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Die vorliegende Erfindung betrifft neue, attenuierte Pseudomonas aeruginosa-Stämme, eine prophylaktische Vakzine und ein therapeutisches Mittel für eine Pseudomonas aeruginosa-
Infektion, und ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue, attenuierte Pseudomonas aeruginosa-Stämme, welche durch Isolieren von Pseudomonas aeruginosa in einem Reinzustand gemäss den Fisher-Devlin-Immunotypen und daran anschliessendes, wiederholtes Reinigen des isolierten Stammes durch aufeinanderfolgende Passagen durch Mäuse gewonnen werden, eine daraus hergestellte, prophylaktische Vakzine und therapeutische
Immunglobuline, welche durch Zellwandproteine induziert worden sind, welche aus dem attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stamm abgetrennt worden sind, und ein Verfahren zur Herstellung derselben.
Pseudomonas aeruginosa ist ein motiles, gramnegatives Stäbchen mit den ungefähren Abmessungen von 0,5 m x 1,5-3,0 m, welches eine einzige Flagelle aufweist und welches weitverbreitet im Boden, im Wasser, in Abwässern und im menschlichen Darm vorkommt (Mol. Microbiol. 4,1069-1075, 1990). Pseudomonas aeruginosa ist ein pathogener Stamm und Erreger von hartnäckigen Infektionen, wie z. B. Blutvergiftung (Sepsis), allgemeinen Infektionen, chronischen Atemwegsinfektionen, zystischer Fibrose der Bauchspeicheldrüse usw.
Die durch Pseudomonas aeruginosa verursachte Sepsis ist eine Krankheit, welche entweder das Ergebnis des Eindringens des Mikroorganismus als solchem in das Blut von Patienten ist, deren Widerstandskraft aufgrund von Operationen oder von Riss-, Schnitt- oder Kratzwunden, eines Traumas od.dgl. herabgesetzt ist, oder welche das Ergebnis der Absonderung der toxischen Bestandteile des Mikroorganismus in das Blut solcher Patienten ist. Das Vorhandensein des Toxins führt zu einem Schock mit hohem Fieber, reduziertem Blutdruck und anderen Symptomen, welche letzten Endes zum Tod führen konnen. Da der Pseudomonas aeruginosa auch bei Harnsystemsinfektionen festgestellt worden ist, hat sich das Interesse an Pseudomonas aeruginosa stark erhöht.
Es besteht daher ein dringender Bedarf nach der Entwicklung eines medizinischen Mittels oder von medizinischen Mitteln, welche (s) befähigt ist (sind), chronische, eitrige Erkrankungen, wie z. B. Sepsis und Harnsystemsinfektionen, welche durch Pseudomonas aeruginosa verursacht worden sind, wirksam zu verhüten oder zu behandeln. Die Pseudomonas aeruginosa-Stämme sind jedoch den meisten antibiotischen Substanzen gegenüber resistent; und bisher ist noch kein wirksames Verhütungsmittel oder therapeutisches Mittel gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen entwickelt worden. Die Virulenz von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen hat daher im Verlauf der Zeit zugenommen.
Die Pseudomonas aeruginosa-Stämme können auf verschiedenen Wegen klassifiziert werden.
Nach einem solchen Klassifikationssystem werden die Stämme nach den Fisher-Immunotypen in sieben (7) Typen eingeteilt. Ein anderes System basiert auf der O-Antigengruppe, wie dies von Terada vorgeschlagen worden ist. Noch ein anderes System ist das "International Antigenic Typing Scheme (IATS)"-Klassifikationssystem. Im Hinblick auf die Klassifikationssysteme sind diejenigen Pseudomonas aeruginosa-Stämme, welche am häufigsten in mit Pseudomonas aeruginosa infi- zierten Patienten vorkommen, die folgenden : die5/2a-, 2c-, 3-, 7/3a-, 3c-, 1/4a-, 4b-, 6/5a-, 5b-, 4/6-, 2/7a-, 7b-, 7c-, /10a-, /13-, /12-, /11- und 3,7/3d, 3e-Typen gemäss den Fisher-Immunotypen/O-Serotypen, wobei hauptsächlich die 3-, 7-, 2- und 1-Typen als Fisher-Immunotypen (entsprechend 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a und 4b als O-Serotypen) vorhanden sind.
Gemäss einem Verfahren zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen werden die Pseudomonas aeruginosa-Toxine mit Antitoxinen neutralisiert. Das Antitoxin ist jedoch ein therapeutisches Mittel, welches nur in Patienten wirksam ist, welche bereits an Sepsis leiden; und es hat keine prophylaktische Wirkung. Ausserdem ist das derzeit verfügbare Antitoxin sehr teuer, und seine Verwendung ist beschränkt. Ausserdem sind die wichtigsten Nachteile, die mit der Verwendung des Antitoxins verbunden sind, die relativ niedrige Heilungsrate und die als Begleiterscheinung auftretenden ernsten Nebenwirkungen.
Gemäss einem in Untersuchung begriffenen Verfahren, welches auf die Vermeidung der Nachteile ausgerichtet ist, die mit dem Antitoxin verbunden sind, wird ein normales Antigen zur Verhütung und Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen verwendet. In Untersuchung befindliche Verfahren zur Gewinnung des normalen Antigens können generell in zwei Gruppen eingeteilt werden. Das erste Verfahren bezieht sich auf die Verwendung eines normalen Antigens, das als prophylaktische Antigen-Vakzine gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen aus Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, welche unterschiedliche Immunotypen aufweisen, abgetrennt
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und gereinigt worden ist [Japan, J. Exp. Med. 45,355-359, 1975].
Das zweite Verfahren bezieht sich auf die Verwendung einer normalen Antigenmasse, welche unter Anwendung einer Gentech- nologie-Methode erzeugt worden ist, gemäss welcher ein für das gewünschte Antigen kodierendes
Gen isoliert und in einen geeigneten Vektor eingeschleust wird, um einen rekombinanten Vektor zu erhalten, wonach dann ein geeigneter Wirtsorganismus bzw. eine geeignete Wirtszelle mit dem so entstandenen, rekombinanten Vektor transformiert und zur Expression des gewünschten Antigens inkubiert wird.
Obgleich die Entwicklung einer prophylaktischen Vakzine unter Verwendung eines normalen Antigens in der Theorie eine sehr wirksame Methode ist, so zeigt doch der gegenwärtige Stand der auf dieses Verfahren bezüglichen Untersuchungen, dass dieses Verfahren mit vielen Problemen behaftet ist, welche ungelöst bleiben. Der Hauptnachteil besteht darin, dass das normale Antigen nicht alle Arten von Pseudomonas aeruginosa, welche verschiedene Immunotypen aufweisen, verhüten kann, so dass seine Wirksamkeit daher eine äusserst niedrige ist. Durch eine derart niedrige Wirksamkeit wird nahegelegt, dass das Vorhandensein eines anderen, unbekannten Hauptantigens, zusätzlich zu dem normalen Antigen, einen wirksamen prophylaktischen Effekt hervorrufen kann.
Ein weiteres Verfahren zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen besteht in der Verabreichung von Antibiotika oder von chemotherapeutischen Mitteln, welche eine BreitbandSelektivität für den Pseudomonas aeruginosa-Stamm haben. Da es jedoch zahlreiche Pseudomonas aeruginosa-Stämme gibt, und da dieselben im allgemeinen einen sehr hohen Grad von Arzneimittelresistenz aufweisen, so sind schon viele Patienten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen erlegen, welche mit Antibiotika nicht wirksam behandelt werden können.
Zusätzlich ist ein Verfahren unter Verwendung eines therapeutischen Immunglobulins entwickelt worden. Ein solches Immunglobulin zeigt jedoch nur eine geringe oder überhaupt keine therapeutische Wirkung gegenüber allen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen und ist daher nur für sehr beschränkte Typen von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen verwendet worden. Dies ist vor allem auf die Tatsache zurückzuführen, dass das Immunglobulin nach einem Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen einen bestimmten Mikroorganismus erzeugt worden ist und daher normalerweise auf die zahlreichen Pseudomonas aeruginosa-Stämme nicht einwirken kann.
Es sind bereits Versuche unternommen worden, mit monoklonalen Mäuse-Antikörpern [J. Inf.
Dis. 152,1290-1299, 1985] oder monoklonalen Human-Antikörpern [FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268, 1990] gegen Pseudomonas aeruginosa ein billiges therapeutisches Mittel zu entwickeln. Hier können Zellinien dahingehend aus einer Zellbank mit einer Zellfusionstechnik selektioniert werden, dass sie die wirksamsten neutralisierenden Antikörper produzieren, wonach dann eine Zellinie als Ausgangsmaterial zur Erzeugung des gewünschten Antikörpers in technischem Massstab verwendet werden kann. Dieses Verfahren zielt jedoch auf die Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen auf dem Weg über eine Antikörper-Erzeugung und nicht auf eine prophylaktische Vakzine ab.
Dieses Verfahren ist ausserdem mit dem Nachteil behaftet, dass nicht alle Infektionen, weil sie von verschiedenen Pseudomonas aeruginosa-Stämmen mit verschiedenen serologischen und immunologischen Typen verursacht werden, mit nur einer Art von monoklonalem Antikörper behandelt werden können. Dies bedeutet, dass die Therapie mit monoklonalen Antikörpern nicht wirksam zum Behandeln aller mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten angewendet werden kann.
Zur Erweiterung einer wirksamen Behandlung nach diesem Verfahren ist die gleichzeitige Verabreichung von mehreren Arten von Antikörpern auf der Basis von deren untersuchter Kreuzreaktivität entwickelt worden. Hier wird Blut aus mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten gesammelt und dahingehend untersucht, den serologischen Typus und/oder den immunologischen Typus der infizierenden Pseudomonas aeruginosa-Stämme zu identifizieren. Dann werden an den Patienten für den identifizierten Typus geeignete monoklonale Antikörper verabreicht. Dieses Verfahren braucht jedoch sehr viel Zeit und kommt daher für jene Patienten nicht in Frage, deren Zustand eine sofortige Behandlung erfordert.
Gemäss dem Stand der Technik ist die Verwendung von aus Pseudomonas aeruginosa-Stämmen abgetrennten Zellwandproteinen als Antigen für eine Vakzine vorgeschlagen worden [siehe Vaccine, Bd. 7, "Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa
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vaccine", 1989]. Bei dem in der obigen Literaturstelle vorgeschlagenen Verfahren werden jedoch vier Arten von allgemeinen Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, nämlich NN 170041, NN 170015,
NN 868 und NN 170046, verwendet, welche nicht attenuiert sind, so dass es daher ein Problem gibt, welches mit den Toxizitäten der Pseudomonas aeruginosa-Stämme als solchen zusammen- hängt.
Weiterhin können bei der Herstellung einer Proteinkomponenten-Vakzine aus solchen
Pseudomonas aeruginosa-Stämmen Zellen zerstört werden, welche dann in das Medium Fremd- nukleinsäuren und toxische Substanzen mit hohem Molekulargewicht, nämlich Lipopolysaccharide (LPS), freisetzen, welche im Zytoplasma vorliegen. Diese Substanzen gelangen dann in die so entstandene Vakzine als Verunreinigungen, wodurch die Sorgfalt noch erhöht wird, welche bei der Verabreichung der Vakzine notwendig ist und deren Verwendung möglicherweise eingeschränkt wird.
Somit sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausgedehnte Forschungsarbeiten mit dem Ziel durchgeführt worden, ein Mittel zu finden, welches befähigt ist, Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa wirksam zu induzieren und welches eine gute immunogene (nämlich antigene) Aktivität bei gleichzeitig äusserst geringem Risiko aufgrund der den Pseudomonas aeruginosaStämmen als solchen eigenen Toxizitäten aufweist.
Als Ergebnis dieser Forschungsarbeiten wurde seitens der damit befassten Erfinder bestätigt, dass dann, wenn die aus mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten isolierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme auf der Basis ihrer Immunotypen in sieben (7) Spezies klassifiziert werden, wonach dann jeder reine Stamm dadurch attenuiert wird, dass der Organismus mehrmals in Passagen durch ein geeignetes Wirtstier geführt wird, neue, sichere und attenuierte Pseudomonas aeruginosa-Stämme gewonnen werden können.
Diese Stämme haben Zellwand proteine, welche nicht nur zur Herstellung einer Vakzine für die Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen nützlich sind, sondern welche auch als Antikörper-Veranlasser für die Erzeugung von Immunglobulinen für Pseudomonas aeruginosaInfektionen im Tierkörper verwendet werden können. Die so entstandenen Immunglobuline zeigen gemäss der vorliegenden Erfindung eine überlegene therapeutische Wirkung gegenüber verschiedenen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen, einschliesslich schwerer Fälle.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt daher in der Schaffung eines neuen und sicheren, attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stammes, welcher Zellwandproteine aufweist, welche Antigenität ohne die Toxizität des Pseudomonas aeruginosa-Stammes als solchem zeigen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung einer Vakzine zum Induzieren einer Immunantwort zur Verhütung einer späteren, durch Pseudomonas aeruginosa verursachten Erkrankung in einem Patienten, der die Vakzine verabreicht bekommen hat.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung der Vakzine.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen, welches Mittel wenigstens ein Immunglobulin für den Pseudomonas aeruginosa-Stamm enthält.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung des Immunglobulins.
