DE2833846A1 - Kulturmedium fuer fungi - Google Patents

Kulturmedium fuer fungi

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Description

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Die Erfindung betrifft ein Kulturmedium für Fungi, das frische Ochsengalle (Oxgall), gereinigtes Saponin, ein Substrat für Phenoloxydase und ein Trägermaterial, z.B. Agar enthält. Dieses Kulturmedium ermöglicht die Feststellung und Identifizierung pathogener Hefepilze. Die Erfindung umfaßt auch lagerfähige Kulturmedien für Fungi in Trockenform, die bei Zugabe von Wasser das eigentliche Medium bilden und eine rasche Analyse verschiedener, häufiger in Körperflüssigkeiten vorkommender pathogener Fungi ermöglichen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Kulturmedium, das die rasche und zuverlässige Feststellung und Identifizierung zweier medizinisch wichtigen Fungi, nämlich von Candida albicans und Cryptococcus neoformans gewährleistet.
Unter normalen Bedingungen treten verschiedene Hefearten, d.h. einzellige Fungi, wie Saprophyten im Körper auf, die die normalen Körperfunktionen nicht beeinträchtigen, da das Pilzwachstum durch Bakterien kontrolliert wird; die normalerweise ebenfalls vorhanden sind. Wenn jedoch ein Patient aufgrund bakterieller Infektionen behandelt, z.B. durch die Verabfolgung antibakteriell wirksamer Antibiotika, wird das normale Bakterien-Fungi-Gleichgewicht gestört und es kann tatsächlich zu einer Pilzinfektion kommen. An Krebs
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leidende Patienten sind für solche Pilzinfektionen besonders empfänglich, da ihnen eine Vielzahl antibakteriell wirksamer Arzneimittel verabfolgt wird und ihr Immunsystem nicht mehr intakt ist. Eine Pilzinfektion kann den Zustand eines Patienten äußerst rasch verschlechtern, vor allem, wenn er z.B. aufgrund bakterieller Infektionen ohnehin geschwächt ist. Solche Pilzinfektionen können sich in ernsthaften Erkrankungen, z.B. in Meningitis, niederschlagen.
Zwei der medizinisch wichtigsten Arten von Fungi sind Candida albicans und Cryptococcus neoformans. Candida albicans ist ein Saprophyt, der sich im gastrointestinaien Trakt des Menschen befindet. Unter bestimmten Bedingungen kann diese Hefe jedoch übergreifen und zu schwerwiegenden und gewöhnlich tödlichen Erkrankungen des geschwächten Patienten führen. Cryptococcus neoformans ist besonders wichtig, weil er das zentrale Nervensystem angreift, was zu schweren Erkrankungen eines biologisch abwehrschwachen Patienten führen kann.
Die vermutliche Identifizierung von Candida albicans hängt allein von morphologischen Veränderungen ab, die auftreten, wenn man diesen Fungus auf einem geeigneten Medium ausstreicht und ihn wachsen läßt. Die erste morphologische Veränderung, die die Gegenwart von Candida albicans anzeigt, besteht in
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der Bildung von Keimschläuchen, die als winzige Vorsprünge aus den ausgestrichenen, einzelligen Proben herausragen. Diese Keimschläuche wachsen unter Umständen zu verlängerten Fäden, die sich aus dem Körper von Candida albicans nach außen erstrecken. Die Bildung von Keimschläuchen innerhalb von zwei bis drei Stunden nach dem Ausstreichen des Fungus stellt ein vermutliches Anzeichen dafür dar, daß Candida albicans vorliegt. In einer zweiten Wachstumsstufe erscheinen im allgemeinen runde Körper an den Enden der Fäden. Diese runden Körper sind als Chlamydosporen bekannt. Nur zwei Arten von Candida-Gattungen bilden Chlamydosporen. Es handelt sich bei diesen um Candida albicans und Candida stellatoidea. Die Bildung von Chlamydosporen zeigt damit die Gegenwart von entweder Candida albicans oder Candida stellatoidea an.
Die Identifizierung von Cryptococcus neoformans ist im allgemeinen schwieriger als die Identifizierung von Candida albicans, da Cryptococcus neoformans keine morphologischen Veränderungen eingeht, die sich feststellen lassen, sondern während des Wachstums einzellig bleibt. Bis vor kurzem wurden ein oder mehrere von drei Grundtests oder eine Kombination dieser angewandt, um das Vorhandensein der Gattung Cryptococcus zu ermitteln. Eine dieser Identifizierungsmethoden
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umfaßt die mikroskopische Untersuchung einer Probe, um festzustellen, ob rund um die Zellen des Fungi eine kapselähnliche Anordnung entstanden ist. Um die Feststellung einer solchen kapselähnlichen Anordnung zu erleichtern, wird eine Probe mit chinesischer Tusche umgeben, die das Erscheinen der Kapsel insofern unterstützt, als ein klares und durchscheinendes Bild gegen den schwarzen Hintergrund entsteht, was die Identifizierung der Kapseln bei der mikroskopischen Untersuchung erleichtert. Eine zweite Methode zur Identifizierung der Gattung Cryptococcus besteht darin, daß man eine Probe auf einem Medium ausstreicht, das Harnstoff und einen Farbindikator enthält. Da Cryptococcus neoformans ein Enzym erzeugt, das als Urease bekannt ist, hat es die Fähigkeit, den Harnstoff abzubauen und den Stickstoff des Harnstoffs zu verwenden, wodurch der pH-Wert ansteigt und eine Farbänderung des Indikators eintritt. Damit zeigt das Wachstum auf einem harnstoffhaltigen Medium die Gegenwart von Cryptococcus neoformans an. Eine dritte Methode zur Identifizierung der Gattung Cryptococcus beruht auf der Fähigkeit dieser Gattung, eine stärkeähnliche Verbindung zu erzeugen. Wenn die stärkeähnliche Verbindung vorhanden ist, führt die Zugabe von Iod zu einem purpurfarbenen Ring, der rund um die Kolonie erscheint. Keine dieser Testmethoden ist jedoch spezifisch für Cryptococcus neoformans, weder allein noch in Kombination,
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da andere Arten der Gattung Cryptococcus und andere Hefegattungen ebenfalls eine positive Reaktion ergeben können.
