DE2843295C2 - - Google Patents

Description

Anwendung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabiler, avirulenter und hochimmunogener Bakterienmutanten für Lebendimpfstoffe, insbesonder für verschiedene Impfstämme gegen Salmonellose.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Eine unbedingte Voraussetzung für den Einsatz von Impfstoffen aus lebenden Bakterien ist die genetische Stabilität der für ihre Herstellung benutzten Mutanten, um epidemiologische und epizootiologische Risiken auszuschließen. Stabile Mutanten müssen gleichzeitig bestimmte Parameter zur Virulenz, Immunogenität, Kultivation und Tenazität erfüllen, um Impfstoffeigenschaften zu erreichen (SCHÖLL, GRÜNERT und LINDE, Zschr. f. d. ges. Hyg. 23, 678 (1977)).

Bei Mutanten mit nur einem einzigen attenuierenden Marker reduziert sich notwendigerweise die Forderung nach Stabilität auf eine unter nichtselektiven Praxisbedingungen nicht nachweisbare Reversion zum Wildstamm. Eine optimale Lösung des Problems Stabilität für die Belange der Impfstoffherstellung und des Einsatzes ist durch die Kopplung von zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern zu erreichen.

Für eine wissenschaftlich exakte Impfstammprüfung sind solche Mutantentypen besonders geeignet, wo die Art der attenuierenden Mutation bzw. Mutationen eine Einschätzung der Reversionshäufigkeit mit hochselektiven in vitro-Methoden zuläßt. Für die Überwachung von Impfstoffen gegen Zooantroponosen sind solche in vitro-Methoden geradezu zu fördern.

Beim Fehlen von in vitro-Methoden geben indirekte Verfahren über die Größenordnung der Stabilität einer bestimmten Mutation ungefähre Anhaltspunkte. Solche indirekt - z. B. über wiederholte Nährböden- und in vivo-Passagen - gewonnenen Schätzwerte : Reversionshäufigkeit ≲ 10^-x , täuschen jedoch evtl. eine zu hohe Stabilität vor, da bei Fehlen eines starken Selektionsdruckes einzelne Revertanten auf dem Populationsniveau eliminiert werden können. Diese Problematik in Abhängigkeit vom Mutantentyp und Anwendungsgebiet wird dadurch demonstriert, daß

• - einerseits Literaturhinweise existieren, wonach bei Attenuierung durch nur einen Marker (Reversionshäufigkeit ≲ 10^-7) keine absolute Sicherheit vor Impfkomplikationen besteht (COLLINS, J. Infect. Dis. 126, 69-76 (1972); SMITH, US-PS 33 64 117; SCHMIDT und KIEFER, Zbl. Bakt. Abt. I Orig. 227, 257-262 (1974)),
• - andererseits jedoch umfangreiche Feldversuche die Stabilität ausgewählter Einmarkerstämme (Reversionshäufigkeit zur Virulenz ≲ ^-8) bewiesen haben, wie z. B. mit Streptomycin-dependenten (Sm-d) Mutanten von Salmonella dublin bei Kälbern (MEYER und Mitarb., Arch. f. exp. Vet.-Med. 27, 301-320 (1973); 31, 71-93, 95-113, 277-288 (1977)) mit Sm-d Shigellen bei Kindern (DU PONT und Mitarb., J. Inf. Dis. 125, 5-11 sowie 12-16 (1972); MEL, Zschr. f. d. ges. Hyg. 19, 656-857 (1973); SERGEEV und Mitarb., Zschr. f. d. ges. Hyg. 19, 657-658 (1973), Sm-d Salmonelle typhi bei Erwachsenen (MEL, Zschr. f. d. ges. Hyg. 19, 656-657 (1973)) und Sm-d Enteritis-Coli bei Säuglingen (KÖDITZ und BÜRDEL; Zschr. f. d. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft.

Für die notwendige staatliche Prüfung von Impfstämmen stellt sich damit die Forderung, daß

• - bei Einmarker-Mutanten, deren Einsatz in endemisch/enzootisch durchsuchten Populationen vertretbar ist, die Reversionshäufigkeit des Attenuierungsmarkers mit direkten hochselektiven Labormethoden erfaßt werden kann und ≦ 10^-8 liegt,
• - bei Doppelmarker-Mutanten - als anzustrebende Optimallösung des Problems Stabilität und Sicherheit vor Impfkomplikationen - nach Möglichkeit einer der beiden attenuierenden Marker in seiner Reversionshäufigkeit zur Virulenz mittels direkten hochselektiven Labormethoden erfaßt werden kann und mit ≲ 10^-7 siehe unten) festgelegt werden sollte.

Als potentielle Salmonella-Impfstämme wurden beschrieben:

• - Mutanten mit vermehrungsbegrenzendem Marker, wie z. B.
  • . Streptomycin-dependente Stämme (REITMAN. J. Infect. Dis 117, 101-107 (1967); SHUSTER und Mitarb., Zh, Mikrobiol. (Moskau) 1970/1, 144-145),
  • . Temperatur-sensible Mutanten (FAHEY und COOPER, Infect, Immun. 1, 263-270 (1970); 2, 183-191 sowie 192-200 (1970)),
• welche in vivo ihre Vermehrung einstellen und deren Reversionshäufigkeit mit hochselektiven Labormethoden erfaßbar ist (LINDE und Mitarb., Zschr. f. d. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft; LICHODED und SHUSTER, Zschr. f. d. ges. Hyg. 22. (1976) 1. Beiheft). Nachteilig für diese Mutantentypen ist, daß infolge der fehlenden Vermehrung im Wirtsorganismus zur Erzeugung einer belastbaren Immunität mehrfache und hohe Impfstoffdosen notwendig sind.
• - Mutanten mit nichtvermehrungsbegrenzender Attenuierung, welche die Potenz zur Gewebepersistenz bzw. in vivo-Vermehrung unterhalb des klinischen Schwellenwertes besitzen, daher in der Regel bei einmaliger Immunisierung eine belastbare Immunität auslösen und deren Reversionshäufigkeit zur Virulenz in Abhängigkeit vom Mutantentyp entweder mit selektiven Labormethoden oder lediglich indirekt (siehe oben) erfaßt werden kann, wie z. B.
  • . Rauhform-Mutanten (SMITH, US-PS 33 64 117; MARTINKOVA und Mitarb., Immunprophylpraxis 1971/2, 12-17),
  • . avirulente S-Form-Stämme (SMITH, J. Hyg. (London), 54, 419-432 (1956)),
  • . Sekundär-Mutanten von Klonen mit defekter Galaktose-4-Epimerase (GERMANIER, DE-PS 21 69 626),
  • . avirulente Coli-Hybriden mit Salmonella typhimurium-O-Antigen von (SCHMIDT und KIEFER, Zbl. Bakt. Hyg. I Abt. Orig. A 227, 257-262 (1974)),
  • . Salmonella-Hybride aus avirulenter (Donor) und virulenter (Recipient) Samonella (KRISNAPILIAI und KARTHIGSASU, J. Bacter. 97, 1343-1351 (1969)),
  • . Auxotrophie-Phänotypen mit einer zur Attenuierung führenden (Mutagen-induzierten) Ko-Mutation in benachbarten Genen der Zellwandsynthese (BACON und Mitarb., Brit. J. exper. Pathol. 31, 714-724 (1950), 32, 85-96 (1951); GARBER, The American Naturalist XC, 183-194 (1956; LINDE und Mitarb., Acta microbiol, Acad. Sci. Hung. 21, 11-27 (1974)) und
  • . Mutanten mit defekter Glycerinkinase (RAVDONIKAS, Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1976/12, 29-32).

