DE19807550C2 - Verfahren zum Analysieren von Bilirubin-Fraktionen - Google Patents
Verfahren zum Analysieren von Bilirubin-FraktionenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum
Analysieren von Bilirubin-Fraktionen in lebenden
Körperflüssigkeitproben wie z. B. Plasma, Serum, Urin usw. und
insbesondere auf ein Verfahren zum Analysieren von Bilirubin-
Nicht-δ-Fraktionen und einer Bilirubin-δ-Fraktion in lebenden
Körperflüssigkeitsproben, wobei Bilirubinoxidase verwendet
wird, die in Gegenwart von mindestens einem kationischen
oberflächenaktiven Mittel und/oder einem nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittel nicht fähig ist, eine Bilirubin-δ-
Fraktion zu oxidieren, die aber fähig ist, Bilirubin-Nicht-δ-
Fraktionen zu oxidieren; sie bezieht sich auch auf ein
Analyse-Set zur Verwendung in demselben Verfahren.
Bilirubin ist ein Stoffwechselprodukt von Hämoglobin, das aus
gealterten Erythrozyten stammt, und die Hauptkomponente von
Gallenfarbstoff bildet. Blut enthält eine Fraktion mit
erhöhter Wasserlöslichkeit (gekoppelte Form) aufgrund einer
Esterbindung einer Seitenketten-Propionat-Gruppe von
Bilirubin hauptsächlich enzymatisch an Glucuronsäure in der
Leber, sowie eine Fraktion mit verringerter Wasserlöslichkeit
(freie Form), da die Propionat-Gruppe im freiem Zustand
bleibt. Das Erstgenannte wird wegen seiner leichten Reaktion
mit einem Diazo-Reagens "direktes Bilirubin" genannt, während
das Letztgenannte als "indirektes Bilirubin" bestimmt wird,
indem die Konzentration an direkten Bilirubin von der
Konzentration des Gesamtbilirubins, die durch Diazofärben von
Bilirubin in Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers wie z. B.
Alkohol, usw. erhalten wird, da die Reaktion mit dem
Diazoreagens nur in Gegenwart des Reaktionsbeschleunigers
abläuft, substrahiert wird.
Durch fraktionierte Bestimmung der Konzentrationen der
konjugierten Form bzw. der freien Form von Bilirubin kann
eine Diagnose von Gelbsucht aufgrund verschiedener
Lebererkrankungen, hämolytischer Erkrankungen, usw.
durchgeführt werden; somit ist die Bestimmung von Bilirubin
ein wichtiger Untersuchungsbestandteil bei der klinischen
Laboruntersuchung.
Abgesehen von der Reaktion mit einem Diazoreagens wurde auch
eine fraktionierte Analyse von Bilirubin durch Hochdruck-
Flüssigkeitschromatographie (HPLC) untersucht. Bilirubin in
Serum wird durch HPLC hauptsächlich in vier Fraktionen, d. h.
α-, β-, γ- und δ-Fraktion aufgetrennt, wobei die α-Fraktion
als die freie Form von Bilirubin identifiziert ist; die β-
Fraktion als Bilirubin, bei dem eine der zwei Propionat-
Gruppen im Molekül eine Esterbindung mit Glucuronsäure bildet
(Bilirubinmonoglucuronid), identifiziert ist; die γ-Fraktion
als Bilirubin, bei dem beide Propionat-Gruppen eine
Esterbildung mit Glucuronsäure eingegangen sind
(Bilirubindiglucuronid), identifiziert ist; und die δ-Fraktion
als Bilirubin in kovalenter Bindung mit Albumin identifiziert
ist. Außerdem wird angenommen, daß die δ-Fraktion aus nicht
enzymatischer Reaktion der γ-Fraktion mit Albumin resultiert
(Toshio Yamashita: Journal of The Japanese Society of
Internal Medicine 78 (11), 36-41 (1989)).
Entsprechend der Klassifikation basierend auf der Reaktivität
zu einem Diazoreagens wird angenommen, daß die α-Fraktion
indirektem Bilirubin entspricht und die β- und γ-Fraktionen
und auch die δ-Fraktion dem direkten Bilirubin entsprechen
(John J. Lauff: Clin. Chem. 28 (4), 629-637 (1982)).
Die β- und γ-Fraktionen werden aus wasserlöslichen
Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht gebildet und
können somit leicht die Nierenglomeruli passieren, um rasch
in Urin ausgeschieden zu werden. D. h. sie bleiben nie über
längere Zeit im Blut. Die δ-Fraktion dagegen kann keinen
Metabolismus als Bilirubin, sondern eher als Albumin,
durchmachen; und es wird angenommen, daß die Halbwertszeit
der δ-Fraktion im Blut 2 bis 3 Wochen lang ist, wohingegen
die anderer Fraktionen einige 10 min kurz ist (John J. Lauff:
J. Chromatogr., 226, 391-402 (1981); J. S. Weis: N. Engl. J.
Med., 309, 147-156 (1983)).
Analysenresultate von Serum-Bilirubin nach dem herkömmlichen
Diazoverfahren können eine wichtige Information über die
Anfangsphase von Gelbsucht, insbesondere Hyperbilirubinämie
(direkte Form) geben; allerdings wurde das Diazoverfahren
bisher als nicht geeignet angesehen, um Analysenresultate
anzugeben, die fortschreitende Veränderungen bei Gelbsucht
genau und zeitlich wiedergeben. Dieses Phänomen wird aus der
Tatsache, daß eine Reaktion der γ-Fraktion mit Albumin die δ-
Fraktion verstärken kann, offensichtlich; dadurch wird die
Bilirubin-Stoffwechselrate verzögert, was eine Verzögerung
zwischen den Bilirubin-Analysenresultaten und der
tatsächlichen Verbesserung und/oder Verschlechterung der
Erkrankung verursacht. D. h., es kann gesagt werden, daß in
dem Fall, in dem eine große Menge δ-Fraktion vorliegt, die
den langsamen Stoffwechselprozeß hat und die auch in Proben
die Reaktivität mit direktem Bilirubin zeigt, die Bilirubin-
Analysenresultate nach dem Diazoverfahren keine klinischen
Bedeutung mehr haben, da die Analysenresultate auch den hohen
Level an δ-Bilirubin beinhalten und daher das Fortschreiten
der Erkrankung nicht korrekt wiedergeben. (Toshio Yamamoto:
Tan-Kan-Sui (Gallblader, Liver and Pancrease), 11 (3),
393-400 (1985)).
Zur Bestimmung von Bilirubin-Konzentrationen, die gegenüber
Veränderungen des Krankheitszustandes empfindlich sind,
wurden Versuche hinsichtlich einer fraktionierten
quantitativen Bestimmung der einzelnen α- bis β-Fraktionen
gemacht; einer dieser Versuche basiert auf dem oben erwähnten
HPLC-Verfahren (John J. Lauff: J. Chromatogr., 226, 391-402
(1981)). Seine Verbesserungen bestanden darin, daß
komplizierte Proben-Vorbehandlungsschritte so weit wie
möglich weggelassen wurden (Nakamura H.: Bunsekikagaku, 36,
352-355 (1987); Yukihiko Adachi: Gastroenterologia Japanica,
23 (3), 268-272 (1988); Yuko Kato: Medical Journal of Kinki
University, 14 (1), 97-112 (1989)).
