DE2014200C3 - Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten und ihre Verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten, ausgehend von pathogenen oder nicht pathogenen Bakterien. Die Bakterienvarianten zeigen eine gegenüber den Bakterien, aus denen sie entstanden sind, vollständig unterschiedliche Morphologie.

Die Vorstellung von Bakterien, die bei einer von den bekannten Bakterien vollständig unterschiedlichen Morphologie der Fortpflanzung fähig sind, geht zurück auf die ersten Untersuchungen der L-Formen durch Klieneberger. Diese spontan aufgetretenen Formen wurden (nach dem Lister Institut) LI-Formen genannt. Sie wurden von Dienes als wirkliche Bakterienvarianten und nicht Symbionten identifiziert. Klieneberger-Nobel und Tu 1 asηe schlossen sich dieser Meinung an.

Die L-Formen wurden lange Zeit als das Ergebnis von Laboratoriumsmanipulationen betrachtet und im erweiterten Sinne als künstliche Kreationen. Indessen konnte die Existenz von spontan in L-Form überlebenden normalen Bakterien für Keime beobachtet werden, denen eine extreme Polymorphie zukommt, und zwar bei Haverhillia moniliformis und Spherophorus funduliformis (para influenza), den Agentien der post-anginösen Sepsis beim Menschen.

Pierce, Dienes, Klieneberger und Tula s η e ist es gelungen, im Laboratorium eine L-Transformation bei zahlreichen Bakterien herbeizuführen, und <:war sowohl bei Bazillen aus auch bei Kokken wie Salmonellen, Shiga-Kruse-Bacillus, Typhusbazillen, Clostridia, Gonokokken, Streptokokken sowie Para-influenza, und zwar durch Einwirkung von Penicillin.

Es gibt zahlreiche andere Mittel, die in der Lage sind, eine L-Transformation hervorzurufen, wie Antibiotika, die auf die Bakterienwände einwirken (Bacitracin, Cycloserin), chemische Mittel (Glysin in erhöhter Konzentration), Lyso- Enzyme (Lysozym, Lysostaphin), physikalische Mittel (ultraviolette Strahlungen) oder

biologische Mittel (Phagen, komplementäre Antikörper).

Um einen besonderen Typ von L-Formen zu bezeichnen, wurde der Begriff der Protoplasten und Sphäroplasten eingeführt. Als Protoplasten, ein Aus-

druck botanischen Ursprungs, der von Welbull und McGuillen eingeführt wurde, bezeichnet man infolge der Einwirkung von Penicillin oder Lysozym aus Bakterien entstandene globulöse bzw. kugelige Organismen. Als Sphäroplasten werden L-Formen mit cha-

rakteristischer globulöser Morphologie bezeichnet, die ihren Ursprung von Bakterien nehmen, die sie reproduzieren können, wenn das für die Transformation bestimmende induzierende Mittel eliminiert wird (Behandlung mit Benzylpenicillin, anderen Penicillinen,

Cycloserin, Lysozym bei pH 8,8, Lysazym in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure und »Tris«-Puffer).

Die L-Formen der Bakterien werden in allgemeiner V/eise definiert als von Bakterien ausgehende glöbulöse Elemente, deren Wand durch diverse Faktoren modifiziert oder vollständig beseitigt worden ist Sie sind geeignet, Ausgangspunkt für Kolonien von zwei unterschiedlichen Typen, nach Dienes den L3B- und L3A-Typen, zu werden. Bezüglich der Morphologie begegnet man einer Polymorphie, deren Beschreibung

je nach Autor und den Modalitäten des Herstellungsverfahrens schwankt; man kennt:

übergroße kugelige Körper nach Weibull: Gewisse Bestandteile der Wand sind verschwunden, da die Bakterie ihre Form verloren hat;
Fäden, die nach Klieneberger-Nobel künstliche Strukturen sein sollen, die sich durch die große Plastizität der L-Formen erklären sollen, welche sich in der Nährlösung deformieren;
Elementarkorpuskeln nach Klieneberger oder Zwergformen nach T u 1 a s η e, die filtrierbare und lebensfähige inframikroskopische Elemente sind.

Ein Entwicklungszyklus der Bakterienvarianten wurde jedoch bisher nicht nachgewiesen.

In cytologischer Hinsicht besteht bei den L-Formen eine Veränderung oder ein Verschwinden der Zellwand, die durch mehrere aufeinanderfolgende Schichten gebildet wird, die im wesentlichen zwei Bestandteile enthalten: N-Acetylmuraminsäure und N-Acetyl-glucosamin. Die Wand scheint sich nicht in das osmotische Gleichgewicht des bakteriellen Cytoplasmas einzuschalten. Die Permeabilität der Bakterienzellen geht zurück auf die Cytoplasmamembran, die durch Lipoide und Proteine, enzymatische Systeme, spezifische Permeasen gebildet wird. Im Gegensatz zur Bakterie ist das Cytoplasma relativ abgesondert bzw. diskret gegenüber der Masse der Keimbläschen.

Was die Eigenarten der Kulturen betrifft, so haben einige der zitierten Autoren in der Absicht, die L-Formen zu erhalten, protein- und lipoidreiche Milieus verwendet. Durch Anreicherung von gebräuchlichem Kulturmilieu mit einem Rinderherzextrakt, durch Zusatz von Pepton, Pferde- oder Rinderserum in erhöhter Menge (10-20% des Milieugewichts) oder von Bierhefe.

Andere haben eine Abhängigkeit der L-Form von Sterolen und gewissen Lipoiden ins Auge gefaßt

Hinsichtlich der Antigenstruktur wurden als Techni-_Cen uiejenigen verwendet, die für Bakterien in Gebrauch sind; sie haben jedoch nicht zu positiven Ergebnissen geführt, wobei der Fehler darin bestand, ständig das gesamte Mosaik der für die Bakterie kennzeichnenden Antigene in dem Mikroorganismus wiederfinden zu wollen, die eine echte genetische Mutation durchgemacht hatten.

Schließlich kamen die Autoren, die das pathogene Verhalten der in vitro erhaltenen pathogenen Varianten untersucht haben, meist zu dem Schluß, daß eine Virulenz, »verbunden mit dem Unvermögen dieser Varianten, im Organismus zu überleben«, nicht besteht. In vivo wurde die Existenz der L-Formen bei der Ratte und bei der Maus nach Injektion von Streptokokken und Behandlung mit Penicillin (Überleben von 25 Tagen im Bauchfell der Maus) festgestellt.

Andere vom Staphylokokkus, Proteus und vom Bacillus pyocyaneus stammende L-Formen wurden im Blut von an chronischen Infektionen Leidenden (Harnleiden) beobachtet. Ihre Diagnose konnte erst durch Rückkehr zu den Ursprungsbakterien sichergestellt werden, da die L-Varianten instabil waren.

Die Inhibition oder Auflösung der Zellwand kann partiell oder vollständig sein; man hat in dieser Hinsicht bereits den L3B-Typus beobachtet, der von einer Transformation im Phänotypus herrührt mit Möglichkeit der Rückkehr zur Ursprungsbakterie und den L3A-Typus, der als Resultat einer genetischen Transformation anzusehen ist, wobei die Biosynthese der steifen Bakterienwand dann definitiv gehemmt ist.

Diese stabile Form der L3A-Form könnte als vollständige L-Transformation anzusehen sein, während das L3B-Stadium so nur eine Zwischenform darstellt.