Nachteilig für die Mehrzahl obiger durch einen einzigen Marker attenuierten Mutantentypen ist, daß die genetische Stabilität nur über indirekte Parameter ermittelt werden kann, so daß für die Impfstoffprüfung und den Einsatz dieser Mutanten als Impfstoff ein gewisser Unsicherheitsfaktor besteht.

Dieser Nachteil ist bekanntermaßen durch den Einbau eines zweiten Markers zu beheben, welcher unabhängig vom ersten Marker eine Attenuierung bedingt: Suppressormutanten sind stabile Stämme mit zwei unabhängig voneinander attenuierdenden Merkmalen. Daher wurden aus Streptomycin-dependenten Salmonellan durch spontane Mutation entstandene Streptomycin-independente Suppressormutanten (LICHODED und SHUSTER, Z. f. d. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft; SHUSTER und Mitarb., Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1971/7, 29-23) sowie aus temperatursensiblen Salmonellan durch spontane Mutation entstandene temperaturresistente Suppressormutanten (LINDE und Mitarb., Z. f. d. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft) beschrieben.

Der Nachteil der Streptomycin-independenten Suppressormutanten besteht jedoch darin, daß diese Doppelmutanten

• a) sich von Wildstämmen nur durch aufwendige Transduktionsanalysen oder die umständliche Bestimmung der verlängerten Generationszeit abtrennen lassen,
• b) infolge offensichtlich nicht identischer Mutationen in den Genen von bestimmten Ribosomenproteinen in ein Spektrum von Klonen mit unterschiedlichen Virulenz- und Immunogenitätsverhalten zerfallen (BLATZ und KNOLL, Leipzig, Karl-Marx-Universität, Diss. (1974), 92. S.),
• c) am Mäusemodell in der Regel eine Immunogenität nur bei relativ hoher Restvirulenz aufweisen (BLATZ und KNOLL, siehe b).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Einführung bzw. Verwendung eines definierten genetischen Markers,

• - bei dem der Phänotyp mit der Attenuierung korreliert,
• - dessen Reversionshäufigkeit zur Virulenz mit direkten Labormethoden hochselektiv erfaßbar ist,
• - welcher sich zur Herstellung von stabilen nichtvermehrungsbegrenzt attenuierten Bakterienmutanten für gut verträglich Lebendimpfstoffe unter Berücksichtigung der großtechnischen Herstellung eignet,
• - bei dem der genetische Defekt eine zeitlich begrenzte Vermehrung im Nutztier bzw. spezifischen Wirt unterhalb des klinischen Schwellenwertes zuläßt, so daß bei Einmarker-Mutanten (siehe unten) durch eine einmalige bzw. bei Doppelmarker-Mutanten (siehe unten) durch eine in der Regel einmalige Impfung die zur Erzeugung einer belastbaren Immunität notwendige Antigenmenge im Wirtsgewebe sowie eine ausreichende aber begrenzte Antigenpersistenz als Voraussetzung für die Auslösung einer zellulären Immunität als Hauptfaktor des Schutzes vor zyklischen Infektionen (COLLINS, Bacteriol, Rev. 38, 371-402 (1974) erreicht wird.
• - der es erlaubt, die damit versehenen Impfstämme jederzeit mit minimalem Aufwand von endemisch/enzootisch oder epidemisch/epizootisch vorkommenden Wildstämmen sicher abzugrenzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß

• -Bakterienmutanten für nichtvermehrungsbegrenzte attenuierte Bakterienmutanten, geeignet für die Herstgellung von Lebendimpfstoffen, welche sich unter nichtselektiven Praxisbedingungen als stabil erweisen, dadurch zu erhalten sind, indem man von Wildstämmen Purin-abhängige Mutanten mit einer Reversionshäufigkeit ≦ 10^-8 als Einmarker-Stämme isoliert.
• - stabile, nichtvermehrungsbegrenzte attenuierte Bakterienmutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern, geeignet für die Herstellung von Lebendimpfstoffen, dadurch zu erhalten sind, indem man die Purin-Abhängigkeit als nichtvermehrungsbegrenzenden Zweitmarker in eine aus anderen Ursachen nicht vermehrungsbegrenzt attenuierte hochimmunogene Einmarker-Mutante einbaut. Da bei solchen Doppelmarker-Mutanten eine gleichzeitige spontane Reversion in den zwei unabhängig voneinander attenuierten Merkmalen infolge der sich potenzierenden Einzelhäufigkeiten (≲ 10^-7 × ≲ 10^-7 = ≲ 10^-14) ausscheidet, besitzen solche Impfstämme unter den nichtselektiven Feldbedingungen eine volle Stabilität.
• - sich derartige Mutanten auf Grund ihrer Übereinstimmung von phänotypisch erkennbaren und genetisch attenuierenden Markern mittels Routineverfahren der Serologie, Biochemie und Lysotypie hinreichend sicher von virulenten Feldstämmen in vitro abgrenzen lassen.
• - derartige Mutanten fermentiert anzüchtbar und mittels Lyophilisation ausreichend lange konservierbar sind,
• - aus derartigen Mutanten hergestellte Lebendimpfstoffe in großen Nutztierpopulationen ohne epidemiologisches und epizootiologisches Risiko einsetzbar und immunogen sind.