Auf der Basis dieser HPLC-Resultate wurde berichtet, daß ein
Verhältnis einzelner Bilirubin-Fraktionen wie z. B. δ/(β + γ + δ),
(β + γ)/δ oder β/δ Veränderungen bei Lebererkrankungen
empfindlich wiedergibt und insbesondere für eine Prognostik
nützlich ist. Eine Analyse einzelner Bilirubin-Fraktionen
könnte die Probleme der Bilirubin-Analyse durch das
herkömmliche Diazoverfahren lösen, da die Information sogar
bei Fortschreiben der Erkrankung nur durch eine einzige
Untersuchung erhalten werden könnte; damit wurde die Position
von Serum Bilirubin bei der Leberfunktionsuntersuchung als
wichtig angesehen (Toshio Yamamoto: Kan-Tan-Sui (Gallblader,
Liver and Pancrease) 11 (3), 393-400 (1985)).
Allerdings erfordert das HPLC-Verfahren etwa eine Stunde zur
Analyse einer Probe, selbst wenn die komplizierten
Vorbehandlungen weggelassen werden könnten; somit kann es
nicht als praktisches Verfahren zur Untersuchung einer großen
Anzahl von Proben täglich angesehen werden, sondern nur als
Untersuchungsverfahren für den Labormaßstab.
Andererseits entwickelten Wu et al. ein
Trockenchemieverfahren (Ektachem-Verfahren) als in der Praxis
äußerst gut anwendbares Verfahren zur Analyse von Bilirubin-
Fraktionen auf der Basis eines Prinzips, bei dem Proteine
einschließlich der δ-Fraktion durch eine Spezialmembran
abgetrennt und entfernt werden können; dann wird die
Bilirubin-Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht, die durch
die Membran gegangen ist, mit kationischen Polymeren
reagieren gelassen; die freie Form von Bilirubin (α-Fraktion)
und die konjugierte Form von Bilirubin (β + γ-Fraktion) können
als Resultat einer Änderung im Reflexionsspektrum bei 400 nm
bzw. 460 nm fraktioniert und quantitativ bestimmt werden,
wobei die δ-Fraktion erhalten werden kann, indem die
Analysenresultate für die freie Form von Bilirubin (α-
Fraktion) und die konjugierte Form von Bilirubin (β + γ-
Fraktion) von dem Analysenresultat für Gesamtbilirubin, das
nach dem Diazoverfahren erhalten wird, subtrahiert werden.
D. h., nach dem Ektachem-Verfahren werden die Konzentration an
Gesamtbilirubin, die Konzentration an Bilirubin in freier
Form (α-Fraktion), die Konzentration an Bilirubin in
konjugierter Form (β + γ-Fraktion) und die Konzentration der δ-
Fraktion fraktioniert bzw. quantitativ bestimmt (Tai-Wing Wu:
Clin. Chem., 30 (8), 1304-1309 (1984)).
Das Ektachem-Verfahren kann eine Probe in wenigen Minuten
analysieren und kann somit als ein in der Praxis
hervorragendes Verfahren zur Analyse von Fraktion angesehen
werden. Es wurde berichtet, daß bei einem Vergleich die
Analysenresultate des Ektachem-Verfahrens bezüglich
Hyperbilirubinämie (direkte Form) in guter Übereinstimmung
mit denen des HPLC-Verfahrens waren. Allerdings wurde auch
berichtet, daß in dem Fall, wo die Gesamtbilirubin-
Konzentration im Normalbereich liegt (nicht mehr als
1,3 mg/dl) oder im Fall von Hpyerbilirubinämie (indirekte
Form) die analysierte δ-Fraktion des Ektachem-Verfahrens
beträchtlich von der des HPLC-Verfahrens abwich (Yukihiko
Adachi: Gastroenterologia Japonica, 23 (3), 268-272 (1986)).
Darüber hinaus hat das Ektachem-Verfahren den Nachteil, daß
aufgrund der Messung der Reflexionsintensität gefärbte
Substanzen starken Einfluß haben (Young D. S.: Washington D. C.
AACC Press (1990); Yound D. S.: 1991 Supplement. Washington
D. C. AACC Press (1991); Friedoman R. B.: Washington D. C. AACC
Press (1990)). Außerdem sind aufgrund der Trockenchemie
Spezialinstrumente für die Analyse erforderlich; damit fehlt
es dem Ektachem-Verfahren an Vielseitigkeit bei einer
gleichzeitigen mehrphasigen Untersuchung einer großen
Probenzahl wie bei der mehrphasigen Analyse bei einer
klinischen Laboruntersuchung, was ein weiterer Nachteil ist.
Ein weiteres praktisches Verfahren zur Analyse von Bilirubin-
Fraktionen wurde von Akira Kosaka: Seibutsu Shiryo Bunseki
(Biological Sample Analysis), 9 (3), 15-23 (1986);
JP-A-62,105047) oder von Umachi et al. (Hisami Umachi: Rinsho
Byori (Clinical Pathology), 37 (8), 905-910 (1989))
vorgeschlagen.
Nach dem Verfahren von Kosaka et al. wird Bilirubinoxidase,
die von Myrothecium verrucaria stammt, auf eine Probe mit
pH 10,0 einwirken gelassen, um die β- und γ-Fraktionen durch
Oxidation zu eliminieren; dann wird nur die δ-Fraktion zur
Bestimmung einer Diazofärbung durch direkte Diazoreaktion
unterzogen, oder die α- und δ-Fraktion werden zur Bestimmung
durch indirekte Diazoreaktion (Diazoreaktion in Gegenwart
eines Reaktionsbeschleunigers wie z. B. Alkohol, usw.) einer
Diazofärbung unterworfen und das Analysenresultat wird von
dem Analysenresultat für die Gesamtbilirubin-Konzentration
oder dem Analysenresultat für die direkte Bilirubin-
Konzentration abgezogen, wodurch die Konzentrationen der α-
Fraktion und der β + γ-Fraktion wie auch der δ-Fraktion
bestimmt werden können.
Allerdings leidet das Verfahren von Kosaka et al. an
folgenden Unannehmlichkeiten: daß gleichzeitig mit der
Eliminierung der β- und γ-Fraktion durch Oxidation mit der
Bilirubinoxidase, die von Myrothecium verrucaria stammt, ein
Teil der α-Fraktion in gleicher Weise durch Oxidation
eliminiert wird; daß ein Teil der α-Fraktion während der
direkten Diazoreaktion ebenfalls eine Diazofärbung eingeht;
daß der Reaktionsgrad zwischen der direkten Reaktion und der
indirekten Reaktion bei der Diazofärbung der δ-Fraktion
unterschiedlich ist, was zu sehr komplizierten Fehlern in
dem Analysenresultaten führt; dies zeigt die Tendenz zu
Abweichungen bei der Konzentration der bestimmten δ-Fraktion
zwischen diesem Verfahren und dem HPLC-Verfahren (Biological
Sample Analysis), 9 (3), 15-23 (1986); John J. Lauff: Clin,
Chem., 28 (4); 629-637 (1982); Lo H. D.: Clim., 29, 31-36
(1983)).