Um daher die Art Cryptococcus neoformans identifizieren zu können, waren in der Vergangenheit zusätzliche Tests erforderlich. Diese umfassen die Bildung eines Wachstumsprofils einer Probe, wenn diese auf einer Reihe von Kohlehydrat enthaltenden Medien ausgestrichen wird. Zum Beispiel können bis zu 14 verschiedene Kohlehydratarten in Wachstumsmedien eingearbeitet werden. Nach 7 bis 21 Tagen entwickelt eine darauf ausgestrichene Probe ein Wachstumsprofil, das anzeigt, ob Cryptococcus neoformans in der Probe vorhanden war oder nicht. Eine andere Methode zur Identifizierung der Art besteht im Ausstreichen einer Probe auf einem Agarmedium, das Kreatinin enthält. Wenn innerhalb von 5 bis 8 Tagen wesentliches Wachstum beobachtet wird, zeigt dieses Wachstum die Gegenwart von Cryptococcus neoformans an, weil dieser Fungi Kreatinin zu assimilieren vermag. Jedoch haben auch andere Hefegattungen die Fähigkeit, auf Kreatinin zu wachsen, so daß dieser Test für Cryptococcus neoformans nicht spezifisch ist.
Wahrscheinlich die einzige erfolgreiche und spezifische herkömmliche Methode zum Nachweis von Cryptococcus neoformans besteht in der Verwendung von Vogelfutteragar. Man hat
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festgestellt, daß, -wenn Cryptococcus neoformans in einer auf Vogelfutteragar ausgestrichenen Probe enthalten war, eine spezifische, verräterische braune Farbe erschien, wenn die Probe 5 Tage lang bis zwei Wochen auf dem Agar wuchs. Diese Methode wurde durch Verwendung eines Extraktes aus Vogelfutter verbessert, wodurch sich die Identifizierungszeit auf drei bis fünf Tage verringerte. Noch später hat man festgestellt, daß die braune Pigmentverfärbung auf der Umsetzung zwischen dem Enzym Phenoloxydase und einem spezifischen Substrat beruhte, das in Vogelfutteragar enthalten ist. Dementsprechend verkürzte die Verwendung substituierter Phenole, wie Kaffeesäure, im Kulturmedium, die für die Identifizierung notwendige Zeit weiter auf etwa 48 Stunden. Eine weitere Verfeinerung der Verwendung von Kaffeesäure bei der Identifizierung von Cryptococcus neoformans ist in dem Aufsatz von Hopfer und Grosche, "Six Hour Pigmentation Tests for the Identification of Cryptococcus neoformans", Journal of Clinical Microbiology, August 1975, Band II, Nr. 2, Seite 96-98, beschrieben. Diese Verbesserung besteht in der Kombination der Kaffeesäure mit Ferricitrat und der Einarbeitung dieser Verbindungen in Papierscheiben, die als Substrate für die Phenoloxydase von Cryptococcus neoformans dienen. Die Verwendung dieser mit Kaffeesäure und Ferricitrat imprägnierten Papierscheiben verringerte die Identifizierungszeit nochmals, und zwar auf 3 bis 6 Stunden. Die für die
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Imprägnierung der Papierscheiben verwendete Lösung von Kaffeesäure und Ferricitrat ist jedoch ziemlich unbeständig, wenn sie Licht ausgesetzt wird und ist daher mit Lagerungsproblemen verbunden. Außerdem sind die Konzentrationen von Kaffeesäure und Ferricitrat kritisch, d.h. eine nicht-ausgeglichene Kombination erfordert längere Inkubationszeiten für die Erzeugung eines dunklen Pigments oder, in einigen Fällen, einer nicht-spezifischen Pigmentierung von Cryptococcusarten und verschiedenen Candida-Arten. Während ferner zwar die Identifizierungszeit auf 3 bis 6 Stunden verringert wurde, beginnend vom Zeitpunkt des Ausstreichens der Probe auf den Papierscheiben, mußte auf einem "Primärmedium" vorkultiviert werden, bevor auf den mit Ferricitrat und Kaffeesäure imprägnierten Scheiben ausgestrichen werden konnte,
Obwohl Candida albicans und Cryptococcus neoformans beide medizinisch wichtige Hefen darstellen, eignet sich kein herkömmliches Testverfahren oder Medium für die gleichzeitige Identifizierung beider Fungi. Vielmehr war es bisher notwendig, zwei Tests durchzuführen, einen auf die Gegenwart von Candida albicans und einen zweiten, z.B, einen der oben beschriebenen zur Identifizierung von Cryptococcus neoformans.