Einmarker-Mutanten

Der Einbau einer Purin-Abhängigkeit mit nicht nachweisbaren bzw. ≲ 10^-8 liegender Reversionshäufigkeit zur Prototrophie (Virulenz) in einen Wildstamm führt beispielsweise zu nachfolgend aufgeführten erfindungsgemäßen Einmarker-Mutanten, welche infolge ihrer Attenuierung und hohen Immunogenität für Mäuse (siehe Tabellen 1 und 3) als potentielle Impfstämme geeignet sind und beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena, DDR (ZIMET), hinterlegt wurden.

Doppelmarker-Mutanten

Der Einbau einer Purin-Abhängigkeit, deren Reversionshäufigkeit entsprechend dem Anliegen "Stabilität" mit ≲ 10^-7 festgelegt werden sollte, in eine aus anderer Ursache nichtvermehrungsbegrenzt attenuierte hochimmunogene Einmarker-Mutante führt beispielsweise zu nachfolgend aufgeführten erfindungsgemäßen Doppelmarker-Mutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern, welche infolge ihrer stabilen Attenuierung und Immunogenität für Mäuse und Nutztiere (siehe unten) als potentielle Impfstämme geeignet sind und beim ZIMET hinterlegt wurden.

• . Salmonella dublin met^- 91 pur ade^- 23 AF 24 23 26 hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen Klons aus der
  Einmarker-Mutante S. dublin S-Form met^- 91;
  Attenuierung durch Ko-Mutation,
  i. p. LD₅₀ Maus ∼ 10^6,5 Einmarker-Mutantenkeime,
  Reversionshäufigkeit zur Virulenz ≲ 10^-7 (s. u.)
• . Salmonella typhi-murium his^- 155 pur (ade^-) 4 AF 22 10 52 (siehe Tabelle 7,
  hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen Klons aus der Einmarker-Mutante S. typhi-murium S-Form his^- 155;
  Attenuierung durch Ko-Mutation,
  i. p. LD₅₀ Maus ∼ 10^6,7 Einmarker-Mutantenkeime,
  Reversionshäufigkeit zur Virulenz ≲ 10^-7 (s. u.)
• . Salmonella cholerae-suis R-Dessau pur ade^- 4 AF 23 20 10 bzw. 431/261,
  hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen Klons aus der Einmarker-Mutante S. cholerae-suis R-Dessau 431/256;
  Attenuierung durch R-Form Antigen,
  i. p. LD₅₀ Maus 10^5,2 R-Mutantenkeime,
  Reversionshäufigkeit zur virulenten S-Form ≲ 10^-10.

Hochimmunogene Doppelmarker-Mutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern können auch erhalten werden, wenn in eine Einmarker-Mutante mit Purin-Abhängigkeit ein zweiter aus anderer Ursache attenuierender und nichtvermehrungsbegrenzender Marker eingebaut wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die oben näher bezeichneten Impfstämme besitzen - bezogen auf den Purinmarker - folgende Vorteile bzw. erfüllen folgende Forderungen:

• . Korrelation zwischen phänotypischem Erscheinungsbild und Attenuierung.
• . Reversionshäufigkeit zur Virulenz mit direkten Labormethoden hochselektiv erfaßbar.
• . Potenz zur Vermehrung im spezifischen Wirt unterhalb des klinischen Schwellenwertes und zeitlich begrenzte Antigenpersistenz im Gewebe als Voraussetzung für die Auslösung einer belastbaren Immunität.
• . Eignung zur Herstellung von stabil attenuierten Mutanten für hochimmunogene Lebendimpfstoffe.

Diese erfindungsgemäße Problemlösung ist überraschend, denn auf Grund eines seit 25 Jahren bestehenden wissenschaftlichen Vorurteils wurde die Mutation zur Purin-Abhängigkeit als ein nur zu schwach immunogenen Impfstämmen führendes vermehrungsbegrenzendes Attenuierungsmerkmal eingeschätzt (z. B. bei S. typhi-murium und S. typhi von RACON und Mitarb. Brit. J. exper. Path. 32, 85-96 (1951); BRAUN, bakterialni genetika p. 191, Academia Praha 1968; GARBER, The American Naturalist XC, 183-194 (1956); GOWEN und Mitarb., Genetics 38, 531-549 (1953); MENDEL-HERZBERG, J. Infect. Dis. 110, 192-203 (1962); TKACHENKO, Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1967/6, 21-25; 1967/10, 102-105; 1969/10, 80-86) und daher die potentiellen Möglichkeiten nicht erkannt (ELKINA und Mitarb., Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1971/11, 10-13; LIKHODED und SHUSTER; Zschr. f. d. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft), welche sich aus dem Einsatz dieser Marker für die Herstellung nicht vermehrungsbegrenzt attenuierter, hochimmunogener Mutanten für bakterielle Lebendimpfstoffe ergeben.

Im Gegensatz zu dieser anerkannten wissenschaftlichen Meinung bzw. irrtümlich interpretierten Literatur konnte die verbliebene Potenz dieses Mutantentyps zur in vivo-Vermehrung und in vivo-Persistenz nachgewiesen werden.

• - Purin-abhängige Mutanten lassen auf mit 10% Mäuseserum substituiertem Minimalmedium eine Spur von Wachstum erkennen.
• - Die in Tabelle 1 zusammengestellten Daten über die Immunogenität von Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten für Mäuse beweisen indirekt die in vivo-Vermehrung und in vivo-Persistenz.

Tabelle 1

Attenuierung und Immunogentität von acht Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten.
Reversionshäufigkeit 1/10⁸

Mutanten-Keime.
Summe aus 6-8 Einzelversuchen am Mäusemodell.