Das Verfahren von Kosaka et al. ist ein Mehrstufen-
Reaktionsverfahren; grundsätzlich ist eine manuelle Analyse
obligatorisch. Damit ist das Verfahren nicht auf einen
automatischen Allzweck-Zweireagenzien-Analysator anwendbar;
außerdem fehlt es ihm an Einfachheit.
Nach dem Verfahren Umachi et al. wird dagegen
Bilirubinoxidase, die von Trachyderma tsunodae stammt, auf
eine Probe mit pH 8,0 in Gegenwart von Salicylsäure einwirken
gelassen, um die α-, β- und γ-Fraktionen durch Oxidation zu
eliminieren; lediglich die δ-Fraktion wird zur Analyse einer
Diazofärbung durch Diazoreaktion unterworfen. Die Analyse der
einzelnen Fraktionen kann wie in dem Verfahren von Kosaka et
al. durchgeführt werden, d. h., die Konzentrationen der α-
Fraktion und der β + γ-Fraktion wie auch der δ-Fraktion können
aus dem Analysenresultat für die Konzentration der δ-Fraktion
oder durch Subtraktion vom Analysenresultat für die
Konzentration der Gesamtbilirubin-Fraktion oder dem
Analysenresultat für die Konzentration der direkten
Bilirubin-Fraktion bestimmt werden.
In dem Verfahren von Umachi et al. eliminiert die
Bilirubinoxidase, die von Trachyderma tsunodae stammt, in
Gegenwart von Salicylsäure etwa 40% der δ-Fraktion durch
Oxidation; es ist unmöglich, eine exakte Bestimmung der δ-
Fraktion durchzuführen. Darüber hinaus ist das Verfahren
ebenfalls ein Mehrstufen-Reaktionsverfahren; grundsätzlich
ist ein manuelle Analyse obligatorisch. Damit ist das
Verfahren nicht auf einen automatischen Allzweckanalysator
anwendbar; außerdem fehlt ihm die Einfachheit.
Bei der Analyse von Serum-Bilirubin kann - wie oben
beschrieben wurde - das herkömmliche Diazoverfahren den
Erkrankungszustand im Fall eines größeren Anteils der δ-
Fraktion nicht genau wiedergeben; lediglich Analysenresultate
von Bilirubin-Fraktionen können empfindlich auf den
Erkrankungszustand eingehen. Ein technischer Durchbruch für
die Analyse von Bilirubin-Fraktionen ist offensichtlich nur
eine Entwicklung eines einfachen Verfahrens zum Analysieren
der δ-Fraktion. Allerdings sind bei der täglichen klinischen
Laboruntersuchung keine geeigneten Reagenzien zur
Untersuchung der δ-Fraktion für einen automatischen Allzweck-
Zweireagenzien-Analysator verfügbar gewesen, der fähig ist,
eine gleichzeitige Analyse mehrerer Werte bei einer großen
Anzahl von Proben durchzuführen. Somit wurde die Entwicklung
von Reagenzien gefordert, die fähig sind, die δ-Fraktion in
dem automatischen Analysator mit hoher Zuverlässigkeit zu
bestimmen.
WO 86/00933 offenbart ein Reagenz mit einem pH von etwa 8 bis
8,4, das umfasst:
- a) eine Bilirubinoxidase, die aus der Gattung Myrothecium stammt,
- b) einen Puffer, und
- c) ein Tensid, das eine Mischung aus Natriumcholat und Natriumdodecylsulfat umfasst, wobei Natriumcholat und das Natrimdodecylsulfat in der Mischung in Mengen vorliegt, so dass das Reagenz in der Lage ist, α-, β- und γ-Bilirubin zu oxidieren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der
Bereitstellung eines Verfahrens zum Analysieren von
Bilirubin-Fraktionen und eines Analyse-Sets, das für einen
automatischen Allzweck-Analysator des Zwei-Reagenzien-Typs
zur Durchführung einer gleichzeitigen Analyse mehrerer Werte
bei einer großen Anzahl von Proben in guter Übereinstimmung
mit den Analysenresultaten des HPLC-Verfahrens, das bisher
als das Standardverfahren angesehen wurde, geeignet ist.
Als Resultat ausgedehnter Untersuchungen über
Reaktionsbedingungen zur Begünstigung einer
Oxidationsreaktion der einzelnen α-, β- und γ-Fraktionen von
Bilirubin durch Bilirubinoxidase bei Unterdrückung der
Oxidation der δ-Fraktion mit Hilfe der HPLC-Analyse stellten
die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, daß das
Vorliegen von mindestens einem kationischen
oberflächenaktiven Mittel und/oder einem nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittel, wie in Anspruch 1 definiert, die
Oxidation der δ-Fraktion unterdrücken kann und die Oxidation
der α-, β- und γ-Fraktionen fördern kann.
Darüber hinaus stellten die Erfindung der vorliegenden
Erfindung fest, das im Unterschied zu der Bilirubinoxidase,
die von Myrothecium verrucaria stammt, und der
Bilirubinoxidase, die von Trachyderma tsunodae stammt, eine
Bilirubinoxidase, die von der Gattung Pleurotus stammt, keine
beträchtliche Hemmung in Gegenwart von mindestens einem
kationischen oberflächenaktiven Mittel und/oder einem nicht-
ionischen oberflächenaktiven Mittel, wie in Anspruch 1
definiert, erleidet.
Als Resultat weiterer Untersuchungen auf der Basis der
Kombination dieser Feststellungen vollendeten die Erfinder
die vorliegende Erfindung einer praktisch vollständigen
Oxidation der α-, β- und γ-Fraktionen, während die Oxidation
der δ-Fraktion im wesentlichen unterdrückt wird.
