DE2014200C3 - Process for obtaining and maintaining bacterial variants and their use - Google Patents
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten, ausgehend von pathogenen oder nicht pathogenen Bakterien. Die Bakterienvarianten zeigen eine gegenüber den Bakterien, aus denen sie entstanden sind, vollständig unterschiedliche Morphologie.The subject of the invention is a method for the production and maintenance of bacterial variants, starting from pathogenic or non-pathogenic bacteria. The bacterial variants show one opposite The morphology of the bacteria from which they originated is completely different.
Die Vorstellung von Bakterien, die bei einer von den bekannten Bakterien vollständig unterschiedlichen Morphologie der Fortpflanzung fähig sind, geht zurück auf die ersten Untersuchungen der L-Formen durch Klieneberger. Diese spontan aufgetretenen Formen wurden (nach dem Lister Institut) LI-Formen genannt. Sie wurden von Dienes als wirkliche Bakterienvarianten und nicht Symbionten identifiziert. Klieneberger-Nobel und Tu 1 asηe schlossen sich dieser Meinung an.The idea of bacteria that is completely different from the known bacteria in one Morphology of reproduction goes back to the first investigations of the L-forms by Klieneberger. These spontaneously occurring forms became (according to the Lister Institute) LI forms called. They were identified by Dienes as real bacterial variants and not symbionts. Klieneberger-Nobel and Tu 1 asηe closed agree with this opinion.
Die L-Formen wurden lange Zeit als das Ergebnis von Laboratoriumsmanipulationen betrachtet und im erweiterten Sinne als künstliche Kreationen. Indessen konnte die Existenz von spontan in L-Form überlebenden normalen Bakterien für Keime beobachtet werden, denen eine extreme Polymorphie zukommt, und zwar bei Haverhillia moniliformis und Spherophorus funduliformis (para influenza), den Agentien der post-anginösen Sepsis beim Menschen.The L-shapes have long been considered the result of laboratory manipulation and have expanded Senses as artificial creations. Meanwhile, the existence of could spontaneously survive in the L-shape normal bacteria can be observed for germs that are extremely polymorphic, namely in Haverhillia moniliformis and Spherophorus funduliformis (para influenza), the agents of post-anginal sepsis in humans.
Pierce, Dienes, Klieneberger und Tula s η e ist es gelungen, im Laboratorium eine L-Transformation bei zahlreichen Bakterien herbeizuführen, und <:war sowohl bei Bazillen aus auch bei Kokken wie Salmonellen, Shiga-Kruse-Bacillus, Typhusbazillen, Clostridia, Gonokokken, Streptokokken sowie Para-influenza, und zwar durch Einwirkung von Penicillin.Pierce, Dienes, Klieneberger and Tula s η e succeeded in creating one in the laboratory Induce L-transformation in numerous bacteria, and <: was off in both bacilli off as well as in Cocci such as salmonella, Shiga-Kruse-Bacillus, typhus bacilli, Clostridia, gonococci, streptococci and para-influenza, through the action of Penicillin.
Es gibt zahlreiche andere Mittel, die in der Lage sind, eine L-Transformation hervorzurufen, wie Antibiotika, die auf die Bakterienwände einwirken (Bacitracin, Cycloserin), chemische Mittel (Glysin in erhöhter Konzentration), Lyso- Enzyme (Lysozym, Lysostaphin), physikalische Mittel (ultraviolette Strahlungen) oder There are numerous other agents that are able to induce an L-transformation, such as antibiotics that act on the bacterial walls (bacitracin, cycloserine), chemical agents (glysin in increased concentration), lyso-enzymes (lysozyme, lysostaphin), physical means (ultraviolet rays) or
biologische Mittel (Phagen, komplementäre Antikörper). biological agents (phages, complementary antibodies).
Um einen besonderen Typ von L-Formen zu bezeichnen, wurde der Begriff der Protoplasten und Sphäroplasten eingeführt. Als Protoplasten, ein Aus- To denote a particular type of L-shape , the term protoplasts and spheroplasts was introduced. As protoplasts, an ex
druck botanischen Ursprungs, der von Welbull und McGuillen eingeführt wurde, bezeichnet man infolge der Einwirkung von Penicillin oder Lysozym aus Bakterien entstandene globulöse bzw. kugelige Organismen. Als Sphäroplasten werden L-Formen mit cha-Print of botanical origin, which was introduced by Welbull and McGuillen, refers to globular or spherical organisms formed from bacteria as a result of the action of penicillin or lysozyme. L-shapes with cha-
rakteristischer globulöser Morphologie bezeichnet, die ihren Ursprung von Bakterien nehmen, die sie reproduzieren können, wenn das für die Transformation bestimmende induzierende Mittel eliminiert wird (Behandlung mit Benzylpenicillin, anderen Penicillinen,characteristic globular morphology which originate from bacteria which they can reproduce if the inducing agent determining the transformation is eliminated (treatment with benzylpenicillin, other penicillins,
Cycloserin, Lysozym bei pH 8,8, Lysazym in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure und »Tris«-Puffer). Cycloserine, lysozyme at pH 8.8, lysazym in the presence of ethylenediaminetetraacetic acid and "Tris" buffer).
Die L-Formen der Bakterien werden in allgemeiner V/eise definiert als von Bakterien ausgehende glöbulöse Elemente, deren Wand durch diverse Faktoren modifiziert oder vollständig beseitigt worden ist Sie sind geeignet, Ausgangspunkt für Kolonien von zwei unterschiedlichen Typen, nach Dienes den L3B- und L3A-Typen, zu werden. Bezüglich der Morphologie begegnet man einer Polymorphie, deren BeschreibungThe L-forms of the bacteria are generally defined as the celobular ones emanating from the bacteria Elements of which the wall has been modified or completely eliminated by various factors suitable, starting point for colonies of two different types, according to Dienes the L3B and L3A types, too. Regarding the morphology, one encounters a polymorphism, its description
je nach Autor und den Modalitäten des Herstellungsverfahrens schwankt; man kennt:varies depending on the author and the modalities of the manufacturing process; one knows:
übergroße kugelige Körper nach Weibull: Gewisse Bestandteile der Wand sind verschwunden,
da die Bakterie ihre Form verloren hat;
Fäden, die nach Klieneberger-Nobel künstliche Strukturen sein sollen, die sich durch die
große Plastizität der L-Formen erklären sollen, welche sich in der Nährlösung deformieren;
Elementarkorpuskeln nach Klieneberger oder Zwergformen nach T u 1 a s η e, die filtrierbare
und lebensfähige inframikroskopische Elemente sind.oversized spherical bodies according to Weibull: certain components of the wall have disappeared because the bacterium has lost its shape;
Threads that, according to Klieneberger-Nobel, should be artificial structures that should be explained by the great plasticity of the L-shapes, which deform in the nutrient solution;
Elementary corpuscles according to Klieneberger or dwarf forms according to T u 1 as η e, which are filterable and viable inframicroscopic elements.
Ein Entwicklungszyklus der Bakterienvarianten wurde jedoch bisher nicht nachgewiesen.However, a development cycle of the bacterial variants has not yet been proven.
In cytologischer Hinsicht besteht bei den L-Formen eine Veränderung oder ein Verschwinden der Zellwand, die durch mehrere aufeinanderfolgende Schichten gebildet wird, die im wesentlichen zwei Bestandteile enthalten: N-Acetylmuraminsäure und N-Acetyl-glucosamin. Die Wand scheint sich nicht in das osmotische Gleichgewicht des bakteriellen Cytoplasmas einzuschalten. Die Permeabilität der Bakterienzellen geht zurück auf die Cytoplasmamembran, die durch Lipoide und Proteine, enzymatische Systeme, spezifische Permeasen gebildet wird. Im Gegensatz zur Bakterie ist das Cytoplasma relativ abgesondert bzw. diskret gegenüber der Masse der Keimbläschen.From a cytological point of view, there is a change or disappearance of the cell wall in the L-forms, which is formed by several successive layers, which are essentially two components contain: N-acetylmuramic acid and N-acetyl-glucosamine. The wall does not seem to intervene in the osmotic equilibrium of the bacterial cytoplasm. The permeability of the bacterial cells goes back to the cytoplasmic membrane, which is made by lipoids and Proteins, enzymatic systems, specific permeases are formed. In contrast to bacteria, that is The cytoplasm is relatively separate or discrete from the mass of the germinal vesicles.
Was die Eigenarten der Kulturen betrifft, so haben einige der zitierten Autoren in der Absicht, die L-Formen zu erhalten, protein- und lipoidreiche Milieus verwendet. Durch Anreicherung von gebräuchlichem Kulturmilieu mit einem Rinderherzextrakt, durch Zusatz von Pepton, Pferde- oder Rinderserum in erhöhter Menge (10-20% des Milieugewichts) oder von Bierhefe.As for the peculiarities of cultures, some of the authors cited have the intention to To obtain L-shapes, protein and lipoid-rich environments are used. By enriching common Culture medium with a bovine heart extract, by adding peptone, horse or bovine serum in increased amount (10-20% of the milieu weight) or of brewer's yeast.
Andere haben eine Abhängigkeit der L-Form von Sterolen und gewissen Lipoiden ins Auge gefaßtOthers have envisaged an L-form dependence on sterols and certain lipoids
Hinsichtlich der Antigenstruktur wurden als Techni-Cen uiejenigen verwendet, die für Bakterien in Gebrauch sind; sie haben jedoch nicht zu positiven Ergebnissen geführt, wobei der Fehler darin bestand, ständig das gesamte Mosaik der für die Bakterie kennzeichnenden Antigene in dem Mikroorganismus wiederfinden zu wollen, die eine echte genetische Mutation durchgemacht hatten.Regarding the antigenic structure were used as uiejenigen en technicians C, are for bacteria in use; however, they did not lead to positive results, the mistake being to constantly try to find in the microorganism the entire mosaic of antigens characteristic of the bacterium which had undergone a genuine genetic mutation.
Schließlich kamen die Autoren, die das pathogene Verhalten der in vitro erhaltenen pathogenen Varianten untersucht haben, meist zu dem Schluß, daß eine Virulenz, »verbunden mit dem Unvermögen dieser Varianten, im Organismus zu überleben«, nicht besteht. In vivo wurde die Existenz der L-Formen bei der Ratte und bei der Maus nach Injektion von Streptokokken und Behandlung mit Penicillin (Überleben von 25 Tagen im Bauchfell der Maus) festgestellt.Finally, the authors came up with the pathogenic behavior of the pathogenic variants obtained in vitro have examined, mostly to the conclusion that a virulence, "connected with the inability of this Variants to survive in the organism «does not exist. In vivo the existence of the L-forms in the rat and in the mouse after injection of streptococci and treatment with penicillin (survival of 25 days in the peritoneum of the mouse).
Andere vom Staphylokokkus, Proteus und vom Bacillus pyocyaneus stammende L-Formen wurden im Blut von an chronischen Infektionen Leidenden (Harnleiden) beobachtet. Ihre Diagnose konnte erst durch Rückkehr zu den Ursprungsbakterien sichergestellt werden, da die L-Varianten instabil waren.Other L-forms derived from Staphylococcus, Proteus, and Bacillus pyocyaneus have been identified in the Blood from people with chronic infections (urinary disorders) observed. Your diagnosis could only be ensured by returning to the original bacteria, since the L variants were unstable.
Die Inhibition oder Auflösung der Zellwand kann partiell oder vollständig sein; man hat in dieser Hinsicht bereits den L3B-Typus beobachtet, der von einer Transformation im Phänotypus herrührt mit Möglichkeit der Rückkehr zur Ursprungsbakterie und den L3A-Typus, der als Resultat einer genetischen Transformation anzusehen ist, wobei die Biosynthese der steifen Bakterienwand dann definitiv gehemmt ist.The inhibition or dissolution of the cell wall can be partial or complete; one has in this regard already observed the L3B type, which results from a transformation in the phenotype with possibility the return to the original bacterium and the L3A type, which is the result of a genetic transformation can be seen, whereby the biosynthesis of the stiff bacterial wall is definitely inhibited.