Vor kurzem wurde nun ein neues Kulturmedium für die Identifizierung von Cryptococcus neoformans, Candida albicans und
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Candida stellatoidea entdeckt, das Kaffeesäure, Oxgall und ein Emulgiermittel enthält (Tween 80, Atlas Chemical Company). Dieses Medium ist von Fleming, Hopkins und Land in "New
Culture Medium for the Presumptive Identification of Candida albicans and Cryptococcus neoformans", Journal of
Clinical Microbiology, Februar 1977, Band V, Nr. 2, Seiten 236-243 beschrieben. Es eignet sich für die spezifische
Identifizierung von sowohl Candida albicans als auch von
Cryptococcus neoformans. Obzwar die Identifizierung von
Cryptococcus neoformans langsamer vor sich geht als auf den mit Kaffeesäure und Ferricitrat imprägnierten Papierscheiben, hat die Verwendung des Tween 80 - Oxgall - Kaffeesäure-Mediums, das nachfolgend auch als TOC bezeichnet ist, bestimmte Vorteile, da es nicht lichtempfindlich ist und die Konzentrationen der Komponenten nicht in so kritischer Weise formuliert werden müssen, wie bei den Ferricitratscheiben. Der einzige Nachteil des TOC-Mediums ist, daß Candida krusei,
eine fadenbildende Hefe keine Pseudohyphen bildet. Während somit Candida albicans oder Candida stellatoidea durch die Bildung von Keimschläuchen innerhalb von drei Stunden nach dem Ausstreichen ermittelt werden können, kann die Gegenwart von Candida krusei unentdeckt bleiben, da selbst nach 24 Stunden auf dem TOC-Medium keine Fadenbildung eintritt. Obgleich die Lagerzeit des hergestellten TOC-Mediums gut ist,
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sie beträgt etwa 3 Wochen, ist eine längere Lagerbeständigkeit natürlich erwünscht. Da Tween 80 eine flüssige Zusammensetzung darstellt, eignet sich das TOC-Medium nicht zur Formulierung in einer vollständig dehydratisierten trockenen Pulverform, die bis zum Gebrauch in dieser Form gelagert werden kann. Dieses Medium kann jedoch in einem einzigen Test zur Identifizierung, von'Candida albicans, Candida stellatoidea und Cryptococcus neoformans verwendet werden.
Während somit eine Vielzahl von Methoden und Medien verwendet wurden, um verschiedene pathogene Fungi zu identifizieren und zu differenzieren, einschließlich der wichtigen Arten Candida albicans und Cryptococcus neoformans, besteht nach wie vor Bedarf an Kulturmedien für Fungi, die eine rasche Identifizierung und Differenzierung dieser Arten und anderer Fungi ermöglichen, verhältnismäßig leicht herzustellen und zu gebrauchen sind und eine verhältnismäßig lange Lagerbeständigkeit besitzen.
Die Erfindung stellt ein Kulturmedium für Fungi zur Verfügung, das die rasche und zuverlässige Identifizierung von Fungi ermöglicht, die unter bestimmten Bedingungen pathogen sein können, z.B. für Patienten, die Immunreaktionen unterdrückende Arzneimittel erhalten. Im Prinzip enthält das Kulturmedium gemäß der Erfindung Oxgall, gereinigtes Saponin, ein Phenoloxydasesubstrat und ein Trägermaterial. Das
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Phenoloxydasesubstrat, vorzugsweise Kaffeesäure, ermöglicht die spezifische Identifizierung von Cryptococcus neoformans durch die charakteristische braune Pigmentierung, die aus der spezifischen Enzymwirkung von Cryptococcus neoformans auf das Phenoloxydasesubstrat resultiert. Es wurde auch gefunden, daß das Oxgall, außer seiner bekannten Wirkung, nichtpathogene Organismen zu unterdrücken, die Farbbildung und die Chlamydosporenerzeugung der medizinisch wichtigen Fungi Candida albicans und Candida stellatoidea fördert. Das in den Kulturmedien verwendete gereinigte Saponin verstärkt wesentlich die braune Pigmentierung von Cryptococcus neoformans und fördert die Bildung der Keimschläuche und die Chlamydosporenerzeugung von Candida albicans und Candida stellatoidea, so daß eine extrem rasche Identifizierung dieser besonders gefährlichen pathogenen Fungi möglich wird. Das Trägermaterial für die beschriebenen Wirkstoffe bilden z.B. gewöhnlicher Agar oder Silicagele,
Das erfindungsgemäße Medium stellt, ein ausgezeichnetes Differenzierungsmedium für die Identifizierung von zwei der medizinisch wichtigsten Arten potentieller pathogener Fungi dar. Dieses Medium ist spezifisch für die Identifizierung von Cryptococcus neoformans und zeigt rasch die Gegenwart der Arten albicans oder stellatoidea der Gattung Candida an. Die Differenzierung zwischen diesen beiden Candidaarten kann
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dadurch bewirkt werden, daß man einen weiteren herkömmlichen Differenzierungstest anschließt, z.B. einen Assimilierungstest für den Zucker Saccharose, in dem Candida albicans Saccharose assimiliert, Candida stellatoidea jedoch nicht. Außerdem ist das Kulturmedium gemäß der Erfindung für die Identifizierung anderer Gattungen von fadenbildenden Hefen brauchbar, wobei die charakteristische Morphologie und die Pigmentierung der Hefen erhalten bleibt. Zum Beispiel bleiben Candida krusei und Candida tropicalis auf den erfindungsgemäßen -Medien weiße fadenbildende Hefen.