Vorstehend sind einige der relevanteren Ziele der vorliegenden Erfindung umrissen worden Diese Ziele sollten jedoch dahingehend ausgelegt werden, dass sie bloss einige der relevanteren Merkmale und Anwendungen der Erfindung veranschaulichen. Viele andere vorteilhafte Ergebnisse können durch Anwendung der beschriebenen Erfindung auf eine unterschiedliche Art und Weise oder durch Modifizieren der Erfindung innerhalb des Rahmens der Offenbarung erhalten werden. Demgemäss ergeben sich weitere Ziele und ein gründlicheres Verständnis der Erfindung aus der Zusammenfassung der Erfindung und aus der eingehenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform, zusätzlich zu dem durch die Patentansprüche definierten Schutzumfang der Erfindung im Zusammenhang mit den Begleitzeichnungen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft neue, sichere und wirksame, attenuierte Pseudomonas aeruginosa-Stämme, welche Zellwand proteine aufweisen, die Antigenität ohne die Toxizität des Pseudomonas aeruginosa-Stammes als solchem manifestieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung sichere, attenuierte Pseudomonas aeruginosa-Stämme, welche durch Isolieren der Pseudomonas aeruginosa-Stämme aus mit Pseudomonas aeruginosa mfizier- ten Patienten, Klassifizieren der isolierten Mikroorganismusstämme in sieben (7) Arten von
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Spezies gemäss den Fisher-Devlin-Immunotypen, Selektionieren eines einzelnen, repräsentativen
Stammes für jeden Immunotypus,
Reinigen des selektionierten Stammes auf dem Wege über wiederholte Injektions-/Isolations-/Re-Injektionsstufen in Versuchstieren und Selektionieren des in höchstem Masse attenuierten Stammes für jeden von sieben (7) Arten von Pseudomonas aerugino- sa-Stämmen gewonnen werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine neue Vakzine und das
Verfahren zur Herstellung der Vakzine für eine Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa-
Infektionen. Die Vakzine wird durch Abtrennen, wie nachstehend beschrieben, von Zellwandprotei- nen in einem im wesentlichen reinen Zustand aus jedem der sieben (7) Arten von sicheren, attenu- ierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen und weiteres Reinigen der abgetrennten Zellwand- proteine und - vorzugsweise - durch anschliessendes Vereinigen der gereinigten Zellwandproteine, welche aus wenigstens 3 Typen der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme stammen, hergestellt. Vorzugsweise werden zur Herstellung der Vakzine gemäss der vorliegenden Erfindung äquivalente Mengen von Zellwandproteinen aus jedem der 3 Typen verwendet.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein therapeutisches Mittel für
Pseudomonas aeruginosa-Infektionen, welches wenigstens ein Immunglobulin enthält, das durch
Kultivieren von wenigstens einem sicheren, attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stamm, Abtrennen des Zellwandproteins, Reinigen des abgetrennten Zellwandproteins und darauffolgendes
Injizieren des reinen Zellwandproteins, als Antikörper-Veranlasser, in Versuchstiere, um das Immunglobulin zu induzieren, produziert worden ist ; ein Verfahren zur Herstellung des thera- peutischen Mittels.
Die relevanteren und wichtigeren Merkmale der vorliegenden Erfindung sind vorstehend umrissen worden, damit die nachstehende, eingehende Beschreibung besser verständlich sein möge und damit der vorliegende Beitrag zum Stande der Technik voll gewürdigt werden kann. Weitere, nachstehend beschriebene Merkmale der Erfindung bilden den Gegenstand der Patentansprüche der Erfindung. Fachleuten auf diesem Gebiet wird es klar sein, dass der Erfindungsgedanke und die hierin beschriebene, spezifische Ausführungsform leicht als Grundlagen zum Modifizieren oder Konstruieren anderer Strukturen benützt werden können, um damit die gleichen Zwecke wie bei der vorliegenden Erfindung zu verfolgen.
Weiterhin wird den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, dass solche äquivalente Konstruktionen von dem in den Patentansprüchen dargelegten Erfindungsgedanken und Rahmen der Erfindung nicht abweichen.
Für ein gründliches Verständnis der Natur und der Ziele der Erfindung sei auf die nachstehende, eingehende Beschreibung im Zusammenhang mit den Begleitzeichnungen verwiesen, welche zeigen :
Die Fig. 1 das Ergebnis einer SDS-PAGE von gereinigten Zellwandproteinen, welche gemäss der vorliegenden Erfindung aus attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen abgetrennt worden sind ; die Fig. 2 eine graphische Darstellung, welche die Gewichtsveränderung einer männlichen Maus darstellt, in welche das Zellwandprotein von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen gemäss der vorliegenden Erfindung intravenös injiziert worden ist.
Die Fisher-Devlin-Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa werden in sieben Typen, nämlich Typus 1 bis Typus 7, eingeteilt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Pseudomonas aeruginosa-Stämme, welche die Fisher-Immunotypen 1 bis 7 aufweisen, als Stämme für die Attenuierung ausgewählt, und zwar aufgrund der Tatsache, dass dieselben im Blut der Mehrheit, nämlich von 90 bis 95% oder darüber, der mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten nachgewiesen werden. Insbesondere sind unter den sieben (7) Typen von Pseudomonas aeruginosa der Typus 1 und der Typus 3 die am häufigsten festgestellten Stämme in mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten. Die Lehre der vorliegenden Erfindung kann jedoch auf irgendeinen der Stämme von Pseudomonas aeruginosa angewendet werden, um Schutz zu gewähren oder um eine Behandlung durchzuführen.
Die sicheren, attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung können durch Isolieren von jedem der sieben Typen von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen im Reinzustand aus dem Blut von Patienten, bei denen festgestellt worden ist, dass sie eine Pseudomonas aeruginosa-lnfektion haben, und anschliessendes Attenuieren der isolierten Stämme mit wiederholten Reinigungsverfahren gewonnen werden. Die so erhaltenen, sicheren, attenuierten
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Pseudomonas aeruginosa-Stämme umfassen alle sieben (7) Typen und werden mit CFCPA 10142 (Fisher-Typ 1), CFCPA 20215 (Fisher-Typ 2), CFCPA 30720 (Fisher-Typ 3), CFCPA 40057 (Fisher-Typ 4), CFCPA 50243 (Fisher-Typ 5), CFCPA 60534 (Fisher-Typ 6) bzw. CFCPA 70018 (Fisher-Typ 7) bezeichnet.
Hierin stellt CFCPA ein Akronym aus "Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa" dar, welches den Firmennamen Cheil Food and Chemicals Inc. enthält, nämlich den Namen der Firma, bei welcher die Erfinder der vorliegenden Erfindung angestellt sind, und den Namen des gegenständlichen Stammes, nämlich Pseudomonas aeruginosa, enthält.
Die attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme, welche, wie oben beschrieben, durch wiederholte Reinigungsverfahren gewonnen worden sind, weisen Phänotypen und mikrobiologische Eigenschaften auf, welche mit jenen der entsprechenden Mutterstämme im wesentlichen identisch sind, sie zeigen aber auch neue Eigenschaften, welche zur Herstellung einer Antigen- Vakzine für die Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen nützlich sind ; zeigen aber nicht jene Pathogenität, welche den Mutterstämmen vor dem Attenuieren eigen ist. Demgemäss werden die attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung als neue Mikroorganismenstämme angesehen.
Diese Stämme wurden daher bei dem "Korean Culture Center of Microorganisms in the Korean Federation of Culture Collections", nachstehend KCCM genannt, als internationaler Hinterlegungsstelle gemäss dem Budapester Vertrag am 12 Mai 1993 unter den Hinterlegungsnummern KCCM 10029 für CFCPA 10142, KCCM 10030 für CFCPA 20215, KCCM 10031 für CFCPA 30720, KCCM 10032 für CFCPA 40057, KCCM 10033 fur CFCPA 50243, KCCM 10034 für CFCPA 60534 und KCCM 10035 für CFCPA 70018, hinterlegt.
Die Reinigungsverfahren zur Erzeugung der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme werden wiederholt durchgeführt, und zwar im allgemeinen so lange, bis die Stämme die gewünschten LDso-Werte aufweisen. Obgleich die Anzahl der Reinigungsverfahren oder-stufen je nach der Fachkenntnis oder Geschicklichkeit der daran beteiligten Techniker, der Toxizität der Mutterstämme und dgl. variiert, so wird dennoch die Reinigungsstufe vorzugsweise drei- bis siebenmal durchgeführt, z. B. so lange, bis die LD50 des Pseudomonas aeruginosa wenigstens 2x1 07 Zellen beträgt.
Die LDso-Menge der so gemäss der vorliegenden Erfindung in der Maus gewonnenen, neuen, attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme beträgt vorzugsweise 2.0x10 Zellen oder darüber.
Die vorliegende Erfindung schafft auch eine Vakzine zur Immunisierung gegenüber Pseudomonas aeruginosa-Infektionen, welche durch Abtrennen von Zellwandproteinen im Reinzustand aus jedem der neuen, wie oben gewonnenen, attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung und im Anschluss daran durch weiteres Reinigen der abgetrennten Zellwandproteine, und durch Vereinigen der so gewonnenen, gereinigten Zellwandproteine in einem gewissen Mischungsverhältnis, vorzugsweise in äquivalenten Mengen der Zellwandproteine aus jedem der gewünschten Pseudomonas aeruginosa-Stämme, gegenüber welchen eine Immunisierung angestrebt wird, hergestellt wird. Dies bedeutet, dass die für jeden Stamm verwendete Menge jene ist, welche ausreicht, um eine Immunisierung gegen diesen Stamm in einem besonderen Typus von Wirtsorganismus zu induzieren.
Zusätzlich schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Vakzinen für die Immunisierung gegen Pseudomonas aeruginosa, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass attenuierte Pseudomonas aeruginosa-Stämme in Fermentern unter Aufrechterhaltung optimaler Wachstumsbedingungen zur Erzielung einer Masse von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen inkubiert werden. Die dabei erhaltene Masse von Mikroorganismen wird gemäss einer Reihe von Verfahrensweisen behandelt, darunter eine Extraktion der Zellwandproteine durch Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, Fraktionierung auf Basis der Molekulargewichte, eine Ultrazentrifugation, um die gewünschten Zellwandproteine zu erhalten.
Die so erhaltenen Zellwandproteine, welche aus den sieben (7) Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen stammen, werden miteinander in einer geeigneten Zusammensetzung bei einem gewünschten Verhältnis, vorzugsweise in äquivalenten Mengen, vereinigt.
Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung von Vakzinen gemäss der vorliegenden Erfindung kann wie folgt zusammengefasst werden.
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Tabelle 1. Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Zellwandproteinen aus attenuierten
Pseudomonas aeruginosa-Stämmen zur Herstellung von Vakzinen.
Kultivierung von sieben (7) Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen
Abtrennung der Mikroorganismenzellen
Abgetrennte Zellen + organisches Lösungsmittel
Extraktion der Zellwandproteine
Erste Fraktionierung aufgrund des Molekulargewichtes (Ultrafiltration)
Zweite Fraktionierung aufgrund des Molekulargewichtes (Ultrafiltration)
Ultrazentrifuge (180. 000 x g)
Abgetrennte Zellwandproteine (M.G.
10.000 100.000)
Pseudomonas aeruginosa Vakzine
Nachstehend werden die Vakzinenzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf das Verfahren zur Herstellung derselben näher erläutert
Zur Herstellung von Vakzinen für eine Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa gemäss der vorliegenden Erfindung werden in einer ersten Stufe sieben Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, nämlich CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 bzw. CFCPA 70018, in einem Fermenter von geeigneter Grösse inkubiert. Als Kulturmedium für diesen Zweck ist eine Sojabrühe mit Trypsingehalt oder vorzugsweise ein nachstehend beschriebenes Spezialmedium für die oben beschriebene Inkubation von Pseudomonas aeruginosa geeignet.
Das Spezialmedium enthält Glukose (30 g/l), Pepton (15 g/l), MgS04 (0,5 g/l), CaC03 (5 g/l), KH2P04 (1 g/l), FeS04 (5 mg/l), CuS04 (5 mg/l), und ZnS04 (5 Mg/I)- Dieses Spezialmedium ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung in einzigartiger Weise für die Kultivierung von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen ausgelegt worden und ist neu. Demgemäss fällt dieses Spezialmedium unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Werden die Pseudomonas aeruginosa-Stämme in dem Speziaimedium gezüchtet, dann ist die Ausbeute an der Bakterienmasse um wenigstens 30% höher als die in der Sojabrühe mit Trypsingehalt gezüchtete Bakterienmasse, jeweils bezogen auf das Trockengewicht der Bakterienmasse. Die Verwendung eines solchen Spezialmediums stellt daher eine bevorzugte Ausführungsform dar.
Bei einer solchen Stufe des Inkubierens der Bakterienmasse sind die optimalen Kulturbedin- gungen die folgenden : Temperatur37 C, Belüftungsrate 1 Vol./Vol./min (VolumenNolumen/min); das Beimpfungsvolumen beträgt 5 Vol.-% der Lösung des Kulturmediums; und die Inkubation wird bei einer Geschwindigkeit des Umrührens von 100 U/min während der anfänglichen 2 h und dann von 600 U/min wahrend 10 bis 20 h, vorzugsweise während 12 bis 16 h, durchgeführt.