In Anbetracht der widersprüchlichen Angaben über Kulturen, Morphologie, Cytologie, Abwesenheit eines pathogenen Verhaltens der Kulturen in vitro und Existenz eines solchen bei isolierten Varianten in vivo (instabile Varianten, die zum Ursprungsbakterium zurückkehren), wurden die Untersuchungen nicht fortgesetzt, und zwar auch wegen der Unmöglichkeit, die L-Varianten überleben zu lassen und zu konservieren. Da Mittel zur Erhaltung der L-Varianten nicht bekannt waren, konnten serologische Untersuchungen und eine Prüfung ihrer spezifischen pathogenen Wirkung im Vergleich zu den Ursprungsbakterien nicht unternommen werden.

Die Anmelderin hat beobachtet, daß sich Mutationen fortpflanzen können und daß die Lebensfähigkeit der Keime nicht an die Anwesenheit der Ze'lwand gebunden ist: Eine zarte semipermeable Membran haftet am Cytoplasma und spielt eine beachtliche Rolle bei den Erscheinungen der osmotischen Nahrungsaufnahme und der Ausbildung neuer Zellwände bei den Tochterzellen, wenn sich die Mutante zum Ursprungsbakterium zurückentwickelt

Diese nicht mit einer steifen Wand versehenen und nur durch eine zarte Cytoplasmamembran begrenzten Mutanten unterscheiden sich deutlich von den Ursprungsbakterien, gleichgültig, ob diese pathogen sind oder nicht. Wegen ihrer sehr geringen Größe bzw. extremen Plastizität, wodurch sie leicht verformbar sind, können sie durch Ultrafilter hindurchgehen. Ihr morphologischer Aufbau und ihre Art der Fortpflanzung sind den herkömmlichen bakteriologischen Untersuchungsmethoden unzugänglich geblieben. Auf festem Milieu sind ihre Kolonien sehr klein (10 bis 600 μ) und pntfffthen daher oft dem unbewaffneten Auge.

Im Lichtmikroskop (1300- bis 2000fache Vergrößerung) beobachtet man die Ausbildung von Ringen, Pseudomycelfäden und übergroßen kugeligen Körpern. Da jedoch zwei Punkte, deren Abstand geringer als 200 ητιμ ist, nicht mehr als solche aufgelöst werden, können Einzelorganismen, deren Größe unterhalb dieser Grenze liegt, nicht mehr wahrgenommen werden. Da diese Mutanten weiter keine Zellwand besitzen, sind die klassischen Anfärbemethoden der Bakteriologie nicht mehr geeignet, die nur die Zellwand anfärben (insbesondere Gram-Anfärbung).

Mit dem Elektronenmikroskop (20000fache Vergrößerung) erkennt man Formen von Elementarkorpuskeln, deren Größe von 125 bis 150ΐτ>μ schwankt. Es konnte jedoch nicht festgestellt werden, ob diese isolierten Körper nicht nur einfach eine Phase eines Fortpflanzungszyklus wären.

Die herkömmlichen bakteriologischen Nährböden bzw. -lösungen erlauben weder die Verfolgung noch die Erhaltung von stabilen Varianten, die in Anbetracht ihrer Empfindlichkeit in bezug auf den osmotischen Druck in hypotonischem Milieu platzen.

Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten vorgesehen, das von pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterien aus der Gruppe der Enterobakterien, Pseudomonaden und Aktinomyceen ausgeht, wobei man zur Entfernung der Bakterienwand auf diese Bakterien in einem zellfreien Milieu ein chemisches oder biochemisches induzierendes Mittel einwirken läßt oder eine Plasmolyse durch osmotischen Schock im zellfreien Milieu unter einem osmotischen Druck größer oder gleich 60 Atmosphären ausübt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man das die Entfernung der Bakterienwand induzierende Mittel bzw. den osmotischen Schock im Zeitpunkt der Zellteilung einwirken läßt und daß man die so erhaltenen Varianten bei einer Temperatur zwischen 22 und 37⁰C auf einem durch zellpermeationsregulierende Mittel, enthaltend Saccharose, Spuren von Kalium, Magnesium, Natriumchlorid, Natriumbikarbonat und Phosphor, osmotisch abgeglichenen zellfreien Nährmilieu kultiviert und überträgt, wobei der osmotische Druck der Gesamtheit dieser regulierend wirkenden Mittel zwischen 20 und 30 Atmosphären liegt.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Bakterienvarianten zur Herstellung von Impfstoffen und Reagenzien für Gerodiagnostik und identifizierung infektiöser Agenzien atypischen Krankheiten.

Die Besonderheit der Erfindung liegt wesentlich in der Auffindung von Modalitäten, die einerseits die Gewinnung von stabilen L-Varianten, ausgehend von Kulturstämmen, ermöglichen und andererseits ihre Konservierung bzw. Erhaltung. Dadurch wird die Festlegung eines Verfahrens möglich, das industriell durchgeführt werden kann und zu Bakterienvarianten führt, die morphologisch den Mycoplasmen ähnlich sind. Ihr Fortpflanzungszyklus ist vollständig definiert, ihre cytotoxische Wirkung in vitro wurde aufgezeigt und ihre Ähnlichkeit zu den Stämmen des isolierten Mycoplasmas von »atypischen« Krankheiten herausgestellt.

Für die Gewinnung und Erhaltung der Bakterienvarianten wurde aus zwei Gründen ein zellfreies Milieu gewählt: Erstens, weil solche, nicht an Zellmaterial gebundene Kulturen industriell rentabler sind als sogenannte zellhaltige Kulturen, und zweitens, weil

jeder Interpretationsirrtum vermieden werden sollte. Die Anmelderin hat insbesondere wegen des zweiten Grundes für ihre Untersuchungen synthetische Milieus ausgewählt, die weder Serum, noch Lysozym, noch Antibiotika enthalten.

Der 24 Stunden alte Bakterienstamm wurde in Pepton und Glucose enthaltendes, mit Nukleinsäuren und Adenosindiphosphat angereichertes Wasser eingeimpft und einer die Zellwand ausschaltenden Induktion ausgesetzt.

Unter den induzierend wirkenden Faktoren sind Antibiotika zu nennen, die auf die Zellwand wirken, wo sich das Substrat befindet, das sie inaktivieren oder Antibiotika, die nicht in den Bakterienkörper eindringen sowie zellwandlösende Enzyme, ionische oder nicht ionische Detergentien, welche die Wand auflösen, physikalische Mittel, wie Strahlungen oder Plasmolyse, welche die Wand ablösen. Zur Erzielung einer genetischen Mutation und mithin einer stabilen Variante ist es jedoch unerläßlich, daß die Einwirkung des induzierenden Mittels zum Zeitpunkt der Zellteilung erfolgt, den man aus der Wachstumskurve der Bakterien und über die Bestimmung ihrer exponentiellen Entwicklungsphase ermitteln kann.

Die optimale Bedingung, unter der die Bakterie auf die Wirkung des induzierenden Mittels anspricht, ist der Moment der Zellteilung, der in der Tat einer für Fehler im genetischen Code günstigen Periode entspricht.

Durch Beobachtungen dieser Teilung im Lichtmikroskop wurde festgestellt, daß die Teilung der Kernpartikeln um vieles derjenigen des Cytoplasmas vorangeht. Es war daher unerläßlich, den Rhythmus und die Regel dieser Erscheinung mit Sicherheit mathematisch zu erfassen; da festgestellt wurde, daß die Geschwindigkeit des Wachstums proportional zur Dichte (Konzentration) der lebenden Substanz und das Wachstumsverhältnis unter den experimentellen Bedingungen konstant ist, wurde die Exponentialfunktion nach M a 11 h u s verwendet, um die Zahl der Generationen pro Stunde und darüber den Zeitpunkt der Zellteilung zu ermitteln.