D. h. die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum
Analysieren von Bilirubin-Fraktionen bereit, das die
folgenden Schritte umfaßt:
- - das Reagieren einer Bilirubinoxidase, die von der Gattung Pleurotus, Melanoleuca oder Agaricus stammt und die in Gegenwart mindestens eines kationischen oberflächenaktiven Mittels und/oder eines nicht- ionischen oberflächenaktiven Mittels, ausgewählt aus einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n- alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso- alkylphenyl)ether, nicht fähig ist, eine Bilirubin-δ- Fraktion zu oxidieren, aber fähig ist, Bilirubin-Nicht- δ-Fraktionen zu oxidieren, als Oxidationsmittel mit der lebenden Körperflüssigkeitsprobe in Gegenwart des besagten kationischen oberflächenaktiven Mittels und/oder nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, wobei das kationische oberflächenaktive Mittel und/oder das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration vorliegen (vorliegt), die wirksam ist, um die Oxidation der Bilirubin-δ-Fraktion zu unterdrücken; und
- - das Bestimmen der Menge der so oxidierten Bilirubin- Nicht-δ-Fraktionen oder der nicht-oxidierten Bilirubin- δ-Fraktion, um auf diese Weise die Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder die Konzentration der Bilirubin-δ-Fraktion der lebenden Körperflüssigkeitsprobe zu erhalten.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Bestimmung der Konzentration einer Bilirubin-δ-Fraktion
in einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe bereit, welches die
folgenden Schritte umfaßt:
- a) Einwirkenlassen ein Reagenzes, das fähig ist, mit dem gesamten Bilirubin zu reagieren, auf eine lebende Körperflüssigkeitsprobe, wodurch die Konzentration an Gesamtbilirubin bestimmt wird;
- b) Wirken lassen einer Bilirubinoxidase, die in Gegenwart von mindestens einem kationischen oberflächenaktiven Mittel und/oder einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, ausgewählt aus einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(iso- alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso-alkylphenyl)ether, nicht fähig ist, die Bilirubin-δ-Fraktion zu oxidieren, aber fähig ist, Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen zu oxidieren, als Oxidationsmittel auf die lebende Körperflüssigkeitsprobe und Bestimmen der Menge der umgesetzten Bilirubin-Nicht-δ- Fraktionen, wodurch die Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ- Fraktionen bestimmt wird; und
- c) Subtrahieren der in Schritt ii) erhaltenen Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen von der in Schritt i) erhaltenen Konzentration an Gesamtbilirubin, wodurch die Konzentration der Bilirubin-δ-Fraktion erhalten wird.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Analyse-
Set zur Bestimmung der Konzentrationen der Bilirubin-Nicht-δ-
Fraktionen oder der Konzentration der Bilirubin-δ-Fraktion in
einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe bereit, das
- a) mindestens ein kationisches oberflächenaktives Mittel und/oder ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n- alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso- alkylphenyl)ether; und
- b) eine Bilirubinoxidase, die von der Gattung Pleurotus, Melanoleuca oder Agaricus stammt und die in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels nicht fähig ist, die Bilirubin-δ-Fraktion zu oxidieren, aber fähig ist, die Bilirubin-Nicht-δ-Fraktion zu oxidieren,
umfaßt.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung noch die
Verwendung einer Bilirubinoxidase bereit, welche in Gegenwart
mindestens eines kationischen oberflächenaktiven Mittel
und/oder eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels,
ausgewählt aus einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem
Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n-
alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso-
alkylphenyl)ether, nicht fähig ist, die Bilirubin-δ-Fraktion
zu oxidieren, die aber fähig ist, Nicht-δ-Fraktionen zu
oxidieren, bei der Bestimmung der Konzentration der
Bilirubin-δ-Fraktion oder
der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen in einer lebenden
Körperflüssigkeit.
Fig. 1 zeigt ein typisches Fraktionierungsmuster einer
Gelbsucht-Serumprobe, das durch Bilirubin-
Fraktionierungsanalyse mit HPLC erhalten wird.
Fig. 2 zeigt Fraktionierungsmuster vor bzw. nach Reaktion
einer Gelbsucht-Serumprobe gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 zeigt die Korrelation zwischen Konzentrationen
Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen gemäß HPLC (herkömmliches
Verfahren) und denen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 4 zeigt die Korrelation zwischen Konzentrationen der
Bilirubin-δ-Fraktion gemäß HPLC (herkömmliches Verfahren) und
denen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Der Ausdruck "lebende Körperflüssigkeitsprobe", der hier
gebraucht wird, meint eine Probe, die von einer
Körperflüssigkeit im lebenden Körper, einschließlich Plasma,
Serum, Urin, usw. erhältlich ist.
Kationische oberflächenaktive Mittel zur Verwendung in der
vorliegenden Erfindung beinhalten vorzugsweise quaternäre
Ammoniumsalze, die durch die folgenden Formeln (I), (II) und
(III) dargestellt werden:
worin R1, R2 und R3 unabhängig voneinander eine Alkyl-Gruppe
mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkyl-Gruppe mit 5
bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 10
Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10
Kohlenstoffatomen darstellen; Xm- ein m-wertiges Anion
darstellt; und n eine ganze Zahl von 7 bis 17 darstellt.
In der vorerwähnten Formel (I) kann die Alkyl-Gruppe R1, R2
und R3, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome hat, entweder
geradkettig oder verzweigt sein und z. B. Methyl, Ethyl, n-
Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, tert-Butyl,
Pentyl, Hexyl, Octyl, usw. umfassen; die Cycloalkyl-Gruppe
mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen umfaßt beispielsweise
Cyclopentyl, Cyclohexyl, usw.; die Aryl-Gruppe mit 6 bis 10
Kohlenstoffatomen umfaßt z. B. Phenyl, Tolyl, Xylyl, Naphthyl,
usw.; die Aralkyl-Gruppe umfaßt z. B. Benzyl, Phenethyl, usw.
R1, R2 und R3 können gleich sein oder voneinander
verschiedene Gruppen sein.
In den vorangehenden Formeln (I), (II) und (III) umfassen
Beispiele für 1/mXm- Ionen wie z. B. F-, Cl-, Br- und I-; und
NO3 -, 1/2SO4 2-, 1/2SO3 2-, CH3SO4 -, p-Toluolsulfonat-Ion, usw.
Gruppen, die durch CH3(CH2)n- dargestellt werden, beinhalten
beispielsweise Decyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl,
Octadecyl, usw.
Beispiele für quaternäre Ammoniumsalze, die durch die
vorerwähnte Formel (I), dargestellt werden, umfassen
Alkyltrimethylammoniumsalze wie z. B.
Dodecyltrimethylammoniumbromid,
Dodedcyltrimethylammoniumchlorid,
Tetradecyltrimethylammoniumbromid,
Tetradecyltrimethylammoniumchlorid, usw.;
Alkyltriethylammoniumsalze wie z. B.
Dodecyltriethylammoniumchlorid,
Tetradecyltriethylammoniumchlorid, usw.;
Alkyltripropylammoniumsalze wie z. B.
Dodecyltripropylammoniumbromid,
Tetradecyltripropylammoniumchlorid, usw.; Benzylammoniumsalze
wie z. B. Dodecyldimethylbenzylammoniumchlorid,
Tetradecyldimethylbenzylammoniumchlorid (Zephiramin),
Dodecyldiethylbenzylammoniumchlorid,
Tetradecyldiethylbenzylammoniumchlorid, usw.; und andere.
Beispiele von quaternären Ammoniumsalzen, die durch die
vorstehende Formel (II) dargestellt werden, umfassen
Alkylpyridiniumsalze wie z. B. Decylpyridiniumchlorid,
Dodecylpyridiniumchldorid, Tetradecylpyridiniumchlorid,
Cetylpyridiniumbromid, usw.; und andere.