Nach Beendigung der Inkubation werden die ausgefällten Bakterienzellen in einer zweiten Stufe von der Kulturlösung mit Hilfe von Zentrifugation oder dgl. abgetrennt. Die abgetrennten Bakterienzellen werden in einer dritten Stufe mit einem organischen Lösungsmittel behandelt, um die Mikroorganismen zu inaktivieren und um gleichzeitig die Zellwand-Lipidkomponenten zu entfernen.
In der dritten Stufe wird das organische Lösungsmittel vorzugsweise aus einer Gruppe ausgewählt, welche aus Aceton, Chloroform, Ethanol, Butanol usw. besteht, wobei Aceton in höchstem Masse bevorzugt ist.
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Anschliessend umfasst eine vierte Stufe die wiederholte Extraktion von Zellwandproteinen, nämlich 5 bis 6 Extraktionen, wobei die Zellen als solche nicht in einer solchen Art und Weise zerstört werden, dass ihr Zellinhalt verlorengeht. Zu diesem Zweck werden die Mikroorganismus-Zellen in einer Lösung, wie z. B. einer Phosphatpufferlösung, einer Tris-Pufferlösung und dgl., vorzugsweise in der Phosphatpufferlösung, gehalten und werden zum Extrahieren der Zellwandproteine in einem Mischer oder Homogenisator verarbeitet. Die Extraktion wird vorzugsweise durch Umrühren bei 100 bis 2000 U/min bei 4 C durchgeführt. Zusätzlich sollten in der vierten Stufe spezielle Vorkehrungen getroffen werden, um eine Zerstörung der Zellen zu verhindern, so dass die gewünschten Zellwandproteine von den toxischen Proteinen, welche im Zytoplasma vorhanden sind, getrennt gehalten werden können.
Somit ist es während des Extraktionsverfahrens notwendig, kontinuierlich festzustellen, ob die Zellen zerstört werden oder nicht, indem man das Vorliegen von Lactatdehydrogenase oder Hexokinase als Zytoplasma-Markerenzymen bestimmt.
Anschliessend werden die Zellwand proteine der attenuierten Pseudomonas aeruginosaStämme, welche gemäss den obigen Verfahrensweisen in einem Überstand gewonnen worden sind, dadurch fraktioniert, dass man sie einem ersten und zweiten Ultrafiltrationsvorgang unterwirft, um nur jene Proteine zu erhalten, welche Molekulargewichte zwischen 10. 000 und 100. 000 haben.
In dieser Stufe ist es sehr wichtig, dass das Molekulargewicht der so erhaltenen Zellwandproteine in den Bereich von 10. 000 bis 100.000 fällt Der Grund dafür liegt darin, dass ein Molekulargewicht der Zellwandproteine von unter 10. 000 nicht zu dem gewünschten prophylaktischen Effekt führt, wie dies durch Tierversuche festgestellt worden ist, während ein höheres Molekulargewicht als 100.000 aufgrund des Vorliegens von Lipopolysacchariden (LPS) mit einem hohen Molekulargewicht toxische Wirkungen hervorrufen kann.
Die abgetrennten Zellwandproteine aus jedem der sieben Typen von attenuiertem Pseudomonas aeruginosa mit einem Molekulargewicht zwischen 10. 000 und 100. 000 werden jeweils durch Ultrazentrifugation weiter gereinigt, um jedwede mögliche, kleine Mengen an Lipopolysacchariden, welche vorhanden sein könnten, zu entfernen. Dann wird noch eine Stufe zum Entfernen jeglicher bakterieller Substanzen durchgeführt, um schliesslich die Zellwandproteine der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme zu erhalten, welche nicht-pathogen sind und welche einen für die Verwendung als Vakzine für die Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen ausreichend hohen Reinheitsgrad haben.
Die aus den sieben Typen der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme erhaltenen Zellwandproteine werden dann zur Formulierung der Vakzine in einem gewissen Verhältnis miteinander vereinigt. Betrachtet man die Häufigkeit des Auftretens von Erkrankungen aufgrund der Mutterstämme von Pseudomonas aeruginosa vor dem Attenuieren, dann sollte die Kombination der Zellwandproteine durch Vermischen von Zellwandproteinen hergestellt werden, welche aus wenigstens drei (3) Typen, in höherem Masse bevorzugt vier (4) Typen oder darüber, und in höchstem Masse bevorzugt aus allen sieben (7) Typen der Pseudomonas aeruginosa-Stämme gewonnen worden sind.
Obgleich das Mischungsverhältnis mit den Typen der Pseudomonas aeruginosaStämme variiert, aus denen die zu kombinierenden Zellwandproteine gewonnen worden sind, so werden die Zellwandproteine dennoch vorzugsweise in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen miteinander vermischt.
Beispielsweise sind die bevorzugten Vakzinezusammensetzungen gemäss der vorliegenden Erfindung jene, welche Zellwandproteine enthalten, die aus CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534 in einem Mischungsverhältnis von 1:1:1,5:0,5; 1:1:1:1oder 0,5:1,5:1,5:0,5 erhalten worden sind ; eine Vakzine, welche alle Zellwandproteine enthält, die aus CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 und CFCPA 70018 in einem Mischungsverhältnis von im wesentlichen äquivalenten Mengen erhalten worden sind. Die geringste Menge an dem Gemisch von Zellwandproteinen aus jedem der in der Vakzine vorhandenen Pseudomonas aeruginosa-Stämme ist jene Mindestmenge, welche ausreicht, um eine Immunisierung in dem vorgesehenen Wirtsorganismus/Patienten zu induzieren.
Gewünschtenfalls kann die Vakzine für eine Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosaInfektionen gemäss der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den wie oben gewonnenen Zellwandproteinkomponenten auch noch pharmazeutisch annehmbare Arzneistoffträger, z. B. Calciumhydroxid, Calciumphosphat, ISCOM (immunstimulierenden Komplex), SAF-1 (Syntex Adjuvans Formulierung-1), SAFm (modifizierte Syntex-Adjuvans-Formulierung) und ähnliche, dem Fach-
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mann auf diesem Gebiet bekannte Vehikel enthalten.
Für die Verwendung als prophylaktische Vakzine gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen variiert die zu verabreichende Dosierung mit dem Geschlecht, Alter, Gewicht, dem Gesundheitszustand usw. des Subjektes, welches der Einwirkung von Pseudomonas aeruginosa ausgesetzt sein könnte, doch beträgt dieselbe im allgemeinen 0,5 bis 2,5 mg des Gemisches von Zellwandproteinen aus jedem der attenuierten Stämme. Diese Menge wird generell aus einer Bakterienmasse eines Trockengewichtes von 0,1 g bis 0,5 g (entsprechend einem Nassgewicht von 0,5 bis 2,5 g) erhalten. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist die intramuskuläre Injektion.
Gemäss einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die im Reinzustand aus dem attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stamm der vorliegenden Erfindung gewonnenen Zellwandproteine auch als Antikörper-Veranlasser zum Induzieren von Immunglobulinen in Versuchstieren verwendet werden. Die vorliegende Erfindung schafft daher ein therapeutisches Mittel zum Behandeln von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen, welches Mittel Immunglobuline enthält, welche durch Injizieren der Zellwandproteine im Reinzustand, die durch die oben angeführten Abtrennungs- und Reinigungsvorgänge erhalten worden sind, in ein Versuchstier, zum Induzieren der Produktion von Immunglobulinen gegen Pseudomonas aeruginosa, erzeugt worden sind.
Insbesondere sind die abgetrennten und gereinigten Zellwandproteine, welche gemäss den vorstehend spezifisch erläuterten Verfahrensweisen aus attenuierten Pseudomonas aeruginosaStämmen der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind, Antigene, welche zum Beimpfen von Versuchstieren, wie z. B. Schafen, Kaninchen usw., zum Induzieren der Bildung der entsprechenden Antikörper, verwendet werden. Aus den Versuchstieren wird Blut gesammelt, wonach das Serum abgetrennt wird. Das abgetrennte Serum wird auf bekannte Art und Weise behandelt, um die gewünschten Immunglobuline in gereinigtem Zustand zu erhalten. Zu diesem Zweck kann die Abtrennung und Reinigung von Immunglobulinen aus dem abgetrennten Serum z.B. nach einem Verfahren durchgeführt werden, das auf dem betreffenden technischen Gebiet wohlbekannt ist [siehe Practical Immunology, 3. Aufl.
(1989), 292-294], nämlich durch Vermischen des abgetrennten Serums mit destilliertem Wasser, Zugabe des Gemisches zu DEAE-Zellulose (Diethylaminoethylzellulose), damit die Immunglobuline absorbiert werden, Entfernen des Überstandes und anschliessendes mehrmaliges Waschen der DEAE-Zellulose mit den absorbierten Immunglobulinen mit Phosphatpufferlösung zur Gewinnung der gereinigten Immunglobuline.
Die in dem therapeutischen Mittel verwendeten Immunglobuline zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen werden durch Immunisieren eines Versuchstieres mit einem Gemisch erhalten, welches Zellwandproteine in einem gewissen Verhältnis enthält, die aus verschiedenen attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen abgetrennt worden sind. Zu diesem Zweck können kombinierte Immunglobuline verwendet werden, welche durch Immunisieren des Versuchstieres mit einem Gemisch erhalten worden sind, welches aus jedem der Zellwandproteine besteht, die aus jedem der sieben (7) Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen in einem bestimmten Verhältnis, vorzugsweise in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen, gewonnen worden sind.
Betrachtet man jedoch die Kreuzreaktivität von jedem der Immunglobuline, dann sind die Immunglobuline, welche durch Immunisieren eines Versuchstieres mit einem Gemisch erhalten worden sind, welches aus Zellwandproteinen besteht, die aus jedem der 4 Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen abgetrennt worden sind, die folgenden : CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534, in einem Verhältnis von 1 :1:1:1, ergeben eine beträchtliche therapeutische Wirkung bei Infektionen, die durch sämtliche Pseudomonas aeruginosa-Stämme hervorgerufen worden sind, welche die Fisher-Typen 1, 2,3, 4, 5,6 und 7 aufweisen. Dies ist das bevorzugte therapeutische Mittel auf der Basis kombinierter Immunglobuline zum Behandeln einer durch Pseudomonas aeruginosa verursachten Erkrankung.
Die erfindungsgemässen Immunglobuline gegen Pseudomonas aeruginosa können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen in einer lyophilisierten Form oder in flüssiger Form formuliert werden; und sie können zusätzlich, falls dies erforderlich ist, pharmazeutisch annehmbare Träger, z. B. Stabilisatoren, Konservierungsmittel, isotonische Mittel und#dgl. enthalten. Die pharmazeutisch annehmbaren Träger, welche verwendet werden können, umfassen vorzugsweise z. B. Mannit, Lactose, Saccharose, Human-Albumin usw. im Falle von lyophilisierten Präparaten ; und physiologische Kochsalzlösung, Wasser für Injektionszwecke, Phosphatpufferlösung, Aluminiumhydroxid usw., im Falle von flüssigen Präparaten.
<Desc/Clms Page number 9>
Die Dosierung der Immunglobuline variiert in Abhängigkeit vom Alter, dem Körpergewicht,
Geschlecht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Subjektes, der Schwere der Pseudo- monas aeruginosa-Infektion und den Komponenten der zu verabreichenden, kombinierten Immun- globuline. Die Immunglobuline werden im allgemeinen in einer Menge von 0,1 mg bis 1000 mg, vorzugsweise von 1 mg bis 100 mg, pro Tag und pro kg Körpergewicht an einen Erwachsenen auf dem intravenösen Weg verabreicht.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht, sie wird jedoch durch die Beispiele in keiner Weise eingeschränkt.
Beispiel 1: Isolierung von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen aus mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Patienten und Identifizierung derselben.
Aus jeder von 260 verschiedenen Blutproben aus mit Pseudomonas aeruginosa infizierten
Patienten wurde eine aliquote Menge von etwa 1 bis 5 ml aseptisch gesammelt und während 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachdem das Blut in einem Kühlschrank bei 4 C über
Nacht gelagert worden war, wurde es während 10 min bei 4 C mit 1500xg (g = Schwerkraft) zentrifugiert, um die festen Substanzen zu entfernen und um ein Überstand-Serum zu gewinnen. Das wie oben gewonnene Serum wurde mit einer Phosphatpufferlösung (NaH2P04 1,15 g, KCI 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCI 8,766 g pro Liter) in einem Verhältnis von 1 :10 zu Lösung) verdünnt und dann auf einer Kulturplatte mit Sojabrühe mit Trypsingehalt unter Zugabe von 1,0 bis 1,5% Agar, welche Kulturplatte zuvor schon hergestellt worden war, ausgebreitet.
Die Kulturplatte wurde während 12 h oder darüber in einem auf einer konstanten Temperatur von 37 C gehaltenen Inkubator unter aeroben Bedingungen inkubiert. Die so erhaltenen Kulturen wurden auf frische Kultur- platten transferiert, wonach die gewünschten Mikroorganismen mit Hilfe eines bekannten Verfah- rens zum Isolieren von reinen Mikroorganismen [siehe Thomas D. Brock und Michael T. Madigan,
Biology of Microorganisms (1988), 5. Aufl., S. 32-33, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey] im Reinzustand isoliert wurden.