Wenn man die Zeit längs der Abszisse tuiftrügt und längs der Ordinate die Logarithmen der nephelometrisch bestimmten Kulturdichten, so liefert die Phase exponentiellen Wachstums eine Gerade.

Während der exponentiellen Phase ist das Wachstumsverhältnis umgekehrt proportional der Generations/cit, und man leitet daraus die Zahl der Minuten ab, die /wischen zwei Teilungen verstreichen.

Über die Zahl der Teilungen pro Zeileinheil erhält man:

log X₂ - log Xj

"■ «j-~f,)log2 '

wobei μ das Wachstumsverhältnis, ΑΊ die Kulturdichtc zur Zeit fi und Xi die Dichte zur Zeit h ist. Die Gcncrutionszcit ist dünn:

Bestimmte Stämme und insbesondere Proteus rougeri zeigen etwa alle halbe Stunde eine Doppeltcilung; bei Aktivierung des Stoffwechsels können vier Teilungen pro Stunde erhalten werden, und der physiologische Zustand nähert sich demjenigen der pathogenen Bakterien. Während aufeinanderfolgender Übertragungen zielen die Doppeltcilungcn auf eine größere Anzuhl von Bakterien ab, ohne daß die Zeit, die zwei Ocncraiioncn trennt, verändert wird.

Man erhält die größte Zahl von Bakterien durch Teilung, wenn man 3 bis 4 aufeinanderfolgende Übertragungen während der günstigen Teilung vornimmt und bei Kenntnis der Zellteilungszeit die neuer Kulturen bei 10°C 5 Minuten vor der Doppelteren^ synchronisiert; man vermeidet so, daß die Bakterien, die in der Entwicklung voraus sind, sich bereits teilen. Die relative Absenkung der Temperatur hemmt die Zellteilungsaktivität, nicht jedoch den Stoffwechsel det

ίο Keime; allein die für das Wachstum optimale Temperatur von 37°C begünstigt die Teilungen.

Die Zunahme des Wachstums wird gemessen, iht folgt eine Periode des Latenz, während der die Bakterien ihre Proteide und Lipoide synthetisieren und nach Ablauf der Generationszeit nimmt die Zelldichte erneut zu.

Auf diese Weise teilen sich nahezu alle Mikroorganismen zum gleichen Zeitpunkt; um jedoch einer Überalterung der Kultur vorzubeugen, ist es zweckmä- Big, das induzierend wirkende Mittel schon bei der ersten Zellteilungen einwirken zu lassen.

Die so behandelten Stämme befinden sich unter optimalen Bedingungen für die Einwirkung des induzierenden Mittels. Sie sind im sogenannten Zustand »der Kompetenz«. Eine L-Mutation in diesem Stadium wurde bisher nicht beschrieben.

Unter den im Zeitpunkt der Zeillteilung der Bakterie verwendeten induzierend wirkenden Faktoren wird erfindungsgemäß auch die Plasmolyse (Induktion durch osmotischen Schock) herangezogen.

Wenn man Bazillen mit feiner Wandstruktur einem hypertonischen Milieu aussetzt, so wird dadurch ein Aufbrechen der Trennwände zwischen den Zellen hervorgerufen, das durch Anfärben mit einer verdünn ten Lösung von Kristallviolctt und Beizen mit Tannin sichtbar gemacht werden kann. Die ihrer Schutzhülle beraubten Bazillen werden zu verformbaren Korpuskeln, die bei rascher »Lösung« im herkömmlichen bakteriologischen Milieu quellen und platzen, wenn der osmotischc Druck des flüssigen Milieus nicht auf sie abgestellt ist.

Y.% ist eines der wesentlichen Merkmale des crfindungsgcmäßcn Verfahrens, daß im Stadium der Zellteilung, el. h. in dem Augenblick, in dem die Zellwand wegen dieses Teilungsvorgangs sehr geschwächt ist, ein osmotischcr Druck von zumindest M), vorzugsweise 80 Atmosphären angewandt wird, um die steife Wand der Bakterien platzen zu lassen.

Die im »Kompetcnz«-Zustand befindlichen Hakte·

ricnsttlmmc werden in einer Menge von 0,1 ml Kultur in IO ml einer hypertonischen Salzlösung eingeimpft, deren osmotischcr Druck auf etwa 80 Atmosphären eingestellt ist, und zwar während einer Zeitdauer von 12 bis 24 Stunden, Der erhöhte osmolische Druck wird

SS durch lilcktrolytc. wie Mineralsalze und 0.3 M Succha· rose erhalten, die gute Stabilisatoren für den osmotischen Druck sind.

Die Plasmolyse erfolgt unter einer Stickstoff- oder COj-Atmoüphärc bei anaeroben Bakterien und in herkömmlicher Weise bei aeroben Bakterien. Es wurden lebende Keime in Aeroblosc durch Absenken des rH unter 20 durch Beigabc eines Stickstoff* und

Kohlendioxydgasmilieus erhalten. ErfindungsgemäB wurde festgestellt, daß die Bakte·

('S rien, die für die Induktion durch osmotischen Schock günstig sind, durch diejenigen gebildet werden, die keine die Zellwand einschließende Kapsel (nicht gekapselte Bakterien) und auch keine sturkc Zcllwnncl hüben und

deren Cytoplasmaflüssigkeit nicht in Form eines Gels vorliegt. Die diesen Bedingungen entsprechenden Keime gehören zu den Enterobakteriaceen, Pseudomonadaceen und Actinomyceen.

Bei dem Verfahren unter Einwirkung auf die in Zellteilung begriffenen Bakterien und unter den beschriebenen Modalitäten wurden bei ein und demselben Stamm Bakterien beobachtet, bei denen der erhöhte osmotische Druck keine Wirkung zeigte; global erlitten 70% der Bazillen eine definitive Mutation, ι ο während die übrigen Bazillen intakt blieben. Bei dem soeben beschriebenen Verfahren wurden niemals Bakterien beobachtet, deren Wand partiell verändert worden wäre (reversible Mutation).

Die Abtrennung der erhaltenen stabilen Varianten erfolgt durch Filtration (die Varianten sind »ultrafiltrierbar«) und Übertragung:

Wenn die nicht modifizierten Bakterien im Kulturmilieu in geringer Zahl vorhanden sind, sterben sie ab, wenn das Milieu für ihre Vermehrung nicht geeignet ist, oder es ist ihnen ganz einfach unmöglich, bei mangelnder Absorption oder Elimination zu bestehen;
wenn die Zahl der nicht modifizierten Bakterien hoch ist, bildet sich in geringer Zahl eine neue ^2S Kultur un;er Auflösung der wenigen transformierten Elemente; dieser Fall kann einmal auf sechs Fälle auftrc'en; die Bakterien haben dann möglicherweise genügend Nährreserven, um bei dem erhöhten osmotischen Druck während der Induk- ·* tionszcit überleben zu können.

Die erhaltenen stabilen Varianten sind in bezug auf osmotische Erscheinungen sehr empfindlich. Es ist daher notwendig, das zollfreie Milieu für die Erhaltung vs in osmotischcr Hinsicht abzugleichen; Bei Hypotonie quellen die Varianten und platzen, während sie bei Hypertonie schrumpfen.

Für ihre Erhaltung verwendet man ein Pcpton und glucosehaltiges und un Nukleinsäurc und Adenosindiphosphat angereichertes Milieu, wie es bereits für die der Induktion vorangehende Impfung verwendet wurde. Wegen der neuen Struktur der Varianten ist es jedoch notwendig, das Milieu hinsichtlich des osmotischen Drucks abzugleichen, indem man für einen zusätzlichen Druck von 20 bis 30 Atmosphären bei 22 bis 37"C sorgt.