Diese stabile Form der L3A-Form könnte als vollständige L-Transformation anzusehen sein, während das L3B-Stadium so nur eine Zwischenform darstellt.This stable form of the L3A form could be viewed as a complete L-transform while the L3B stage is only an intermediate form.
In Anbetracht der widersprüchlichen Angaben über Kulturen, Morphologie, Cytologie, Abwesenheit eines pathogenen Verhaltens der Kulturen in vitro und Existenz eines solchen bei isolierten Varianten in vivo (instabile Varianten, die zum Ursprungsbakterium zurückkehren), wurden die Untersuchungen nicht fortgesetzt, und zwar auch wegen der Unmöglichkeit, die L-Varianten überleben zu lassen und zu konservieren. Da Mittel zur Erhaltung der L-Varianten nicht bekannt waren, konnten serologische Untersuchungen und eine Prüfung ihrer spezifischen pathogenen Wirkung im Vergleich zu den Ursprungsbakterien nicht unternommen werden.Given the conflicting information about cultures, morphology, cytology, absence of one pathogenic behavior of cultures in vitro and existence of such in isolated variants in vivo (unstable variants that return to the original bacterium), the investigations were not continued, also because of the impossibility of letting the L variants survive and preserve them. Since the means for maintaining the L variants were not known, serological examinations were possible and a test of their specific pathogenic effect in comparison with the original bacteria is not to be undertaken.
Die Anmelderin hat beobachtet, daß sich Mutationen fortpflanzen können und daß die Lebensfähigkeit der Keime nicht an die Anwesenheit der Ze'lwand gebunden ist: Eine zarte semipermeable Membran haftet am Cytoplasma und spielt eine beachtliche Rolle bei den Erscheinungen der osmotischen Nahrungsaufnahme und der Ausbildung neuer Zellwände bei den Tochterzellen, wenn sich die Mutante zum Ursprungsbakterium zurückentwickeltApplicants have observed that mutations can propagate and that the viability of the Germs not bound to the presence of the Ze'lwand: A delicate semipermeable membrane adheres to the cytoplasm and plays a considerable role in the phenomena of osmotic ingestion and the formation of new cell walls in the daughter cells when the mutant becomes the original bacterium reverse engineered
Diese nicht mit einer steifen Wand versehenen und nur durch eine zarte Cytoplasmamembran begrenzten Mutanten unterscheiden sich deutlich von den Ursprungsbakterien, gleichgültig, ob diese pathogen sind oder nicht. Wegen ihrer sehr geringen Größe bzw. extremen Plastizität, wodurch sie leicht verformbar sind, können sie durch Ultrafilter hindurchgehen. Ihr morphologischer Aufbau und ihre Art der Fortpflanzung sind den herkömmlichen bakteriologischen Untersuchungsmethoden unzugänglich geblieben. Auf festem Milieu sind ihre Kolonien sehr klein (10 bis 600 μ) und pntfffthen daher oft dem unbewaffneten Auge.These are not provided with a rigid wall and are only limited by a delicate cytoplasmic membrane Mutants differ significantly from the original bacteria, regardless of whether they are pathogenic or not. Because of their very small size and extreme plasticity, which makes them easy to deform, they can pass through ultrafilters. Their morphological structure and their mode of reproduction have remained inaccessible to conventional bacteriological examination methods. On solid In the milieu, their colonies are very small (10 to 600 μ) and It is therefore often to the naked eye.
Im Lichtmikroskop (1300- bis 2000fache Vergrößerung) beobachtet man die Ausbildung von Ringen, Pseudomycelfäden und übergroßen kugeligen Körpern. Da jedoch zwei Punkte, deren Abstand geringer als 200 ητιμ ist, nicht mehr als solche aufgelöst werden, können Einzelorganismen, deren Größe unterhalb dieser Grenze liegt, nicht mehr wahrgenommen werden. Da diese Mutanten weiter keine Zellwand besitzen, sind die klassischen Anfärbemethoden der Bakteriologie nicht mehr geeignet, die nur die Zellwand anfärben (insbesondere Gram-Anfärbung).In the light microscope (1300- to 2000-fold magnification) one observes the formation of rings, pseudomycelial threads and oversized spherical bodies. However, since two points whose distance is less than 200 ητιμ are no longer resolved as such, individual organisms whose size is below this limit can no longer be perceived. Since these mutants do not have a cell wall, they are the classic staining methods used in bacteriology no longer suitable, which only stain the cell wall (especially Gram staining).
Mit dem Elektronenmikroskop (20000fache Vergrößerung) erkennt man Formen von Elementarkorpuskeln, deren Größe von 125 bis 150ΐτ>μ schwankt. Es konnte jedoch nicht festgestellt werden, ob diese isolierten Körper nicht nur einfach eine Phase eines Fortpflanzungszyklus wären.With the electron microscope (20000x magnification) one recognizes the shapes of elementary corpuscles, whose size varies from 125 to 150ΐτ> μ. It however, it could not be determined whether this isolated body was not just simply a phase of a Reproductive cycle.
Die herkömmlichen bakteriologischen Nährböden bzw. -lösungen erlauben weder die Verfolgung noch die Erhaltung von stabilen Varianten, die in Anbetracht ihrer Empfindlichkeit in bezug auf den osmotischen Druck in hypotonischem Milieu platzen.The conventional bacteriological culture media or solutions allow neither tracking nor Preservation of stable variants, given their sensitivity to the osmotic Burst pressure in a hypotonic environment.
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten vorgesehen, das von pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterien aus der Gruppe der Enterobakterien, Pseudomonaden und Aktinomyceen ausgeht, wobei man zur Entfernung der Bakterienwand auf diese Bakterien in einem zellfreien Milieu ein chemisches oder biochemisches induzierendes Mittel einwirken läßt oder eine Plasmolyse durch osmotischen Schock im zellfreien Milieu unter einem osmotischen Druck größer oder gleich 60 Atmosphären ausübt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man das die Entfernung der Bakterienwand induzierende Mittel bzw. den osmotischen Schock im Zeitpunkt der Zellteilung einwirken läßt und daß man die so erhaltenen Varianten bei einer Temperatur zwischen 22 und 370C auf einem durch zellpermeationsregulierende Mittel, enthaltend Saccharose, Spuren von Kalium, Magnesium, Natriumchlorid, Natriumbikarbonat und Phosphor, osmotisch abgeglichenen zellfreien Nährmilieu kultiviert und überträgt, wobei der osmotische Druck der Gesamtheit dieser regulierend wirkenden Mittel zwischen 20 und 30 Atmosphären liegt.According to the invention, a method for obtaining and maintaining bacterial variants is now provided, which proceeds from pathogenic or non-pathogenic bacteria from the group of enterobacteria, pseudomonads and actinomyces, whereby a chemical or biochemical inducing agent is used to remove the bacterial wall on these bacteria in a cell-free environment Allow agent to act or plasmolysis by osmotic shock in a cell-free environment under an osmotic pressure greater than or equal to 60 atmospheres, the method being characterized in that the agent which induces the removal of the bacterial wall or the osmotic shock is allowed to act at the time of cell division and that cult the variants thus obtained at a temperature of 22-37 0 C on an osmotically balanced by zellpermeationsregulierende medium containing sucrose, traces of potassium, magnesium, sodium chloride, sodium bicarbonate and phosphorus cell-free nutrient medium ivates and transmits, the osmotic pressure of all these regulating agents being between 20 and 30 atmospheres.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Bakterienvarianten zur Herstellung von Impfstoffen und Reagenzien für Gerodiagnostik und identifizierung infektiöser Agenzien atypischen Krankheiten.The invention also relates to the use of the bacterial variants obtained according to the invention for Manufacture of vaccines and reagents for gerodiagnostics and identification of infectious agents atypical diseases.
Die Besonderheit der Erfindung liegt wesentlich in der Auffindung von Modalitäten, die einerseits die Gewinnung von stabilen L-Varianten, ausgehend von Kulturstämmen, ermöglichen und andererseits ihre Konservierung bzw. Erhaltung. Dadurch wird die Festlegung eines Verfahrens möglich, das industriell durchgeführt werden kann und zu Bakterienvarianten führt, die morphologisch den Mycoplasmen ähnlich sind. Ihr Fortpflanzungszyklus ist vollständig definiert, ihre cytotoxische Wirkung in vitro wurde aufgezeigt und ihre Ähnlichkeit zu den Stämmen des isolierten Mycoplasmas von »atypischen« Krankheiten herausgestellt. The peculiarity of the invention lies essentially in the finding of modalities that, on the one hand, the Obtaining stable L-variants, starting from culture strains, enable and on the other hand theirs Conservation or preservation. This makes it possible to establish a process that is industrial can be carried out and leads to bacterial variants that are morphologically similar to mycoplasmas. Their reproductive cycle is fully defined, their cytotoxic effects in vitro have been demonstrated and their similarity to the strains of the isolated mycoplasma of "atypical" diseases was highlighted.
Für die Gewinnung und Erhaltung der Bakterienvarianten wurde aus zwei Gründen ein zellfreies Milieu gewählt: Erstens, weil solche, nicht an Zellmaterial gebundene Kulturen industriell rentabler sind als sogenannte zellhaltige Kulturen, und zweitens, weilA cell-free environment was used to obtain and maintain the bacterial variants for two reasons Chosen: First, because such cultures, which are not bound to cell material, are industrially more profitable than so-called cell-containing cultures, and secondly because
jeder Interpretationsirrtum vermieden werden sollte. Die Anmelderin hat insbesondere wegen des zweiten Grundes für ihre Untersuchungen synthetische Milieus ausgewählt, die weder Serum, noch Lysozym, noch Antibiotika enthalten.any misinterpretation should be avoided. The applicant has in particular because of the second Reason for their investigations selected synthetic milieus, which neither serum, nor lysozyme, nor Contain antibiotics.
Der 24 Stunden alte Bakterienstamm wurde in Pepton und Glucose enthaltendes, mit Nukleinsäuren und Adenosindiphosphat angereichertes Wasser eingeimpft und einer die Zellwand ausschaltenden Induktion ausgesetzt.The 24 hour old bacterial strain was transformed into peptone and glucose containing nucleic acids and adenosine diphosphate enriched water and one that switches off the cell wall Induction suspended.
Unter den induzierend wirkenden Faktoren sind Antibiotika zu nennen, die auf die Zellwand wirken, wo sich das Substrat befindet, das sie inaktivieren oder Antibiotika, die nicht in den Bakterienkörper eindringen sowie zellwandlösende Enzyme, ionische oder nicht ionische Detergentien, welche die Wand auflösen, physikalische Mittel, wie Strahlungen oder Plasmolyse, welche die Wand ablösen. Zur Erzielung einer genetischen Mutation und mithin einer stabilen Variante ist es jedoch unerläßlich, daß die Einwirkung des induzierenden Mittels zum Zeitpunkt der Zellteilung erfolgt, den man aus der Wachstumskurve der Bakterien und über die Bestimmung ihrer exponentiellen Entwicklungsphase ermitteln kann.Among the inducing factors are antibiotics that act on the cell wall, where there is the substrate that they inactivate or antibiotics that do not penetrate the bacterial body as well as cell wall-dissolving enzymes, ionic or non-ionic detergents that dissolve the wall, physical means, such as radiation or plasmolysis, which detach the wall. To achieve a genetic mutation and therefore a stable variant, it is essential that the action of the inducing agent takes place at the time of cell division, which can be derived from the growth curve of the bacteria and can determine it by determining its exponential development phase.
Die optimale Bedingung, unter der die Bakterie auf die Wirkung des induzierenden Mittels anspricht, ist der Moment der Zellteilung, der in der Tat einer für Fehler im genetischen Code günstigen Periode entspricht.The optimal condition under which the bacterium will respond to the action of the inducing agent is that The moment of cell division, which in fact corresponds to a period favorable to errors in the genetic code.