Für die isolierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme sind deren serologische und immunologische Kennmerkmale bereits veröffentlicht worden (siehe Bergey's Manual), und die Identifizierung dieser Stämme kann unter Verwendung eines kommerziellen Analysen-Kits nach dem Analysenverfahren bestimmt werden, das in J. Gen. Microbiol., 130,631-644, 1984, beschrieben ist. Mit jedem Pseudomonas aeruginosa-Stamm wurde ein Proberöhrchen beimpft, welches 5 ml Sojabrühe mit Trypsingehalt enthielt, wonach bei 37 C unter aeroben Bedingungen inkubiert wurde, um die Konzentration der Bakterienmasse so einzustellen, dass die dekadische Extinktion unter sichtbarem Licht von 650 nm bei etwa 2,0 oder darüber gehalten wurde.
Aus dieser Kulturlösung wurde ein aliquoter Anteil von 1 ml aseptisch entnommen und während 10 min bei 4 C mit 6000xg zentrifugiert. Die überstehende Kulturlösung wurde entfernt, und die ausgefällten Mikroorganismen wurden durch Zugabe der gleichen Menge an einer sterilisierten Kochsalzlösung suspendiert. Zu jeder Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurden jeweils 15 l des in dem Kit enthaltenen Testserums und des Kontrollserums (normalen Kaninchenserums) eingebracht und mit 15 l der wie oben erhaltenen Mikroorganismensuspension vermischt, um festzustellen, ob innerhalb von 10 bis 30 min eine Agglutination stattfand.
Bei dieser Untersuchung konnte die Identifizierung der isolierten Mikroorganismen leicht bewirkt werden, weil der Mikroorganismen-Stamm in einer Vertiefung mit positiver Agglutination einen Serotypus aufweist, der identisch mit jenem des hinzugefügten Serums ist.
Beispiel 2: Auswahl von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen aus jeder Charge von isolierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen.
Zum Attenuieren von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen zwecks Gewinnung sicherer Mikroorganismen für die Verwendung bei der Herstellung einer Vakzine wurde jeweils ein Stamm aus jedem der Pseudomonas aeruginosa-Stämme mit unterschiedlichen Immunotypen ausgewählt und dann durch wiederholte Reinigungsvorgänge attenuiert.
Bei diesem Verfahren wurde als Kontrolle ein toxischer Pseudomonas aeruginosa-Stamm GN 11189 (Episome Institute, Japan) ausgewählt, welcher eine Letalitätsrate von 100% innerhalb von 3 Tagen nach einer intravenösen (oder intraperitonealen) Injektion von 2,Ox106 Zellen des GN 11189 in eine männliche ICR-Maus mit einem Gewicht von 20 bis 25 g aufweist.
<Desc/Clms Page number 10>
Jeder Stamm der wie oben ausgewählten Pseudomonas aeruginosa-Stämme mit einem unterschiedlichen Immunotypus wurde in einer flüssigen Sojabrühe mit Trypsingehalt unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert und dann während 10 min bei 4 C mit 6000xg zentrifugiert.
Das so erhaltene Zellpräzipitat wurde in 10 ml von physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, nochmals unter den gleichen Bedingungen wie oben zentrifugiert und dann mit frischer physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um den Zellgehalt auf 5x105, 5x106, 5x107 und 5x108 Zellen pro ml einzustellen. Jede Zellverdünnung wurde an eine Gruppe, welche aus 10 ICR-Mäusen bestand, auf dem intravenösen (oder intraperitonealen) Weg verabreicht. An die Kontrollgruppe wurde der GN 11189-Stamm in einer Menge von 2,Ox106 Zellen pro Kontrolltier verabreicht. Zu dem Zeitpunkt, zu welchem die Letalität in der Kontrollgruppe innerhalb von 3 Tagen 100% betrug, wurden Pseudomonas aeruginosa-Stämme aseptisch aus jenen ICR-Mäusen/aus jener ICR-Maus isoliert, welche bei der höchsten Zellkonzentration überlebt haben bzw. hat.
Die isolierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme wurden nochmals auf einem Soja-Agar-Plattenmedium mit Trypsingehalt ausgebreitet. Nach dem oben erwähnten Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen im Reinzustand wurde jeder Mikroorganismenstamm im Reinzustand isoliert.
Alle sieben (7) Arten der ersten attenuierten Mikroorganismen wurden in wiederholten Passagen durch ICR-Mäuse geführt, nämlich etwa 3 bis 7 mal nach dem oben beschriebenen Verfahren, so lange, bis die gewünschte LDso von wenigstens 2,0x107 Zellen für jeden Mikroorganismenstamm erreicht worden war. Der Sicherheitswert für jeden schliesslich attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stamm, welcher Wert als LD50 ausgedrückt wird, ist in der nachstehenden Tabelle 2 angeführt.
EMI10.1
<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 2. <SEP> Sicherheitswerte <SEP> von <SEP> attenuierten <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa-Stämmen, <SEP> welche <SEP> gemäss
<tb> der <SEP> vorliegenden <SEP> Erfindung <SEP> ausgewählt <SEP> worden <SEP> sind.
<tb>
Ausgewählte <SEP> P. <SEP> Fisher-Devlin- <SEP> LD50 <SEP> LD50
<tb> aeruginosa-Stämme <SEP> Immunotypus <SEP> zu <SEP> Beginn <SEP> am <SEP> Ende
<tb> CFCPA <SEP> 10142 <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 1,5x106 <SEP> 7,6x107
<tb> CFCPA20215 <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 1,4x106 <SEP> 2,7x107
<tb> Test- <SEP> CFCPA <SEP> 30720 <SEP> 3 <SEP> < <SEP> 2,Ox106 <SEP> 2,5x108
<tb> Stamm <SEP> CFCPA <SEP> 40057 <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 3,7x106 <SEP> 4,5x10'
<tb> CFCPA <SEP> 50243 <SEP> 5 <SEP> < <SEP> 5,Ox106 <SEP> 3,0x107
<tb> CFCPA <SEP> 60534 <SEP> 6 <SEP> < <SEP> 1,5x106 <SEP> 2,0x107
<tb> CFCPA <SEP> 70018 <SEP> 7 <SEP> < <SEP> 3,8x106 <SEP> 2,7x107
<tb> Kontroll- <SEP> GN <SEP> 11189 <SEP> - <SEP> 2,0x106
<tb> Stamm
<tb>
Alle sieben (7) Arten der oben erwähnten Mikroorganismen zeigten einen Wert für die LD50 von wenigstens 2,0x107 Zellen.
Demgemäss konnte festgestellt werden, dass die attenuierten Mikro- organismen ausgewählt worden waren.
Beispiel 3 : Identifizierung des attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stammes.
Sterilisiertes, 10%iges (Gew.Nol.) Cetrimid wurde zu einem flüssigen Nährmedium (pH-Wert 7,2 bis 7,4) zugegeben, welches durch Sterilisieren in einem Autoklaven bei 121 C mit Wasserdampf während 15 min auf eine Endkonzentration von 0,3% (Vol./Vol.) gebracht worden war. Von dem so erhaltenen Medium wurde ein aliquoter Anteil von 10 ml aseptisch entnommen und dann in ein Proberöhrchen eingebracht, welches durch Zugabe eines Tropfens von jedem in Reinzustand gemäss dem obigen Beispiel 2 isoliertem Pseudomonas aeruginosa-Stamm beimpft und dann bei 30 bis 37 C während 12 bis 16 h einer Keim-Kultivierung unterworfen wurde.
Aus dem Proberöhrchen, in welchem das Wachstum der Mikroorganismen stattfindet, wurden 0,5 ml der Kulturlösung entnommen und auf einer Platte mit einem Cetrimid-Agarmedium als Pseudomonas aeruginosa-
<Desc/Clms Page number 11>
Isolationsmedium ausgebreitet, wonach die Platte inkubiert wurde.
Die zuerst als Pseudomonas aeruginosa durch Pigmentbildung identifizierte Kolonie wurde dann auf ein Pseudomonas aeruginosa-Agarmedium transferiert und auf demselben inkubiert, um den Fluorescein-Nachweis durchzuführen (Proteose-Pepton Nr. 3 (Oxoid) 2%, Glycerin (zweimal destilliert) 1%, K2HP04 (wasserfrei) 0,15%, MgS04.7H20 0,15%, Agar 1,5% (Gew.Nol.), pH 7,2); und sie wurde dann auf ein Pseudomonas aeruginosa-Agarmedium transferiert und auf demselben inkubiert, um den Pyocyanin-Nachweis durchzuführen (Pepton (Difco) 2%, Glycerin (zweimal destilliert) 1%, K2S04 (wasserfrei) 1%, MgCI2 (wasserfrei) 0,14%, Agar 1,5% (Gew./Vol.), pH 7,2);
und dann wurde diese Kolonie nochmals durch einen morphologischen Test auf ihre Erfordernisse hinsichtlich der Ernährung und durch einen Oxidasetest geprüft, um das Vorliegen des Pseudomonas aeruginosa-Stammes festzustellen. Die Typen der ausgewählten Pseudomonas aeruginosa-Stämme wurden nach dem IATS-Klassifikationssystem unter Verwendung eines (von den Difco Laboratories, Detroit, Michi- gan, USA, erzeugten) Pseudomonas aeruginosa-Antigen-Kits bestimmt ; dann wurden sie gemäss den Fisher-Immuno-/Serotypen klassifiziert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 angeführt.
Tabelle 3 : Kriterien für die Auswahl der Pseudomonas aeruginosa-Stämme sowie deren Sero- typen und Schutzbereich
EMI11.1
<tb>
<tb> Gegenstand <SEP> Testergebnisse
<tb> Wachstum <SEP> auf <SEP> Isolationsmedium <SEP> Wachstum
<tb> Wachstum <SEP> auf <SEP> Pseudomonas <SEP> Wachstum
<tb> aeruginosa-Medium <SEP> für <SEP> den
<tb> Nachweis
<tb> Morpologische <SEP> Merkmale <SEP> Beide <SEP> enden <SEP> sind <SEP> rund <SEP> und <SEP> es
<tb> (Mikroskop) <SEP> liegt <SEP> eine <SEP> einzige, <SEP> polare
<tb> Flagelle <SEP> vor.
<tb>
Gram-Anfärbung <SEP> Gram-negativ
<tb> Oxidase-Reaktion <SEP> Positive <SEP> Antwort <SEP> (+) <SEP> oder
<tb> positiv-negative <SEP> Antwort <SEP> (+)
<tb> Antigen-Antikörper-Reaktion <SEP> -¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb> (für <SEP> die <SEP> ersten <SEP> ausgewählten
<tb> Stämme)
<tb> CFCPA <SEP> 20215 <SEP> Schutzgewährend <SEP> für <SEP> die
<tb> Fisher-Typen <SEP> 3 <SEP> und <SEP> 7 <SEP> als
<tb> Fisher-Immunotypus <SEP> 2
<tb> (0-Serotypus <SEP> 7)
<tb> CFCPA <SEP> 60534 <SEP> Schutzgewährend <SEP> für <SEP> die
<tb> Fisher-Typen <SEP> 3 <SEP> und <SEP> 7 <SEP> als
<tb> Fisher-Immunotypus <SEP> 6
<tb> (O-Serotypus <SEP> 5)
<tb> CFCPA <SEP> 10142 <SEP> Schutzgewährend <SEP> für <SEP> die
<tb> Fisher-Typen <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 1 <SEP> als
<tb> Fisher-Immunotypus <SEP> 1
<tb> (O-Serotypus <SEP> 4)
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb> Gegenstand <SEP> Testergebnisse
<tb> CFCPA <SEP> 30720, <SEP> Schutzgewährend <SEP> für <SEP> den
<tb> CFCPA <SEP> 30721 <SEP> Fisher-Tyus <SEP> 6 <SEP> als
<tb> Fisher-Immunotypus <SEP> 3
<tb> (O-Serotypus <SEP> 3)
<tb>
Beispiel 4 : Physiologische Kennmerkmale der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme (1) Für jede der sieben Arten von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, welche gemäss Beispiel 2 attenuiert worden sind, wurden die Wachstumsraten in Abhängigkeit von verschiedenen pH-Werten bestimmt. Jeweils 50 ml einer Sojabrühe mit Trypsingehalt mit einem pH-Wert von 7,2 wurden mit jedem Mikroorganismenstamm beimpft und anschliessend bei einer Umrührgeschwindigkeit von 200 U/min unter aeroben Bedingungen während 12 bis 16 h bei 37 C vorinkubiert.
Mit der Bakterienmasse von jedem vorinkubierten Stamm wurden jeweils 500 ml einer frischen Sojabrühe mit Trypsingehalt vom pH 3,0, pH 5,0, pH 7,0 bzw. pH 9,0 auf eine Endkonzentration von 1% (Vol./Vol.) beimpft, wonach in Fermentern bei 37 C unter den gleichen Bedingungen wie oben inkubiert wurde. Während dieser Zeitspanne wurden aus jedem Kulturmedium in Abständen von 2 h Proben entnommen, worauf die Konzentration der Bakterienmasse durch Messen der dekadischen Extinktion der Probe bei 600 nm mit Hilfe eines Spektrophotometers bestimmt wurde. Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in der nachstehenden Tabelle 4 angeführt.
EMI12.2
<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 4. <SEP> Wachstumsraten <SEP> der <SEP> Mikroorganismen <SEP> in <SEP> Abhängigkeit <SEP> vom <SEP> pH-Wert.
<tb>
Stämme <SEP> pH <SEP> 3.0 <SEP> pH <SEP> 5.0 <SEP> pH <SEP> 7.0 <SEP> pH <SEP> 9.0 <SEP>
<tb> CFCPA <SEP> 10142 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP>
<tb> CFCPA <SEP> 20215 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP>
<tb> CFCPA <SEP> 30720 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> CFCPA <SEP> 40057 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> CFCPA <SEP> 50243 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> CFCPA <SEP> 60534 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> CFCPA <SEP> 70018- <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb>
Anm.: + Wachstum, - Kein Wachstum
Aus der Tabelle 4 ist zu ersehen, dass die attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung unter stark sauren Bedingungen, z.