Aussage zur Attenuierung und Immunogenität

Aus den Daten der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß bei einmaliger i. p.-Immunisierung mit 10⁵ Mutantenkeimen der jeweiligen Salmonella-Spezies auf Grund der ausgeprägten Attenuierung Verendungen in der Größenordnung von minimal 0 bis 14% auftreten. Wird als Kontrolle die gleiche Lebendkeimzahl nicht attenuierter Wildstammkeime der jeweiligen Salmonella-Spezies verabreicht, sterben über 90% der Kontrollmäuse. Bei den Versuchsmäusen, welche die "immunisierung" durch die attenuierten Mutanten überstanden haben, verursacht die Wildstamm-Belastung mit der etwa 100fachen LD₅₀ in Abhängigkeit von der jeweiligen Mutante Verendungen zwischen 4 und 37%. Von den NaCl-Kontrollen verenden im Beobachtungszeitraum 6% der Tiere.

• - Der direkte Nachweis einer in vivo-Vermehrung und Gewebepersistenz von Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten in Mäusen als Voraussetzung für die hohe Immunogenität dieses Mutantentyps (siehe oben) wird durch den nachfolgenden Versuch mit dem potentiellen Impfstamm Salmonella dublin pur (ade^-) 16 erbracht: Von 18-20 Gramm schweren ICR-Mäusen, welche i. p. 10⁵ Mutantenkeime erhielten, wurden sofort nach der Immunisierung sowie täglich über 10 Tage je 3 Mäuse getötet, Leber und Milz steril entnommen, zusammen im Mörser zerreiben und in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Von diesen Stammsuspensionen wurden die log.-Verdünnungsreihen 10^-1, 10^-2, 10^-3 mit physiologischer Kochsalzlösung hergestellt und 0,1 ml der Suspension 10⁰ bis 10^-4 auf Nähragar gespatelt. Nach 24 Stunden 37°C Bebrütung wurde die Zahl der Salmonella-Kolonien bestimmt und der Mittelwert gebildet. Die nach dem Versuchtstag aufgeschlüsselten interpolierten Keimzahlen aus Leber und Milz sind in Tabelle 2 festgehalten.

Tabelle 2

Vermehrung und Persistenz der Einmarker-Mutante S. dublin pur (ade^-) 16 in Leber und Milz von ICR-Mäsuen: Immunisierung i. p. mit 10⁵ Keimen, quantitative Keimzahlbestimmung bei je 3 Mäusen unmittelbar nach Immunisierung und im täglichen Abstand (siehe Fig. 1).

Wie aus dem Kurvenverlauf ersichtlich ist, erfolgt in der Maus innerhalb der ersten 48 Stunden eine geringgradige Zunahme der Impfstamm-Keimzahlen, welche bis zum vierten Tag etwa konstante Werte zeigen. In den nachfolgenden Tagen kommt es dann zu einer langsamen Eliminierung der Salmonella-Mutante aus dem Gewebe. Diese Versuchsergebnisse entsprechen den Befunden, wie sie COLLINS, Bacteriol. Rev. 38, 371-402 (1974) für avirulente Serotypen angibt, welche infolge ihrer Gewebepersistenz die Versuchstiere gegen eine letale Infektion mit spezies-adaptierten hochvirulenten Salmonellen schützen.

• - Das angeführte Labortierergebnis wird durch prinzipiell gleiche Aussagen aus den vorklinischen und klinischen Erprobungen an Nutztieren erhärtet: So wurden von 35 im Alter von 3 Wochen oral mit je 5 × 10⁸ Lebendkeimen des potentiellen Impfstammes Salmonella cholerae-suis R (ade^-) 4 immunisierten Saugferkeln täglich Rektaltupferproben entnommen, welche nach STELLMACHER-SCHÖLL (STELLMACHER, W. in BEER, J. "Infektionskrankheiten der Haustiere", Fischer-Verlag Jena (1972); SCHÖLL, W. Fortschrittsberichte für die Land- und Nahrungsgüterwirtschaft 16/3, Berlin (1978)) aufgearbeitet wurden. Die Ausscheidung des Impfstammes konnte in unregelmäßiger Folge bis zum 35. Tag post immunisationem nachgewiesen werden. Mit der Methodik nach SCHÖLL (1978) gelang der Nachweis des Impfstammes aus den Organen von 172 bis zu 26 Wochen post immunisationem untersuchter Schweine bis zu 38 Tagen nach der Immunisierung.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird nachstehend anhand der angegebenen Versuchsparameter und Beispiele näher erläutert.

a) Material und Methoden

Wildstämme:
- Salmonella typhi-murium 415 (Moskau), i. p. LD₅₀ Maus 10¹ Keime
- Salmonella dublin 81 (ITFJ), i. p. LD₅₀ Maus 10⁵ Keime
- Salmonella cholerae-suis 431/031 (Dessau) i. p. LD₅₀ 10³ Keime

Einmarker-Mutanten als Ausgangsstämme für die Herstellung von Doppelmarker-Impfstämmen;
- Salmonella typhi-murium his^- 155 (Leipzig) i. p. LD₅₀ Maus 10^6,7 Keime
- Salmonella dublin met^- 91 (Leipzig) i. p. LD₅₀ Maus 10^6,5 Keime
- Salmonella cholerae-suis R 431/256 (Dessau) i. p. LD₅₀ Maus 10^5,2 Keime

Versuchstiere:
16-18 Gramm schwere ICR-Mäuse

Nährböden für die Vermehrung der Wildstämme, der jeweiligen Einmarker- und Doppelmarker-Mutanten sowie Mutantenselektion:

Vollmedium:
Nähragar und Nährbouillon (Trockenmedium) SIFIN

Minimalmedium:
Modifizierte (FALKOW und Mitarb., J. Bakteriol. 84, 1303-1312 (1962)) M9-Salzlösung (DAVIS und MINGIOLI, J. Bacteriol. 60, 17-23 (1950)) mit bzw. ohne 2,5% gewässertem Agar und 0,5% Dextrose. Das Minimalmedium wird als solches zur Vermehrung des Salmonella typhi-nurium-Wildstammes eingesetzt, für den Salmonella dublin-Wildstamm ist eine Supplementierung mit 20 µg Nikotinsäureamid/ml bzw. für den Samonella cholerae-suis-Wildstamm mit 20 µg Thiamin/ml notwendig.

Teilsubstituiertes Minimalmedium:
Für den Ausgangsstamm spezifisch ergänztes Minimalmedium plus 20 µg Aminosäure/ml. D. h. für den Salmonella cholerae-suis R-Stamm Dessau 431/256 also ohne Aminosäure; für Salmonella dublin-Stamm met^- 91 also mit Methionin; für Salmonella typhi-murium-Stamm his^- 155 also mit Histidin.