Durch Beobachtungen dieser Teilung im Lichtmikroskop wurde festgestellt, daß die Teilung der Kernpartikeln um vieles derjenigen des Cytoplasmas vorangeht. Es war daher unerläßlich, den Rhythmus und die Regel dieser Erscheinung mit Sicherheit mathematisch zu erfassen; da festgestellt wurde, daß die Geschwindigkeit des Wachstums proportional zur Dichte (Konzentration) der lebenden Substanz und das Wachstumsverhältnis unter den experimentellen Bedingungen konstant ist, wurde die Exponentialfunktion nach M a 11 h u s verwendet, um die Zahl der Generationen pro Stunde und darüber den Zeitpunkt der Zellteilung zu ermitteln.By observing this division under the light microscope, it was found that the division of the nuclear particles precedes that of the cytoplasm by much. It was therefore imperative to mathematically determine the rhythm and rule of this phenomenon with certainty capture; since it has been found that the rate of growth is proportional to the density (concentration) of living matter and the growth ratio is constant under the experimental conditions, the exponential function according to M a 11 h u s was used to calculate the number of generations per hour and using it to determine the time of cell division.
Wenn man die Zeit längs der Abszisse tuiftrügt und längs der Ordinate die Logarithmen der nephelometrisch bestimmten Kulturdichten, so liefert die Phase exponentiellen Wachstums eine Gerade.If one is to mislead the time along the abscissa and along the ordinate the logarithms of the nephelometrically determined culture densities, the phase provides exponential growth a straight line.
Während der exponentiellen Phase ist das Wachstumsverhältnis umgekehrt proportional der Generations/cit, und man leitet daraus die Zahl der Minuten ab, die /wischen zwei Teilungen verstreichen.During the exponential phase, the growth ratio is inversely proportional to the generations / cit, and the number of minutes is derived from this, the / between two divisions elapse.
Über die Zahl der Teilungen pro Zeileinheil erhält man:About the number of divisions per line unit received man:
log X2 - log Xj log X 2 - log Xj
"■ «j-~f,)log2 '"■« j- ~ f,) log2 '
wobei μ das Wachstumsverhältnis, ΑΊ die Kulturdichtc zur Zeit fi und Xi die Dichte zur Zeit h ist. Die Gcncrutionszcit ist dünn:where μ is the growth ratio, ΑΊ is the culture densityc at time fi and Xi is the density at time h . The Gcncrutionszcit is thin:
Bestimmte Stämme und insbesondere Proteus rougeri zeigen etwa alle halbe Stunde eine Doppeltcilung; bei Aktivierung des Stoffwechsels können vier Teilungen pro Stunde erhalten werden, und der physiologische Zustand nähert sich demjenigen der pathogenen Bakterien. Während aufeinanderfolgender Übertragungen zielen die Doppeltcilungcn auf eine größere Anzuhl von Bakterien ab, ohne daß die Zeit, die zwei Ocncraiioncn trennt, verändert wird.Certain strains, and especially Proteus rougeri, show a double division about every half hour; at Activation of metabolism can be obtained four divisions per hour, and the physiological State approaches that of pathogenic bacteria. During successive transmissions, the duplication aims at a larger number of bacteria without changing the time separating the two ocncraions.
Man erhält die größte Zahl von Bakterien durch Teilung, wenn man 3 bis 4 aufeinanderfolgende Übertragungen während der günstigen Teilung vornimmt und bei Kenntnis der Zellteilungszeit die neuerThe greatest number of bacteria is obtained by dividing if one is 3 to 4 consecutive Carries out transmissions during the favorable division and, if the cell division time is known, the new ones Kulturen bei 10°C 5 Minuten vor der Doppelteren^ synchronisiert; man vermeidet so, daß die Bakterien, die in der Entwicklung voraus sind, sich bereits teilen. Die relative Absenkung der Temperatur hemmt die Zellteilungsaktivität, nicht jedoch den Stoffwechsel detCultures at 10 ° C 5 minutes before the double ^ synchronized; this avoids the bacteria that are ahead of the curve from already dividing. the Relative lowering of the temperature inhibits cell division activity, but not metabolism
ίο Keime; allein die für das Wachstum optimale Temperatur von 37°C begünstigt die Teilungen.ίο germs; Only the temperature of 37 ° C, which is optimal for growth, favors the division.
Die Zunahme des Wachstums wird gemessen, iht folgt eine Periode des Latenz, während der die Bakterien ihre Proteide und Lipoide synthetisieren undThe increase in growth is measured, followed by a period of latency during which the Bacteria synthesize their proteins and lipoids and nach Ablauf der Generationszeit nimmt die Zelldichte erneut zu.after the generation time has elapsed, the cell density decreases again to.
Auf diese Weise teilen sich nahezu alle Mikroorganismen zum gleichen Zeitpunkt; um jedoch einer Überalterung der Kultur vorzubeugen, ist es zweckmä-In this way, almost all microorganisms divide at the same time; however one To prevent the aging of the culture, it is expedient Big, das induzierend wirkende Mittel schon bei der ersten Zellteilungen einwirken zu lassen.Big, the inducing agent already with the to let the first cell divisions take effect.
Die so behandelten Stämme befinden sich unter optimalen Bedingungen für die Einwirkung des induzierenden Mittels. Sie sind im sogenannten ZustandThe strains treated in this way are under optimal conditions for the action of the inducing agent. You are in the so-called state »der Kompetenz«. Eine L-Mutation in diesem Stadium wurde bisher nicht beschrieben.»The competence«. An L mutation at this stage has not yet been described.
Unter den im Zeitpunkt der Zeillteilung der Bakterie verwendeten induzierend wirkenden Faktoren wird erfindungsgemäß auch die Plasmolyse (Induktion durchAmong the inducing factors used at the time of cell division of the bacterium is according to the invention also the plasmolysis (induction by osmotischen Schock) herangezogen.osmotic shock).
Wenn man Bazillen mit feiner Wandstruktur einem hypertonischen Milieu aussetzt, so wird dadurch ein Aufbrechen der Trennwände zwischen den Zellen hervorgerufen, das durch Anfärben mit einer verdünnIf you expose bacilli with a fine wall structure to a hypertonic environment, it becomes a Rupture of the partitions between the cells is caused by staining with a dilute ten Lösung von Kristallviolctt und Beizen mit Tannin sichtbar gemacht werden kann. Die ihrer Schutzhülle beraubten Bazillen werden zu verformbaren Korpuskeln, die bei rascher »Lösung« im herkömmlichen bakteriologischen Milieu quellen und platzen, wenn derth solution of crystal violet and pickling with tannin can be made visible. The bacilli, deprived of their protective cover, become deformable corpuscles, which, with rapid "solution", become conventional bacteriological environment swell and burst when the osmotischc Druck des flüssigen Milieus nicht auf sie abgestellt ist.The osmotic pressure of the liquid environment is not applied to them.
Y.% ist eines der wesentlichen Merkmale des crfindungsgcmäßcn Verfahrens, daß im Stadium der Zellteilung, el. h. in dem Augenblick, in dem die Zellwand Y.% is one of the essential features of the discovery process that in the stage of cell division, el. at the moment when the cell wall wegen dieses Teilungsvorgangs sehr geschwächt ist, einis very weakened because of this division process osmotischcr Druck von zumindest M), vorzugsweiseosmotic pressure of at least M), preferably 80 Atmosphären angewandt wird, um die steife Wand80 atmospheres is applied to the stiff wall der Bakterien platzen zu lassen.to burst the bacteria.
ricnsttlmmc werden in einer Menge von 0,1 ml Kultur in IO ml einer hypertonischen Salzlösung eingeimpft, deren osmotischcr Druck auf etwa 80 Atmosphären eingestellt ist, und zwar während einer Zeitdauer von 12 bis 24 Stunden, Der erhöhte osmolische Druck wirdricnsttlmmc are in an amount of 0.1 ml of culture in 10 ml of a hypertonic saline solution, the osmotic pressure of which is about 80 atmospheres is set, for a period of 12 to 24 hours, The increased osmolic pressure is
SS durch lilcktrolytc. wie Mineralsalze und 0.3 M Succha· rose erhalten, die gute Stabilisatoren für den osmotischen Druck sind.SS by lilcktrolytc. like mineral salts and 0.3 M succha rose, which are good stabilizers for osmotic pressure.
Die Plasmolyse erfolgt unter einer Stickstoff- oder COj-Atmoüphärc bei anaeroben Bakterien und inThe plasmolysis takes place under a nitrogen or COj atmosphere for anaerobic bacteria and in herkömmlicher Weise bei aeroben Bakterien. Esconventionally with aerobic bacteria. It wurden lebende Keime in Aeroblosc durch Absenkenwere living germs in Aeroblosc by lowering them des rH unter 20 durch Beigabc eines Stickstoff* unddes rH below 20 by adding a nitrogen * and
('S rien, die für die Induktion durch osmotischen Schock günstig sind, durch diejenigen gebildet werden, die keine die Zellwand einschließende Kapsel (nicht gekapselte Bakterien) und auch keine sturkc Zcllwnncl hüben und('S rien for induction by osmotic shock are favorable to be formed by those who do not have a capsule enclosing the cell wall (non-encapsulated Bacteria) and no stubborn cells either
deren Cytoplasmaflüssigkeit nicht in Form eines Gels vorliegt. Die diesen Bedingungen entsprechenden Keime gehören zu den Enterobakteriaceen, Pseudomonadaceen und Actinomyceen.whose cytoplasmic fluid is not in the form of a gel is present. The germs corresponding to these conditions belong to the Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae and actinomyces.
Bei dem Verfahren unter Einwirkung auf die in Zellteilung begriffenen Bakterien und unter den beschriebenen Modalitäten wurden bei ein und demselben Stamm Bakterien beobachtet, bei denen der erhöhte osmotische Druck keine Wirkung zeigte; global erlitten 70% der Bazillen eine definitive Mutation, ι ο während die übrigen Bazillen intakt blieben. Bei dem soeben beschriebenen Verfahren wurden niemals Bakterien beobachtet, deren Wand partiell verändert worden wäre (reversible Mutation).In the process under the action of the bacteria in the process of cell division and among the described modalities were observed in the same strain of bacteria in which the increased osmotic pressure had no effect; globally, 70% of the bacilli suffered a definite mutation, ι ο while the remaining bacilli remained intact. In the procedure just described, never Bacteria observed whose wall would have been partially changed (reversible mutation).
Die Abtrennung der erhaltenen stabilen Varianten erfolgt durch Filtration (die Varianten sind »ultrafiltrierbar«) und Übertragung:The stable variants obtained are separated off by filtration (the variants are »ultrafilterable«) and transmission:
Wenn die nicht modifizierten Bakterien im Kulturmilieu in geringer Zahl vorhanden sind,
sterben sie ab, wenn das Milieu für ihre Vermehrung nicht geeignet ist, oder es ist ihnen
ganz einfach unmöglich, bei mangelnder Absorption oder Elimination zu bestehen;
wenn die Zahl der nicht modifizierten Bakterien hoch ist, bildet sich in geringer Zahl eine neue 2S
Kultur un;er Auflösung der wenigen transformierten Elemente; dieser Fall kann einmal auf sechs
Fälle auftrc'en; die Bakterien haben dann möglicherweise
genügend Nährreserven, um bei dem erhöhten osmotischen Druck während der Induk- ·*
tionszcit überleben zu können.If the unmodified bacteria are present in the culture medium in small numbers, they die if the medium is not suitable for their reproduction, or it is simply impossible for them to survive in the absence of absorption or elimination;
if the number of unmodified bacteria is high, a new 2S culture will form in small numbers and the few transformed elements will dissolve; this case can occur once in six cases; the bacteria then possibly have sufficient nutrient reserves to be able to survive the increased osmotic pressure during the induction cycle.