B. bei einem pH-Wert von 3,0, nicht wuchsen, dass sie aber unter den Bedingungen des Mediums von einem pH-Wert von 5,0 bis zu einem pH-Wert von 9,0 im wesentlichen identische oder ähnliche Wachstumsraten zeigten. Daher können im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle 7 Arten von Mikroorganismen sehr wohl innerhalb eines weiten Bereiches von pH-Werten wachsen.
(2) Nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) oben, wurden die Wachstumsraten von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen gemäss Veränderungen in der Temperatur bestimmt. Jeweils 50 ml einer Sojabrühe mit Trypsingehalt mit einem pH-Wert von 7,0 wurden mit jedem der sieben Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen beimpft und dann während 12 bis 16 h bei 37 C unter aeroben Bedingungen und bei einer Umrührgeschwindigkeit von 200 U/min vorinkubiert. Mit jedem der vorinkubierten Stämme wurden jeweils 500 ml einer Sojabrühe mit Trypsingehalt und mit einem pH-Wert von 7,0 beimpft und dann in Fermentem inkubiert, welche unter den gleichen Bedingungen wie oben bei verschiedenen Temperaturen von 25 C, 30 C, 37 C bzw. 42 C gehalten wurden.
Während dieser Zeitspanne wurde die Wachstumsrate in jedem Fermenter durch Messung der dekadischen Extinktion der Kulturlösung bei 600 nm mit Hilfe eines Spektrophotometers bestimmt Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 angeführt.
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb>
<tb> Tabelle <SEP> 5. <SEP> Wachstumsraten <SEP> der <SEP> Mikroorganismen <SEP> in <SEP> Abhängigkeit <SEP> von <SEP> Temperaturänderungen.
<tb>
Stamm <SEP> 25 C <SEP> 30 C <SEP> 37 C <SEP> 42 C
<tb> CFCPA <SEP> 10142 <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +
<tb> CFCPA <SEP> 20215 <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +
<tb> CFCPA <SEP> 30720 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +
<tb> CFCPA <SEP> 40057 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +
<tb> CFCPA <SEP> 50243 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +
<tb> CFCPA <SEP> 60534 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +
<tb> CFCPA <SEP> 70018 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +
<tb> Anm.: <SEP> + <SEP> Wachstum, <SEP> - <SEP> Kein <SEP> Wachstum
<tb>
Aus der Tabelle 5 ist zu ersehen, dass alle 7 Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosaStämmen das beste Wachstum bei 37 C zeigten, und dass sie auch ein gutes Wachstum bei 30 C, 25 C zeigten.
Bei 42 C zeigte jedoch jede der sieben Arten von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen eine relativ niedrige Wachstumsrate im Vergleich zu der Wachstumsrate bei den anderen Temperaturen.
(3) Der nachstehende Versuch zielte darauf ab, die Wirkung der Kohlenstoffquelle auf die Wachstumsrate der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme zu bestimmen. Mit jedem der 7 Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen wurden jeweils 50 ml einer Sojabrühe mit Trypsingehalt und mit einem pH-Wert von 7,0 beimpft, wonach bei 37 C während 12 bis 16 h unter aeroben Bedingungen und bei einer Umrührgeschwindigkeit von 200 U/min inkubiert wurde. Das Kulturmedium wurde dann mit 6000xg bei 4 C während 10 min unter aseptischen Bedingungen zentrifugiert, um die Bakterienmasse zu ernten, welche dann erneut in 10 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert wurde.
Mit je 50 l der oben erhaltenen Mikroorganismensuspensionen wurden dann jeweils 5 ml eines M9-Mediums (Na2HPO4. 7H2O 12,8 g, KH2P04 3 g, NaCI 0,5 g, NH4C1 1 g) beimpft, weiches verschiedene Kohlenstoffquellen enthielt (diesbezüglich siehe die nachstehende Aufstellung), wonach dann während 12 h inkubiert wurde.
Dann wurde für jede Kulturlösung das Ausmass des Mikroorganismenwachstums durch Messung der dekadischen Extinktion bei 600 nm bestimmt.
EMI13.2
<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 6: <SEP> Wachstums-Kennmerkmale <SEP> der <SEP> attenuierten <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa-Stämme <SEP> in
<tb> Abhängigkeit <SEP> von <SEP> der <SEP> Kohlenstoffquelle.
<tb>
P. <SEP> aeruginosa- <SEP> CFCPA <SEP> CFCPA <SEP> CFCPA <SEP> CFCPA <SEP> CFCPA <SEP> CFCPA <SEP> CFCPA
<tb> Stämme <SEP> 10142 <SEP> 20215 <SEP> 30720 <SEP> 40057 <SEP> 50243 <SEP> 60534 <SEP> 70018
<tb> Kohlenstoffquellen <SEP> @
<tb> Glukose <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Xylose
<tb> Mannit <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Galaktose <SEP> ¯ <SEP> - <SEP>
<tb> Sorbit
<tb> Inosit
<tb> Maltose
<tb> Saccharose
<tb> Arabinose
<tb> Mannose <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> -
<tb> #-Alanin <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> Nur <SEP> Salze <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 14>
Anm.:
+ Wachstum, - Kein Wachstum
Die Wachstums-Kennmerkmale der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme in Abhän- gigkeit von den Kohlenstoffquellen zeigten ein Muster, welches im wesentlichen den Wachstums-
Kennmerkmalen von allgemeinen Pseudomonas aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von den
Kohlenstoffquellen gleicht (siehe Bergey's Manual). Bemerkt sei jedoch, dass der attenuierte Pseu- domonas aeruginosa gemäss der vorliegenden Erfindung ein geringes Ausmass von Wachstum in dem mannosehältigen Medium zeigte, obwohl berichtet worden ist, dass Pseudomonas aeruginosa generell Mannose nicht verwertet.
Aus den obigen Ausführungen ist zu ersehen, dass die attenuierten Pseudomonas aeruginosa-
Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung in einem herkömmlichen Medium, welches eine
Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen, Aminosäuren, Vitamine und andere Nährstoffe enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer ausgewählten Temperatur, einem ausgewählten pH-Wert usw. zur Gewinnung einer Bakterienmasse inkubiert werden können. Die
Zellwandproteine aus der so erhaltenen Bakterienmasse werden zur Herstellung von Pseudomo- nas aeruginosa-Vakzinen verwendet.
Als Kohlenstoffquelle für die Inkubation der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme können verschiedene Kohlenhydrate, wie z.B. Glukose, Mannit, Fruktose usw., verschiedene orga- nische Säuren, wie z. B. Essig-, Brenztrauben-, Milchsäure und dgl., verwendet werden. Als Stick- stoffquelle können verschiedene organische und anorganische Ammoniumsalze, Pepton, Hefe-
Extrakte, Casein-Hydrolysate und die anderen stickstoffhaltigen Substanzen verwendet werden.
Als anorganische Verbindungen können Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Ferrosulfat, Cuprosul- fat, Zinksulfat, Kaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat und dgl. verwendet werden.
Die Inkubation wird vorzugsweise bei 25 bis 37 C unter aeroben Bedingungen, z. B. mit Hilfe einer
Plattenkultur oder einer flüssigen Kultur, wie z.B. einer Schüttelkultur oder einer Spinner-Kultur mit
Belüftung, durchgeführt. Während der Inkubationsperiode wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise auf einem pH-Wert von 5 bis 9 gehalten. Vorzugsweise wird die Bakterienmasse, wel- che durch Zentrifugieren der während 12 bis 16 h inkubierten Kulturlösung gewonnen wird, als
Ausgangsmaterial für die Herstellung von Vakzinen verwendet, wie dies nachstehend beschrieben ist.
Beispiel 5: Inkubation der attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme.
(1) In einem 5-Liter-Fermenter wurde die gemäss Beispiel 2 erhaltene Bakterienmasse von
Pseudomonas aeruginosa zur Massenproduktion wie folgt inkubiert. 2,5 Liter einer Mediumlösung, die durch Auflösen von 30 g Sojabrühe mit Trypsingehalt in 1 Liter von destilliertem Wasser erhalten worden war, wurden auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, sterilisiert und dann in den 5-Liter- Fermenter eingebracht.
Die Inkubationsbedingungen waren die folgenden : DieInkubationstempe- ratur betrug 37 C; die Belüftungsrate betrug 1 Vol./Vol./min; die Beimpfungsmenge betrug 5% (Vol.Nol.) an der aus der Kulturlösung des Beispiels 2 gewonnenen Bakterienmasse von Pseudomonas aeruginosa ; und die Umrührgeschwindigkeit wurde während der anfänglichen 2 h auf
100 U/min gehalten, wonach die Inkubation während 12 bis 16 h bei einer feststehenden Umrührgeschwindigkeit von 600 U/min fortgesetzt wurde. Obgleich die Mengen der erhaltenen Bakterienmasse in Abhängigkeit von dem Typus des Pseudomonas aeruginosa-Stammes etwas differierten, so betrug die mittlere Ausbeute dennoch etwa 8 g (an Trockengewicht) der Bakterienmasse pro Liter der Kulturlösung.
(2) Jeder dieser sieben Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen wurde unter den gleichen Inkubationsbedingungen wie oben unter (a) inkubiert, jedoch mit der Ausnahme, dass als Medium ein Spezialmedium zum Kultivieren des Pseudomonas aeruginosa verwendet wurde, welches aus Glukose (30 g/l), Pepton (15 g/l), MgS04 (0,5 g/l), CaC03 (5 g/l), KH2P04 (1 g/l), FeS04 (5 mgll), CuS04 (5 mg/l) und ZnS04 (5 mg/l) bestand. Mit diesem Spezialmedium wurden etwa 10,4 g bis 10,5 g (Trockengewicht) an Bakterienmasse für jeden Mikroorganismenstamm erhalten.
Durch die Verwendung dieses Spezialmediums lässt sich somit eine Ausbeute an Bakterienmasse erzielen, welche um wenigstens 30% (bezogen auf das Trockengewicht) höher als jene ist, die in der Sojabrühe mit Trypsingehalt erhalten wird.
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Beispiel 6: Teilweise Reinigung von Zellwandproteinen aus attenuierten Pseudomonas aerugi- nosa-Stämmen.
Zur Herstellung von Vakzinen gegen Pseudomonas aeruginosa wurden die Zellwand proteine aus jeder der sieben Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen teilweise gerei- nigt. Nachstehend wird der Stamm des Typus 3, nämlich CFCPA 30720 (KCCM 10031),als typi- sches Beispiel verwendet. Die anderen attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme können jedoch ebenfalls dem gleichen Verfahren wie der nachstehenden Reinigungsmethode zur Gewin- nung der teilweise gereinigten Zellwandproteine unterworfen werden.
2,5 Liter des im obigen Beispiel 4 (2) verwendeten Spezialmediums wurden in einen 5 Liter-
Fermenter eingebracht und dann während 12 bis 16 h unter Einhaltung der gleichen Inkubationsbedingungen wie oben inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden 2,5 Liter der Kultur- lösung mit 6000xg bei 4 C während 20 min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Die ausgefällten Zellen wurden erneut in einer Phosphatpufferlösung (Na2HPO4 1,15 g, KCI 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCI 8,766 g, pro Liter, pH 7,2) bei 4 C suspendiert, nochmals zentrifugiert und dann mit der gleichen Phosphatpufferlösung gewaschen. Zu 130 g der so erhaltenen Zellen wurden 3 Volumensanteile (etwa 390 ml) an Aceton, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der nassen Zellen, zugegeben, und das Gemisch wurde während 12 h oder darüber bei 4 C stehen gelassen.
Das Aceton wurde von den ausgefällten Zellen entfernt, und 2 Volumensanteile (etwa 260 ml) an frischem Aceton, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der nassen Zellen, wurden wieder zu dem Rückstand gegeben. Das so entstandene Gemisch wurde während 5 bis 10 min umgerührt und dann während 20 min bei 4 C mit 8000xg zentrifugiert. Das überstehende Aceton wurde entfernt, und das gleiche Volumen an Aceton wurde zu dem Rückstand zugegeben. Das Gemisch wurde in der gleichen Weise wie oben beschrieben umgerührt und zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Die ausgefällten Zellen wurden auf einer Platte bei Raumtemperatur getrocknet, um das Aceton zu entfernen.
Die getrockneten Mikroorganismen wurden erneut durch Zugabe von 250 ml der gleichen Phosphatpufferlösung wie oben suspendiert, so dass die Endkonzentration auf
10% (Vol./Vol.) eingestellt werden konnte. Das so entstandene Gemisch wurde zum Extrahieren der Zellwandproteine während 10 min bei einer Geschwindigkeit von 500 bis 1500 U/min unter Aufrechterhaltung der Temperatur auf 4 C in einem Homogenisator behandelt. Die so erhaltene Suspension wurde mit 8000 bis 10.000xg während 30 min zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Die ausgefällten Zellen wurden abgetrennt, durch Zugabe des gleichen Volumens an der Phosphatpufferlösung erneut suspendiert und dann zur Gewinnung des Überstandes einem zweiten Extraktionsvorgang unter den gleichen Bedingungen wie bei dem obigen ersten Extraktionsvorgang unterworfen.