Es ist diese Druckdifferenz, die die Entfaltung der Varianten in einem der Bakterienkultur angepaßten Nährmilieu ermöglicht. Diese Druckdifferenz wird durch Einführung von zcllpermeaiionsregulicrenUen Mitteln in das Ntihrmilicu crhultcn; sie entspricht den partiellen osmotischen Drücken der Gesamtheit der regulierenden Mittel. Von den regulierenden Mitteln sind Saccharose und Minerulsalze gut geeignet. Die mineralischen Mittel regeln in abgeglichenen Mengen-Verhältnissen den pH-Wert und erleichtern den Austausch /wischen den L-Varianten und dem umgebenden Milieu; sie verhindern die Zerstörung der Keime und ermöglichen ihr Überleben.

Spuren von Kalium sind für dos Phänomen der (to Permeabilität im Nivcuu der Zellmembran unerläßlich; Magnesium ist für die Synthesen notwendig: Natriumchlorid nimmt Einfluß auf die Zellpermeabilltttt und «0 auf die Austauschvorgänge der Varianten mit dem umgebenden Milieu. Diese Stoffe sind zustimmen mit (·.·> Saccharose gute Stabilisierungsmittel für den osmotischen Druck. Natrlumbicarbonat ermöglicht die Aufrechterhuliung eines alkalischen pH-Wertes. Phosphor ist ein wichtiges Element und Phenolrot ein Indikator für die metabolische Aktivität der Keime.

In einem gut abgeglichenen Milieu bleiben die transformierten Elemente über Monate intakt, wobei eine Übertragung alle 4 oder 6 Wochen ausreicht. Stämme von Mutanten konnten durch dieses Verfahren mehr als 3 Jahre am Leben erhalten werden.

Es folgt ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel

Es wurde von einer Enterobakterie, dem Proteus rettgeri, ausgegangen.

Zur Vermeidung von Interpretationsirrtümern wurde ein zellfreies Milieu gewählt (d. h. ein synthetisches Milieu, das weder Serum noch Lysozym noch Antibiotika enthielt). Die Bakterien wurden auf ein Milieu aus 20 g pankreatisches Papton, 2 g Glucose, 0,10 g Nukleinsäureanreicherung und 0,01 g Adenosindiphosphat, 0,01 g Phenolrot als Indikator und Wasser ad 1000 ml geimpft.

Als induzierend wirkendes Mittel wurde in der Phase exponentiellen Wachstums die Plaamolyse angewandt, und zwar zu einem Zeitpunkt, in dem die Bazillen im Begriff der Zellteilung standen, bei dem die Zellwand wegen des Teilungsvorganges sehr geschwächt ist. Unter der Wirkung eines osmotischen Schocks werden die Mikroorganismen, statt eingeschlossen in ihrer festen Hülle zu bleiben, in das Milieu ausgestoßen und besitzen dann als einzigen Schutz die cytoplasmische Membran.

Im Fall des Proteus rettgeri und unter den oben angegebenen Versuchsbedingungen wurde eine Gcne-1 ation alle 15 Minuten beobachtet, wodurch der Zeilpunkt festgelegt ist, zu dem man das Induktionsmittel einwirken lassen muß.

Die Bazillen wurden zum Zeitpunkt der Zellteilung in einer Menge von 0,1 ml Kultur in 10 ml hypertonische Salzlösung gebracht, deren pH-Wert zwischen 7,5 und 8,4 und deren osmotischcr Druck bei etwa 80 Atmosphären lag, und zwar während einer Dauer von 12 bis 24 Stunden.

Der osmotische Druck von etwa 80 Atmosphären wurde durch folgendes Milieu erhalten:

Komponenten	102	osmotisch«.'!1 Druck
	4	der einzelnen
	40	Komponenten (ut)
0,3 M Saccharose	I	7,4
Calciumchlorid	14	3,6
Natriumchlorid	—	36
Nairiumblcnrbonni	18	1,27
Magnesiumchlorid 6H)O	0,6	15.3
Magnesiumsulfat 7HiO	0.01	—
Natriumsulfat	1000	13
Kalziumchlorid		0,4
Phenolrot
bldcst. Wasser
	2 - 76,97 nt

I ui die Erhaltung der stabilen L-Vtmanten des l'nitcus rettgeri wurde ein bei 37"C gehaltenes Milieu lobender /.usiimmemoizting verwundet:

)0B 032/101

ίο

Milieu für die Erhaltung der L3A-Varianten:

Komponenten

.τ (at)

Pankreatisches Ponton	20,00	Σ	7,4
Nukleinsäuren	0,10
Adenosindiphosphat	0,01		15,7
Glucose	2		2,4
Saccharose (0,3 M)	102,00		0,1
Calciumchlorid	—	0,07
Natriumchlorid	18
Natriumbicarbonat	2,00	0,22
Magnesiumchlorid 6H2O	0,10
Magnesiumsulfat 7H2O	0,40
Natriumsulfat	_	= 25,89 at
Kaliumchlorid	0,40
Phenolrot	0,01
bidest. Wasser	1000

Da die Stämme durch Übertragungen in Abständen von 4 bis 6 Wochen erhalten werden konnten, kann man annehmen, daß die nach dem beschriebenen Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen L-Mutanten überleben und auf Grund dieser Tatsache morphologische und cytologische Untersuchungen vornehmen und ihre Fortpflanzung sowie ihr pathogenes Verhalten studieren.

Im Verlauf von mehrjährigen Untersuchungen wurden zahlreiche Analogien zwischen den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von Bakterien erhaltenen Varianten und den Mycoplasmen beobachtet. In Anbetracht der Morphologie, des Entwicklungszyklus und der pathogenen Wirksamkeit besteht der dringende Verdacht einer Identität zwischen den erhaltenen L-Varianten und den Mycoplasmen. Wie die Mycoplasmen sind die L-Variantcn »ultrafiltricrbar« und befinden sich in der Klassifikationsskala zwischen den Viren und den Bakterien.

Die Tatsache, daß die ihre Zellwand verloren und nur eine zarte cytoplasmische Membran von extremer Plastizität bewahrt haben, bringt sie den Mycoplasmen nahe, den Mitteln subakutcr rezidiver latenter Infektionen, die durch fortlaufende Übertragungen isoliert wurden und hinsichtlich ihrer Ätiologic auf irreversiblen definitiven und vererbbaren Mutationen zu beruhen scheinen.

Die erhaltenen Varianten haben mit diesen ihre Größe, ihre Ultrafiltrierbarkcit, ihren Nührbcdarf im /.ellfreien Milieu, ihren Mangel an Resistenz gegenüber physikalischen Einwirkungen, ihre osmotische Anfälligkeit und das Aussehen der Kolonien auf festem Milieu gemeinsam: Eine tief in die Oelose inkrustierte, undurchsichtige zentrale Zone wird von einem oberflächlich transparenten Saum umgeben.

Die mikroskopischen Merkmale der Kulturen sind typisch und stets Uhnlich unabhängig von den Urtprungsbaktcricn. So unterschiedliche Keime, wie Vibrionen, Proteus und Streptokokken geben L-Orgunismcn von identischem Aussehen.

Die Ähnlichkeit mit dem Mycoplasmen zeigt sich Buch hinsichtlich der morphologischen und cytologilchen Aspekte der erhaltenen L-Varianten.