Die erhaltenen stabilen Varianten sind in bezug auf osmotische Erscheinungen sehr empfindlich. Es ist daher notwendig, das zollfreie Milieu für die Erhaltung vs in osmotischcr Hinsicht abzugleichen; Bei Hypotonie quellen die Varianten und platzen, während sie bei Hypertonie schrumpfen.The stable variants obtained are very sensitive to osmotic phenomena. It is therefore necessary to maintain the duty-free environment vs. balance osmotically; In hypotension, the variants swell and burst, while at Hypertension will shrink.
Für ihre Erhaltung verwendet man ein Pcpton und glucosehaltiges und un Nukleinsäurc und Adenosindiphosphat angereichertes Milieu, wie es bereits für die der Induktion vorangehende Impfung verwendet wurde. Wegen der neuen Struktur der Varianten ist es jedoch notwendig, das Milieu hinsichtlich des osmotischen Drucks abzugleichen, indem man für einen zusätzlichen Druck von 20 bis 30 Atmosphären bei 22 bis 37"C sorgt.For their preservation one uses a pcptone and glucose-containing and un nucleic acid and adenosine diphosphate Enriched milieu, as it was already used for the vaccination preceding the induction. Because of the new structure of the variants, however, it is necessary to change the osmotic milieu Adjust the pressure by adding 20 to 30 atmospheres of additional pressure at 22 to 37 "C.
Es ist diese Druckdifferenz, die die Entfaltung der Varianten in einem der Bakterienkultur angepaßten Nährmilieu ermöglicht. Diese Druckdifferenz wird durch Einführung von zcllpermeaiionsregulicrenUen Mitteln in das Ntihrmilicu crhultcn; sie entspricht den partiellen osmotischen Drücken der Gesamtheit der regulierenden Mittel. Von den regulierenden Mitteln sind Saccharose und Minerulsalze gut geeignet. Die mineralischen Mittel regeln in abgeglichenen Mengen-Verhältnissen den pH-Wert und erleichtern den Austausch /wischen den L-Varianten und dem umgebenden Milieu; sie verhindern die Zerstörung der Keime und ermöglichen ihr Überleben. It is this pressure difference that enables the variants to develop in a nutrient medium adapted to the bacterial culture. This pressure difference is crhultcn by the introduction of agents into the zcllpermeaiionsregulicrenUen Ntihrmilicu; it corresponds to the partial osmotic pressures of all the regulating agents. Of the regulating agents, sucrose and mineral salts are well suited. The mineral agents regulate the pH value in balanced proportions and facilitate the exchange / wipe between the L variants and the surrounding environment; they prevent the germs from being destroyed and enable them to survive.
Spuren von Kalium sind für dos Phänomen der (to Permeabilität im Nivcuu der Zellmembran unerläßlich; Magnesium ist für die Synthesen notwendig: Natriumchlorid nimmt Einfluß auf die Zellpermeabilltttt und «0 auf die Austauschvorgänge der Varianten mit dem umgebenden Milieu. Diese Stoffe sind zustimmen mit (·.·> Saccharose gute Stabilisierungsmittel für den osmotischen Druck. Natrlumbicarbonat ermöglicht die Aufrechterhuliung eines alkalischen pH-Wertes. Phosphor ist ein wichtiges Element und Phenolrot ein Indikator für die metabolische Aktivität der Keime. Traces of potassium are essential for the phenomenon of permeability in the level of the cell membrane; Magnesium is necessary for the syntheses: Sodium chloride influences the cell permeability and the exchange processes of the variants with the surrounding environment. These substances must be agreed with (· . ·> Sucrose is a good stabilizer for the osmotic pressure. Sodium bicarbonate enables the maintenance of an alkaline pH value. Phosphorus is an important element and phenol red an indicator for the metabolic activity of the germs.
In einem gut abgeglichenen Milieu bleiben die transformierten Elemente über Monate intakt, wobei eine Übertragung alle 4 oder 6 Wochen ausreicht. Stämme von Mutanten konnten durch dieses Verfahren mehr als 3 Jahre am Leben erhalten werden.In a well-balanced environment, the transformed elements remain intact for months, whereby one transfer every 4 or 6 weeks is sufficient. Strains of mutants could be identified by this procedure be kept alive for more than 3 years.
Es folgt ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.An example of the implementation of the method according to the invention follows.
Es wurde von einer Enterobakterie, dem Proteus rettgeri, ausgegangen.An enterobacteria, the Proteus rettgeri, was assumed.
Zur Vermeidung von Interpretationsirrtümern wurde ein zellfreies Milieu gewählt (d. h. ein synthetisches Milieu, das weder Serum noch Lysozym noch Antibiotika enthielt). Die Bakterien wurden auf ein Milieu aus 20 g pankreatisches Papton, 2 g Glucose, 0,10 g Nukleinsäureanreicherung und 0,01 g Adenosindiphosphat, 0,01 g Phenolrot als Indikator und Wasser ad 1000 ml geimpft.In order to avoid errors of interpretation, a cell-free environment was chosen (i.e. a synthetic one Environment that did not contain serum, lysozyme or antibiotics). The bacteria were looking for an environment 20 g pancreatic Papton, 2 g glucose, 0.10 g nucleic acid enrichment and 0.01 g adenosine diphosphate, 0.01 g phenol red as an indicator and water inoculated to 1000 ml.
Als induzierend wirkendes Mittel wurde in der Phase exponentiellen Wachstums die Plaamolyse angewandt, und zwar zu einem Zeitpunkt, in dem die Bazillen im Begriff der Zellteilung standen, bei dem die Zellwand wegen des Teilungsvorganges sehr geschwächt ist. Unter der Wirkung eines osmotischen Schocks werden die Mikroorganismen, statt eingeschlossen in ihrer festen Hülle zu bleiben, in das Milieu ausgestoßen und besitzen dann als einzigen Schutz die cytoplasmische Membran.Plaamolysis was used as an inducing agent in the exponential growth phase, namely at a point in time when the bacilli were in the process of cell division, at which the cell wall is very weakened because of the division process. Being under the action of an osmotic shock the microorganisms, instead of remaining enclosed in their solid shell, are expelled into the environment and then have the cytoplasmic membrane as the only protection.
Im Fall des Proteus rettgeri und unter den oben angegebenen Versuchsbedingungen wurde eine Gcne-1 ation alle 15 Minuten beobachtet, wodurch der Zeilpunkt festgelegt ist, zu dem man das Induktionsmittel einwirken lassen muß.In the case of the Proteus rettgeri and under the experimental conditions given above, a Gcne-1 ation observed every 15 minutes, whereby the target point is determined, at which one the induction agent must have an effect.
Die Bazillen wurden zum Zeitpunkt der Zellteilung in einer Menge von 0,1 ml Kultur in 10 ml hypertonische Salzlösung gebracht, deren pH-Wert zwischen 7,5 und 8,4 und deren osmotischcr Druck bei etwa 80 Atmosphären lag, und zwar während einer Dauer von 12 bis 24 Stunden.The bacilli were at the time of cell division in a quantity of 0.1 ml of culture in 10 ml of hypertonic saline solution, the pH of which between 7.5 and 8.4 and whose osmotic pressure was about 80 atmospheres for a period of 12 to 24 hours.
Der osmotische Druck von etwa 80 Atmosphären wurde durch folgendes Milieu erhalten:The osmotic pressure of about 80 atmospheres was obtained through the following environment:
(ut) Components
(ut)
I ui die Erhaltung der stabilen L-Vtmanten des l'nitcus rettgeri wurde ein bei 37"C gehaltenes Milieu lobender /.usiimmemoizting verwundet:I ui the preservation of the stable L-Vtmanten des l'nitcus rettgeri became an environment kept at 37 ° C praising /.usiimmemoizting wounded:
)0B 032/101) 0B 032/101
ίοίο
Milieu für die Erhaltung der L3A-Varianten:Environment for the preservation of the L3A variants:
KomponentenComponents
.τ (at).τ (at)
Da die Stämme durch Übertragungen in Abständen von 4 bis 6 Wochen erhalten werden konnten, kann man annehmen, daß die nach dem beschriebenen Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen L-Mutanten überleben und auf Grund dieser Tatsache morphologische und cytologische Untersuchungen vornehmen und ihre Fortpflanzung sowie ihr pathogenes Verhalten studieren. Since the strains could be obtained by transfers at intervals of 4 to 6 weeks, one can assume that the L mutants obtained by the method described according to the invention survive and on the basis of this fact carry out morphological and cytological examinations and theirs Study reproduction and its pathogenic behavior.
Im Verlauf von mehrjährigen Untersuchungen wurden zahlreiche Analogien zwischen den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von Bakterien erhaltenen Varianten und den Mycoplasmen beobachtet. In Anbetracht der Morphologie, des Entwicklungszyklus und der pathogenen Wirksamkeit besteht der dringende Verdacht einer Identität zwischen den erhaltenen L-Varianten und den Mycoplasmen. Wie die Mycoplasmen sind die L-Variantcn »ultrafiltricrbar« und befinden sich in der Klassifikationsskala zwischen den Viren und den Bakterien.In the course of several years of research, numerous analogies were found between the after Method according to the invention starting from variants obtained from bacteria and the mycoplasmas observed. Considering the morphology, development cycle and pathogenic effectiveness there is strong suspicion of an identity between the obtained L variants and the mycoplasma. Like the mycoplasma, the L variants are "ultrafiltrable" and are on the classification scale between the viruses and the bacteria.
Die Tatsache, daß die ihre Zellwand verloren und nur eine zarte cytoplasmische Membran von extremer Plastizität bewahrt haben, bringt sie den Mycoplasmen nahe, den Mitteln subakutcr rezidiver latenter Infektionen, die durch fortlaufende Übertragungen isoliert wurden und hinsichtlich ihrer Ätiologic auf irreversiblen definitiven und vererbbaren Mutationen zu beruhen scheinen.The fact that they lost their cell wall and only Having retained a delicate cytoplasmic membrane of extreme plasticity, it brings the mycoplasmas close, to the means of subacute recurrent latent infections isolated by continuous transmissions and to be based on irreversible, definitive and hereditary mutations with regard to their etiology seem to be.
Die erhaltenen Varianten haben mit diesen ihre Größe, ihre Ultrafiltrierbarkcit, ihren Nührbcdarf im /.ellfreien Milieu, ihren Mangel an Resistenz gegenüber physikalischen Einwirkungen, ihre osmotische Anfälligkeit und das Aussehen der Kolonien auf festem Milieu gemeinsam: Eine tief in die Oelose inkrustierte, undurchsichtige zentrale Zone wird von einem oberflächlich transparenten Saum umgeben. The variants obtained have in common with them their size, their ultrafilterability, their need to be stirred in an cell-free environment, their lack of resistance to physical influences, their osmotic susceptibility and the appearance of the colonies in a solid environment: an opaque central area that is deeply encrusted in the oil Zone is surrounded by a superficially transparent border.
Die mikroskopischen Merkmale der Kulturen sind typisch und stets Uhnlich unabhängig von den Urtprungsbaktcricn. So unterschiedliche Keime, wie Vibrionen, Proteus und Streptokokken geben L-Orgunismcn von identischem Aussehen.The microscopic characteristics of the cultures are typical and always similar, independent of the bacteria of origin. Germs as different as Vibrions, Proteus and Streptococci give L-orgunisms of identical appearance.
Die Ähnlichkeit mit dem Mycoplasmen zeigt sich Buch hinsichtlich der morphologischen und cytologilchen Aspekte der erhaltenen L-Varianten.The similarity with the mycoplasma is shown in the book with regard to the morphological and cytological aspects of the L variants obtained.