Vollsubstituiertes Minimalmedium:
Wie teilsubstituiertes Minimalmedium mit zusätzlich 20 µg/ml Purin bzw. ein anderes Purin-Derivat, wie beispielsweise Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Inosin usw.

b) Selektion der Purin-abhängigen Mutanten

5 ml einer 16 h Schüttelkultur in Nährbouillon werden mit 45 ml Nährbouillon verdünnt und weitere 5 h bei 37°C bebrütet. Nach Zentrifugieren sowie einmaligem Waschen mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung wird das Sediment in einer Konzentration von 10⁸ Keimen/ml in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Hiervon werden 10 ml mittels 100 µg N-Methyl-N′-Nitrosoguanidin/ml bei 37°C bis zu einer Überlebensrate von 5% behandelt. Nach der Mutagenese wird der Ansatz zweimal mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, mit Nährbouillon auf 10 ml aufgefüllt und zur phänotypischen Expression über Nacht bei 37°C bebrütet. Die Kultur wird erneut zentrifugiert, mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in teilsubstituiertem Minimalmedium mit einer Keimzahl von 10⁷-10⁸ resuspendiert, 2 Stunden bei 37°C bebrütet und dann 400 IE Penicillin/ml zugesetzt und weitere 5-7 Stunden bei 37°C bebrütet.

Nach Zentrifugieren und einmaligem Waschen mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung wird das Sediment in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung auf das alte Volumen von 10 ml resuspendiert, eine logarithmische Verdünnungsreihe hergestellt und von den Konzentrationen 10⁰, 10^-1, 10^-2 und 10^-3 jeweils 0,1 ml auf Nähragarplatten gespatelt. Nach 24 Stunden Bebrütung bei 37°C werden die Kolonien von Nähragarplatten mit Koloniezahlen zwischen 20 und 100 mittels Stempeltechnik auf Nähragar, Minimalmedium bzw. teilsubstituiertes Minimalmedium bzw. teilsubstituiertes Minimalmedium und vollsubstituiertes Minimalmedium übertragen.

Klone, welche auf dem vollsubstituierten Minimalmedium wachsen, jedoch kein Wachstum auf Minimalmedium bzw. teilsubstituiertem Minimalmedium zeigen, werden auf die Stabilität ihrer Purin-Abhängigkeit geprüft.

Beispiel 1 Einmarker-Mutanten

Von Wildstämmen abgeleitete Purin-abhängige Klone, welche unter Laborbedingungen keine Revertanten abspalten bzw. deren Reversionshäufigkeit ≲ 10^-8 liegt, können als stabile Einmarker-Impfstämme eingesetzt werden.

Die theoretische Möglichkeit einer Abspaltung von 10⁰ Wildstammkeimen bei Impfstoff-Dosen ≳ 10⁸ Keime ist ohne Praxisrelevanz, da

• - solche Impfstämme in ohnedies mit Salmonella Wildstämmen verseuchten Tierbeständen eingesetzt werden,
• - diese einzelnen Keime mit Sicherheit auf dem Populationsniveau eliminiert werden.

Nach der angeführten Methode wurden die oben beschriebenen stabilen Einmarker-Impfstämme erhalten mit dem Merkmal Purin-Abhängigkeit als nichtvermehrungsabgrenzende Mutation.

Die speziellen Daten für die stabilen Einmarker-Impfstämme hinsichtlich Attenuierung und Immunogenität am Mäusemodell sind aus der nachfolgenden Tabelle 3 sowie den dazugehörigen Ausführungen ersichtlich.

Tabelle 3

Attenuierung und Immunogenität der stabilen Purinabhängigen Einmarker-Mutanten. Reversionshäufigkeit des nichtvermehrungsbegrenzenden attenuierenden Merkmals zur Prototrophie (Virulenz) mit hochselektiven Labormethoden nicht nachweisbar bzw. ≲ 10^-8.

Wie Tabelle 3 zeigt, sterben bei dieser Versuchsanstellung an der i. p. Immunisierung mit den

• - Purin-abhängigen Mutanten (i. p. LD₅₀ ≲ 10⁸ Keime) letztmalig einzelne Mäuse bei Keimzahlen von 10⁷ und resultiert aus der i. p. Immunizierung mit den
• - Einmarker-Purin-abhängigen Mutanten für ≳ 95% der die Immunisierung überlebenden Mäusen eine volle Immunität gegen die ≳ 100 LD₅₀ Wildstamm-Infektion.

Bemerkenswert erscheint, daß eine solide Immunität durch die Impfstämme von Keimzahlen induziert wird, welche das Versuchstier Maus voll toleriert und mindestens zwei log.-Stufen unter dem Wert der Toxoinfektion liegen.

Die bei Einsatz eines Lebendimpfstoffes notwendige und in jedem bakteriologischen Labor leicht durchführbare Abtrennung des Impfstammes und homologen Wildstämmen erfolgt - wie aus Tabelle 4 ersichtlich - über den Nachweise des Purin-Markers:

Tabelle 4

Abtrennung der Impfstämme von homologen Wildstämmen

Beispiel 2 Doppelmarker-Mutanten

Von nichtvermehrungsbegrenzt attenuierten Ausgangsstämmen (d. h. von Einmarker-Mutanten) abgeleitete Purin-abhängige Klone, welche bezogen auf die Purin-Abhängigkeit eine Reversionshäufigkeit bis 1 prototrophe Revertante auf 10⁷ Purin-abhängige Keime besitzen, können als potentielle Impfstämme mit 2 unabhängig voneinander attenuierenden Markern eingesetzt werden:

Die Kopplung von 2 Markern

Marker 1: z. B.

• - Methionin- oder Histidin-Auxotrophiemutanten mit durch Ko-Mutation bedingter Attenuierung. Reversion zur Virulenz ≲ 10^-7 nachgewiesen durch stabile Attenuierung < 20 Nähragarpassagen und den alleinigen Nachweis der attenuierten Mutante bei i. p. mit 10⁵ und 10⁷ Mutantenkeimen geimpften Mäusen, von denen einzelne Tiere intercurrent bzw. an der Belastung durch den Impfstamm sterben (Wildstamm i. p. LD₅₀ 10^6,5 Keime).
• - Rauhform-Mutanten mit einer Rerversionshäufigkeit ≲ 10^-8.