Unter Anwendung der gleichen Bedingungen wie bei dem ersten Extraktionsverfahren wurden die Zellwandproteine wiederholt, nämlich fünf- bis sechsmal, extrahiert, wobei darauf zu achten ist, dass keine der Zellen (durch Lyse) zerstört wird. Die Zerstörung der Zellen kann durch Messen eines spezifischen Proteins als Zytoplasma-Markersubstanz, nämlich der Lactatdehydrogenase oder Hexokinase, festgestellt werden. Die extrahierten Überstände, von denen ein jeder geprüft wird, um zu gewährleisten, dass die Zellwandproteine ohne Beimengung von Zytoplasmaproteinen, Lactatdehydrogenase und Hexokinase extrahiert werden, wurden gesammelt, umgerührt und dann schliesslich erneut mit 10.000xg bei 4 C während 30 min zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu gewinnen.
Die so erhaltene Proteinlösung bestand nur aus im wesentlichen reinen Zellwandproteinen; und sie wurde gemäss einem quantitativen Proteintest so eingestellt, dass die Proteinkonzentration auf einem Stand von 1 mg/ml bis 2 mg/ml gehalten wurde. Weiterhin wurde die Reinheit der Proteinlösung mit Hilfe einer Elektrophorese bei einem Konzentrationsgradienten von 10 bis 15% bestimmt. Als Ergebnis derselben konnte festgestellt werden, dass die gewünschten Zellwandproteine mit einem Molekulargewichtsbereich von 10. 000 bis 100. 000 vorlagen (siehe die Fig. 1).
Beispiel 7 : Reinigung der Rohproteine auf einen sehr hohen Reinheitsgrad
Das nachstehende Verfahren wurde durchgeführt, um die Lösung der Rohzellwandproteine in einer Konzentration von 1 bis 2 mg/mi dahingehend zu reinigen, dass sie nur mehr die wirksamen Komponenten enthielt.
2 bis 2,5 Liter einer Lösung von Rohzellwandproteinen wurden mit einem MG-100.000-Cut-offMembranfilter in dem Pellicon Cassettensystem behandelt, um Proteinmoleküle mit Molekular-
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gewichten über 100. 000 zu entfernen. Gemäss diesem Verfahren wurden die Proteine mit einem
Molekulargewicht unter 100.000 als Filtrat rückgewonnen, und die Proteine mit einem Molekulargewicht über 100. 000 wurden kontinuierlich in Umlauf gehalten, um dieselben von den kleinen Mole- külen mit einem Molekulargewicht unter 100. 000 abzutrennen.
Demzufolge wurde die Proteinlösung um 10% bis 20% des anfänglichen Volumens konzent- riert, und sie wurde aufeinanderfolgend mit 20 bis 25 Litern (der zehnfachen Menge des anfängli- chen Volumens der Proteinlösung) einer sterilisierten Phosphatpufferlösung (Na2HP04 1,15 g, KCI
0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCI 8,766 g, pro Liter), gewaschen, um 90% oder mehr der Proteine mit einem Molekulargewicht unter 100. 000 rückzugewinnen.
Die Proteine mit einem Molekulargewicht unter 100.000, welche als Filtrat abgetrennt worden waren, wurden auf ein MG-10.000-Cut-off-
Membranfilter in dem gleichen System aufgebracht, um die Proteine mit einem Molekulargewicht unter 10. 000 und andere Verunreinigungen zu entfernen und um gleichzeitig die Proteine, welche
Molekulargewichte von 10.000 bis 100.000 haben, auf eine Konzentration von 1 mglml zu konzent- rieren.
Schliesslich wurde der Überstand ultrazentrifugiert, um die Lipopolysaccharide (LPS) und mit der Zellwand zusammenhängende Fragmente zu entfernen, welche möglicherweise in dem oben erhaltenen Überstand in Spurenmengen vorhanden sind. Die Ultrazentrifugation wird mit
180.000xg bis 200.000xg während 3 h bei 4 C durchgeführt. Nach dem Entfernen der Präzipitate wurde der gewonnene Überstand durch Filtration durch ein 0,2 m-Filter sterilisiert, um 250 bis 260 mg einer für die Verwendung in Vakzinen für eine Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen bestimmten Proteinzusammensetzung zu erhalten.
Beispiel 8: Reinigung von Zellwandproteinen aus attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stäm- men, welche unterschiedliche Immunotypen aufweisen
Die restlichen sechs Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen gemäss der vorliegenden Erfindung, nämlich CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 und CFCPA 70018, wurden nach dem gleichen Verfahren wie jenem für die lnkubation und Reinigung von Mikroorganismen behandelt, wie dies in den Beispielen 5, 6 und 7 beschrieben ist, um eine Vakzinenzusammensetzung für den Pseudomonas aeruginosa-Stamm CFCPA 30720 herzustellen. Die schliesslich in dieser Weise erhaltenen Pseudomonas aeruginosaVakzinenzusammensetzungen zeigten das gleiche Bandenmuster wie die CFCPA 30720-Vakzinezusammensetzung in einer SDS-PAGE mit einem Konzentrationsgradienten von 10 bis 15%.
Ausserdem konnte als Ergebnis eines Vergleiches mit einem Standard-Molekulargewichtsmarker festgestellt werden, dass alle in den Vakzinenzusammensetzungen enthaltenen Proteine den Molekulargewichtsbereich von 10. 000 bis 100. 000 aufweisen (Fig. 1).
Beispiel 9 : Test auf das Vermögen einer Kreuz-Schutzgewährung mit kombinierten Antigenen
Die Zellwand proteine, welche aus jedem attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stamm nach Durchführung der in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Abtrennungs- und Reinigungsstufen erhalten worden waren, wurden intraperitoneal in einer Menge von 0,2 mg/kg an 6 Wochen alte, männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 23 bis 25 g verabreicht, um die Tiere zu immunisieren. Jede Gruppe bestand aus 10 bis 15 Versuchstieren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde aus 2 bis 3 Mäusen pro Gruppe für die Durchführung von ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) Blut entnommen.
Den restlichen ICR-Mäusen wurde jeweils ein dem jeweiligen Immunotypus entsprechender Pseudomonas aeruginosa-Stamm vom Wildtypus in einer Menge injiziert, welche dem 10- bis 50-fachen des anfänglichen LDso-Wertes für jeden in der Tabelle 2 in Beispiel 2 angeführten Mikroorganismusstamm entsprach. Die Schutzwirkung gegen den Pseudomonas aeruginosa-Stamm wurde während einer Woche kontinuierlich untersucht. Als Ergebnis zeigten alle Testgruppen eine Schutzwirkung gegen die entsprechenden Pseudomonas aeruginosa-Stämme, und die ELISA-Tests für alle gesammelten Blutproben zeigten ebenfalls gute positive Werte, was eine Verbesserung in den immunologischen Antworten bedeutet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden zur Herstellung von Vakzinen, welche befähigt sind, die normale Schutzwirkung gegen Infektionen zu zeigen, die durch irgendeinen Typus von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen verursacht worden sind, vier Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen (drei Typen von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, welche bei
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Infektionen im menschlichen Körper am häufigsten nachgewiesen werden, und ein Typus eines Pseudomonas aeruginosa-Stammes, der nur schwer zu überwinden ist, wenn man ihn sich einmal zugezogen hat, nämlich CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534), zur Gewinnung von Zellwandproteinen behandelt,
welche in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen miteinander kombiniert und dann auf ihr Kreuz-Schutzvermögen gegen jeden Immunotypus von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen geprüft wurden.
Die aus den vier oben angegebenen Pseudomonas aeruginosa-Stämmen abgetrennten Zellwandproteine wurden - auf Gewichtsbasis - in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen (1:1:1:1) miteinander vereinigt. Die kombinierten Zellwandproteine wurden intraperitoneal an männliche ICR-Mäuse verabreicht, um die Versuchstiere zu immunisieren. Die Kontrollgruppe erhielt 0,3 ml einer Phosphatpufferlösung (Na2HPO4 1,15 g, KCI 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCI 8,766 g, pro Liter).
Eine Woche nach der Immunisierung wurde an jedes Tier in der Testgruppe, welche mit einer Pseudomonas aeruginosa-Vakzine immunisiert worden war, bzw. in der Kontrollgruppe, die mit der Phosphatpufferlösung immunisiert worden war, intraperitoneal Pseudomonas aeruginosa in fünf (5) verschiedenen Konzentrationen, und zwar in 10-fach-Reihenverdünnungen von 1x108 Zellen bis 1x104 Zellen, verabreicht ; und nach einer Woche wurde die Anzahl der überlebenden Versuchstiere festgestellt, um den Effizienzindex (EI, "efficacy index") zu berechnen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der nachstehenden Tabelle 7 angeführt, in welcher der Effizienzindex als ein LDso-Wert in der Testgruppe, dividiert durch den LDso-Wert in der Kontrollgruppe, definiert ist.
Aus der Tabelle 7 ist zu ersehen, dass eine Vakzine, welche aus den Zellwandproteinen besteht, welche aus 4 Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, nämlich CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534, gewonnen worden sind, einen EI-Wert von 3,0 bis 18 oder darüber gegenüber jedem Immunotypus von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen aufweist. Zieht man daher in Betracht, dass Vakzine, welche einen EI-Wert von wenigstens 2 haben, dahingehend eingestuft werden, dass sie eine gute immunologische Wirkung haben, dann ist zu ersehen, dass die Vakzinen gemäss der vorliegenden Erfindung eine gute Schutzwirkung gegen Infektionen aufweisen, die von irgendeinem Typus der 7 Arten von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen verursacht worden sind.
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<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 7 <SEP> : <SEP> Test <SEP> auf <SEP> das <SEP> Kreuz-Schutzvermögen <SEP> von <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa-Vakzinen, <SEP> welche
<tb> unter <SEP> Verwendung <SEP> von <SEP> vier <SEP> (4) <SEP> verschiedenen <SEP> Spezies <SEP> von <SEP> attenuierten <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa-Stämmen <SEP> hergestellt <SEP> worden <SEP> sind, <SEP> gegen <SEP> jeden <SEP> Typus <SEP> dieser <SEP> Mikroorganismen.
<tb>
Zum <SEP> Infizieren <SEP> Immunotypus <SEP> Serotypus <SEP> EI-Wert
<tb> verwendeter <SEP> Stamm
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 10142 <SEP> 1 <SEP> 06 <SEP> 9,5
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 20215 <SEP> 2 <SEP> 011 <SEP> 13
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 30720 <SEP> 3 <SEP> 02 <SEP> > 18
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 40057 <SEP> 4 <SEP> 01 <SEP> 3
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 50243 <SEP> 5 <SEP> 010 <SEP> 4,5
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 60534 <SEP> 6 <SEP> 07 <SEP> 8,4
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 70018 <SEP> 7 <SEP> 05 <SEP> 7
<tb>
Gemäss dem oben beschriebenen Verfahren, jedoch mit der Ausnahme, dass das hergestellte Gemisch aus Zellwandproteinen aus 3 Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, nämlich CFCPA 10142, CFCPA 30720 und CFCPA 20215 (Gruppe I)
stammte, bzw. dass das Gemisch von Zellwandproteinen aus allen 7 Typen von attenuierten Pseudomonas aeruginosaStämmen (Gruppe II) hergestellt worden war, wurde das Kreuz-Schutzvermögen dieser beiden Arten von Vakzinen gegen Infektionen mit jedem Pseudomonas aeruginosa untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der nachstehenden Tabelle 8 angeführt.
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Tabelle 8 : Test auf das Kreuz-Schutzvermögen von Vakzinen, welche aus 3 Typen (Gruppe I) oder aus 7 Typen (Gruppe II) von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen stammen, gegen jeden Typus dieser Mikroorganismen.
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<tb>
<tb>
Zum <SEP> Infizieren <SEP> El-Wert <SEP> (LD50 <SEP> in <SEP> der <SEP> Testgruppe
<tb> verwendeter <SEP> Stamm <SEP> Et-Wert <SEP> (LD50 <SEP> in <SEP> der <SEP> Kontrollgruppe
<tb> Gruppe <SEP> Gruppe <SEP> II
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 10142 <SEP> 14,3 <SEP> 9,2
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 20215 <SEP> 12,0 <SEP> 10,7
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 30720 <SEP> > 18,0 <SEP> 15,0
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 40057 <SEP> 2,5 <SEP> 8,3
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 50243 <SEP> 4,0 <SEP> 10,6
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 60534 <SEP> 3,7 <SEP> 9,7
<tb> Mutterstamm <SEP> von <SEP> CFCPA <SEP> 70018 <SEP> 2,8 <SEP> 12,9
<tb>
Aus den obigen Versuchsergebnissen ist zu ersehen,
dass diese Vakzine eine ausgezeichnete Schutzwirkung gegen jeden Immunotypus von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zu nur einer einzigen Art von normalem Antigen aufweist, weil die aus gemischten Proteinkomponenten bestehende Vakzine gemäss der vorliegenden Erfindung aus Zellwandproteinen zusammengesetzt ist, die aus wenigstens drei (3) verschiedenen Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosaStämmen, welche voneinander unterschiedliche Immunotypen aufweisen, hergestellt worden sind.