Da die Zellwand für die Gram-Anfärbung verantwortlich ist, Ist es nicht weiter verwunderlich, daß die durch Verschwinden ihrer Zellwand modifizierten Bakterien gramnegativ sind, Die erhaltenen L-Varianten werden durch klassische Anfttrbemlttcl der Cytalo-Since the cell wall is responsible for the Gram staining, it is not surprising that the bacteria modified by the disappearance of their cell wall are gram-negative.
gie und Histologie angefärbt. Die in dünner Schichi getrockneten, nicht fixierten Präparate werden ir 10 Minuten durch ein Bad nach Shorr Trichome Stair (hinterlegte Zusammensetzung von Gurr) angefärb und mit tert.-Butylalkohol gespült, d. h. einem Lösung* mittel, das den Farbstoff nicht von den Strukturer beseitigt, auf denen er fixiert ist. Die Zellen sind heike und deformierbar. Ihre Morphologie ist variabel, uric man findet kugelige Körper, Ringe, kleine Körnungen Üvoide, kokkobazilläre Körper mit Schlüssel-, Komma· und Frage/eichenform, feine spiralförmige Bazillen ir granulösen Ketten oder Fäden, die auch isoliert gekrümmt oder gewunden sein können (s. F i g. 2 bis 4). Die von S a b i η gegebene Definition der Mycoplas men zeigt analoge morphologische Aspekte. »Die Organismen vom Typ der Pleuropneumonie der Rindei können auf einem Milieu vegetieren, das keine lebender Zellen enthält, wobei sie Mikrokolonien mit 10 bis 20 ji Durchmesser bilden, mit Extremen von 600μ. Irr Mikroskop beobachtet man Formationen in Ringform kugelige Körper, Pseudomycelfäden und Elementarkör per.«stained energy and histology. The non-fixed preparations, dried in thin layers, are stained for 10 minutes in a bath according to Shorr Trichome Stair (deposited composition by Gurr) and rinsed with tert-butyl alcohol, i.e. a solvent that does not remove the dye from the structure, on which he is fixated. The cells are hot and deformable. Their morphology is variable, you can find spherical bodies, rings, small grain sizes, cocobacillary bodies with key, comma and question / oak shape, fine spiral-shaped bacilli ir granular chains or threads, which can also be curved or twisted in isolation (see p. Fig. 2 to 4). The definition of mycoplasms given by S abi η shows analogous morphological aspects. “Bovine egg pleuropneumonia-type organisms can vegetate in a medium devoid of living cells, forming micro-colonies 10-20 µ in diameter, with extremes of 600 µ. In the microscope one observes formations in the shape of a ring, spherical bodies, pseudomycelial threads and elementary bodies. "
Die beobachteten cytologischen Strukturen sind die gleichen für die erhaltenen L-Variantcn und die Mycoplasmen: feine Begrenzungsmembran, vakuoläre! bzw. vesikuläres Aussehen des Cyptoplasmas, Bildung von Elementarkörpern durch Sprossung. Differenziation von Zonen mit Ribosomen und eines zentraler Retikulums von Kernmaterie.The cytological structures observed are the same for the L variants obtained and the Mycoplasma: fine limiting membrane, vacuolar! or vesicular appearance of the cyptoplasm, formation of elementary bodies by sprouting. Differentiation of zones with ribosomes and one central Reticulum of nuclear matter.
Die bei der Bakterie im Übermaß vorhandene Cyioplasmamasse ist reduziert und gegen die Innenschicht der Membran zusammengezogen. Der Kerr nimmt nahezu das gesamte Volumen ein. Er zeigt sich ir Form von zahlreichen Körnchen variabler Größe uno Form, die untereinander durch feine Fäden verbunder sind.The excess of cyioplasma mass present in the bacterium is reduced and against the inner layer the membrane contracted. The Kerr takes up almost the entire volume. He shows himself ir Form of numerous granules of variable size and shape, which are connected to each other by fine threads are.
Die Körnchen sind ziemlich dicht. Die Kerne crleidcr Teilungen und Wiedervereinigungen, ohne daß Teilungen des Cytoplasmas folgen, die bei Reifung die voluminöse Kernmasse der Kugelkörper bilden.The granules are quite dense. The nuclei crleidcr Divisions and reunions, without the divisions of the cytoplasm that follow upon maturation form voluminous core mass of spherical bodies.
Hinsichtlich des Stoffwechsels scheinen die stabilen Varianten und die Mycoplasmen beide die gleichen hriordcrnisse zu haben. Kulturversuche nach üblichem verfuhren bei vollständig zerstörter Zellwand bleiben olt negativ und erfordern eine Anreicherung des Milieus. Die Kultur von Mycoplasmen ist sclbsl schwierig, und die verwendeten Kulturmedien haben empirische Zusammensetzungen. Im zellfreien Milieu sind mehrere Wochen, bisweilen mehrere Monate, erforderlich, bis eine Entwicklung zu sehen ist. Die Kurturen dürfen erst nach einer Aufbewahrungszeit vor Si'0^0" gUnsligen Bedin8"ngen als negativ With regard to metabolism, the stable variants and the mycoplasmas both seem to have the same abnormalities. Culture experiments following the usual procedure with a completely destroyed cell wall often remain negative and require an enrichment of the environment. The culture of mycoplasmas is difficult and the culture media used have empirical compositions. In a cell-free environment, several weeks, sometimes several months, are required before development can be seen. The Kurturen allowed only after a storage period before Si '0 ^ 0 "gUnsligen Bedin 8" hang as negative
Antibiotika, die auf die Bakterienwand einwirken haben - nicht mehr als die Antibiotika, die überhaupl nicht in die Bakterie eindringen - keinerlei Wirkunj auf die erhaltenen L-Varianten oder auf die Mycoplaemen; allein die Antibiotika, die auf die Mechaniemen dot Übertragung der Übermittlung der genetischen Informotion und der Proteinsymhese einwirken, haben ein« wirkung, und sie sind die einzigen, die tatsachlich in dai lnn c ere.de8Cytoplasmas eindringen.Antibiotics that have an effect on the bacterial wall - no more than the antibiotics that do not penetrate the bacteria at all - have no effect on the obtained L-variants or on the mycoplaemes; only the antibiotics that dot the Mechaniemen transmission of the transmission of genetic Informotion and Proteinsymhese act, an "effective, and they are the only ones actually in dai lnn c he e. d e8 penetrate cytoplasm.
^u μ eBI ch pflonzen slch dle stabilen L-Varianten wie die Mycoplasmen nicht durch Zellteilung fort.^ u μ eBI do not plant the stable L variants such as mycoplasmas through cell division.
Nach den Arbeiten von Turner scheinen die Mycoplasmen einen Entwicklungszyklus zu besitzen, per Eniwicklungszyklus von L-Bakterienvarianten Konnte dugegen bisher nicht bewiesen werden. BlslanaAccording to Turner's work, the Mycoplasmas have a development cycle, per development cycle of L-bacterial variants However, it has not yet been proven. Blslana
konnte durch keinerlei Versuche gezeigt werden, daß die Zwergformen lebensfähig sein können und daß die Fäden nicht Überreste von zerplatzten Elementen sind.could not be shown by any experiments that the dwarf forms can be viable and that the Threads are not the remains of broken elements.
Durch kreuzweise Übertragung und fortlaufende Anfärbungcn von Kulturen erfindungsgemäß erhaltener stabiler Varianten mit Unna-Blau (metachromatische Anfärbung) etwa alle Stunden und dank systematischer Wiederholungen der Beobachtungen unter den gleichen Arbeitsbedingungen konnte der Fortpflanzungszyklus der stabilen Varianten festgestellt werden. So konnten die Eigenschaften ihrer synocytischen Struktur (plasmodialer und syncytialer Zustand) beobachtet werden und die ganz besondere Bedeutung dieses vollständigen biologischen Zyklus (dilpoidc und haploide Phase), obligatorisch die Erscheinung der Chromatinvcrmindcrung an dünnen Schichten aufgezeigt werden.According to the invention obtained by cross-transferring and continuously staining cultures more stable variants with Unna blue (metachromatic staining) approximately every hour and thanks to systematic Repetitions of the observations under the same working conditions could change the reproductive cycle of the stable variants can be determined. So the properties of their synocytic structure (plasmodial and syncytial state) can be observed and the very special meaning of this complete biological cycle (dilpoid and haploid phases), obligatory the appearance of chromatin reduction be shown on thin layers.
Die sphäroidalc Phase geht stets der Mycelphasc voran. Ebenso scheint es so, daß während der granulösen Phase freigesetzte Körnchen nicht lebensfähig sind; sie können nicht stärker werden und einen neuen Zyklus rückbilden. Der Ausgangspunkt eines Zyklus ist gegeben durch die letzte Entstehung von Sphäroiden von losgelösten fadenartigen Enden oder verzweigten Armen, die ihr Sphäroid isoliert zurücklassen. The spheroidal phase always precedes the mycelial phase. It also appears that during the granules released in the granular phase are not viable; they cannot get stronger and one regress into a new cycle. The starting point of a cycle is given by the last creation of Spheroids of detached thread-like ends or branched arms that leave their spheroid in isolation.
Der Zyklus dauert 6 bis 10 Tage und kann sich während mehrerer Monate im geeigneten Milieu erneuern. Zu Beginn sind die Phasen ziemlich synchronisiert; mit Alterung der Kulturen tritt eine funktioneile Ordnungsstörung auf, und die (einzelnen) Phasen finden sich gleichzeitig mit den L3A-Varianten wieder, die eine Vorliebe für Pseudomycclformen zu haben scheinen (Entwicklungspausc im latenten Zustand). The cycle lasts 6 to 10 days and can last for several months in a suitable environment renew. At the beginning the phases are fairly synchronized; with aging of the cultures occurs functional disorder, and the (individual) phases are found at the same time as the L3A variants again, who seem to have a predilection for pseudomyclin forms (development pause in the latent state).
Für das Studium der Zyklen oder den Nachweis der pathogcncn Fähigkeit der Varianten müssen die Übertragungen während der spharoidalcn Phase im nahezu reinen Zustand derselben vorgenommen werden. Auf Grund dieser Beobachtung kann die von den verschiedenen Autoren erzeugte Verwirrung verstanden werden, die die L-r-ormcn untersucht und die Verarmung der Kulturen der Varianten im Verlauf von Übertragungen festgestellt haben,For the study of the cycles or the proof of the pathogenic ability of the variants the Transfers during the spheroidal phase in the almost pure state of the same can be made. Based on this observation, the confusion generated by the various authors who studied the L-r ormcn and the Have observed the impoverishment of the cultures of the variants in the course of transfers,
Es wurde festgestellt, daß die erhaltenen Varinnton einen F.ntwicklungs/.yklus mit mehreren Phasen besitzen und einen Organisationstyp, der nicht mehr derjenige der Bakterie ist, von der sie sich ableiten. It has been found that the varntons obtained have a development cycle with several phases and a type of organization which is no longer that of the bacteria from which they are derived.
Wahrend eines Zyklus durchlaufen sie vier gut individualisierte Perioden, die man jedoch nicht als die einzig möglichen dieses komplexen Prozesses betrachten kann; diese Perioden folgen aufeinander gemäß einer gut bestimmten Ordnung: During a cycle, they go through four well- individualized periods, which, however, cannot be regarded as the only possible ones in this complex process; these periods follow one another according to a well-determined order:
SphQroidalc Phase (P I g. 4 bis 7): Die Elemente sind isoliert, von schleimigem Aussehen und ganz allgemein in Anhäufungen mit anderen verbunden; zunächst nimmt das Volumen der Spharolde (0,5 bis 2 μ) zu, dann bilden sie cytoplasmlschc Auswüchse, die Chromatin· korpuskcln einschließen, welche I, 2 oder mehrere kurze und dünne Fäden aussenden, deren Enden frei oder nach einer Art Sprossung Träger von neuen kugeligen oder ovalen Teilchen sind; die Füden bleiben um zentralen SpliUrold haften oder lösen sich davon.SphQroidalc phase (P I g. 4 to 7): The elements are isolated, slimy in appearance, and generally associated with others in clusters; next if the volume of the spherules (0.5 to 2 μ) increases, then they form cytoplasmic outgrowths which enclose chromatin corpuscles which contain 1, 2 or more send out short and thin threads, the ends of which are free or after a kind of sprouting bearer of new ones are spherical or oval particles; the threads stick to the central splint or loosen from it.