Der Hauptvorteil der erfindungsgemäßen Differenzierungsmedien besteht darin, daß sie die rasche und spezifische Identifizierung von Cryptococcus neoformans und Candida albicans ermöglichen. Cryptococcus neoformans läßt sich in 3 bis 6 Stunden, nachdem die Probe auf das Medium aufgebracht wurde, identifizieren, und zwar durch die braune Pigmentierung, die innerhalb dieser Zeit mit dem bloßen Auge wahrgenommen werden kann. Candida albicans oder Candida stellatoidea können innerhalb von etwa 3 bis etwa 18 Stunden nach dem Ausstreichen aufgrund der Keimschläuche und Chlamydosporen mikroskopisch sichtbar gemacht werden, Da nur die Arten albicans und stellatoidea der Gattung Candida Keimschläuche und Chlamydosporen bilden, genügt ein einziger herkömmlicher Differenzierungstest um festzustellen, welche der beiden Arten vorliegt.
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Es wurde gefunden, daß eine Kombination von drei Wirkstoffen angewandt werden kann, zusammen mit einem Trägermaterial, wie z.B. Agar, um die oben beschriebenen erwünschten Ergebnisse zu erzielen. Oxgallr ein Derivat einer Substanz, die in der Gallenblase von Ochsen gefunden wird, wird angewandt, um das Wachstum der Fäden und Chlamydosporen von Candida albicans und stellatoidea zu- fördern. Ein zweiter Wirkstoff, wie Kaffeesäure oder ein anderes Substrat für Phenoloxydase, wird als Identifizierungsmittel für Cryptococcus neoformans eingesetzt, da die Umsetzung zwischen der Phenoloxydase des Fungus und dem Substrat eine bräunliche Pigmentierung erzeugt, die für Cryptococcus neoformans spezifisch ist. Der dritte Wirkstoff im erfindungsgemäßen Kulturmedium ist gereinigtes Saponin. Im allgemeinen stellen Saponine Glycoside dar, die in Pflanzen weitverbreitet sind, Öl-in-Wasser-Emulsionen zu bilden vermögen und als Schutzkolloide wirken. Jedes Saponinmolekül besteht aus einem Sapogenin, das den Agluconanteil des Moleküls bildet, und Zucker. Es ist wichtig, daß nur gereinigtes Saponine verwendet werden können, wenn die gewünschten Ergebnisse erzielt werden sollen. Gereinigtes Saponin ist im Gegensatz zu ungereinigtem Saponin gegenüber pathogenen Mikroorganismen, wie Hefen, die in den erfindungsgemäßen Medien identifiziert werden, nicht toxisch. Die Saponine können im allgemeinen nach den in der US-Patentschrift 38 83 425 beschriebenen Verfahren "Entgiftung von Saponinen" gereinigt werden. Die so gereinigten Saponine
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können dann in den erfindungsgemäßen Medien verwendet werden. Die genaue Funktion der in diesen Kulturmedien enthaltenen Saponine ist nicht bekannt, man nimmt jedoch an, daß das Saponin eine Emulgierwirkung ausübt, die zu einer Trennung der Zelltrauben in der Probe der Körperflüssigkeit in Einzelzellen der Fungi führt. Diese Trennung unterstützt wahrscheinlich die Umsetzung zwischen dem Phenoloxydasesubstrat und dem Phenoloxydaseenzym des Cryptococcus neoformans, so daß es rascher zu den charakteristischen braunen Pigmentierungen kommt.
Als Phenoloxydasesubstrat kann jedes Substrat verwendet werden, von dem man weiß, daß es in Gegenwart von Cryptococcus neoformans eine braune Pigmentierung hervorruft. Geeignete Phenoloxydasesubstrate sind 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Protocatechusäure), DOPA, 3,4-Dihydroxyzimtsäure (Kaffeesäure), der Methylester und das Diacetat der Kaffeesäure, 3-Hydroxytriptamin, 3,4-Dihydroxyphenylethanolamin (Norepinephrin) und 4-Hydroxy-3,5-Dimethoxyzimtsäure. Man nimmt an, daß die Farbbildung von den Hydroxylgruppen in 3- und 4-Stellung des Phenylringes abhängt. Von den oben genannten Phenoloxydasesubstraten wird die Kaffeesäure bevorzugt.
Das erfindungsgemäße Medium kann wie folgt hergestellt werden.
