuSO₄-5H,O, 0,0005% MnCl₂-7H,O und 0,0005% ZnSO₄ · 7H₂O enthält, werden in eine Gärungsvorrichtung aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2001 gegeben. Nach einer Sterilisation bei 12O⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten werden 1,21 einer Kulturbrühe des Stammes Nr. ATCC 21470 aseptisch aufgeimpft. Das Rühren erfolgt mit 200 UpM, während unter Verwendung von 25 1 Luft pro Minute belüftet wird. Die Gärungszeitspanne beträgt 113 Stunden. Die Temperatur wird auf 27⁰C gehalten. Die aus 1101 bestehende Kulturbrühe (pH 7,4, 63 μg/ml) wird unter Verwendung von 8 kg Diatomeenerde nach einem Einstellen des pH auf 4,9 unter Verwendung von 11 6n-HCl filtriert. Einschließlich des zum Waschen des Filters verwendeten Wassers erhält man insgesamt 1171 eines Filtrats. Das Filtrat wird durch eine Säule geschickt, die 6,5 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes (zu 70% in der NH₁-Form) enthält. Nach einem Waschen mit Wasser wird das Negamycin mit 0,5 η-Ammoniak eluiert. Das aus 31 bestehende aktive Eluat wird auf 495 ml (3520 μg/ml) unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird durch eine Säule geschickt, die ein stark basisches Anionenaustauscherharz (OH-Typ) enthält. Nach einem Waschen mit 350 ml Wasser wird Negamycin mit 0,5 n-HCl eluiert. Das aktive Eluat (180 ml) wird mit 3 η-Ammoniak neutralisiert. Man erhält 5,5 g eines gel blichbraunen Pulvers aus rohem Negamycin (Reinheit 294 μg/mg) nach dem Trocknen. Die Gesamtausbeute beträgt 23,4%.

Beispiel 6

3,4 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen Pulvers mit einer Reinheit von 29,4% werden in 22 ml Wasser aufgelöst, worauf die Lösung auf einen pH von 8,8 eingestellt wird. Diese Lösung wird auf eine Säule ■lit einem Durchmesser von 26 mm aufgebracht, die Hit 250 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherkarzes (in der NH₄-Form) gefüllt ist. Nach einem Waschen mit 500 ml Wasser wird 0,1 %iges NH₄OH durch die Säule geschickt. Das Eluat wird in 20-ml-Praktionen eingeteilt. Das Negamycin wird in den Fraktionen 69 bis 81 gefunden. Aus den Fraktionen 69 bis 73 erhält man 233 mg (Reinheit 90%) eines hellgelblichen Negamycin-Pulvers. Aus den Fraktionen 74 bis 77 erhält man 383 mg eines reinen Negamycin. Die Fraktionen 78 bis 81 liefern 395 mg eines reinen Negamycins.

Beispiel 7
(Vergleichsbeispiel)

Zur Bestimmung der Wirksamkeit des erfindungs-

gemäßen Negamycins und zum Nachweis der Überlegenheit des erfindungsgemäßen Negamycins gegenüber Carbenicillin, einem bekannten halbsynthetischen Penicillin mit breitem Wirkungsspektrum, bei der Behandlung von durch bakterielle Infektionen hervorgerufenen Erkrankungen wurden die folgenden Versuche durchgeführt:

Mäuse wurden intraperitoneal mit Bakterienzellen künstlich infiziert (2 · 10^e Zellen von Staphylococcus aureus Smith S-424, 7 · 10² Zellen von Klebsieila pneumoniae S-1802 und 1,1 · 10⁸ Zellen von Pseudomonas aeruginosa Nr. 12). Dann wurden die infizierten Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt. Die eine wurde mit Negamycin subcutan in Einzeldosen unmittelbar nach der Infektion behandelt, während die andere mit Carbenicillin behandelt wurde. Dabei wurden folgend; Ergebnisse erhalten:

Die CD₅₀-Werte bei der Behandlung von Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa mit Negamy;in betrugen 25, 12,5 bzw. 8,9 mg/kg Körpergewicht, während die CP₅₀-Werte bei der Behandlung der gleichen Bakt:ri η mit Carbenicillin 8,1, >100 bzw. >400 m?/icg Körpergewicht betrugen.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Negamycin bei der Bekämpfung von künstlich hervorg:rufen;n Infektionen bei Mäusen stark wirksam war und daß es hinsichtlich seiner Wirkung dem bekannten halb;ynth:ti5chen Breitbandpenicillin Carbeni ;iliin überlegen war.

In den Rahmen der Erfindung fallen neben dem Negamy;in auch Säur eadditi mis ;a'ze von Negamycin mit organischen und anorganischen Säuren, beispielsweise Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure, Bromwasserstoff äure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Ascorbinsäure, Essigsäure, Picrinsäure, ρ - Hydroxyazobenzol - p' - sulfonsäure, Phytinsäure, Livopimarin - 6,8 a - eis - endobern steinsäure, Sulfaminsäure, Glykolsäure und Mandelsäure.

Für therapeutische Zwecke verwendet man Salze nichttoxischer Säuren, während Salze toxischer Säuren, beispielsweise ρ - Hydroxyazobenzol - p' - sulf onsäuresalz, für Isolationszwecke geeignet sind, beispielsweise als Ausfällmittel aus wäßrigen Lösungen, sowie füi Desinfektionszwecke, bei denen eine Toxizität keine Rolle spielt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Negamycin der Formel

CH₂ — CH — CH₂ — CH — CH₂ -C-NH-N-CH₂-COOH

NH₂ OH

NH,