Mycclphusc (F I g. 8 bis 10): Von regulären Sphttrolditggregaten gehen Fttden aus, die sich zu Ketten von mehreren 10 μ Lunge verlängern und sich unter Bildung eines wirklichen Myccls verflechten oder verzweigen.Mycclphusc (Fig. 8 to 10): From regular sphttroldite aggregates go out, which form chains of several 10 μ lungs elongate and form intertwine or branch out of a real myccl.
Granulöse Phase (Fig. II, It bis, 12, 12 bis): Die Füden und primitiven sphüroidcn Formen verwischen sich, während sich die Einschlüsse aufteilen, aber durch eine dünne Schicht von viskosem Sekret miteinander verbunden bleiben, was der Kultur das Aussehen von Kokkenketten oder irregulären Gruppen von diversen Mikrokokkcn gibt. Granular phase (Fig. II, It bis, 12, 12 bis): The threads and primitive spheroidal forms blur , while the inclusions split up, but remain connected to one another by a thin layer of viscous secretion, which gives the culture the appearance of chains of cocci or irregular groups of diverse micrococci.
Desintegrationsphase (Fig. 13): Die Elemente degenerieren, die Granulationsketten brechen auf, die Partikeln verstreuen sich in das extrazelluläre Milieu; unter den realisierten Vcrsuchsbcdingungcn sind dieseDisintegration phase (Fig. 13): the elements degenerate, the granulation chains break open, the particles scatter into the extracellular milieu; These are some of the conditions of search that have been implemented
ίο Teilchen nicht lebensfähig.ίο Particle not viable.
Zwischen der dritten und der vierten Phase werden die primitiven Bakterien auf ihre einfachste Ausdrucksform reduziert; Ein Chromatinteilchcn, umgeben von einer sehr verformbaren fluiden Substanz.Between the third and fourth phases, the primitive bacteria are reduced to their simplest form of expression; A chromatin particle surrounded by a very malleable fluid substance.
Man kann daraus schließen, daß die erhaltenen • L-Varianten nicht nur überleben, sondern sich mit einer ihnen eigenen Fortpflanzungsweisc fortpflanzen, und zwar analog zu derjenigen, die bei Mycoplasmen beobachtet wird. Man findet hier die gleiche Möglich- keil zur Bildung von Fäden während der Mycelphase wieder und die gleiche Tendenz zum parasitären Leben während der sphäroidalen Phase; die Sphäroide sind die »Ruhe«-Formen(mykrocytische Keime),die in der Lage sind, über sehr lange Zeiten in Ruhe zu bleiben, zu überleben und unter schlechten Bedingungen zu überdauern.One can conclude from this that the L-variants obtained not only survive, but reproduce with their own specific mode of reproduction, analogous to that observed in mycoplasmas. One can find the same possibility wedge to form filaments during Mycelphase again and the same tendency to parasitic life during the spheroidal phase; The spheroids are the "resting" forms (mycrocytic germs) that are able to remain in peace for very long periods of time, to survive and to survive under poor conditions.
Ein Zyklus dauert etwa 10 Tage; er umfaßt im zcllfreien Milieu zwei Phasen des Gedeihens, eine Phase der Dekadenz und eine Degenerationsphasc, wobei die während der granulösen Phase freigesetzten sphäroiden Elemente einen identischen Zyklus reproduzieren.One cycle lasts about 10 days; In the cell-free milieu it comprises two phases of prosperity, one phase of decadence and a degeneration phase, with the spheroids released during the granular phase Elements reproduce an identical cycle.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen L-Variantcn sind lebensfähig, können sich in einem gut definierten Entwicklungszyklus fortpflanzen, und esThe L variants obtained by the process according to the invention are viable and can be combined in one well-defined development cycle, and propagate it
ergibt sich das Problem ihres Überlebens im Organismus und ihre pathogene Rolle:there arises the problem of their survival in the organism and their pathogenic role:
Die erhaltenen L-Varianten rufen bei der Zelle einen cytopathogenen und cytotoxischen Effekt hervor.
Zur Stützung dieser Annahme wurden die gemäß der Erfindung erhaltenen Varianten von Proteus rettgeri
entnommen und auf Vaginalzellcn geimpft, die mit einem Ayrc-Spatcl durch Schaben im Niveau des
hinteren Drittels des Scheidengewölbes nach Desinfektion gesammelt wurden, Die in Hanks-Flüssigkcit inThe L variants obtained produce a cytopathogenic and cytotoxic effect on the cell.
To support this assumption, the variants of Proteus rettgeri obtained according to the invention were removed and inoculated on vaginal cells which were collected with an Ayrc spatula by scraping at the level of the posterior third of the vaginal vault after disinfection, which were dissolved in Hanks liquid in
«ts Suspension gebrachten Zellen wurden geimpft mit einer reinen Kultur von L-Variantcn, die nach oben beschriebenen Verfahren erhalten worden waren, und zwar während der Sphüroidal-Phase (ungestielte Sphttroidc) und in einer Menge von etwa 0,1 ml pro I bis 2 ml Cells brought into suspension were inoculated with a pure culture of L-Variants, which had been obtained by the method described above, during the spheroidal phase (sessile Sphttroidc) and in an amount of about 0.1 ml per 1 to 2 ml
Die Verwendung einer direkten Entnahme wurde bevorzugt, da man mögliche Interpretationsirrtümer bei Verwendung von Präparaten des Pasteur-lnstituts vermeiden wollte, denen 100 Einheiten Penicillin pro mlThe use of direct sampling was preferred, as there could be errors of interpretation I wanted to avoid the use of preparations from the Pasteur Institute, which had 100 units of penicillin per ml
SS und 123 mg Thalliumacetat pro 1 1 Milieu beigegeben sind.SS and 123 mg thallium acetate added per 1 liter of medium are.
Bei den Zellen wurde nach einer Zeit von 2 bis 6 Tagen eine cytoloxische Wirkung beobachtet. Die gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varianten sind imA cytoloxic effect was observed on the cells after a period of 2 to 6 days. the L variants obtained according to the invention are in
Cytoplasmabercich der Zelle lokalisiert, und zwar nahe dem Kern und in ovoidcn Granulationen, ring- oder kreuzförmigen Körpern oder sphäroiden Elementen, die Arten von Einschlüssen bilden; sie werden umgeben von einer feinen Haut, welche sie deutlich zumCytoplasm located near the cell the nucleus and in ovoid granulations, ring- or cruciform bodies or spheroidal elements, the types of inclusions form; they are surrounded by a fine skin, which they are clearly visible to
(>S Cytoplasma (der befallenen Zelle) abgrenzt; die Kerne werden in dieser Zeitspanne wenig berührt (s. F i g. 4).(> S cytoplasm (the affected cell) delimits; the nuclei are little touched in this period of time (see Fig. 4).
Eine Vcrglcichsentnuhme, die nicht mit stabilen L-Varianten geimpft worden war, zeigte keine Degene-A comparison that is not stable with L variants had been vaccinated, showed no degeneration
rationserscheinungen und keine toxischen Wirkungen. Die durchgeführte Untersuchung wäre nicht verläßlich, wenn diese Vergleichszellen in der gleichen Zeit ebenfalls anomale Degenerationen zeigen würden.ration symptoms and no toxic effects. The investigation carried out would not be reliable if these comparison cells also showed abnormal degeneration at the same time.
Andere Versuche wurden unter Verwendung von Nierenepithelzellen vom Affen durchgeführt. Die erfindungsgemäß erhaltenen L-Varianten wurden wie im vorangehenden Fall direkt in das Milieu eingeimpft in einer Menge von 0,1 ml pro 1 ml Suspension, wobei die L-Varianten sich in der sphäroidalen Phase, in aktiver Multiplikationsperiode, befanden.Other experiments were carried out using monkey kidney epithelial cells. the L variants obtained according to the invention were inoculated directly into the medium as in the previous case in an amount of 0.1 ml per 1 ml suspension, the L variants being in the spheroidal phase, in active multiplication period.
Bei den Nierenzellen zeigte sich die Infektion ziemlich rasch, im allgemeinen 3 bis 4 Tage nach Impfung. Bei den zum Vergleich beobachteten nicht geimpften Nierenzellen wurde nichts beobachtet; bei den mit stabilen Varianten geimpften Zellen war es dagegen möglich, die verschiedenen Phasen des Entwicklungszyfdus: Fäden, Körnchen und Sphäroide (s. F i g. 15 und 16) in den Zellen wiederzufinden.In the kidney cells, the infection manifested itself fairly rapidly, generally 3 to 4 days after Vaccination. Nothing was observed in the unvaccinated kidney cells observed for comparison; at the cells vaccinated with stable variants, on the other hand, were able to show the different phases of the Developmental cycle: threads, granules and spheroids (see Figs. 15 and 16) to be found in the cells.
Bei beiden Zelltypen wurde für die Sichibarmachung der stabilen Varianten die Anfärbung nach Shorr (hinterlegte Zusammensetzung des Färbemittels nach Gurr) angewandt. Bei den Nierenzellen gibt heiße May-Grunwald-Giemsalösung nach Fixierung mit Methylalkohol gute Ergebnisse.For both cell types, Sichibarmachung of the stable variants the coloring according to Shorr (deposited composition of the coloring agent according to Gurr) applied. The kidney cells are hot May-Grunwald-Giemsa solution after fixation with methyl alcohol good results.
Die Vermehrung der mycoplasmaähnlichen L-Varianten hängt von der Zelle ab; in der Tat können mehrere Fälle auftreten:The multiplication of the mycoplasma-like L variants depends on the cell; in fact can several cases occur:
1. Die Zelle ist gegenüber der eingeimpften Variante unempfindlich: Sie verdaut die fremden Proteine, die sie unter Synthese der arteigenen Proteine assimiliert. Die Zelle überlebt und man findet die - in den Stoffwechsel einbezogenen — den Keim aufbauenden Elemente abhängig von ihrer chemischen Natur in den die Zelle aufbauenden Elementen wieder. In diesem Stadium sind die Versuche, die Varianten durch Einimpfen des integrierten Materials in andere Zellen nachzuweisen, negativ: Dieses ist die Grundlage der Immunität.1. The cell is insensitive to the inoculated variant: it digests the foreign proteins that it contains assimilated with synthesis of the native proteins. The cell survives and you find that - in the metabolism included - the germ-building elements depending on their chemical nature in the cell building elements again. At this stage, attempts to eliminate the variants by inoculating the integrated material in other cells to prove negative: This is the basis of immunity.
2. Die Zelle läßt sich nicht einnehmen, aber sie ist unfähig, alle anwesenden Elemente in ihren Stoffwechsei einzubeziehen: Dieses ist der Fall der nicht in Erscheinung tretenden Infektion (Träger von Keimen); diese Infektion zeigt sich nicht in einer Veränderung der Morphologie der Zellkultur, sondern durch eine funktionell metabolische oder biochemische Störung, die mit dem Überleben der Zelle und demjenigen der stabilen Varianten vereinbar ist (s. F i g. 15 und 16).2. The cell cannot be taken, but it is incapable of using all the elements present in its metabolism to be included: This is the case of the infection that does not appear (carrier of germs); this infection is not shown by a change in the morphology of the cell culture, but by a functionally metabolic or biochemical disorder associated with the survival of the cell and that of the stable variants is compatible (see Figs. 15 and 16).