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Das Oxgall, das gereinigte Saponin und das Phenoloxydasesubstrat können mit einer geeigneten Menge eines pulvrigen Trägermittels, wie z.B. Agar, zu destilliertem Wasser gegeben werden. Die gebildete Mischung wird dann gerührt und zum Sieden erhitzt, damit alle Komponenten in Lösung gehen.
Die Lösung wird bei etwa 121° C etwa 15 Min. bei einem Druck
von etwa 1,05 kg/cm sterilisiert. Nach dem Sterilisieren und dem leichten Kühlen des Mediums kann in herkömmliche Petrischalen gegossen werden und nach der Verfestigung kann man die gegossenen Platten umkehren und sie über Nacht bei Räumtemperatur trocknen lassen. Die erhaltenen Petrischalen können dann zur Lagerung in einen Kühlschrank gestellt werden. Sie sind bis zu etwa 6 Wochen beständig.
Im allgemeinen enthalten die erfindungsgemäßen Medien etwa 0,25 bis etwa 30 Gew.% Oxgall, etwa 1 bis etwa 5 Gew.% Trägermaterial, etwa 0,1 bis etwa 5,0 Gew.% gereinigtes Saponin und etwa 0,001 bis etwa 1,0 Gew.% eines Phenoloxydasesubstrats, bezogen auf die Menge des Wassers, die zu diesen Komponenten gegeben wird.
Bevorzugte Medien können dadurch hergestellt werden, daß man etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.% Oxgall, etwa 1 bis etwa 5 Gew,% Agar, etwa 0,1 bis etwa 1,0 Gew.% gereinigtes Saponin und etwa 0,005 bis etwa 0,5 Gew.% Kaffeesäure, bezogen auf die
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zu den trockenen Komponenten gegebene Menge Wasser, verwendet. Am vorteilhaftesten ist ein Medium, das etwa 1,0 Gew.% Oxgall, etwa 2,0 Gew.% Agar, etwa 0,5 Gew.% gereinigtes Saponin und etwa 0,03 Gew.% Kaffeesäure enthält. Einer der Vorteile der erfindungsgemäßen Medien ist, daß alle Komponenten, das Wasser ausgenommen, Pulverform haben, so daß vorbestimmte Mengen jeder Komponente zu einem Präparat vereinigt werden können, das unbegrenzt lang in trockenem Zustand gelagert und erst unmittelbar vor Gebrauch durch Zugabe von Wasser in das eigentliche Medium übergeführt werden kann.
Die erfindungsgemäßen Medien können entweder als primäre oder als sekundäre Medien für die rasche differenzierte Identifizierung von Cryptococcus neoformans und Candida stellatoidea verwendet werden. Bei Verwendung als primäres Medium wird eine Probe Körperflüssigkeit, z.B. Blut, Sputum oder Urin, direkt auf das SOC-Medium aufgebracht und in eine geeignete Umgebung für das Pilzwachstum gestellt. Bei Verwendung als sekundäres Medium wird zunächst eine Probe der Körperflüssigkeit auf einem primären Medium, z.B, Sabouraud-Agar ausgestrichen, auf dem vorhandene .Fungi sofort ziemlich rasch wachsen, und nach diesem anfänglichen Wachstum werden die Fungi auf das SOC-Medium gemäß der Erfindung aufgebracht, das eine rasche Differenzierung der verschiedenen Arten von Fungi
ermöglicht.
Die folgenden Beispiele zeigen die Vorteile der erfindungsgemäßen Kulturmedien gegenüber solchen, die bisher für die Identifizierung verschiedener Fungi, einschließlich Candida albicans, Candida stellatoidea und Cryptococcus neoformans verwendet wurden.
Beispiel I
Dieses Beispiel· soll die Unterschiede in der Zeit zeigen, die erforderlich ist, bis die charakteristischen morphologischen Veränderungen bei Fungi auftreten, die auf einem Maismehlagar (MMA), einem Kaffeesäure, Oxgall und Tween 80 (TOC) bzw. einem erfindungsgemäßen Medium kultiviert wurden, das eine Mischung aus gereinigtem Saponin, Oxgall und Kaffeesäure (SOC) enthielt.
Das MMA-Medium wurde nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt und mit 0,1 % Tween 80 versetzt. Das TOC-Medium bestand aus Tween 80* Oxgall, Kaffeesäure und Davis-Agar, und wurde wie folgt hergestellt:
Zu einem Liter destilliertem Wasser wurden 10 g Oxgallr 20 g Agar, 10 ml einer iO%igen Lösung von Tween 80 und 0,3 g Kaffeesäure gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, zum Sieden erhitzt, damit die Komponenten in Lösung gingen, und etwa 15 Min, bei etwa 120° C und einem Druck von etwa 1,05 kg/cm sterilisiert. Nach dem Sterilisieren und leichtem Kühlen wurde das
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Medium in Fetrischaien gegossen. Das Testmedium gemäß der Erfindung, SOC, wurde wie folgt hergestellt: 10 g Oxgall, 20 g Agar, 5 g gereinigtes Saponin und 0,3 g Kaffeesäure wurden zu einem Liter destilliertem Wasser gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, zum Sieden erhitzt, damit
die Komponenten in Lösung gingen und 15 Min. bei 120 C
und einem Druck von 1,05 kg/cm sterilisiert. Nach dem
Sterilisieren und leichten Kühlen wurde das Medium zur Verfestigung in Petrischalen gegossen.