Beispiele für quaternäre Ammoniumsalze, die durch die
vorstehende Formel (III) dargestellt werden, umfassen
Alkylbipyridiniumsalze wie z. B. Decylbipyridiniumchlorid,
Dodecylbipyridiniumbromid, Tetradecylbipyridiniumbromid,
usw.; und andere.
Unter den oben genannten kationischen oberflächenaktiven
Mitteln sind Alkyltrimethylammoniumsalze bevorzugt, und
Alkyltrimethylammoniumsalze von C12-C16 sind besonders
bevorzugt. Die oben genannten kationischen oberflächenaktiven
Mittel können allein oder als Kombination von zwei oder
mehreren der genannten eingesetzt werden.
Das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel zur Verwendung in
der vorliegenden Erfindung ist ein solches, dessen
Polyoxyethylen-Kette als hydrophiler Bereich dienen kann und
wird ausgewählt aus Polyoxyethylen-(n-alkyl- oder -isoalkyl)-
ether wie z. B. Polyoxyethylen-(isoalkyl)ether (Adekatol
SO-135, Warenzeichen eines Produktes, das von Asahi Denka
Kogyo K. K., Japan erhältlich ist), Polyoxyethylen-(n-
alkyl)ether (Emulgen 707, Warenzeichen eines Produktes, das
von Kao Corp., Japan erhältlich ist),
Polyoxyethylencetylether (Brij 58, Warenzeichen eines
Produktes, das von Aldrich Chemical Co., Inc., USA erhältlich
ist), usw.; und Polyoxyethylen-(n-alkylphenyl- oder
-isoalkylphenyl)ether wie z. B. Polyoxyethylen-(n-
nonylphenyl)ether (Adekatol NP-675, Warenzeichen eines
Produktes, das im Handel von Asahi Denka K. K., Japan
erhältlich ist), Polyoxyethylenisooctylphenylether (Triton
X-100 und X-405, Warenzeichen von Produkten, die im Handel
von Rhom & Haas K. K., Japan erhältlich sind).
Unter diesen sind Polyoxyethylen-(n-alkyl oder
-isoalkyl)ether bevorzugt. Die oben genannten nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittel können allein oder als Kombination
aus zwei oder mehreren verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, das oben
genannte kationische oberflächenaktive Mittel allein oder
eine Kombination aus dem kationischen oberflächenaktiven
Mittel und dem oben erwähnten nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittel einzusetzen. Eine Kombination aus
beiden, dem kationischen und nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittel ist wegen des synergistischen
Effekts, der in den folgenden Beispielen dargestellt ist,
besonders günstig.
Bilirubinoxidase zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
ist eine Bilirubinoxidase, die in Gegenwart von mindestens
einem kationischen oberflächenaktiven Mittel und/oder dem
nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel nicht fähig ist,
eine Bilirubin-δ-Fraktion zu oxidieren, die aber fähig ist,
die Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen, (α-, β- und γ-Fraktion)
praktisch vollständig zu oxidieren; es kann irgendeine
Bilirubinoxidase verwendet werden, sofern sie die oben
angegebenen Eigenschaften hat.
Eine derartige Bilirubinoxidase wird aus Bosidiomycetes
erhalten werden, die fähig sind, eine Bilirubinoxidase mit
den oben genannten Eigenschaften zu produzieren, und stammt
von der Gattung Pleurotus, z. B. Pleurotus ostreatus, Stamm
IFO 9669; der Gattung Melanoleuca, z. B. Melanoleuca
melaleuca, Stamm B-43 FERM BP-570, usw.; oder der Gattung
Agaricus, z. B. Agaricus bisporus, Stamm IFO 30774, usw., die
alle zu Basidiomycetes gehören. Bilirubinoxidase,
die von der Gattung Pleurotus stammt, ist besonders
vorteilhaft.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß
die oben genannte Bilirubinoxidase als Oxidationsmittel auf
eine lebende Körperflüssigkeitsprobe, die Bilirubin enthält,
in Gegenwart mindestens eines der oben genannten kationischen
oberflächenaktiven Mittel und/oder nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittel einwirken gelassen wird, wodurch
die α-, β-, und γ-Fraktionen praktisch vollständig oxidiert
werden können, während eine Oxidation der Bilirubin-δ-
Fraktion in der lebenden Körperflüssigkeitsprobe im
wesentlichen unterdrückt wird. Somit wird nach Einwirkung der
Bilirubinoxidase auf die lebende Körperflüssigkeitsprobe die
Menge an umgesetztem Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen (α-, β- und
γ-Fraktionen) oder die Menge an nicht-umgesetzter Bilirubin-
δ-Fraktion gemessen, wodurch die Konzentration der Bilirubin-
Nicht-δ-Fraktionen oder der Bilirubin-δ-Fraktion in der
lebenden Körperflüssigkeitsprobe genau bestimmt werden kann.
Wenn die Konzentration von mindestens einem der beiden,
kationisches oberflächenaktives Mittel und nicht-ionisches
oberflächenaktives Mittel, zur Verwendung in der Reaktion von
Bilirubinoxidase mit einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe
zu niedrig ist, kann keine zufriedenstellende Wirkung zur
Unterdrückung der Oxidation der Bilirubin-δ-Fraktion und kein
zufriedenstellender Effekt einer Unterstützung der Oxidation
der Bilirubin-α-, -β- und -γ-Fraktionen erreicht werden,
wohingegen eine zu hohe Konzentration die Hemmung der
Bilirubinoxidase-Aktivität unter Behinderung der Oxidation
intensivieren wird. Somit ist der Konzentrationsbereich in
der Reaktionslösung vorzugsweise 0,01 bis 10%, bevorzugter
0,02 bis 5%, besonders bevorzugt 0,05 bis 2%, wobei % eine
Gewichtsangabe, bezogen auf die Reaktionslösung ist.
Bilirubinoxidase kann vorzugsweise in einer Konzentration von
0,1 bis 10 KU/l, vorzugsweise 0,5 bis 5 KU/l in der
Reaktionslösung eingesetzt werden.
Der pH-Bereich der Reaktionslösung ist während der Reaktion
von Bilirubinoxidase nicht besonders limitiert, so lange er
die enzymatische Aktivität aufrechterhalten kann; er ist
vorzugsweise 4,0 bis 9,0, insbesondere 5,5 bis 7,5.
Die Temperatur für die Reaktion von Bilirubinoxidase ist
üblicherweise 25 bis 40°C, und die Reaktionszeit beträgt
üblicherweise 3 bis 15 min.
In der vorliegenden Erfindung können bei geeigneter Auswahl
gemäß dem bekannten Verfahren übliche Reagenzien, die bei der
Analyse von lebenden Körperflüssigkeits-Komponenten anwendbar
sind, beispielsweise Puffersorten, Antiseptika,
Chelatbildner, usw. eingesetzt werden.