Da die Zellwand für die Gram-Anfärbung verantwortlich ist, Ist es nicht weiter verwunderlich, daß die durch Verschwinden ihrer Zellwand modifizierten Bakterien gramnegativ sind, Die erhaltenen L-Varianten werden durch klassische Anfttrbemlttcl der Cytalo-

gie und Histologie angefärbt. Die in dünner Schichi getrockneten, nicht fixierten Präparate werden ir 10 Minuten durch ein Bad nach Shorr Trichome Stair (hinterlegte Zusammensetzung von Gurr) angefärb und mit tert.-Butylalkohol gespült, d. h. einem Lösung* mittel, das den Farbstoff nicht von den Strukturer beseitigt, auf denen er fixiert ist. Die Zellen sind heike und deformierbar. Ihre Morphologie ist variabel, uric man findet kugelige Körper, Ringe, kleine Körnungen Üvoide, kokkobazilläre Körper mit Schlüssel-, Komma· und Frage/eichenform, feine spiralförmige Bazillen ir granulösen Ketten oder Fäden, die auch isoliert gekrümmt oder gewunden sein können (s. F i g. 2 bis 4). Die von S a b i η gegebene Definition der Mycoplas men zeigt analoge morphologische Aspekte. »Die Organismen vom Typ der Pleuropneumonie der Rindei können auf einem Milieu vegetieren, das keine lebender Zellen enthält, wobei sie Mikrokolonien mit 10 bis 20 ji Durchmesser bilden, mit Extremen von 600μ. Irr Mikroskop beobachtet man Formationen in Ringform kugelige Körper, Pseudomycelfäden und Elementarkör per.«

Die beobachteten cytologischen Strukturen sind die gleichen für die erhaltenen L-Variantcn und die Mycoplasmen: feine Begrenzungsmembran, vakuoläre! bzw. vesikuläres Aussehen des Cyptoplasmas, Bildung von Elementarkörpern durch Sprossung. Differenziation von Zonen mit Ribosomen und eines zentraler Retikulums von Kernmaterie.

Die bei der Bakterie im Übermaß vorhandene Cyioplasmamasse ist reduziert und gegen die Innenschicht der Membran zusammengezogen. Der Kerr nimmt nahezu das gesamte Volumen ein. Er zeigt sich ir Form von zahlreichen Körnchen variabler Größe uno Form, die untereinander durch feine Fäden verbunder sind.

Die Körnchen sind ziemlich dicht. Die Kerne crleidcr Teilungen und Wiedervereinigungen, ohne daß Teilungen des Cytoplasmas folgen, die bei Reifung die voluminöse Kernmasse der Kugelkörper bilden.

Hinsichtlich des Stoffwechsels scheinen die stabilen Varianten und die Mycoplasmen beide die gleichen hriordcrnisse zu haben. Kulturversuche nach üblichem verfuhren bei vollständig zerstörter Zellwand bleiben olt negativ und erfordern eine Anreicherung des Milieus. Die Kultur von Mycoplasmen ist sclbsl schwierig, und die verwendeten Kulturmedien haben empirische Zusammensetzungen. Im zellfreien Milieu sind mehrere Wochen, bisweilen mehrere Monate, erforderlich, bis eine Entwicklung zu sehen ist. Die Kurturen dürfen erst nach einer Aufbewahrungszeit vor Si'⁰^⁰" ^{gUnsligen Bedin}8"ngen als negativ

Antibiotika, die auf die Bakterienwand einwirken haben - nicht mehr als die Antibiotika, die überhaupl nicht in die Bakterie eindringen - keinerlei Wirkunj auf die erhaltenen L-Varianten oder auf die Mycoplaemen; allein die Antibiotika, die auf die Mechaniemen dot Übertragung der Übermittlung der genetischen Informotion und der Proteinsymhese einwirken, haben ein« wirkung, und sie sind die einzigen, die tatsachlich in dai ^lnn _c ^ere.^de8Cytoplasmas eindringen.

^u μ ^{eBI ch pflonzen slch dle} stabilen L-Varianten wie die Mycoplasmen nicht durch Zellteilung fort.

Nach den Arbeiten von Turner scheinen die Mycoplasmen einen Entwicklungszyklus zu besitzen, per Eniwicklungszyklus von L-Bakterienvarianten Konnte dugegen bisher nicht bewiesen werden. Blslana

konnte durch keinerlei Versuche gezeigt werden, daß die Zwergformen lebensfähig sein können und daß die Fäden nicht Überreste von zerplatzten Elementen sind.

Durch kreuzweise Übertragung und fortlaufende Anfärbungcn von Kulturen erfindungsgemäß erhaltener stabiler Varianten mit Unna-Blau (metachromatische Anfärbung) etwa alle Stunden und dank systematischer Wiederholungen der Beobachtungen unter den gleichen Arbeitsbedingungen konnte der Fortpflanzungszyklus der stabilen Varianten festgestellt werden. So konnten die Eigenschaften ihrer synocytischen Struktur (plasmodialer und syncytialer Zustand) beobachtet werden und die ganz besondere Bedeutung dieses vollständigen biologischen Zyklus (dilpoidc und haploide Phase), obligatorisch die Erscheinung der Chromatinvcrmindcrung an dünnen Schichten aufgezeigt werden.

Die sphäroidalc Phase geht stets der Mycelphasc voran. Ebenso scheint es so, daß während der granulösen Phase freigesetzte Körnchen nicht lebensfähig sind; sie können nicht stärker werden und einen neuen Zyklus rückbilden. Der Ausgangspunkt eines Zyklus ist gegeben durch die letzte Entstehung von Sphäroiden von losgelösten fadenartigen Enden oder verzweigten Armen, die ihr Sphäroid isoliert zurücklassen.

Der Zyklus dauert 6 bis 10 Tage und kann sich während mehrerer Monate im geeigneten Milieu erneuern. Zu Beginn sind die Phasen ziemlich synchronisiert; mit Alterung der Kulturen tritt eine funktioneile Ordnungsstörung auf, und die (einzelnen) Phasen finden sich gleichzeitig mit den L3A-Varianten wieder, die eine Vorliebe für Pseudomycclformen zu haben scheinen (Entwicklungspausc im latenten Zustand).

Für das Studium der Zyklen oder den Nachweis der pathogcncn Fähigkeit der Varianten müssen die Übertragungen während der spharoidalcn Phase im nahezu reinen Zustand derselben vorgenommen werden. Auf Grund dieser Beobachtung kann die von den verschiedenen Autoren erzeugte Verwirrung verstanden werden, die die L-r-ormcn untersucht und die Verarmung der Kulturen der Varianten im Verlauf von Übertragungen festgestellt haben,

Es wurde festgestellt, daß die erhaltenen Varinnton einen F.ntwicklungs/.yklus mit mehreren Phasen besitzen und einen Organisationstyp, der nicht mehr derjenige der Bakterie ist, von der sie sich ableiten.

Wahrend eines Zyklus durchlaufen sie vier gut individualisierte Perioden, die man jedoch nicht als die einzig möglichen dieses komplexen Prozesses betrachten kann; diese Perioden folgen aufeinander gemäß einer gut bestimmten Ordnung:

SphQroidalc Phase (P I g. 4 bis 7): Die Elemente sind isoliert, von schleimigem Aussehen und ganz allgemein in Anhäufungen mit anderen verbunden; zunächst nimmt das Volumen der Spharolde (0,5 bis 2 μ) zu, dann bilden sie cytoplasmlschc Auswüchse, die Chromatin· korpuskcln einschließen, welche I, 2 oder mehrere kurze und dünne Fäden aussenden, deren Enden frei oder nach einer Art Sprossung Träger von neuen kugeligen oder ovalen Teilchen sind; die Füden bleiben um zentralen SpliUrold haften oder lösen sich davon.