Marker 2:

• - Purin-Abhängigkeit mit einer Reversionshäufigkeit bis ≲ 10^-7 garantiert infolge der unter Praxisbedingungen nicht realisierbaren Gesamtreversionshäufigkeit von ≲ 10^-14 eine volle Stabilität (s. Seite 7).

Die lediglich theoretisch zur Diskussion stehenden Revertanten der Impfstämme in einem der attenuierenden Marker werden mit Sicherheit auf dem Populationsniveau eliminiert, zumal diese Revertanten infolge des anderen Markers immer noch attenuiert sind. Nach der angeführten Methode wurden die oben beschriebenen Salmonella-Doppelmarker-Impfstämme erhalten mit dem Merkmal (Marker) Purin-Abhängigkeit als zweiten nichtvermehrungsbegrenzend attenuierten Marker. Möglich ist auch, daß von attenuierten Purin-abhängigen Einmarker-Mutanten als Ausgangsstämme andersartig auxotrophe (z. B. Thiamin-auxotrophe) Klone mit einer Reversionshäufigkeit dieses Zweitmarkers ≲ 10^-7 abgeleitet und als potentielle Impfstämme mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern verwendet werden können.

In diesem Fall wäre:

Marker 1:Purin-Abhängigkeit mit einer Reversionshäufigkeit ≲ 10^-7; Marker 2:z. B. Thiamin-Auxotrophie, verbunden mit Attenuierung und Reversion zur Prototrophie ≲ 10^-7.

Die speziellen Marker für die Doppelmarker-Impfstämme sind den nachfolgenden ausgeführten drei Beispielen zu entnehmen:

Beispiel 2a Salmonella dublin (81) pur (ade^-) thia^-

Marker 1:pur (ade^-) mit einer Reversion zur Prototrophie 10^-8, i. p. LD₅₀ 10^8,5 Keime Marker 2:thia^- mit einer Reversion zur Prototrophie ∼ 1/10⁸ thia Keime
Doppelmutante S. dublin (81) pur (ade^-) thia^- i. p. LD₅₀ Maus 10^9,7 Keime
(Wildstamm S. dublin (81) i. p. LD₅₀ Maus 10^1,2 Keime).
Die gleichzeitige Rückmutantenhäufigkeit beider Marker des Impfstammes S. dublin (81) pur (ade^-) thia^- liegt theoretisch somit in der Größenordnung von ≲ 10^-16.

Die in vivo-Stabilität und Persistenz der Doppelmarker-Mutante Salmonella dublin (81) pur ade^- thia^- wurde ebenso wie die LD₅₀ und die Prüfung der Immunogenität an NMRI-Mäusen getestet. Die Organe wurden einzeln in Porzellanmörsern homogenisiert und anschließend in ein jeweils dafür bestimmtes Reagenzglas mit 10 ml Nährbouillon (SIFIN-Berlin-Weißensee) gegeben. Nach 24stündiger Bebrütung bei 37°C wurden die Bouillon-Kulturen auf modifizierte Gassner-Nährböden abgeimpft und diese wiederum 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Von bewachsenen Kulturen wurden mehrere Einzelkolononien auf Kligler-Schrägagar-Röhrchen isoliert, 24 Stunden bei 37°C bebrütet und als Salmonella-verdächtige Kulturen anschließend serologisch typisiert. Um evtl. isolierte Revertanten zu erkennen, wurden die Kligler-Kulturen auf teil- bzw. vollsubstituiertes Minimalmedium gebracht, um die vorhandenen Marker zu charakterisieren. Alle geprüften Kulturen besaßen beide Marker und somit wurde in vivo-Reversion der Marker nicht beobachtet.

Hinsichtlich Organpersistenz gelang der Bakteriennachweis in den parenchymatösen Organen wesentlich häufiger, und die Persistenz hielt hier auch länger an als im Darm (siehe Fig. 2). Die Isolierung aus dem Darm gelang letztmalig am 23. Tag nach Belastung (siehe Fig. 2a), in den parenchymatösen Organen am 55. Tag nach der Belastung (siehe Fig. 2b). Diese zeitlich begrenzte Organpersistenz der avirulenten Doppelmutante stellt einen erwünschten Faktor der zur Erzielung einer hohen Immunität. Immunogenität der Doppelmarker-Mutante Salmonella dublin (81) pur ade^- thia^- für Labortiere läßt Tabelle 5 erkennen. Der Impfstamm wird oral sehr gut vertragen, während der Immunisierungszeit überlebten alle Tiere. Nach 2maliger Antigengabe ist bereits mit Dosen von 10¹⁰ Keimen und nach 4maliger Antigengabe bereits mit Dosen von 10⁷ Keimen ein sehr guter Impfschutz bei den Mäusen erzielbar (siehe Fig. 2).

Tabelle 6

Mäuseschutzversuch nach oraler Immunisierung mit der Doppelmarker-Mutante S. dublin (81) pur (ade^-) thia^-. Antigengaben bei zweimaliger Immunisierung am 1. und 14., bei 4maliger Immunisierung am 1., 2., 3. und 14. Versuchstag. Orale Belastung mit 1 × 10⁵ Keimen des Wildstammes S. dublin (81) 14 Tage nach letzter Antigengabe. Berechnung der Signifikanzschwellen mit dem ²-Test.

Das Immunisierungsergebnis der Doppelmarkermutante Salmonella dublin (81) pur (ade^-) thia^- am definitiven Impfling Kalb zeigt Tabelle 7.

Tabelle 7

Ergebnis nach oraler Immunisierung von Kälbern bis zu 4 Wochen Lebensalter mit der Doppelmarker-Mutante S. dublin (81) pur (ade^-) thia^- und 2 bis 3 Wochen danach erfolgter oraler Belastung mit dem virulenten Stamm S. dublin (81)

Immungisierungsvarianten

Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen

Die bei Einsatz eines Lebendimpfstoffes notwendige Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen anderer Herkunft ist leicht durchführbar und zeigt Tabelle 8.