Dies bedeutet, dass, obgleich der Effizienzindex der Vakzine gemäss der vorliegenden Erfindung mit der Art und Anzahl der aus attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen ausgewählten Mikroorganismen, dem Mischverhältnis der daraus stammenden Zellwand proteine, dem immunologischen Schema und Verfahren usw. variiert, man dennoch bestätigen kann, dass die Vakzine der vorliegenden Erfindung gegen alle Pseudomonas aeruginosa-Stämme wirksam ist, die gegenwartig in Spitälern und Patienten vorkommen.
Beispiel 10: Toxikologie-Test für die Zellwandproteine
Für die Herstellung einer aus Komponenten bestehenden Vakzine für die Prophylaxe gegen durch Pseudomonas aeruginosa verursachte Infektionen muss die Sicherheit der als Komponenten der Vakzine zu verwendenden Zellwand proteine als solchen, sowie die Sicherheit der in Beispiel 2 beschriebenen Mikroorganismenstämme als solchen gewährleistet sein. Bei diesem Beispiel wurden die Zellwandproteine teilweise gereinigt und dann auf ihre Sicherheit in einem Versuchstier, nämlich der Maus, untersucht. Insbesondere wurde jeder der attenuierten Mikroorganismen mit Sojabrühe mit Trypsingehalt als Kulturmedium in einem 5-Liter-Fermenter inkubiert und dann gemäss den in den Beispielen 5,6 und 7 beschriebenen Verfahren behandelt.
Die Überstände der aus den attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen extrahierten Zellwandproteine wurden gesammelt, vereinigt und nochmals mit 10.000xg bei 4 C während 30 min zentrifugiert, um die möglicherweise in der Lösung vorhandenen Feinteilchen zu entfernen. Die so erhaltenen Zellwandproteine wurden durch ein Amicon-Membranfilter filtriert, wobei ein Gemisch von Zellwandprotei- nen erhalten wurde, welche Molekulargewichte in einem Bereich von 10. 000 bis 100. 000 haben, welches Gemisch dann auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/mi konzentriert und dann mit einem 0,2 m-Filter sterilisiert wurde, um eine Proteinquelle für eine toxikologische Untersuchung zu erhalten.
Bei dieser toxikologischen Untersuchung waren die verwendeten Versuchstiere männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 22 g. Die Proteinquelle wurde den Tieren in der Testgruppe intravenös in einer Menge von 20 mg/kg bzw. 100 mg/kg injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt eine physiologische Kochsalzlösung in einer Menge von 25 ml/kg. Aus der Tabelle 9 und der angeschlossenen Fig. 2 ist zu ersehen, dass die Testgruppe am ersten Tag nach der Verabreichung eine geringfügige Hemmung der Gewichtszunahme zeigte, dass sie aber am zweiten Tag nach der
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Verabreichung und an den darauffolgenden Tagen ein normales Wachstum und keine speziellen Symptome zeigte. Zusätzlich konnten selbst am 7. Tag und danach keine spezifischen Veränderungen oder Symptome in irgendwelchen Organen festgestellt werden.
Tabelle 9- Toxikologischer Akuttest für die aus attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen stammende Zellwandproteinquelle
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<tb>
<tb> Gruppe <SEP> Dosierung <SEP> Test- <SEP> Überlebende <SEP> Anmerkungen
<tb> Subjekte <SEP> Subjekte/
<tb> Test-Subjekte
<tb> Test- <SEP> 20mg/kg <SEP> 20 <SEP> 20/20 <SEP> Keine <SEP> Ändegruppe <SEP> A <SEP> rung <SEP> des <SEP> Körpergewichtes
<tb> Test- <SEP> 100mg/kg <SEP> 15 <SEP> 15/15 <SEP> Änderung <SEP> des
<tb> gruppe <SEP> B <SEP> Körpergewichtes <SEP> nur <SEP> am
<tb> ersten <SEP> Tag
<tb> Kontroll- <SEP> Physiolog. <SEP> 15 <SEP> 15/15 <SEP> Keine <SEP> Ändegruppe <SEP> Kochsalz- <SEP> rung <SEP> des <SEP> Körlösung <SEP> pergewichtes
<tb>
Beispiel 11:
Bestimmung der Antigenität von Zellwandproteinen
Die durch teilweise Reinigung von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen in gleicher Weise wie in Beispiel 10 erhaltenen Zellwandproteine wurden als Antigene verwendet und wurden ICR-Mäusen in einer Menge von 0,1 mg/kg oder 0,2 mg/kg intravenös injiziert, um die Versuchstiere zu immunisieren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde aus jeder Maus in der Gruppe von Mäusen eine gewisse Blutmenge entnommen, das Serum wurde von dem gesammelten Blut abgetrennt, und die Bildung von Antikörpern wurde nach dem ELISA-Verfahren bestimmt [J. Clin.
Microbiol. 15, 1054-1058, 1982].
Zuerst wurden in jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen 100 l des in Beispiel 10 hergestellten Antigens eingebracht, welches Antigen in einem Überzugspuffer (nämlich einer 0.05M Carbonatpufferlösung, welche aus NaHC03 2,85 g, Na2C03 1,70 g, H20 1 g, pH 9,6, bestand) auf eine Konzentration von 0,1mg/ml eingestellt worden war, wonach das Antigen entweder bei Raumtemperatur während 2 h oder bei 4 C während 12 bis 14 h reagieren gelassen wurde, um das Protein durch Adhäsion an die Platte zu binden.
Nach dem Entfernen der wässrigen Lösung wurden 200 l einer 1%igen Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) zu jeder Vertiefung in der Platte hinzugefügt, wonach bei Raumtemperatur während 1 h reagieren gelassen wurde, um den restlichen, nicht an das Protein gebundenen Anteil in den Vertiefungen zu blockieren.
Bei diesem Test wurde das Serum einer nicht-immunisierten Maus als Antikörper für die Kontrollgruppe verwendet. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Platte wieder fünf- bis sechsmal mit einer Phosphatpufferlösung (vom pH 7,0 bis 7,2) gewaschen, wonach zu jeder Vertiefung 100 l eines zweiten Antikörpers, nämlich eines Kaninchen-Anti-Mäuse-Ig-Peroxidase-Konjugates, hinzugefügt wurden und bei Normaltemperatur während 1 h reagieren gelassen wurden.
Anschliessend wurde die Platte siebenmal oder öfter mit der gleichen Phosphatpuffer-Waschlosung (vom pH 7,0 bis 7,2) kräftig gewaschen. Als Substrat wurden 50 l ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, welches auf eine Konzentration von 0,3 bis 0,4 mg/mi in einer Citrat-Phosphatpufferlösung (0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer, pH 5,0) eingestellt worden war, in jede Vertiefung der Platte gegeben und während 20 min unter Ausschluss von Licht reagieren gelassen. Dann wurden zu jeder Vertiefung 50 l 1 N-Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion in jeder Vertiefung zu stoppen.
Dann wurde für jede Reaktionslösung die dekadische Extinktion bei 490 nm mit einem Spektrophotometer gemessen.
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Tabelle 10 : Bildung von Antikörpern gegen die Zellwandproteine von jedem Mikroorganismus (490 nm)
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<tb>
<tb> AntikörperVerdünnung <SEP> 1/5 <SEP> 1/25 <SEP> 1/125 <SEP> 1/625 <SEP> 1/3125 <SEP> 1/15625
<tb> Antigengehalt <SEP> (mg/kg) <SEP> @
<tb> Kontrollgruppe <SEP> -16 <SEP> 0,15 <SEP> 0,29 <SEP> 0,47 <SEP> 0,41 <SEP> 0,43
<tb> Test- <SEP> 0,1 <SEP> 0,29 <SEP> 0,25 <SEP> 0,32 <SEP> 0,52 <SEP> 1,1 <SEP> 1,2
<tb> gruppe <SEP> 0,2 <SEP> 0,76 <SEP> 0,67 <SEP> 0,50 <SEP> 0,49 <SEP> 1,3 <SEP> 1,4
<tb>
Aus der Tabelle 10 ist zu ersehen, dass die Verabreichung von 0,1oder 0,2 mg/kg des Antigens in der Testgruppe zu einer Immunität führt,
welche zwei- bis fünfmal so hoch wie jene in der Kontrollgruppe ist.
Beispiel 12 : Erzeugung von Immunglobulinen gegen Pseudomonas aeruginosa
Die in Beispiel 7 erhaltene Proteinlösung wurde an Kaninchen verabreicht, um die entsprechenden Immunglobuline zu erzeugen. Obgleich als typisches Beispiel die aus dem attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stamm CFCPA 30720 erhaltenen Zellwandproteine verwendet wurden, kann das gleiche Verfahren auch auf die anderen attenuierten Pseudomonas aerugmosa-Stämme angewendet werden.
0,5 bis 1 ml der aus dem Stamm CFCPA 30720 in Beispiel 7 erhaltenen Lösung von Zellwandproteinen (mit einem Gehalt von 100 bis 200 g an Zellwandproteinen) wurden zum dreimaligen Beimpfen von Albino-Kaninchen in Abständen von 7 Tagen verwendet. Dann wurde aus jedem der Kaninchen in regelmässigen Abständen Blut entnommen, und das Serum wurde abgetrennt. 100 ml des abgetrennten Kaninchenserums wurden mit 300 ml destilliertem Wasser vermischt, und das Gemisch wurde zu 500 g (Nassgewicht) von DEAE-Zellulose von 4 C zugegeben. Das so entstandene Gemisch wurde während 1 h bei 4 C gründlich geschüttelt und stehen gelassen, wonach der Überstand abgetrennt und entfernt wurde.
Der verbleibende Rückstand wurde dreimal mit jeweils 200 ml einer 0.01M Phosphatpufferlösung (Na2HPO4 1,15 g, KH2P04 0,2 g, KCI 0,2 g, NaCI 8,766 g, pro Liter, pH 8,0) gewaschen, um 600 mg des Immunglobulins IgG mit einem Reinheitsgrad von 96% oder darüber zu erhalten.
Beispiel 13 : Therapeutische Wirkung der Immunglobuline auf Pseudomonas aeruginosa-Infek- tionen
Die in dem obigen Beispiel 12 erhaltenen Immunglobuline gegen Pseudomonas aeruginosaStämme und deren therapeutische Wirkung auf Pseudomonas aeruginosa-Infektionen wurden in der folgenden Art und Weise untersucht Nachstehend wurden in jeder Gruppe 10 Mäuse verwendet.
1,0-3,0x106 Zellen von jedem der pathogenen Pseudomonas aeruginosa-Stämme mit den Fisher-Immunotypen 1, 2, 3,4, 5,6 und 7 wurden jeder Maus intraperitoneal injiziert, um eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion hervorzurufen. Innerhalb von 2 bis 6 h nach der Injektion wurden die gereinigten Immunglobuline für jeden Stamm jeder Maus in einer Menge von 0,1bis 2 mg pro Maus intravenös injiziert, um die therapeutische Wirkung derselben zu untersuchen.
In der Kontrollgruppe wurden 0,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung für Injektionszwecke statt der Immunglobuline intravenös injiziert. Bei diesem Test waren die verwendeten Immunglobuline CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534, oder ein Gemisch dieser vier Arten von Immunglobulinen in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen.
Als Ergebnis zeigte die Kontrollgruppe, welche nur eine physiologische Kochsalzlösung erhalten hatte, eine Letalitätsrate von 50% oder darüber innerhalb von 48 h, und von 100% nach 72 h.
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Wohingegen die Testgruppe, welche die entsprechenden Immunglobuline erhalten hatte, eine Überlebensrate von 80% oder darüber nach 72 h zeigte. Demgemäss konnte aufgezeigt werden, dass die Immunglobuline für die Behandlung von einer Infektion wirksam sind, welche durch den pathogenen Pseudomonas aeruginosa-Stamm mit dem entsprechenden Fisher-Immunotypus verursacht worden ist. Kein einzelnes der Immunglobuline hatte jedoch für sich allein eine nennenswerte Wirkung auf eine Infektion, welche durch pathogene Pseudomonas aeruginosa-Stämme mit den Fisher-Immunotypen 4 und 5 verursacht worden war.
Anderseits zeigte die Mäusegruppe, welche die Kombination von 4 Arten von Immunglobulinen in einem Verhältnis von 1:1:1:1, bezogen auf das Gewicht, erhalten hatte, wegen der Kreuzreaktivität dieser Immunglobuline eine überlegene therapeutische Wirkung selbst bei den Fisher-Typen 4 und 5 der Pseudomonas aeruginosa-Stämme. Demgemäss kann die Zusammensetzung aus kombinierten Immunglobulinen gemäss der vorliegenden Erfindung als therapeutisches Mittel verwendet werden, welches gegen Infektionen wirksam ist, die durch Pseudomonas aeruginosa-Stämme verursacht worden sind, die alle Fisher-Immunotypen aufweisen. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den Tabellen 11und 12 zusammengefasst.