Nach Einwirkung von Bilirubinoxidase auf eine lebende
Körperflüssigkeitsprobe kann die Menge an umgesetzten
Bilirubin-nicht-δ-Fraktionen oder nicht-umgesetzter δ-
Fraktion vorzugsweise durch Messung z. B. optischer
Veränderungen in der lebenden Körperflüssigkeitsprobe
bestimmt werden, wobei ein automatischer Analysator für die
Messung verwendet werden kann. Die Menge kann insbesondere
bestimmt werden, indem Veränderungen bei der Extinktion im
Wellenlängenbereich von 430 bis 460 nm durch Bilirubin,
üblicherweise bei 450 nm gemessen werden.
Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise in folgender
Weise durchgeführt werden:
Zur Bestimmung der Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ- Fraktionen auf der Basis optischer Veränderungen in einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe wird eine erste Reagenzlösung, die mindestens ein kationisches oberflächenaktives Mittel und/oder das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel enthält, mit einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe, die Bilirubin enthält, z. B. Plasma, Serum, Urin usw. vermischt; dann wird eine Extinktion im Wellenlängenbereich (430 bis 460 nm) durch Bilirubin in der Lösung gemessen (Extinktion 1). Danach wird eine zweite Reagenzlösung, die eine Bilirubinoxidase enthält, zu der Lösung gegeben, um eine Oxidation von Bilirubin bei 25°C bis 40°C für 3 bis 15 min durchzuführen. Dann wird in der Lösung erneut eine Extinktion im Wellenlängenbereich (430 bis 460 nm) durch das Bilirubin gemessen (Extinktion 2). Nach Durchführung einer Flüssigkeitsvolumen-Korrektur, usw. bei den gemessenen Extinktionen 1 und 2 wird eine Veränderung bei der Extinktion vor und nach der Oxidation erhalten. Die Konzentration von Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen in der lebenden Körperflüssigkeitsprobe kann aus der so erhaltenen Veränderung bei der Extinktion und einer Eichkurve, die vorher in der gleichen Weise wie oben auf der Basis von Veränderungen bei der Extinktion in einer Standardlösung, die bekannte Bilirubin-Konzentrationen hat, bestimmt werden. Eine solche Bestimmung der Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ- Fraktion kann in einem automatischen Analysator durchgeführt werden.
Zur Bestimmung der Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ- Fraktionen auf der Basis optischer Veränderungen in einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe wird eine erste Reagenzlösung, die mindestens ein kationisches oberflächenaktives Mittel und/oder das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel enthält, mit einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe, die Bilirubin enthält, z. B. Plasma, Serum, Urin usw. vermischt; dann wird eine Extinktion im Wellenlängenbereich (430 bis 460 nm) durch Bilirubin in der Lösung gemessen (Extinktion 1). Danach wird eine zweite Reagenzlösung, die eine Bilirubinoxidase enthält, zu der Lösung gegeben, um eine Oxidation von Bilirubin bei 25°C bis 40°C für 3 bis 15 min durchzuführen. Dann wird in der Lösung erneut eine Extinktion im Wellenlängenbereich (430 bis 460 nm) durch das Bilirubin gemessen (Extinktion 2). Nach Durchführung einer Flüssigkeitsvolumen-Korrektur, usw. bei den gemessenen Extinktionen 1 und 2 wird eine Veränderung bei der Extinktion vor und nach der Oxidation erhalten. Die Konzentration von Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen in der lebenden Körperflüssigkeitsprobe kann aus der so erhaltenen Veränderung bei der Extinktion und einer Eichkurve, die vorher in der gleichen Weise wie oben auf der Basis von Veränderungen bei der Extinktion in einer Standardlösung, die bekannte Bilirubin-Konzentrationen hat, bestimmt werden. Eine solche Bestimmung der Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ- Fraktion kann in einem automatischen Analysator durchgeführt werden.
Die Konzentration der Bilirubin-δ-Fraktion in einer lebenden
Körperflüssigkeitsprobe kann erhalten werden, indem die
Konzentration von Gesamtbilirubin in der lebenden
Körperflüssigkeitsprobe vorher bestimmt wird und dann die
Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen, die oben
erhalten wurde, von der Konzentration des Gesamtbilirubins
abgezogen wird.
Die Konzentration an Gesamtbilirubin kann nach den bisher
gutbekannten Verfahren bestimmt werden, z. B. nach einem
Verfahren zur Messung optischer Veränderungen einer lebenden
Körperflüssigkeitsprobe (Veränderungen bei der Extinktion bei
430 bis 460 nm, üblicherweise bei 450 nm) bei Wirkung von
Vanadinsäure als Oxidationsmittel (JP-A-5-18978); nach einem
Verfahren zur Messung optischer Veränderungen in einer
lebenden Körperflüssigkeitsprobe (Veränderungen in der
Extinktion bei 430 bis 460 nm, üblicherweise bei 450 nm) bei
Einwirkung von salpetriger Säure als Oxidationsmittel
(WO 96/17251); nach einem Verfahren zur Messung der Menge an
Azo-Farbstoffen, die durch Reaktion eines Diazoreagenzes mit
einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe in Gegenwart eines
Reaktionsbeschleunigers gebildet werden (Clin. Chem., 19,
984-993 (1973)), usw.; oder darüber hinaus nach einem
Verfahren zur Messung optischer Veränderungen in einer
lebenden Körperflüssigkeitsprobe (Veränderungen in der
Extinktion bei 430 bis 460 nm, üblicherweise bei 450 nm) bei
Einwirkung von Bilirubinoxidase als Oxidationsmittel (Billy
Perry, Basil T. Doumag et al.: Clin. Chem., 32 (2), 329-332
(1986); Shogo Otsuji et al.: Clin. Biochem., 21, 33-38
(1988)).
Alternativ kann die Bilirubin-δ-Fraktion in einer lebenden
Körperflüssigkeitsprobe durch direkte Messung ohne Bestimmung
der Konzentration an Gesamtbilirubin analysiert werden, d. h.
durch Bestimmung der Menge der nicht-umgesetzten δ-Bilirubin-
Fraktion, die bei der Wirkung von Bilirubinoxidase auf die
lebende Körperflüssigkeitsprobe in Gegenwart mindestens eines
kationischen oberflächenaktiven Mittels und/oder eines nicht-
ionischen oberflächenaktiven Mittels nach den oben
angeführten bekannten Verfahren, z. B. dem Verfahren zur
Messung optischer Veränderungen (Veränderungen der Extinktion
bei 430 bis 460 nm, üblicherweise 450 nm) einer Probe unter
Verwendung von Vanadinsäure oder salpetriger Säure oder nach
dem Verfahren unter Verwendung eines Diazoreagenzes. In
diesem Fall ist es wichtig, ein Oxidationsmittel auszuwählen,
das fähig ist, selbst bei Vorliegen des oberflächenaktiven
Mittels, die δ-Bilirubin-Fraktion zu oxidieren.