Diese latente Infektion kann auf die Nachkommenden übertragen werden. Die L-Varianten besitzen ADN und ARN; diese Nukleinsäuren können dem genetisehen Potential der Zelle im Verlauf einer Teilung eingebaut werden und integrierender Teil der Chromosomen werden.This latent infection can be passed on to the descendants. The L variants have ADN and ARN; These nucleic acids can increase the genetic potential of the cell in the course of division be incorporated and become an integral part of the chromosomes.
Ohne induzierenden Schock pflanzt sich die Zelle normal fort. Findet ein Schock statt, treten die erhaltenen Varianten ohne Vorbereitung oder Inkubation spontan wieder in Erscheinung. Die vom Parasiten befallene Zelle kann erneut eine Resistenz entgegensetzen. Without an inducing shock, the cell reproduces normally. If there is a shock, they kick Variants obtained spontaneously reappear without preparation or incubation. The one from the parasite the infected cell can again offer resistance.
3. Die Zelle zeigt keine Resistenz: Die L-Bakterienvarianten drücken ihren Stempel der Zelle auf, die während ihrer Überlebensperiode Nukleoproteide vom Typ der L-Variante produziert. Die Zelle stirbt durch Verschwinden der normalen Strukturen. Es findet eine Zelldegeneration statt (s. F i g. 14).3. The cell shows no resistance: The L-bacterial variants put their stamp on the cell, the produced nucleoproteins of the L variant type during their survival period. The cell dies through Disappearance of normal structures. Cell degeneration takes place (see FIG. 14).
In dieser F i g. 14 sieht man bei 1 eine Anhäufung von Varianten (Mycelphase) und bei 2 den praktisch des Cvtonlasmas beraubten Kern der Zelle.In this fig. 14 you can see at 1 an accumulation of Variants (mycelial phase) and in 2 the nucleus of the cell practically deprived of the Cvtonlasmas.
Wirtzelle und vergiftende Mikroorganismen sind die eine wie die anderen - ausgestattet mit einer genetischen Kontinuität; vom Augenblick an, in dem sich einer von beiden auf Kosten des anderen vermehrt oder sobald einer dem anderen ergänzendes Strukturmaterial leiht, das für den Aufbau von dessen Nukleoproteidmaterial erforderlich ist, findet der Konflikt Wirtzelle-L-Variante seine Verlängerung in der genetischen Kontinuität desjenigen, der überlebt. Host cell and poisoning microorganisms are one like the other - equipped with one genetic continuity; from the moment one of them multiplies at the other's expense or as soon as one lends the other additional structural material necessary for the construction of his If nucleoprotein material is required, the host cell L variant conflict finds its extension in the genetic continuity of whoever survives.
Die pathogene Rolle der mycoplasmaähnlichen L-Varianten wurde auch durch den Versuch einer Bestimmung ihres möglichen pathogenen Wirken·, studiert.The pathogenic role of the mycoplasma-like L variants was also investigated by an Determination of their possible pathogenic effects ·, studied.
In der Tat konnte die Rolle bei isolierten Keimen eines menschlichen Organismus beider Genese einer Läsion bestätigt werden, indem ihre biologischen Merkmale mit den klinischen Gegebenheiten und den Umständen der Isolierung konfrontiert wurden:In fact, the role in isolated germs of a human organism could both genesis one Lesion can be confirmed by comparing its biological characteristics with the clinical circumstances and the Circumstances of isolation were faced:
Es ist die Isolierung eines Mycoplasmas in mehreren Entnahmen beim gleichen Kranken bei pathologischen Produkten gleichen Ursprungs, es ist vor allem die Anwesenheit dieser Mycoplasmen in den Exairesestiikken, wodurch die pathogene Eigenschaft von Mycoplasmen erkannt werden konnte.It is the isolation of a mycoplasma in several samples from the same patient in the case of pathological ones Products of the same origin, it is mainly the presence of these mycoplasmas in the exairesestiikken, whereby the pathogenic property of mycoplasmas could be recognized.
Man befindet sich nun in Gegenwart von virulenten Formen, die »atypische« Krankheiten hervorrufen, wobei der Keim nicht mehr die normale Morphologie der Bakterie hat und schwierig nachzuweisen ist; andererseits widersteht dieser Keim den üblichen therapeutischen Mitteln, insbesondere gewissen antibiotischen Mitteln, deren Rolle es ist, auf die Bakterienwand hemmend zu wirken, ohne die Lebensfähigkeit des Keims zu verhindern.One is now in the presence of virulent forms that cause "atypical" diseases, the germ no longer has the normal morphology of the bacterium and is difficult to detect; on the other hand, this germ resists the usual therapeutic agents, especially certain antibiotic ones Agents whose role is to have an inhibitory effect on the bacterial wall without affecting the viability of the Prevent germ.
Die Mycoplasmen werden nicht mehr als einfaches Saprophyten betrachtet, sondern als pathogene Agentien, deren in der Humanpathologie beobachtete klinische Manifestationen zusammengefaßt werden können unter der allgemeinen Bezeichnung »Mycoplasmosen«. The mycoplasmas are no longer regarded as simple saprophytes, but as pathogenic agents, whose clinical manifestations observed in human pathology are summarized can under the general name »mycoplasmoses«.
Außer diesen morphologischen und cytologischen Eigenschaften haben Kulturmerkmale, das Aussehen der Kulturen und das Studium der Empfindlichkeit gegenüber antibiotischen Mitteln sowie die Fortschritte hinsichtlich der serologischen Identifizierungsmethoden es ermöglicht, die antigene Struktur einer gewissen Anzahl von isolierten Mycoplasmenstämmen von Entnahmen humanen Ursprungs, wie Bronchialaspiration, Pleuralflüssigkeit, Ganglionen, Serosites, Exairesestücke und Mark zu erkennen.In addition to these morphological and cytological properties, cultural characteristics have appearance of cultures and the study of susceptibility to antibiotic agents as well as advances in terms of serological identification methods it allows to determine the antigenic structure of a certain Number of isolated mycoplasma strains from samples of human origin, such as bronchial aspiration, Detect pleural fluid, ganglions, serosites, exairesis pieces and marrow.
Das Phänomen der Neutralisation von Antigenen bildet, da es sowohl bei Mycoplasmen als auch bei den gemäß der Erfindung erhaltenen L-Varianten auftritt, einen Annäherungspunkt. In identischer Weise kann jede Gattung von Varianten serologisch durch ein »Mosaik« von Antigenen definiert werden.The phenomenon of neutralization of antigens forms, as it occurs both in mycoplasma and in the L variants obtained according to the invention occurs, an approach point. In an identical way can each genus of variants can be serologically defined by a »mosaic« of antigens.
Agglutiriationstests und Komplementfixierung beweisen, daß in diesem Bereich keine vollständige Identität zwischen den erhaltenen stabilen L-Varianten und den Bakterien, von denen sie sich ableiten, besteht.Agglutination tests and complement fixation prove that in this area there is no complete identity between the stable L variants obtained and the Bacteria from which they are derived exists.
Es ist klar, daß die durch das Verfahren erhaltenen L-Varianten nicht das der Zellwand der Bakterie eigene antigene Rüstzeug haben können, insbesondere nicht das Flagcllatenantigen H. Dagegen kann man im Mosaik der Antigene der mycoplasmaähnlichen L-Varianten die Antigene des Zellkörpers, der Membran und der Protoplasmabcstandteile der Ursprungsbaktcricn wiederfinden.It is clear that the L variants obtained by the method are not inherent in the bacterial cell wall antigenic armaments, in particular not the flag cell antigen H. On the other hand, one can in the Mosaic of the antigens of the mycoplasma-like L variants, the antigens of the cell body, the membrane and the protoplasmic constituents of the original bacteria.
Es ist so, daß parallel serologische Untersuchungen durch Inhibition des Wachstums und Komplementfixierungstests durchgeführt werden können, und zwar durch Untersuchung der Antikörper in dünner Schicht nach der Methode von Ouchterlony und fluoreszierenden Antikörpern, um die Anwesenheit der gleichen serologischen Gruppen in den Mycoplasmen und den erhaltenen L-Varianten festzustellen, die sich von Bakterien ableiten, von denen sie nach den durch das klinische Bild gegebenen Informationen Mutanten sein könnten.It is so that parallel serological examinations by inhibition of growth and complement fixation tests can be carried out by examining the antibodies in a thin layer according to the method of Ouchterlony and fluorescent antibodies to determine the presence of the same detect serological groups in the mycoplasmas and the preserved L variants that differ from Inferring bacteria of which, according to the information given by the clinical picture, they will be mutants could.
Das oben angegebene, für einen bestimmten Bacillus spezifische Beispiel wurde für weitere Bakterien reproduziert, und man konnte so, ausgehend von diversen Bakterien, zu den mycoplasmaähnlichen stabilen Varianten in genügend großer Menge gelangen; diesen Bakterienvarianten kommt eine bedeutende Rolle bei Infektionen, und zwar sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin zu.The example given above, specific to a particular Bacillus, was made for other bacteria reproduced, and one could, starting from various bacteria, to the mycoplasma-like stable variants arrive in sufficiently large quantities; these bacterial variants have an important one Role in infections, both in human and veterinary medicine.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, ausgehend von Bakterien sehr unterschiedlichen Typs, konnte man zu mycoplasmaähnlichen L-Varianten gelangen, die mit diversen Mycoplasmen vergleichbar sind, deren infektiöse Rolle man von atypischen Krankheiten und der Antigenspezifität her kennt.When carrying out the method according to the invention, starting from very different bacteria Type, one could get to mycoplasma-like L-variants, those with various mycoplasmas are comparable, the infectious role of which is derived from atypical diseases and antigen specificity knows.
Jeder Stamm bildet eine diskrete serologische Gruppe, die durch ein Mosaik von spezifischen Antigenen gebildet wird. Es ist dadurch möglich, die serologischen Relationen zwischen den L3A-Bakterienvarianten und den isolierten Mycoplasmen festzulegen. Each strain forms a discrete serological group represented by a mosaic of specific Antigens is formed. It is thereby possible to determine the serological relationships between the L3A bacterial variants and to determine the isolated mycoplasmas.
So gelangt man, wenn man das Verfahren auf Mikrokokken anwendet, zu denen die Streptokokken A und D sowie die Staphylokokken gehören und auf Enterobakterien (Klebsieila, Proteus, Salmonella, Shigella) zu L-Bakterienvarianten, analog den bereits bekannten Mycoplasmen: Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma T.This is how you get when you apply the method to micrococci, to which the streptococci A and D as well as the staphylococci belong and to enterobacteria (Klebsieila, Proteus, Salmonella, Shigella) to L-bacterial variants, analogous to the already known Mycoplasmas: Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma T.
Insbesondere erhält man, ausgehend von einem hämolytischen Streptokokkus, eine stabile L-Variante, die vollständig dem Negroni-Agens gleicht, das aus leukämischem Mark isoliert wurde und das man dem Mycoplasma hominis Typ 2 zugeordnet hat.In particular, starting from a hemolytic streptococcus, a stable L variant is obtained, which is completely similar to the Negroni agent isolated from leukemic marrow and known as the Mycoplasma hominis type 2.
Es folgen als Beispiele einige Fälle der Anwendung von erfindungsgemäß erhaltenen mycoplasmaähnlichen L-Varianten.Some cases of using mycoplasma-like obtained according to the invention are given as examples L variants.
Es wurden reine Stämme von Bakterienvarianten erhalten, die pathogene Eigenschaften haben und Antigenextrakte frei von Zellen.Pure strains of bacterial variants which have pathogenic properties and were obtained Antigen extracts free of cells.
Die antigene Realität der nach dem Fabrikationsverfahren erhaltenen Varianten wurde mit Hilfe eines Serums aufgezeigt, das durch Injektion dieser Varianten beim Kaninchen erhalten wurde. Zu diesem Zweck wurde, ausgehend von stabilen L-Varianten des Proteus, ein zellfreier Antigenextrakt hergestellt.The antigenic reality of the variants obtained after the manufacturing process was determined with the help of a Serum shown which was obtained by injection of these variants in the rabbit. To this end a cell-free antigen extract was produced based on stable L variants of Proteus.