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<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 11 <SEP> Immunologische <SEP> Schutzwirkung <SEP> je <SEP> nachdem, <SEP> ob <SEP> die <SEP> Immunglobuline <SEP> einzeln <SEP> oder <SEP> in
<tb> einer <SEP> Kombination <SEP> derselben <SEP> eingesetzt <SEP> werden
<tb> Zur <SEP> Herstellung <SEP> der <SEP> Immun- <SEP> Fisher- <SEP> Immunologischer
<tb> globuline <SEP> verwendete <SEP> Stämme <SEP> Immunotypus <SEP> Schutzbereich
<tb> alleiniger <SEP> CFCPA <SEP> 20215-Stamm <SEP> 2 <SEP> Fisher-Typen <SEP> 3,7
<tb> alleiniger <SEP> CFCPA <SEP> 60523-Stamm <SEP> 6 <SEP> Fisher-Typen <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP>
<tb> alleiniger <SEP> CFCPA <SEP> 10142-Stamm <SEP> 1 <SEP> Fisher-Typen <SEP> 2, <SEP> 1
<tb> alleiniger <SEP> CFCPA <SEP> 30720-Stamm <SEP> 3 <SEP> Fisher-Typus <SEP> 6
<tb> ------------------------------------------------------------------CFCPA <SEP> 20215
<tb> CFCPA <SEP> 60534 <SEP> Misch- <SEP> 2,6,1,
3 <SEP> Fisher-Typen
<tb> CFCPA <SEP> 10142 <SEP> stamm <SEP> 3,7,2,1,6,4
<tb> CFCPA <SEP> 30720 <SEP> und <SEP> 5
<tb> Tabelle <SEP> 12 <SEP> : <SEP> Wechselbeziehung <SEP> hinsichtlich <SEP> des <SEP> immunologischen <SEP> Schutzes <SEP> von <SEP> Immunglobulinen
<tb> gegen <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa-Stämme
<tb> Durch <SEP> den <SEP> CFCPA <SEP> 20215-Stamm <SEP> @
<tb> Durch <SEP> den <SEP> CFCPA <SEP> 20215-Stamm <SEP> Immunologischer <SEP> Schutz
<tb> induzierte <SEP> Immunglobuline <SEP> gegen <SEP> Fisher-Typus <SEP> 3
<tb> und <SEP> Fisher-Typus <SEP> 7
<tb> Durch <SEP> den <SEP> CFCPA <SEP> 60534-Stamm
<tb> induzierte <SEP> Immunglobuline
<tb> Immunologischer <SEP> Schutz
<tb> Durch <SEP> den <SEP> CFCPA <SEP> 10142-Stamm <SEP> gegen <SEP> Fisher-Typus <SEP> 2
<tb> induzierte <SEP> Immunglobuline <SEP> und <SEP> Fisher-Typus <SEP> 1
<tb>
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
<tb>
<tb> Durch <SEP> den <SEP> CFCPA <SEP> 30720-Stamm <SEP> ¯¯¯¯¯ <SEP> Immunologischer <SEP> Schutz
<tb> induzierte <SEP> Immunglobuline <SEP> gegen <SEP> Fisher-Typus <SEP> 6
<tb> Kombination <SEP> der <SEP> obigen <SEP> Immunologischer <SEP> Schutz
<tb> 4 <SEP> Arten <SEP> von <SEP> immun- <SEP> ########## <SEP> gegen <SEP> alle <SEP> Fisher-Typen
<tb> globulinen <SEP> 1, <SEP> 2, <SEP> 3,4, <SEP> 5, <SEP> 6, <SEP> und <SEP> 7
<tb>
Beispiel 14 :
Wirkung der kombinierten Immunglobuline auf Pseudomonas aerugi- nosa-I nfektionen
Die in Beispiel 13 ausgewählten 4 Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, nämlich CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534, wurden nach den gleichen Verfahren wie in den Beispielen 5,6 und 7 inkubiert und extrahiert, um die kombinierten Zusammensetzungen der Zellwandproteine zu erhalten, welche dann in der gleichen Weise wie in Beispiel 13 dreimal, in Abständen von einer Woche, in einer Menge von 1,5 bis 2 mg einer Ziege injiziert wurden, um die kombinierten Pseudomonas aeruginosa-Immunglobuline in grosser Menge zu erhalten, welche dann nach dem bekannten Verfahren gereinigt wurden [siehe Practical lmmunology, 3. Aufl. (1989), S. 292-294].
Zur Bestimmung der immunologischen Schutzwirkung und der therapeutischen Wirkung der oben erhaltenen, gereinigten und kombinierten Immunglobuline gegenüber dem pathogenen Pseudomonas aeruginosa von verschiedenen Fisher-Immunotypen wurden pathogene Pseudomonas aeruginosa-Stämme, welche jeden Immunotypus aufwiesen, einer Gruppe von Mäusen (sechs Gruppen zu je 20 Mäusen pro Gruppe) injiziert, denen die Zusammensetzung aus kombinierten Immunglobulinen zuvor dreimal injiziert worden war ; sie wurden einer anderen Gruppe von Mäusen (sechs Gruppen zu je 10 Mäusen pro Gruppe, welche keine Zusammensetzung von Immunglobulinen erhalten hatte) in einer Menge von 1,0 bis 3,Ox106 Zellen pro Maus injiziert, um die immunologische Schutzwirkung der kombinierten Immunglobuline zu beobachten.
Ausserdem wurde eine andere Gruppe von Mäusen (sechs Gruppen zu je 10 Mäusen pro Gruppe) zuerst mit dem pathogenen Pseudomonas aeruginosa-Stamm geimpft, und nach 2 bis 6 h wurde ihnen die oben erhaltene Zusammensetzung aus kombinierten Immunglobulinen intravenös in einer Menge von 0,1 bis 5 mg pro Maus mit einem Gewicht von etwa 20 bis 25 g injiziert, um die therapeutische Wirkung der Immunglobulinzusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung zu beobachten.
Als Ergebnis dieser Untersuchungen konnte aufgezeigt werden, dass die Zusammensetzung aus kombinierten Immunglobulinen gemäss der vorliegenden Erfindung eine immunologische Schutzwirkung von 80% oder darüber und eine therapeutische Wirkung von 75% oder darüber (bestimmt als Überlebensrate (in %) nach 7 Tagen) zeigt, während sämtliche Kontrollgruppen innerhalb von 3 Tagen eingegangen waren.
Demgemäss lässt sich feststellen, dass die Zusammensetzung aus kombinierten Immunglobulinen gemäss der vorliegenden Erfindung als nützliches Heilmittel verwendet werden kann, welches sowohl eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung als auch eine ausgezeichnete immunologische Schutzwirkung aufweist.
Beispiel 15 : Formulierung von Immunglobulinen
Die Kombination von Zellwandproteinen, welche durch Inkubation und Extraktion von 4 in Beispiel 13 ausgewählten Arten von attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, nämlich CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 und CFCPA 60534, in der gleichen Weise wie in den Beispielen 5,6 und 7 erhalten worden waren, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 14 an eine männliche Ziege verabreicht, um die kombinierten Pseudomonas aeruginosaImmunglobuline zu erhalten, welche abgetrennt und gereinigt und dann unter Verwendung von verschiedenen pharmazeutisch annehmbaren Trägern derart formuliert wurden, dass 1 bis 100 mg an den Antikörper-Immunglobulinen pro kg Körpergewicht verabreicht werden können.
Die formulierten Immunglobuline wurden an Mäuse verabreicht, welche mit Pseudomonas aeruginosa
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Beispiel 16 : Wirksamkeit der formulierten Zusammensetzung aus Immunglobulinen
Die mit einer Phosphatpufferlösung formulierten Immunglobuline, für welche gemäss den Versuchsergebnissen des Beispiels 15 festgestellt worden war, dass sie eine hohe Wirksamkeit ergeben, wurden zur Feststellung ihrer Wirksamkeit als ein prophylaktisches und therapeutisches Mittel für eine sekundäre Hautinfektion als Folge von Riss-, Schnitt- oder Kratzwunden, Verbrennungen, Brandwunden, eines Traumas und dgl. untersucht. Einer Maus wurde nach dem Verbrennungstestverfahren eine Brandwunde zugefügt [siehe J. Infect. Dis. 131,688-691, 1975].
Ein flüssiges Präparat, welches 0,5 bis 1 mg an kombinierten Pseudomonas aeruginosa-Immunglobulinen pro 1 ml an Phosphatpufferlösung enthielt, wurde zu einem Spray formuliert, welcher dann auf den eine Brandwunde aufweisenden Körperteil der Mäuse in der Testgruppe aufgebracht wurde, um seine Wirkung im Vergleich zu einer Kontrollgruppe festzustellen, welche keine Behandlung mit dem Immunglobulinspray erhielt. Als Ergebnis dieses Versuches lässt sich feststellen, dass die Mäusegruppe, welche mit dem Spray auf der Basis von Immunglobulinen und einer Phosphatpufferlösung behandelt worden war, eine bemerkenswert höhere Überlebensrate als die unbehandelte Gruppe zeigte.
Demgemäss lässt sich aufzeigen, dass das Pseudomonas aeruginosa-lmmun- globuline enthaltende Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung eine überlegene Schutzwirkung zeigt und dass es eine überlegene therapeutische Wirkung auf Pseudomonas aeruginosa-Infektionen ausübt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der nachstehenden Tabelle 14 angeführt.
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<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 14. <SEP> Ergebnis <SEP> des <SEP> Brandwundentests
<tb> Überlebensrate
<tb> Anzahl <SEP> Beimpfung
<tb> Behandlung <SEP> der <SEP> mit <SEP> Pseu- <SEP> 24h <SEP> 48h <SEP> 72h <SEP> 96h
<tb> Mäuse <SEP> domonas <SEP> oder
<tb> aeruginosa <SEP> darüber
<tb> (Mit <SEP> Immunglo- <SEP> 20 <SEP> lokale <SEP> Be- <SEP> 20/20 <SEP> 19/20 <SEP> 16/20 <SEP> 16/20
<tb> bulinen <SEP> behan- <SEP> impfung
<tb> delte) <SEP> Brandwunde
<tb> (Nicht <SEP> mit <SEP> 20 <SEP> lokale <SEP> Be- <SEP> 18/20 <SEP> 4/20 <SEP> 0/20
<tb> Immunglobu- <SEP> impfung
<tb> linen <SEP> behandelte
<tb> Brandwunde
<tb> Kontroll- <SEP> 10 <SEP> keine <SEP> Be- <SEP> 10/10 <SEP> 10/10 <SEP> 10/10 <SEP> 10/10
<tb> gruppe <SEP> impfung
<tb>
Wie oben bereits ausgeführt wurde,
wird jeder attenuierte Pseudomonas aeruginosa-Stamm gemäss der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu der Wildspezies oder pathogenen Spezies für sicher angesehen. Ausserdem können die Zellwandproteine dieser attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme, weil sie ausgezeichnete Eigenschaften hinsichtlich der Sicherheit und des Kreuz-Schutzvermögens aufweisen, und weil sie auch eine überlegene Fähigkeit zur Ausbildung neutralisierender Antikörper haben, nicht nur als Vakzine für die Prophylaxe gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen sondern auch als Antikörper-Veranlasser in Versuchstieren zur Produktion von Immunglobulinen verwendet werden, welche Immunglobuline dann als therapeutisches Mittel gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen verwendet werden können.
Demgemäss ist zu ersehen, dass die attenuierten Pseudomonas aeruginosa-Stämme gemäss der vorliegenden Erfindung sehr nützliche Mikroorganismen zur Herstellung einer prophylaktischen Vakzine und eines therapeutischen Mittels gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen darstellen.
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infiziert worden waren, um die Wirksamkeit der Immunglobuline in Abhängigkeit von den Arten der zusammen mit den Immunglobulinen verwendeten Träger zu bestimmen.
Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann festgestellt werden, dass im Falle von flüssigen Formulierungen das Immunglobulinpräparat mit einer physiologischen Kochsalzlösung für Injektionszwecke oder mit einer Phosphatpufferlösung als Träger eine hohe Wirksamkeit aufweist ; dass im Falle von lyophili- sierten Formulierungen die Verwendung von Mannit, Saccharose oder Laktose als Träger eine hohe Wirksamkeit des Immunglobulinpräparates ergibt.
Anderseits wurde festgestellt, dass bei einer lyophilisierten Formulierung durch die Verwendung von Human-Albumin zusammen mit den Pseudomonas aeruginosa-Immunglobulinen gemäss der vorliegenden Erfindung die Wirksamkeit der Immunglobuline herabgesetzt wird ; dass im Falle von flüssigen Formulierungen die Verwen- dung von Aluminiumhydroxid als pharmazeutischer Träger zu einer niedrigen Wirksamkeit führt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 13 zusammengefasst.
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<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 13 <SEP> : <SEP> Wirksamkeit <SEP> der <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa-Immunglobuline <SEP> in <SEP> Abhängigkeit <SEP> von <SEP> den
<tb> pharmazeutischen <SEP> Trägern
<tb> Art <SEP> der <SEP> Bestandteile <SEP> Wirksamkeit
<tb> Formulierung
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> ++++
<tb> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> + <SEP> Mannit <SEP> (5-20%)
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> +++
<tb> Lyophilisierte <SEP> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> Formulierung <SEP> + <SEP> Lactose <SEP> (5-20%)
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> +++
<tb> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> + <SEP> Saccharose <SEP> (5-20%)
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> ++
<tb> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> + <SEP> Human-Albumin <SEP> (1-5%)
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> ++++
<tb> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> + <SEP> physiologische <SEP> Kochsalzlösung
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> ++++
<tb> Flüssige <SEP> Formulie- <SEP> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> rung <SEP> + <SEP> destilliertes <SEP> Wasser
<tb> für <SEP> Injektionszwecke
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> ++++
<tb> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> + <SEP> Phosphatpufferlösung
<tb> Zusammensetzung <SEP> aus <SEP> kombinier- <SEP> ++
<tb> ten, <SEP> gereinigten <SEP> Immunglobulinen
<tb> + <SEP> Aluminiumhydroxid <SEP> +
<tb> Lösungsmittel
<tb>