Grundhefestämme wurden auf einem Sabouraud-Dextrose-Agar subkultiviert. Auf diesem Agar ließ man sie 72 Stunden wachsen. Nach dieser Vorkultivierung, einem Mittel zur Simulierung von Wachstum auf einer Primärplatte, wurden Hefen nach der Dalmau-Technik auf den einzelnen Medien, nämlich dem MMA-, dem TOC- bzw. SOC-Medi'um kultiviert. Diese Technik besteht einfach darin, daß man eine mit den Organismen beimpfte Fläche abdeckt, wodurch die beimpften Flächen der Platte mikroskopisch untersucht werden können. Um reichlich Impfstoff zu erhalten, wurde ein steriles Läppchen zum Ausstreichen der Kolonien auf den Sabouraud-Dextrose-Agarplatten verwendet.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse dieser Versuche aufgeführt. Sie zeigen die Zeit, die erforderlich
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ist, um Chlamydosporen von Candida albicans auf dem MMA-, TOC- bzw. SOC-Medium zu erzeugen. Es wurden 138 Isolate von Candida albicans ausgestrichen und in den in der Tabelle 1 angegebenen Zeitintervallen beobachtet. Die Anzahl der je 100 Mikroskopfelder erzeugten Chlamydosporen wurde dann für jedes Medium aufgezeichnet. Alle auf jedem Medium kultivierten Isolate wurden im wesentlichen den gleichen Bedingungen unterworfen.
TABELLE 1
Vergleich der Zeit, die erforderlich ist, um Chlamydosporen bei Candida albicans auf dem MMA-, TOC- bzw. SOC-Medium zu erzeugen
Beobachtungszeit, Stunden MMA TOC SOC
12 14 16 18 20 24 48
A = 1 bis 4 Chlamydosporen/100 Felder
B = 5 bis 20 Chlamydosporen/100 Felder
C = 21 bis 50 Chlamydosporen/100 Felder
D = 50 oder mehr Chlamydosporen/100 Felder.
A A
A B
A-B D
B-C D
C-D D
A C-D D
A D D
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Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Chlamydosporenerzeugung auf dem SOC-Medium ihr Maximum nach nur 16 Stunden erreichte. Dagegen trat die maximale Chlamydosporenerzeugung auf dem TOC-Medium noch nicht bei 20 Stunden auf. Die Chlamydosporenerzeugung auf dem MMA-Medium war wesentlich geringer als auf dem TOC- und SOC-Medium.
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tabelle; 2
Organismus
CD O CD OO
Vergleich der Erzeugung von Keimschläuchen und Chlamydosporen auf
D^lmau -Objektträgerkulturen unter Verwendung von MMA-, TOC- und SOC-Medium
Anzahl 4er Isolate
Medium
Keimschlauch- Chlamydosporenerzeugung
bildung,
Anzahl %
24 Std.
48 Std.
Anzahl
Anzahl
72 Std.
Anzahl :
Candida 138 alblcans
Candida 30 stellatoidea
MMA 0 0,0 25 18,1 84 60,9 112 81,2
TOC 132 95,7 119 86,2 133 96,3 134 97,1
SOG 138 100,0 138 100,0 138 100,0 138 100,0
MMA 0 0,0 0 0,0 0 0,0 O 0,0
TOC 24 80,0 24 80,0 24 80,0 24 80,0
SOC 24 80,0 24 80,0 24 80,0 24 80,0
+ Dalmau-Objektträgerkultur; Die sterile Abdeckung über einem ausgestrichenen Teil des Organismus ermöglicht die mikroskopische Bestimmung des Wachstums und der morphologischen
Veränderungen der Organismen.
N) OO
U)
Das erfindungsgemäße SOC-Mediura wurde auch hinsichtlich der Keimschlauchbildung und der Chlamydosporenerzeugung über einen Zeitraum von 72 Stunden mit dem MMA- und TOC-Medium verglichen. Für jedes Medium wurden zwei verschiedene Candida-Arten verwendet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.
Sie zeigen, daß das SOC-Medium gegenüber dem TOC-Medium einen deutlichen Vorteil bezüglich der Bildung von Keimschläuchen und der Chlamydosporenerzeugung bei Candida albicans besitzt, während beide Medien wiederum dem MMA-Medium weit überlegen waren. Aus den Daten der Tabelle 2 geht ferner hervor, daß in Bezug auf Candida stellatoidea das SOC- und das TOC-Medium zu den gleichen Ergebnissen führten, und beide Medien dem MMA-Medium deutlich überlegen waren.
Schließlich wurde die spezifische Wirkung des SOC-Mediums auf Cryptococcus neoformans untersucht, indem man eine Anzahl von Stämmen von 8 verschiedenen Arten des Fungi ausstrich, um festzustellen, ob die charakteristische braune Pigmentierung für Cryptococcus neoformans spezifisch ist. Wie die Tabelle 3 unten zeigt, trat die braune Pigmentierung im Durchschnitt etwa 5,3 Studen, nachdem der Cryptococcus neoformans auf dem SOC-Medium ausgestrichen worden war, auf. Keiner der anderen 7 untersuchten Fungi führte nach 72 stündigem Wachstum zu irgendeiner merklichen Pigmentierung.