Alternativ können die Konzentrationen der Bilirubin-Nicht-δ-
Fraktionen und der Bilirubin-δ-Fraktion auch bestimmt werden,
indem eine lebende Körperflüssigkeitsprobe einer HPLC-Analyse
nach dem bekannten HPLC-Verfahren (John J. Lauff: J.
Chromatogr., 226, 391-402 (1981); Nakamura H.; Bunsekikagaku,
86, 352-355 (1987); Yukihiko Adachi: Gastroeuterologia
Japonica, 23 (2), 268-272 (1988); Yuko Kato; Medical Journal
of Kinki University, 14 (1), 97-112 (1989)) vor und nach
Einwirkung von Bilirubinoxidase auf die lebende
Körperflüssigkeitsprobe in Gegenwart mindestens eines
kationischen oberflächenaktiven Mittels und/oder eines nicht-
ionischen oberflächenaktiven Mittels unterworfen wird, und
ein entsprechender Vergleich der analytischen Messungen, die
vor und nach Einwirkung von Bilirubinoxidase erhalten wurden,
angestellt wird.
Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, stellt die vorliegende
Erfindung ein Analyse-Set zur Bestimmung der Konzentration
der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktion oder der Bilirubin-δ-Fraktion
in einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe bereit, das:
- a) mindestens eines der oben genannten kationischen oberflächenaktiven Mittel und/oder nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel; und
- b) die oben genannte Bilirubinoxidase, die in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels nicht fähig ist, die Bilirubin-δ-Fraktion zu oxidieren, aber fähig ist, die Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen zu oxidieren, enthält. Neben diesen essentiellen Komponenten kann das Analyse-Set außerdem normale Reagenzien zur Verwendung beim Analysieren der normalen lebenden Körperflüssigkeits-Komponenten enthalten, z. B. eine Pufferlösung, ein Antiseptikum, einen Chelatbildner, ein Verdünnungsmittel, usw. Das Analyse-Set kann vorzugsweise auf Verwendung in einem automatischen Analysator eingestellt sein.
Wie oben beschrieben wurde, kann die Konzentration der
Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder darüber hinaus der
Bilirubin-δ-Fraktion in einer lebenden
Körperflüssigkeitsprobe gemäß der vorliegenden Erfindung
direkt bestimmt werden. Die Bestimmung kann ohne Zusatz
irgendeines Analysenreagenzes zu der lebenden
Körperflüssigkeitsprobe und ohne spezielle physikalische
Trennmittel durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die
Bestimmung durch Messung der optischen Veränderungen bei
einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe durchgeführt werden
und kann somit mit einem automatischen Analysator erfolgen.
Wenn die Analyse der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder der
Bilirubin-δ-Fraktion einer lebenden Körperflüssigkeitsprobe
mit Reagenzien zur Bestimmung der Bilirubin-Nicht-δ-
Fraktionen oder Bilirubin-δ-Fraktion gemäß der vorliegenden
Erfindung in einem automatischen Analysator zusammen mit der
herkömmlichen Analyse des Gesamtbilirubins oder von direktem
Bilirubin durchgeführt wird, kann in einfacher Weise eine
nützliche Information über δ/(β + γ + δ), (β + γ)/δ, usw. durch die
Rechnerfunktion der automatischen Analysators auf der Basis
der Konzentrationen der α-Fraktion, (β + γ)-Fraktion und
(β + γ + δ)-Fraktion, die durch Kombinationen von Analysenwerten
der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder der Bilirubin-δ-
Fraktion mit den Analysenwerten für Gesamt- oder direktes
Bilirubin erhalten wurden, in einfacher Weise erhalten
werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand eines
Referenzbeispiels, von Beispielen und Zeichnungen näher
beschrieben; die vorliegende Erfindung soll aber nicht auf
diese beschränkt werden.
Eine Bilirubin-Fraktionierungs-Analyse durch HPLC wurde nach
dem Verfahren von Lauff et al. (John J. Lauff: Clin. Chem.,
28 (4) 629-697 (1982)) durchgeführt, wobei unbehandelte
Serumproben ohne Aussalzen mit Natriumsulfat analysiert
wurden, da die einzelnen Bilirubin-Fraktionen an einer
Denaturierung gehindert werden sollten, wenn auch Globuline
unter Förderung Säulenverschlechterung aus den Proben an der
Säule adsorbiert wurden.
Für die HPLC wurde ein Hitachi HPLC-System (Säulenofen
L-7300, UV-Detektor L-7400, Pumpe L-7100 und Integrator
D-7500) in Verbindung mit einer reversed phase-
Chromatographiesäule (Lichrospher 100 RP-18 (10 µm),
erhältlich von Kanto Kagaku Co., Ltd., Japan) verwendet.
Bilirubin-Fraktionen wurden durch eine Elution mit linearem
Gradienten durch Isopropanol zwischen zwei Lösungen, d. h.
Lösung A (gereinigtes Wasser/2-Methoxyethanol, 950/50
(Volumen), mit Phosphorsäure auf pH 2,1 eingestellt) und
Lösung B (Isopropanol/2-Methoxyethanol/Phosphorsäure,
950/50/2,5 (Volumen)) eluiert und bei einer Wellenlänge von
450 nm nachgewiesen.
Ein typisches Fraktionierungsmuster einer Gelbsucht-
Serumprobe durch HPLC-Bilirubin-Fraktionnierungsanalyse ist
in Fig. 1 dargestellt, wobei vier Fraktionen aus α bis δ
erkannt werden können, wie dies bereits beschrieben wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden 480 µl einer
Pufferlösung (R-1), die mindestens ein kationisches
oberflächenaktives Mittel und/oder ein nicht-ionisches
oberflächenaktives Mittel enthält, zu 16 µl Serumprobe
gegeben, worauf 5-minütiges Erwärmen auf 37°C folgt. Danach
werden 120 µl einer isotonischen Natriumchlorid-Lösung
zugesetzt, worauf ein 5-minütiges Erwärmen auf 37°C folgt.
Danach werden 100 µl eines Filtrats aus dem resultierenden
Gemisch durch ein Membran-Filter mit einer Porengröße von
0,45 µm auf eine Säule gegeben. Im Fall einer Analyse der
einzelnen Fraktionen durch Oxidation mit einer
Bilirubinoxidase wird die Analyse in der gleichen Weise wie
oben durchgeführt, außer daß 120 µl Pufferlösung (R-2), die
Bilirubinoxidase enthielt, anstelle der isotonischen
Natriumchlorid-Lösung verwendet wurden, wie dies in den
folgenden Beispielen dargestellt ist.
Zusatzstoffe, die einen Einfluß auf die Begünstigung einer
Oxidation der α-, β- und γ-Fraktionen und die Unterdrückung
der Oxidation der δ-Fraktion auf der Basis von
Bilirubinoxidase (im Handel erhältlich von K. K. Seishin,
Japan), die von Pleurotus ostreatus Stamm IFD 9669 stammt,
haben, wurden unter den folgenden Reagenzbedingungen
durchgemustert:
Kaliumhydrogenphthalat, 50 mM
+ verschiedene Zusatzstoffe
pH 5,5.