Mycclphusc (F I g. 8 bis 10): Von regulären Sphttrolditggregaten gehen Fttden aus, die sich zu Ketten von mehreren 10 μ Lunge verlängern und sich unter Bildung eines wirklichen Myccls verflechten oder verzweigen.

Granulöse Phase (Fig. II, It bis, 12, 12 bis): Die Füden und primitiven sphüroidcn Formen verwischen sich, während sich die Einschlüsse aufteilen, aber durch eine dünne Schicht von viskosem Sekret miteinander verbunden bleiben, was der Kultur das Aussehen von Kokkenketten oder irregulären Gruppen von diversen Mikrokokkcn gibt.

Desintegrationsphase (Fig. 13): Die Elemente degenerieren, die Granulationsketten brechen auf, die Partikeln verstreuen sich in das extrazelluläre Milieu; unter den realisierten Vcrsuchsbcdingungcn sind diese

ίο Teilchen nicht lebensfähig.

Zwischen der dritten und der vierten Phase werden die primitiven Bakterien auf ihre einfachste Ausdrucksform reduziert; Ein Chromatinteilchcn, umgeben von einer sehr verformbaren fluiden Substanz.

Man kann daraus schließen, daß die erhaltenen • L-Varianten nicht nur überleben, sondern sich mit einer ihnen eigenen Fortpflanzungsweisc fortpflanzen, und zwar analog zu derjenigen, die bei Mycoplasmen beobachtet wird. Man findet hier die gleiche Möglich- keil zur Bildung von Fäden während der Mycelphase wieder und die gleiche Tendenz zum parasitären Leben während der sphäroidalen Phase; die Sphäroide sind die »Ruhe«-Formen(mykrocytische Keime),die in der Lage sind, über sehr lange Zeiten in Ruhe zu bleiben, zu überleben und unter schlechten Bedingungen zu überdauern.

Ein Zyklus dauert etwa 10 Tage; er umfaßt im zcllfreien Milieu zwei Phasen des Gedeihens, eine Phase der Dekadenz und eine Degenerationsphasc, wobei die während der granulösen Phase freigesetzten sphäroiden Elemente einen identischen Zyklus reproduzieren.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen L-Variantcn sind lebensfähig, können sich in einem gut definierten Entwicklungszyklus fortpflanzen, und es

ergibt sich das Problem ihres Überlebens im Organismus und ihre pathogene Rolle:

Die erhaltenen L-Varianten rufen bei der Zelle einen cytopathogenen und cytotoxischen Effekt hervor.
Zur Stützung dieser Annahme wurden die gemäß der Erfindung erhaltenen Varianten von Proteus rettgeri entnommen und auf Vaginalzellcn geimpft, die mit einem Ayrc-Spatcl durch Schaben im Niveau des hinteren Drittels des Scheidengewölbes nach Desinfektion gesammelt wurden, Die in Hanks-Flüssigkcit in

«ts Suspension gebrachten Zellen wurden geimpft mit einer reinen Kultur von L-Variantcn, die nach oben beschriebenen Verfahren erhalten worden waren, und zwar während der Sphüroidal-Phase (ungestielte Sphttroidc) und in einer Menge von etwa 0,1 ml pro I bis 2 ml

Suspension.

Die Verwendung einer direkten Entnahme wurde bevorzugt, da man mögliche Interpretationsirrtümer bei Verwendung von Präparaten des Pasteur-lnstituts vermeiden wollte, denen 100 Einheiten Penicillin pro ml

SS und 123 mg Thalliumacetat pro 1 1 Milieu beigegeben sind.

Bei den Zellen wurde nach einer Zeit von 2 bis 6 Tagen eine cytoloxische Wirkung beobachtet. Die gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varianten sind im

Cytoplasmabercich der Zelle lokalisiert, und zwar nahe dem Kern und in ovoidcn Granulationen, ring- oder kreuzförmigen Körpern oder sphäroiden Elementen, die Arten von Einschlüssen bilden; sie werden umgeben von einer feinen Haut, welche sie deutlich zum

(>S Cytoplasma (der befallenen Zelle) abgrenzt; die Kerne werden in dieser Zeitspanne wenig berührt (s. F i g. 4).

Eine Vcrglcichsentnuhme, die nicht mit stabilen L-Varianten geimpft worden war, zeigte keine Degene-

rationserscheinungen und keine toxischen Wirkungen. Die durchgeführte Untersuchung wäre nicht verläßlich, wenn diese Vergleichszellen in der gleichen Zeit ebenfalls anomale Degenerationen zeigen würden.

Andere Versuche wurden unter Verwendung von Nierenepithelzellen vom Affen durchgeführt. Die erfindungsgemäß erhaltenen L-Varianten wurden wie im vorangehenden Fall direkt in das Milieu eingeimpft in einer Menge von 0,1 ml pro 1 ml Suspension, wobei die L-Varianten sich in der sphäroidalen Phase, in aktiver Multiplikationsperiode, befanden.

Bei den Nierenzellen zeigte sich die Infektion ziemlich rasch, im allgemeinen 3 bis 4 Tage nach Impfung. Bei den zum Vergleich beobachteten nicht geimpften Nierenzellen wurde nichts beobachtet; bei den mit stabilen Varianten geimpften Zellen war es dagegen möglich, die verschiedenen Phasen des Entwicklungszyfdus: Fäden, Körnchen und Sphäroide (s. F i g. 15 und 16) in den Zellen wiederzufinden.

Bei beiden Zelltypen wurde für die Sichibarmachung der stabilen Varianten die Anfärbung nach Shorr (hinterlegte Zusammensetzung des Färbemittels nach Gurr) angewandt. Bei den Nierenzellen gibt heiße May-Grunwald-Giemsalösung nach Fixierung mit Methylalkohol gute Ergebnisse.

Die Vermehrung der mycoplasmaähnlichen L-Varianten hängt von der Zelle ab; in der Tat können mehrere Fälle auftreten:

1. Die Zelle ist gegenüber der eingeimpften Variante unempfindlich: Sie verdaut die fremden Proteine, die sie unter Synthese der arteigenen Proteine assimiliert. Die Zelle überlebt und man findet die - in den Stoffwechsel einbezogenen — den Keim aufbauenden Elemente abhängig von ihrer chemischen Natur in den die Zelle aufbauenden Elementen wieder. In diesem Stadium sind die Versuche, die Varianten durch Einimpfen des integrierten Materials in andere Zellen nachzuweisen, negativ: Dieses ist die Grundlage der Immunität.

2. Die Zelle läßt sich nicht einnehmen, aber sie ist unfähig, alle anwesenden Elemente in ihren Stoffwechsei einzubeziehen: Dieses ist der Fall der nicht in Erscheinung tretenden Infektion (Träger von Keimen); diese Infektion zeigt sich nicht in einer Veränderung der Morphologie der Zellkultur, sondern durch eine funktionell metabolische oder biochemische Störung, die mit dem Überleben der Zelle und demjenigen der stabilen Varianten vereinbar ist (s. F i g. 15 und 16).

Diese latente Infektion kann auf die Nachkommenden übertragen werden. Die L-Varianten besitzen ADN und ARN; diese Nukleinsäuren können dem genetisehen Potential der Zelle im Verlauf einer Teilung eingebaut werden und integrierender Teil der Chromosomen werden.

Ohne induzierenden Schock pflanzt sich die Zelle normal fort. Findet ein Schock statt, treten die erhaltenen Varianten ohne Vorbereitung oder Inkubation spontan wieder in Erscheinung. Die vom Parasiten befallene Zelle kann erneut eine Resistenz entgegensetzen.