Tabelle 8

Abtrennung des Impfstammes Salmonella dublin (81) pur (ade^-) thia^- von Wildstämmen sowie von Revertanten in einem der Erkennungsmarker

Wie das Schema der Tabelle 8 zeigt, ermöglicht die Erfassung der beiden Merkmale Thiamin-Auxotrophie plus Purin-Auxotrophie bzw. die alleinige Erfassung eines der beiden genetischen Merkmale eine Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen. Da der Impfstamm keine Geißeln ausbildet, ist seine Indentifizierung zusätzlich noch durch fehlende H-Agglutination in monospezifischem Hp-Serum möglich.

Beispiel 2b Salmonella typhi-murium S-Form his^- 155 pur (ade^-) 4

Marker 1:S-Form his^- 155 (Attenuierung durch Ko-Mutation) i. p. LD₅₀ Muas ∼ 10^6,7 Keime, Reversionshäufigkeit zur Virulenz (siehe oben ≲ 10^-7 (Reversion zur Prototrophie ∼ 10^-8); Marker 2:pur (ade^-) (Attenuierung durch begrenztes Metabolitenangebot in vivo sowie pleiotropen Effekt) gekoppelte (S-Form his^- 155 plus Purin-Abhängigkeit) i. p. LD₅₀ Maus < 10⁸ Keime, Reversionshäufigkeit zur pur (ade^-) Prototrophie ∼ 1/10⁸ pur (ade^-) Keime.

Die gleichzeitige Reversionshäufigkeit beider Marker des Impfstammes S. typhi-murium his^- 155 pur (ade^-) 4 liegt theoretisch in der Größenordnung ≲ 10^-15.

Die Immunogenität des Impfstammes sowie das Vorhandensein des Attenuierungsmarkers 1 im Impfstamm wurde - auf Grund der Schutzwirkung gegen die letale Wildstamm-Infektion bzw. des Virulenzverhaltens der Purin-prototrophen Revertante von Marker 2 - im Mäusemodell nachgewiesen (siehe Tabelle 9).

Tabelle 9

Attenuierung und Immunogenität von S. typhi-murium-Mutanten mit einem einzigen und zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern sowie Virulenzverhalten der aus der Doppelmutante nach Reversion zur Purin-Prototrophie entstandenen Revertante

Wie die Tabelle zeigt, sterben an der i. p. Immunisierung mit der

• - S-Form-Mutante his^- 155 (LD₅₀ ∼ 10^6,7 Keime) nur noch einzelne Tiere bei Keimzahlen von 10⁵ Keimen,
• - Doppelmutante his^- 155 pur (ade^-) 4 (LD₅₀ < 10⁸ Keimen) letztmalig Mäuse der Keimzahlen von 10⁸ Keimen und resultiert aus der i. p. Immunisierung eine volle Immunität gegen die ≳ 100 LD₅₀ Wildstamm-Infektion durch die
• - S-Form-Mutante his^- 155 für ≳ 95% der überlebenden Mäuse
• - Doppelmutante his^- 155 pur (ade^-) 4 für ebenfalls ≳ 90% der bis zur Keimzahl von 10⁵ Keimen immunisierten Tiere.

Bemerkenswert erscheint, daß die solide Immunität durch den Impfstamm auch von Keimzahlen induziert wird, welche das Versuchstier Maus voll toleriert und mindestens 3 log.-Stufen unter dem Grenzwert der Toxoinfektion liegen. Die Revertante des Impfstammes zur Purin-Prototrophie (his^- 155 pur (ade^-) 4 → his^- 155 pur (ade^-) (ade⁺) 4) besitzt den LD₅₀-Wert des S-Form his^- 155 Ausgangsstammes und beweist damit die Stabilität und das Vorhandensein des Markers 1 (S-Form his^- 155; Attenuierung durch Ko-Mutation) im Impfstamm his^- 155 pur (ade^-) 4.

Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen

Die bei Einsatz eines Lebendimpfstoffes notwendige und in jedem bakteriologisch-serologischen Labor leicht durchführbare Abtrennung des Impfstammes von homologen Wildstämmen zeigt Tabelle 10.

Tabelle 10

Impfstamm S. typhi-murium his^- 155 pur (ade^-) 4: Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen anderer Herkunft sowie von Revertanten in einem der Erkennungsmarker

Wie das Schema in Tabelle 10 veranschaulicht, ermöglicht die Erfassung der beiden Merkmale Histidin-Auxotrophie plus Purin-Abhängigkeit bzw. die alleinige Erfassung eines der beiden genetischen Merkmale eine Abtrennung der Impfstämme von homologen Wildstämmen.

Beispiel 2c Salmonella cholerae-suis R-Dessau 431/256 pur ade^- 4 bzw. 431/261

Zu Marker 1:
Das ist Mutation zur R-Form - i. p. Maus ∼ 10^5,2 - des somatischen Antigens mit einer Reversionshäufigkeit von < 10^-10. Die eingesetzte R-Mutante besitzt die Potenz zur Gewebepersistenz beim Nutztier Schwein und zeichnet sich durch ausreichende Immunogenität und stark verminderte Virulenz für Ferkel aus.
Zu Marker 2:
Das ist die Abhängigkeit gegenüber Purin mit einer Reversionshäufigkeit von ∼ 1/10⁸.
Die gekoppelte (R-Form plus Purin-Abhängigkeit) i. p. LD₅₀ Maus beträgt ∼ 10⁹ Keime.
Die gleichzeitige Reversionshäufigkeit beider Marker des Impfstammes S. cholerae-suis R-Dessau 431/256 pur (ade)^- 4 bzw. 431/261 liegt theoretisch in der Größenordnung von < 10^-18.

Die Attenuierung und Immunogentität des Impfstammes sowie der R-Einmarker-Ausgangsmutante am Mäusemodell ist in Tabelle 11 festgehalten.