909SU/0648
283384B
TABELLE
Pigmenterzeugung auf dem SOC-Medium Organismus
Anzahl der Pigment Durchschnittli-Stämme ehe Zeit bis zur
Farbänderung
Cryptococcus neoformans Candida albicans Candida stellatoidea Candida tropicalis Cryptococcus laurentii Cryptococcus innocuous Cryptococcus diffluens Torulopsis glabrata
70 braun 5,3 Stunden
138 weiß k.V. 1
30 weiß k.V.
40 weiß k.V.
40 weiß k.V.
17 weiß k.V.
8 weiß k.V.
73 weiß k.V.
k.V. = keine Veränderung der Pigmentierung nach 72 stündigem Wachstum
Beispiel II
Um das erfindungsgemäße Medium mit einem Gehalt an gereinigtem Saponin, Oxgall und Kaffeesäure mit den oben erläuterten Medien, die Tween 80, Oxgall und Kaffeesäure enthalten, zu vergleichen, wurden Proben dieser verschiedenen Arten von Medien hergestellt, wobei man die Anteile der drei Wirkstoffe variierte. Reichlich Impfstoff von Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida krusei, Cryptococcus neoformans und Cryptococcus diffluens wurde mittels
9098UV0648
2833848
eines Batistläppchens auf den verschiedenen Testmedien aufgebracht und in Zeitabständen von 3 und 24 Stunden beobachtet. Bei den Candida-Organismen wurden zu beiden Beobachtungszeitpunkten morphologische Veränderung festgestellt. Für jedes Testmedium wurde der Prozentsatz der Isolate des Organismus, der morphologische Veränderungen hinsichtlich der Keimschlauchbildung (gt), der Fadenbildung (F) und der Faden- und Chlamydosporenerzeugung (FC) zeigte, notiert. Bezüglich der Cryptococcus-Organismen wurde die Anzahl der Isolate, die eine sichtbare Veränderung in der Pigmentierung aufwiesen, als Prozentsatz der Gesamtanzahl der untersuchten Isolate aufgezeichnet, wobei die Inspizierung der Pigmentierung ebenfalls in Zeitabständen von 3 und 24 Stunden erfolgte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.
§09814/0648
Probe, Agar Oxgall Kaffee-Nr. g/l g/l· säure
(3) 20 0,3
(4) 20 0,25 0,3
(5) 20 0,25 0,3
O (6) 20 1,25 0,3
_* (7) 20 1,25 0,3
(8) 20 2,5 0,3
(9) 20 2,5 0,3
(10) 20 5,0 0,3
(11) 20 5,0 0,3
(12) 20 10 0,3
(13) 2O 10 0,3
(14) 20 10 0,3
Tween 80 gereinigt g/l tes Sapqnin /1
TABELLE 4
Std. Candida
albicans
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10 5
10 50 Candida Candida Candida Cryptococcus Cryptococcus stellatoidea tropicalis krusei neoformans diffluens
3
24		 30% gt
100% F		 80%
100%		 100% F 40% F 100%
3
24		 20% F 40%
10%
50%		 100%
3
24		 100% gt
60% F		 25%
50%		 1OO%
3
24		 40% gt
20% FC
60% F		 100%
90%		 100% F 100%
3
24		 100% gt
60% F		 100%
50%		 100% F —t —— 100%
3
24		 100% gt
80% FC		 100%
90%		 100% F 30% F 100%
3
24		 100% gt
100% FC		 100%
100%		 100% F 10% F 100%
3
24		 60% gt
100% FC		 100%
80%		 100% F 90% F 100%
3
24
3
24		 100% gt
100% FC
60% gt
100% FC		 100%
100%
90%
100%		 1OO% F
100% F		 40% F
80% F		 20%
100%
50%
100%
3
24
3
24
3
24		 100% gt
100% gt
100% gt
100% F
100% gt
100% FC		 gt
FC		 100% F
100% F		 100% F
9O% F
100% F		 20%
100%
60%
100%
5O%
100%
3
24		 100% gt
100% FC		 gt
FC
F		 100% F 9O%
100?