Die Extraktion der antigenen Prinzipien erfolgte durch Einwirkenlassen einer wäßrigen Lösung von 1/2-normaler Trichloressigsäure auf eine Suspension von vorangehend gewaschenen Keimen bei einem pH-Wert von 1 bis 2 und einer Temperatur von 0°C. Der Antigenextrakt liegt vor in Form einer keinesfalls dialysierbaren opaleszierenden Lösung. Getrocknet ist er thermostabil, in wäßrigem Milieu dagegen thermolabil. The antigenic principles were extracted by exposure to an aqueous solution of 1/2 normal trichloroacetic acid on a suspension of previously washed germs in a pH value from 1 to 2 and a temperature of 0 ° C. The antigen extract is by no means present in the form of a dialyzable opalescent solution. When dried it is thermally stable, but in an aqueous medium it is thermally unstable.
Injiziert beim Tier führt er zum Auftreten von sne/ifischen Antikörpern; so werden seine starken Verdünnungen durch ein entsprechendes antigenes Antiserum spezifisch gefällt. Schließlich verhält er sich wie ein aktives Endotoxin; injiziert beim Tier löst der das Auftreten von Antitoxin aus.Injected into the animal it leads to the appearance of sensitive antibodies; so its strong Specifically precipitated dilutions with an appropriate antigenic antiserum. Finally he behaves like an active endotoxin; injected in the animal triggers the appearance of antitoxin.
Diese isolierte säurelösliche antigene Komponente L3A erscheint stark polydispers in wäßriger Lösung.This isolated acid-soluble antigenic component L3A appears highly polydisperse in aqueous solution.
Sehr löslich in Wasser spaltet sie sich unter der Wirkung von Wärme oder einer Diastase; die Polysaccharidfraktion löst sich vom Rest des antigenenVery soluble in water, it splits under the action of heat or diastasis; the Polysaccharide fraction separates from the rest of the antigenic
ίο Komplexes und sprengt so eine Bindung, die weniger stark ist als diejenige, welche die Antigene d^s Bakterienkörpers gefangenhält.ίο Complex and so breaks a bond, the less is stronger than that which the antigens d ^ s Bacterial body held captive.
Man kann so die Bestandteile des Antigenextraktes der L-Varianten des Proteus isolieren: ein spezifisches Polysaccharid der erhaltenen L-Varianten, das für die charakteristischen serologischen Reaktionen des Stammes verantwortlich ist. Dieses freigesetzte Polysaccharid kann durch Zugabe mehrerer Volumen Alkohol oder Aceton gefällt werden.In this way, one can isolate the components of the antigen extract of the L variants of Proteus: a specific one Polysaccharide of the obtained L variants, which is responsible for the characteristic serological reactions of the strain responsible for. This released polysaccharide can by adding several volumes of alcohol or Acetone can be precipitated.
Das Polysaccharid gibt dem proteischen antigenen Element seine Spezifität und ist für die charakteristischen serologischen Reaktionen des Stammes verantwortlich. The polysaccharide gives the protean antigenic Element is its specificity and is responsible for the characteristic serological responses of the strain.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen stabilen L-Varianten wurden für die Herstellung von Reagenzien für die Serodiagnostik und die Identifizierung von infektiösen Agentien von atypischen Krankheiten verwendet. Diese serologischen Reagenzien ermöglichen die Untersuchung einer spezifischen Behandlung (Empfindlichkeit gegen Antibiotika oder andere therapeutische Mittel).The stable L variants obtained by the process according to the invention were used for production of reagents for serodiagnostics and the identification of infectious agents of atypical Diseases used. These serological reagents allow the investigation of a specific Treatment (sensitivity to antibiotics or other therapeutic agents).
Sie haben auch ein gewisses Interesse für die Untersuchung der Ätiologie der isolierten Mycoplasmen in der infektiösen Pathologie.They also have some interest in studying the etiology of the isolated mycoplasmas in infectious pathology.
Es ist klar, daß das Antigenmosaik, so wie es in der Zelle der intakten stabilen L-Varianten existiert, andere Substanzen enthält als die Phospholipoid-, Polysaccharid- und Proteinbestandteile, aber man kann annehmen, daß allein die Polysaccharid- und proteischen Bestandteile für die Antigenmanifestation wesentlich sind.It is clear that the antigen mosaic as it exists in the cell of the intact stable L-variants is different Contains substances as the phospholipoid, polysaccharide and protein components, but it can be assumed that only the polysaccharide and protean components are essential for the antigen manifestation are.
Ein anderes Beispiel für die Anwendung besteht in der Präparation von Impfstoffen mit Hilfe von Kulturen der mycoplasmaähnlichen L-Varianten (vernünftig abgeschwächte Kulturen).Another example of its application is in the preparation of vaccines using cultures of the mycoplasma-like L variants (reasonably attenuated cultures).
Man erhält Keime der L-Varianten, die keine Virulenz besitzen, aber eine Immunisierungswirkung, und zwar durch: Zentrifugieren der Kultur, Suspendieren des Bodensatzes vom Zentrifugieren, Waschen mit wäßriger physiologischer Lösung und Aufheizen über 30 Minuten auf 40 bis 5O0C. Die aseptisch gemachte Suspension der L3A-Varianten wird auf eine bestimmte Konzentration verdünnt. Man verwendet Dosen von 0,1 ml der auf Konzentrationen von 10~5 bis 10~6 verdünnten infektiösen Suspension. Man filtriert mit Hilfe von Membranen mit einem Porendurchmesser zwischen 100 und 150 ιτιμ.Obtained seeds of L-variants which have no virulence, but an immunization effect, by centrifuging the culture, suspending the sediment by centrifugation, washing with an aqueous physiological solution and heating for 30 minutes at 40 to 5O 0 C. The aseptically made suspension of the L3A variants is diluted to a certain concentration. Using doses of 0.1 ml of the at concentrations of 10 -5 to 10 -6 diluted infectious suspension. It is filtered using membranes with a pore diameter between 100 and 150 ιτιμ.
Man kann auch inaktivierte Keime verwenden, indem man den Stamm mit Äther oder Chloroform schwächt oder durch Formaldehydbehandlung und Aufheizen auf 560C über eine halbe Stunde.Inactivated germs can also be used by weakening the strain with ether or chloroform or by treating with formaldehyde and heating it to 56 ° C. for half an hour.
Wegen der Anwendung eines künstlichen Kulturmilieus sind das Verfahren und die Möglichkeit der Gewinnung von mycoplasmaähnlichen Formen, ausgchend von Bakterien, für verschiedene Anwendungen von reeller Bedeutung.Because of the use of an artificial culture environment, the process and the possibility of Production of mycoplasma-like forms, mainly from bacteria, for various applications of real importance.
Die Figuren sind Reproduktionen von Fotografien, deren Vergrößerung nachfolgend angegeben wird:The figures are reproductions of photographs, the enlargement of which is given below:
Fig. 1 zeigt keiner Plasmolyse unterworfene Zellen von Proteus rettgeri.Fig. 1 shows cells of Proteus rettgeri not subjected to plasmolysis.
F i g. 2 zeigt das pleomorphe Aussehen von Varianten des Proteus rettgeri bei gleicher Vergrößerung wie in Fig. 1.F i g. FIG. 2 shows the pleomorphic appearance of variants of the Proteus rettgeri at the same magnification as in FIG Fig. 1.
Die Fig.3 bis 13 wurden vom Entwicklungszyklus vergrößert isolierte Elemente der in Fig.3 gezeigtenFigures 3 through 13 were from the development cycle enlarged isolated elements of those shown in Fig.3
Anhäufung.
In der Phase des sphäroidalen Stadiums B (F ι g. 5 bisAccumulation.
In the phase of the spheroidal stage B (FIGS. 5 to
7) beobachtet man die Bildung von cytoplasmischen Auswüchsen, welche die Chromatinkorpuskeln umgeben, die Fäden aussenden, welche frei sind oder Träger7) one observes the formation of cytoplasmic outgrowths which surround the chromatin corpuscles, send out the threads which are free or carriers
neuer «plhäroidaler Teilchen.
Die Mycelphase wird vom 3. bis 6. auf die Impfungnew «plheroidal particles.
The mycelial phase is from 3rd to 6th on vaccination
folgenden Tag beobachtet. F i g. 8 zeigt Mycelelemente ίο in Anhäufung; Fig.9 zeigt ein isoliertes Element,observed the following day. F i g. 8 shows mycelial elements ίο in accumulation; Fig. 9 shows an isolated element,
F i g. 10 den Übergang der Mycelphase in die granulöseF i g. 10 the transition from the mycelial phase to the granular one
Phase.
Die Fig. 11 und 12 zeigen Fäden zu Beginn derPhase.
11 and 12 show threads at the beginning of the
granulösen Phase (6. oder 7. Tag nach Impfung). Die Fäden sowie auch die primitiven sphäroiden Formengranular phase (6th or 7th day after vaccination). The threads as well as the primitive spheroid forms
verwischen sich, die Einschlüsse zerteilen sich, bleibenblur, the inclusions split up, remain
aber verbunden durch eine dünne Schicht von viskosem Sekret (s. Fig. 1! bis und 12 bis). Fig. 13 zeigt den
Beginn der Zerfallsphase.
F i g. 14 bis 16 zeigen Fälle von durch Varianten desbut connected by a thin layer of viscous secretion (see Fig. 1! bis and 12 bis). 13 shows the beginning of the disintegration phase.
F i g. 14 to 16 show cases of by variants of the
Proteus rettgeri infizierten Zellen (F i g. 14 bis 16).
Die F i g. 14 zeigt eine Nierenepithelzelle vom Affen:Proteus rettgeri infected cells (Figs. 14-16).
The F i g. 14 shows a monkey kidney epithelial cell:
Bei 1 beobachtet man eine Anhäufung von sphäroiden Formen der Varianten, bei 2 stellt man fest, daß der Kern der Zelle von einem Teil des Cytoplasmas befreit ist.At 1 one observes an accumulation of spheroid forms of the variants, at 2 one finds that the The nucleus of the cell has been freed from part of the cytoplasm.
F i g. 15 zeigt zwei epitheliale Zellen mit Kernen 3 und 6; man unterscheidet das sphäroide Element der Variante 4 und den Faden 5.F i g. 15 shows two epithelial cells with nuclei 3 and 6; a distinction is made between the spheroid element of the Variant 4 and the thread 5.
aufgenommen. In der Phase des sphäroidalen Stadiums 30 In Fig. 16 erkennt man die sphäroidalen Formen 7recorded. In the phase of the spheroidal stage 30 The spheroidal shapes 7 can be seen in FIG. 16
und 7', die durch einen Faden 9 verbunden sind; in der Zelle des Kerns 8 zeigt die Form 7 zwei weitere Fäden lOundll.and 7 'connected by a thread 9; in the cell of the core 8, the shape 7 shows two more threads lOundll.
A vereinigen sich die Varianten zu Anhäufungen in den ersten 12 bis 72 Stunden, die der Impfung gemäß den Bedingungen der Plasmolyse folgen; die Fig.4 zeigtA the variants combine to form clusters in the first 12 to 72 hours following vaccination according to the conditions of plasmolysis; 4 shows
Hierzu 9 Blatt ZeichnungenIn addition 9 sheets of drawings
Claims (2)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB05672/69A GB1298668A (en) | 1969-03-25 | 1969-03-25 | Process for obtaining and preserving stable bacterial variants |
| GB1567269 | 1969-03-25 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2014200A1 DE2014200A1 (en) | 1970-12-17 |
| DE2014200B2 DE2014200B2 (en) | 1976-12-23 |
| DE2014200C3 true DE2014200C3 (en) | 1977-08-11 |
Family
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