Tabelle 11

Attenuierung und Immunogenität der S. cholerae-suis-Mutante mit einem Marker (R-Form 431/256) und der Impfstamm-Doppelmutante mit 2 unabhängig voneinander attenuierenden Markern:

R-Form plus Purin-Abhängigkeit

Das in Tabelle 11 aufgeführte Material weist aus, daß

• - durch die Ausgangsmutante 431/256 mit einer LD₅₀ ∼ 10^5,2 bei i. p. Keimzahlen von 10⁴ noch ein Drittel der Mäuse verendet und etwa 45% der die "Immunisierung überlebenden Mäuse" gegen die ≳ 100 LD₅₀ Wildstamm-Belastung geschützt ist.
• - der Impfstamm 431/261 mit einer LD₅₀ ∼ 10⁹ letztmalig bei i. p. 10⁸ Keimen einzelne Tiere durch Toxoinfektion tötet und die einmalige "Immunisierung im Grenzbereich zur Toxoinfektion" erwartungsgemäß über 50% der überlebenden Mäuse gegen die letale Wildstammbelastung schützt, während bei i. p. Immunisierung mit ≲ 10⁷ Keimen keine ausreichende Abwehr gegen den homologen S-Form-Wildstamm aufgebaut wird.

Die für den S. cholerae-suis R-Dessau 431/256 pur (ade)^- 4 bzw. 431/261 Doppelmarker-Impfstamm am Mäusemodell nicht befriedigend nachweisbare Immunogenität bezieht sich allerdings auf die extrem hohe ≳ 100 LD₅₀ Belastung. Im Falle einer ∼ LD₅₀-Belastung am definitiven Impfling - Schwein - ergibt sich eine sehr gute Schutzwirkung, wie Tabelle 12 ausweist.

Tabelle 12

Ergebnis nach Immunisierung von Saugferkeln im 3-Wochen-Alter mit der Doppelmarker-Mutante S. cholerae-suis 431/256 (ade)^- 4 bzw. 431/261 und 3 Wochen danach erfolgter oraler Belastung mit dem virulenten Stamm S. cholerae-suis 431/034

Immunisationsvarianten

Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen

Die bei Einsatz eines Lebendimpfstoffes notwendige und in jedem bakteriologisch-serologischen Labor leicht durchführbare Abtrennung des Impfstammes von homologen Wildstämmen anderer Herkunft zeigt Tabelle 13.

Tabelle 13

Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen und R-Mutanten anderer Herkunft

Wie das Schema in Tabelle 13 veranschaulicht, ermöglicht die Erfassung beider Merkmale - R-Form und Purin-Abhängigkeit - bzw. die alleinige Erfassung des genetischen Merkmals Purin-Abhängigkeit eine Abtrennung des Impfstammes von homologen Wildstämmen. Von den lediglich theoretisch zur Diskussion stehenden Revertanten des Impfstammes in einem Marker läßt sich die R → S-Reversion erfassen. Die Revertanten zur Purin-Prototrophie lassen sich von der Mehrzahl spontan auftretender R-Formen serologisch und durch ein differenziertes Lysisspektrum abtrennen. Nur in den seltenen Fällen einer Übereinstimmung der R-Struktur von Impfstamm und spontan auftretender R-Form ist keine Unterscheidung möglich.

Beispiel 3 Bestimmung der Reversionshäufigkeit zur Purin-Prototrophie (Virulenz) und Nachweis der Purin-Abhängigkeit der oben beschriebenen Impfstämme

Durch Spateln von 10⁸ und 10⁷ Keimen der jeweils zu prüfenden Impfstämme auf Minimalmedium sowie einer Kontrollabimpfung auf vollsubstituiertes Minimalmedium und anschließender 48stündiger Bebrütung bei 37°C erfolgt die Bestimmung der Reversionshäufigkeit,

• - welche für Einmarker-Mutanten mit ≲ 10^-8 festgelegt werden sollte (siehe oben),
• - welche für Doppelmarker-Mutanten mit ≲ 10^-7 festgelegt werden sollte (siehe oben)

und der Nachweis der Purin-Abhängigkeit.

Zur Herstellung des Lebendimpfstoffes werden die Stämme auf einem halbsynthetischen Nährmedium bei 37°C bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase im Fermentor angezüchtet. Die Kultur wird lyophilisiert.

Beispiel für die Herstellung des S. cholerae-suis-Lebendimpfstoffes

Die Kultivierung des Stammes S. cholerae-suis 431/261 erfolgt in einem Fermentor mit 70 l Salmonellen-Nährmedium nach WP 115 919 mit 2% Laktalbuminhydrolysat und 0,5% Glukose. Das Medium wird vorgeklärt, steril filtriert und mit 7 l Vorkultur, die als Standkultur durch 16 h-Bebrütung bei 37°C gewonnen wurde, sowie 35 ml Silikonentschäumer Antaphron NE 30 beimpft. Die Fermentation wird bei 37°C, einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/min und einer Belüftung von 0,06 m³ Luft/h/l durchgeführt. Bei Erreichung der stationären Phase wird die Kultivierung abgebrochen und der pH-Wert mit 20%iger Natronlauge auf den Wert 7,5 korrigiert. Zur Lyophilisation wird die Bakterienkultur mit Stabilisator versetzt.

Nach Abfüllung des Impfstoffes werden die Flaschen im shellfreezing-Verfahren eingefroren, in einer Lyophilsationsanlage getrocknet und anschließend mit Stickstoff geflutet.

Die Lebendimpfstoffe werden in einer in der Regel einmaligen oralen oder parenteralen Gabe von 1 × 10⁸ bis 5 × 10⁹ Lebendkeime an die entsprechenden Nutztiere (definitiven Impflinge) verabreicht. Durch Einsatzprogramme, welche auf den jeweiligen immunologischen Voraussetzungen und epidemiologischen bzw. epizootiologischen Erfordernissen aufbauen, wird die Unterbrechung der natürlichen Infektionsketten der zu bekämpfenden Infektionskrankheiten maßgeblich unterstützt.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung stabiler, hochimmunogener Bakterienmutanten für Lebendimpfstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) aus Wildstämmen oder
• b) aus hochimmunogenen Einmarkerstämmen, die aus anderer Ursache nicht vermehrungsbegrenzt attenuiert sind,

stabile Klone mit dem nichtvermehrungsbegrenzt attenuierenden Marker Purinabhängigkeit selektioniert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Selektion die Purinderivate Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Xanthin oder Inosuin einsetzt.

3. Verwendung der nach Anspruch 1 oder 2 isolierten Stämme Salmonella dublin IMET B 421, Salmonella typhi-murium IMET B 422, Salmonella cholerae-suis IMET B 423, Salmonella dublin IMET B 424, Salmonella typhi-murium IMET B 427 oder Salmonella cholerae-suis IMET B 428 zur Herstellung von Lebendimpfstoffen.