gt
F
gt
FC
gt
F
gt
FC
gt
FC
gt
FC
gt
FC
gt
ι FC
100% gt
100% FC
80% gt
100% FC
100% gt
100% FC
100% gt
100% FC
10%
10%
100%
50%
50% 100%
ioo%
TABELLE 4 (Fortsetzung)
(15) 20 10 0,3
(16) 2O 2,5 0,025 —
(17) 20 2,5 0,25 —
(18) 2O 2,5 2,50 -—
(19) 20 2,5 12,50
(20) 20 2,5 25,00
CO
O
CO
OO
100 3
24		 100%
100%		 gt
FC		 100%
100%		 gt
FC
10 3
24		 ioo%
100%		 gt
FC		 100%
100%		 gt
FC
10 3
24		 100%
100%		 gt
FC		 100%
ioo%		 gt
FC
10 3
24		 ioo%
ioo%		 gt
FC		 100%
100%		 gt
FC
10 3
24		 100%
100%		 gt
FC		 100%
100%		 gt
FC
10 3
24		 100%
90%		 gt
FC		 100%
60%		 gt
FC
l0O% F 100% F 100% F 20% F 100% F
100% F
60% F
100% F
100% F
30% PSH
100% F 1OO% F
20% 1OO%
100% 100% 100%
Probe 1 der Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse, wenn weder Tween 80 noch gereinigtes Saponin in einem Oxgall-Kaffeesäure-Medium enthalten ist. In den Proben 2 bis 11 wurde die Menge der Kaffeesäure konstant gehalten, die Menge an Oxgall jedoch nach oben variiert, und zwar in Abständen von 2 Proben, von 0 (in den Proben 2 und 3) bis 5 g/l (in den Proben (10 und 11). Von jedem Probenpaar mit der gleichen Menge Oxgall enthielt die eine Probe Tween 80 in Kombination mit dem Oxgall und der Kaffeesäure (die Proben mit den geraden Nummern), die anderen gereinigtes Saponin gemäß der Erfindung (die Proben mit den ungeraden Nummern). In beiden Fällen wurden 10 g/l Tween 80 bzw. gereinigtes Saponin angewandt. Die Untersuchung der Proben 2 bis 11 veranschaulicht die Überlegenheit des SOC-Mediums gemäß der Erfindung im Vergleich zu dem TOC-Medium bezüglich der morphologischen Veränderungen bei der Gattung Candida, oder der Veränderungen in der Pigmentierung bei der Gattung Cryptococcus, oder bei beiden.
Die Proben 12 bis 15 veranschaulichen, daß wenn der Gehalt an Oxgall und Kaffeesäure in den Medien auf einem konstanten Wert gehalten, der Gehalt an gereinigtem Saponin jedoch im Bereich von 5 bis 100 g/l variiert wird, gute Ergebnisse erzielt werden können. Das Studium der Proben 12 bis 15 macht jedoch deutlich, daß die maximale Pigmentierung von
9098U/0648
Cryptococcus neoformans bei der Beobachtung nach drei Stunden mit nur 5 g gereinigtem Saponin erzielt wird, während die Zugabe von mehr Saponin die Änderung in der Pigmentierung nicht verbessert.
Die Proben 16 bis 20 veranschaulichen, daß unterschiedliche Mengen Kaffeesäure in Kombination mit dem Oxgall und dem
gereinigten Saponin verwendet werden können. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß bei Mengen von unter etwa 0,25 g/l die Kaffeesäure in unzureichenden Mengen vorhanden ist, um die gewünschte Änderung der Pigmentierung nach 3 bzw. 24 Stunden hervorzurufen.
sch:ek
Ö098U/0648

Claims (1)

  1. UEXKÜLL Ä STOLBERG
    aooo HAMaurw; ">2
    J.K. and Susie L. Wadley Research Institute
    9000 Harry Hines Blvd. Dallas, Texas 75235 / V.St.A.
    PATENTANWÄLTE
    DK. J.-3. TRHR. von 1JEXKULL DR. ULRICH GRAF STOLBERG DIPL.-ING. JÜRGEN SUCHANTKE
    (Prio: 25. August 1977 US 827 573 - 14768)
    Hamburg, 31. Juli 1978
    Kulturmedium für Fungi
    Patentansprüche
    1. Kulturmedium für Fungi, enthaltend frische Ochsengalle, gereinigtes Saponin und ein Substrat für Phenoloxydase sowie ein Trägermaterial.
    2. Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat für die Phenoloxydase aus 2,3-Dihydroxybenzoesäure, Protocatechusäure, DOPA, Kaffeesäure, dem Methylester der Kaffeesäure, dem Diacetat der Kaffcosäure, 3-Hydroxytryptamin, Norepinephrin oder 4-lIydroxy-3,5-dimethoxyzimtsäure besteht.
    $03814/0348
    ORIGINAL INSPECTED
    Ochsengalle und Kaffeesäure enthaltendes KultuTiSeaitiM ^ **
    nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es je Liter Medium mindestens etwa 0,3 g gereinigtes Saponin enthält.
    4. Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es in Trockenform zum Vermischen mit Wasser vorliegt.
    5. Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus Agar besteht.
    6. Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es bezogen auf den Wassergehalt des Mediums etwa 1 bis etwa 5 Gew.% Agar, etwa 0,1 bis 1,0 Gew.% gereinigtes Saponin, etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.% Ochsengalle und etwa 0,005 bis etwa 0,05 Gew.% Kaffeesäure enthält.
    7. Kulturmedium nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 2 Gew.% Agar, etwa 0,5 Gew.% gereinigtes Saponin, etwa 1 Gew.% Ochsengalle und etvra 0,03 Gew.% Kaffeesäure enthält.
    8. Die Verwendung des Kulturmediums nach Anspruch 1 bis 7 zur Identifizierung von Cryptococcus neoformans und
    809814/064*
    2833346
    Candida albicans in Proben von Körperflüssigkeiten, die auf das Kulturmedium aufgebracht werden.
    9· Die Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Probe der Körperflüssigkeit zunächst auf ein erstes Kulturmedium und dann die gebildete Kultur auf ein zweites Medium übertragen wird.
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