3. Die Zelle zeigt keine Resistenz: Die L-Bakterienvarianten drücken ihren Stempel der Zelle auf, die während ihrer Überlebensperiode Nukleoproteide vom Typ der L-Variante produziert. Die Zelle stirbt durch Verschwinden der normalen Strukturen. Es findet eine Zelldegeneration statt (s. F i g. 14).

In dieser F i g. 14 sieht man bei 1 eine Anhäufung von Varianten (Mycelphase) und bei 2 den praktisch des Cvtonlasmas beraubten Kern der Zelle.

Wirtzelle und vergiftende Mikroorganismen sind die eine wie die anderen - ausgestattet mit einer genetischen Kontinuität; vom Augenblick an, in dem sich einer von beiden auf Kosten des anderen vermehrt oder sobald einer dem anderen ergänzendes Strukturmaterial leiht, das für den Aufbau von dessen Nukleoproteidmaterial erforderlich ist, findet der Konflikt Wirtzelle-L-Variante seine Verlängerung in der genetischen Kontinuität desjenigen, der überlebt.

Die pathogene Rolle der mycoplasmaähnlichen L-Varianten wurde auch durch den Versuch einer Bestimmung ihres möglichen pathogenen Wirken·, studiert.

In der Tat konnte die Rolle bei isolierten Keimen eines menschlichen Organismus beider Genese einer Läsion bestätigt werden, indem ihre biologischen Merkmale mit den klinischen Gegebenheiten und den Umständen der Isolierung konfrontiert wurden:

Es ist die Isolierung eines Mycoplasmas in mehreren Entnahmen beim gleichen Kranken bei pathologischen Produkten gleichen Ursprungs, es ist vor allem die Anwesenheit dieser Mycoplasmen in den Exairesestiikken, wodurch die pathogene Eigenschaft von Mycoplasmen erkannt werden konnte.

Man befindet sich nun in Gegenwart von virulenten Formen, die »atypische« Krankheiten hervorrufen, wobei der Keim nicht mehr die normale Morphologie der Bakterie hat und schwierig nachzuweisen ist; andererseits widersteht dieser Keim den üblichen therapeutischen Mitteln, insbesondere gewissen antibiotischen Mitteln, deren Rolle es ist, auf die Bakterienwand hemmend zu wirken, ohne die Lebensfähigkeit des Keims zu verhindern.

Die Mycoplasmen werden nicht mehr als einfaches Saprophyten betrachtet, sondern als pathogene Agentien, deren in der Humanpathologie beobachtete klinische Manifestationen zusammengefaßt werden können unter der allgemeinen Bezeichnung »Mycoplasmosen«.

Außer diesen morphologischen und cytologischen Eigenschaften haben Kulturmerkmale, das Aussehen der Kulturen und das Studium der Empfindlichkeit gegenüber antibiotischen Mitteln sowie die Fortschritte hinsichtlich der serologischen Identifizierungsmethoden es ermöglicht, die antigene Struktur einer gewissen Anzahl von isolierten Mycoplasmenstämmen von Entnahmen humanen Ursprungs, wie Bronchialaspiration, Pleuralflüssigkeit, Ganglionen, Serosites, Exairesestücke und Mark zu erkennen.

Das Phänomen der Neutralisation von Antigenen bildet, da es sowohl bei Mycoplasmen als auch bei den gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varianten auftritt, einen Annäherungspunkt. In identischer Weise kann jede Gattung von Varianten serologisch durch ein »Mosaik« von Antigenen definiert werden.

Agglutiriationstests und Komplementfixierung beweisen, daß in diesem Bereich keine vollständige Identität zwischen den erhaltenen stabilen L-Varianten und den Bakterien, von denen sie sich ableiten, besteht.

Es ist klar, daß die durch das Verfahren erhaltenen L-Varianten nicht das der Zellwand der Bakterie eigene antigene Rüstzeug haben können, insbesondere nicht das Flagcllatenantigen H. Dagegen kann man im Mosaik der Antigene der mycoplasmaähnlichen L-Varianten die Antigene des Zellkörpers, der Membran und der Protoplasmabcstandteile der Ursprungsbaktcricn wiederfinden.

Es ist so, daß parallel serologische Untersuchungen durch Inhibition des Wachstums und Komplementfixierungstests durchgeführt werden können, und zwar durch Untersuchung der Antikörper in dünner Schicht nach der Methode von Ouchterlony und fluoreszierenden Antikörpern, um die Anwesenheit der gleichen serologischen Gruppen in den Mycoplasmen und den erhaltenen L-Varianten festzustellen, die sich von Bakterien ableiten, von denen sie nach den durch das klinische Bild gegebenen Informationen Mutanten sein könnten.

Das oben angegebene, für einen bestimmten Bacillus spezifische Beispiel wurde für weitere Bakterien reproduziert, und man konnte so, ausgehend von diversen Bakterien, zu den mycoplasmaähnlichen stabilen Varianten in genügend großer Menge gelangen; diesen Bakterienvarianten kommt eine bedeutende Rolle bei Infektionen, und zwar sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin zu.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, ausgehend von Bakterien sehr unterschiedlichen Typs, konnte man zu mycoplasmaähnlichen L-Varianten gelangen, die mit diversen Mycoplasmen vergleichbar sind, deren infektiöse Rolle man von atypischen Krankheiten und der Antigenspezifität her kennt.

Jeder Stamm bildet eine diskrete serologische Gruppe, die durch ein Mosaik von spezifischen Antigenen gebildet wird. Es ist dadurch möglich, die serologischen Relationen zwischen den L3A-Bakterienvarianten und den isolierten Mycoplasmen festzulegen.

So gelangt man, wenn man das Verfahren auf Mikrokokken anwendet, zu denen die Streptokokken A und D sowie die Staphylokokken gehören und auf Enterobakterien (Klebsieila, Proteus, Salmonella, Shigella) zu L-Bakterienvarianten, analog den bereits bekannten Mycoplasmen: Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma T.

Insbesondere erhält man, ausgehend von einem hämolytischen Streptokokkus, eine stabile L-Variante, die vollständig dem Negroni-Agens gleicht, das aus leukämischem Mark isoliert wurde und das man dem Mycoplasma hominis Typ 2 zugeordnet hat.

Es folgen als Beispiele einige Fälle der Anwendung von erfindungsgemäß erhaltenen mycoplasmaähnlichen L-Varianten.

Es wurden reine Stämme von Bakterienvarianten erhalten, die pathogene Eigenschaften haben und Antigenextrakte frei von Zellen.

Die antigene Realität der nach dem Fabrikationsverfahren erhaltenen Varianten wurde mit Hilfe eines Serums aufgezeigt, das durch Injektion dieser Varianten beim Kaninchen erhalten wurde. Zu diesem Zweck wurde, ausgehend von stabilen L-Varianten des Proteus, ein zellfreier Antigenextrakt hergestellt.

Die Extraktion der antigenen Prinzipien erfolgte durch Einwirkenlassen einer wäßrigen Lösung von 1/2-normaler Trichloressigsäure auf eine Suspension von vorangehend gewaschenen Keimen bei einem pH-Wert von 1 bis 2 und einer Temperatur von 0°C. Der Antigenextrakt liegt vor in Form einer keinesfalls dialysierbaren opaleszierenden Lösung. Getrocknet ist er thermostabil, in wäßrigem Milieu dagegen thermolabil.

Injiziert beim Tier führt er zum Auftreten von sne/ifischen Antikörpern; so werden seine starken Verdünnungen durch ein entsprechendes antigenes Antiserum spezifisch gefällt. Schließlich verhält er sich wie ein aktives Endotoxin; injiziert beim Tier löst der das Auftreten von Antitoxin aus.

Diese isolierte säurelösliche antigene Komponente L3A erscheint stark polydispers in wäßriger Lösung.

Sehr löslich in Wasser spaltet sie sich unter der Wirkung von Wärme oder einer Diastase; die Polysaccharidfraktion löst sich vom Rest des antigenen

ίο Komplexes und sprengt so eine Bindung, die weniger stark ist als diejenige, welche die Antigene d^s Bakterienkörpers gefangenhält.

Man kann so die Bestandteile des Antigenextraktes der L-Varianten des Proteus isolieren: ein spezifisches Polysaccharid der erhaltenen L-Varianten, das für die charakteristischen serologischen Reaktionen des Stammes verantwortlich ist. Dieses freigesetzte Polysaccharid kann durch Zugabe mehrerer Volumen Alkohol oder Aceton gefällt werden.

Das Polysaccharid gibt dem proteischen antigenen Element seine Spezifität und ist für die charakteristischen serologischen Reaktionen des Stammes verantwortlich.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen stabilen L-Varianten wurden für die Herstellung von Reagenzien für die Serodiagnostik und die Identifizierung von infektiösen Agentien von atypischen Krankheiten verwendet. Diese serologischen Reagenzien ermöglichen die Untersuchung einer spezifischen Behandlung (Empfindlichkeit gegen Antibiotika oder andere therapeutische Mittel).

Sie haben auch ein gewisses Interesse für die Untersuchung der Ätiologie der isolierten Mycoplasmen in der infektiösen Pathologie.

Es ist klar, daß das Antigenmosaik, so wie es in der Zelle der intakten stabilen L-Varianten existiert, andere Substanzen enthält als die Phospholipoid-, Polysaccharid- und Proteinbestandteile, aber man kann annehmen, daß allein die Polysaccharid- und proteischen Bestandteile für die Antigenmanifestation wesentlich sind.

Ein anderes Beispiel für die Anwendung besteht in der Präparation von Impfstoffen mit Hilfe von Kulturen der mycoplasmaähnlichen L-Varianten (vernünftig abgeschwächte Kulturen).

Man erhält Keime der L-Varianten, die keine Virulenz besitzen, aber eine Immunisierungswirkung, und zwar durch: Zentrifugieren der Kultur, Suspendieren des Bodensatzes vom Zentrifugieren, Waschen mit wäßriger physiologischer Lösung und Aufheizen über 30 Minuten auf 40 bis 5O⁰C. Die aseptisch gemachte Suspension der L3A-Varianten wird auf eine bestimmte Konzentration verdünnt. Man verwendet Dosen von 0,1 ml der auf Konzentrationen von 10~⁵ bis 10~⁶ verdünnten infektiösen Suspension. Man filtriert mit Hilfe von Membranen mit einem Porendurchmesser zwischen 100 und 150 ιτιμ.

Man kann auch inaktivierte Keime verwenden, indem man den Stamm mit Äther oder Chloroform schwächt oder durch Formaldehydbehandlung und Aufheizen auf 56⁰C über eine halbe Stunde.

Wegen der Anwendung eines künstlichen Kulturmilieus sind das Verfahren und die Möglichkeit der Gewinnung von mycoplasmaähnlichen Formen, ausgchend von Bakterien, für verschiedene Anwendungen von reeller Bedeutung.

Die Figuren sind Reproduktionen von Fotografien, deren Vergrößerung nachfolgend angegeben wird:

Figur	Vergrößerung
I	2 500
2	2 500
3	2 500
4	3 375
5	3 375
6	3 375
7	3 375
8	3 375
9	3 375
10	3 375
U	= 8 000
11 bis	= 8 000
12	« 8 000
12 bis	« 8 000
13	3 375
14	3 375
15	= 12 000
16	= 8 000

Fig. 1 zeigt keiner Plasmolyse unterworfene Zellen von Proteus rettgeri.

F i g. 2 zeigt das pleomorphe Aussehen von Varianten des Proteus rettgeri bei gleicher Vergrößerung wie in Fig. 1.

Die Fig.3 bis 13 wurden vom Entwicklungszyklus vergrößert isolierte Elemente der in Fig.3 gezeigten

Anhäufung.
In der Phase des sphäroidalen Stadiums B (F ι g. 5 bis

7) beobachtet man die Bildung von cytoplasmischen Auswüchsen, welche die Chromatinkorpuskeln umgeben, die Fäden aussenden, welche frei sind oder Träger

neuer «plhäroidaler Teilchen.
Die Mycelphase wird vom 3. bis 6. auf die Impfung

folgenden Tag beobachtet. F i g. 8 zeigt Mycelelemente ίο in Anhäufung; Fig.9 zeigt ein isoliertes Element,

F i g. 10 den Übergang der Mycelphase in die granulöse

Phase.
Die Fig. 11 und 12 zeigen Fäden zu Beginn der

granulösen Phase (6. oder 7. Tag nach Impfung). Die Fäden sowie auch die primitiven sphäroiden Formen

verwischen sich, die Einschlüsse zerteilen sich, bleiben

aber verbunden durch eine dünne Schicht von viskosem Sekret (s. Fig. 1! bis und 12 bis). Fig. 13 zeigt den Beginn der Zerfallsphase.
F i g. 14 bis 16 zeigen Fälle von durch Varianten des

Proteus rettgeri infizierten Zellen (F i g. 14 bis 16).
Die F i g. 14 zeigt eine Nierenepithelzelle vom Affen:

Bei 1 beobachtet man eine Anhäufung von sphäroiden Formen der Varianten, bei 2 stellt man fest, daß der Kern der Zelle von einem Teil des Cytoplasmas befreit ist.

F i g. 15 zeigt zwei epitheliale Zellen mit Kernen 3 und 6; man unterscheidet das sphäroide Element der Variante 4 und den Faden 5.

aufgenommen. In der Phase des sphäroidalen Stadiums 30 In Fig. 16 erkennt man die sphäroidalen Formen 7

und 7', die durch einen Faden 9 verbunden sind; in der Zelle des Kerns 8 zeigt die Form 7 zwei weitere Fäden lOundll.

A vereinigen sich die Varianten zu Anhäufungen in den ersten 12 bis 72 Stunden, die der Impfung gemäß den Bedingungen der Plasmolyse folgen; die Fig.4 zeigt

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten, ausgehend von pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterien aus der Gruppe der Enterobakterien, Pseudomonaden und Aktinomyceen, wobei man zur Entfernung der Bakterienwand auf diese Bakterien in einem zellfreien Milieu ein chemisches oder biochemisches induzierendes Mittel einwirken läßt oder eine Plasmolyse durch osmotischen Schock im zellfreien Milieu unter einem osmotischen Druck größer oder gleich 60 Atmosphären ausübt, dadurch gekennzeichnet, daß man das die Entfernung der Bakterienwand induzierende Mittel bzw. den osmotischen Schock im Zeitpunkt der Zellteilung einwirken läßt und daß man die so erhaltenen Varianten bei einer Temperatur zwischen 22 und 37°C auf einem durch zellpermeationsregulierende Mittel, enthaltend Saccharose, Spuren von Kalium, Magnesium, Natriumchlorid, Natriumbikarbonat und Phosphor, osmotisch abgeglichenen zellfreien Nährmilieu kultiviert und überträgt, wobei der osmotische Druck der Gesamtheit dieser regulierend wirkenden Mittel zwischen 20 und 30 Atmosphären liegt.

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen Bakterienvarianten zur Herstellung von Impfstoffen und Reagenzien für Serodiagnostik und Identifizierung infektiöser Agenzien atypischer Krankheiten.