Isotonische Natriumchlorid-Lösung,
die 6 KU/l Bilirubinoxidase enthielt.
Pool-Serum mit hohem Bilirubin-Gehalt wurde einer Reaktion
nach demselben Verfahren wie in Referenzbeispiel 1
unterzogen, wobei als erstes Reagens R-1 und als zweites
Reagens R-2 verwendet wurde; danach wurde es einer Bilirubin-
Fraktionierungsanalyse durch HPLC unterzogen. Aus dem
resultierenden Fraktionierungsmuster wurden die Peakflächen
für die α- und δ-Fraktionen erhalten und mit den Peakflächen
der entsprechenden Fraktionen vor der Reaktion (Fall einer
Verwendung der isotonischen Natriumchlorid-Lösung als R-2)
verglichen, um Einflüsse von Zusatzstoffen auf die Oxidation
der α- und δ-Fraktionen zu untersuchen. Es wurde
festgestellt, daß die Peaks der β- und δ-Fraktionen nach der
Reaktion alle verschwanden. Peak-Bereiche der Fraktionen nach
der Reaktion wurden als Restmengen (%) errechnet, wobei die
Peak-Bereiche der entsprechenden Fraktionen vor der Reaktion
als Basis 100 angenommen wurden. Die Resultate sind in
Tabelle 1 aufgeführt.
Tetronic 704 ist ein Polyoxpropylen-Polyoxyethylen-Kondensat
des Ethylendiamins (Warenzeichen eines Produkts, das bei
Asahi Denka K. K., Japan, erhältlich ist).
wie aus Tabelle 1 offensichtlich wird, kann ein Zusatz
mindestens eines kationischen oberflächenaktiven Mittels
und/oder eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels,
ausgewählt aus einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem
Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n-
alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso-
alkylphenyl)ether, eine Oxidation der δ-Fraktion
unterdrücken und eine Oxidation der α-, β- und γ-Fraktionen
begünstigen.
Es wurden Oxidationszustände der einzelnen Bilirubin-
Fraktionen durch Bilirubinoxidase, die von Myrothecium
verrucaria (erhältlich von Amano Seiyaku K. K., Japan),
Bilirubinoxidase, die von Trachyderma tsunodae (im Handel
erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) stammt, und
Bilirubinoxidase, die von Pleurotus ostereatus (im Handel
erhältlich von K. K. Seishin, Japan) stammt, in Gegenwart von
mindestens einem kationischen oberflächenaktiven Mittel
und/oder nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel unter den
folgenden Reagenzbedingungen durch HPLC-
Fraktionierungsanalyse analysiert.
Kaliumhydrogenphthalat: 50 mM
Tetradecyltrimethyl ammoniumbromid: 1%
Brij-58: 1%
Adekatol SO-135 (Asahi Denka): 0,2%
Emulgen 707 (Kao): 0,2%
BSA: 0,5%
pH: 5,5
Tetradecyltrimethyl ammoniumbromid: 1%
Brij-58: 1%
Adekatol SO-135 (Asahi Denka): 0,2%
Emulgen 707 (Kao): 0,2%
BSA: 0,5%
pH: 5,5
Isotonische Natriumchlorid-Lösung,
die 6 KU/l Bilirubinoxidase einer
der genannten Herkunft enthält.
Pool-Serum mit hohem Bilirubin-Gehalt wurde einer Reaktion
nach demselben Verfahren wie im Referenzbeispiel unterzogen
und dann einer Bilirubin-Fraktionierungsanalyse nach HPLC
unterworfen. Aus dem resultierenden Fraktionierungsmuster
wurden Peakflächen einzelner Fraktionen erhalten und mit den
Peakflächen der entsprechenden Fraktionen vor der Reaktion
(Fall einer Verwendung der isotonischen Natriumchlorid-Lösung
als R-2) verglichen, um die Oxidationszustände der einzelnen
Fraktionen zu untersuchen. Die Peakflächen der Fraktionen
nach der Reaktion wurden als Restmenge (%) berechnet, wobei
die Peakflächen der entsprechenden Fraktionen vor der
Reaktionen als 100 angenommen wurden. Die Resultate sind in
Tabelle 2 angegeben. In Fig. 2 sind Fraktionierungsmuster
vor der Reaktion bzw. nach der Reaktion mit Bilirubinoxidase,
die von Pleurotus ostreatus stammt (im Handel erhältlich von
K. K. Seishin, Japan) dargestellt.
Wie aus Tabelle 2 und Fig. 2 zu ersehen ist, war eine
Reaktion von Bilirubinoxidase, die von Myrothecium verrucaria
stammt (im Handel erhältlich von Amano Seiyaku K. K., Japan)
und von Bilirubinoxidase, die von Trachyderma tsunodae (im
Handel erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) stammt,
bei Vorliegen mindestens eines kationischen
oberflächenaktiven Mittels und/oder nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittels beträchtlich gehemmt; die
einzelnen Bilirubin-Fraktionen konnten nicht oxidiert werden,
wohingegen Bilirubinoxidase, die von Pleurotus osteatus (im
Handel erhältlich von K. K. Seishin, Japan) stammt, praktisch
ohne eine Behinderung der Reaktion vollständig die α-, β- und
γ-Fraktionen oxidieren konnte und praktisch 100% der δ-
Fraktion zurückblieb.
25 Serumproben wurden einer Bilirubin-Fraktionierungsanalyse
durch HPLC nach demselben Verfahren wie in Referenzbeispiel 1
unterzogen. Verhältnisse der Peak-Fläche (α + β + γ), die den
Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen entspricht, zu Geseamtpeakfläche
wurden aus den jeweiligen Fraktionierungsmustern erhalten und
mit Analysenwerten der Gesamtbilirubin-Konzentration
multipliziert, wobei die Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ-
Fraktionen durch HPLC erhalten wurden. Die Korrelation von
Konzentrationen der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen, die nach
dem vorliegenden Verfahren bestimmt worden waren, zu den
Konzentrationen der Nicht-δ-Fraktionen durch HPLC ist in
Fig. 3 dargestellt.
Außerdem wurden aus den jeweiligen Fraktionierungsmustern
Verhältnisse der Peakfläche (δ), die der Bilirubin-δ-Fraktion
entspricht, zu der Gesamtpeakfläche erhalten und mit
Analysenwerten für die Gesamtbilirubin-Konzentration
multipliziert, wobei die Konzentrationen der Bilirubin-δ-
Fraktion durch HPLC erhalten wurden. Die Korrelation zwischen
den Konzentrationen der Bilirubin-δ-Fraktion, die durch
Subtrahieren der Konzentrationen der Bilirubin-Nicht-δ-
Fraktionen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt
wurden, von den Konzentrationen an Gesamtbilirubin erhalten
wurde und die Konzentrationen der Bilirubin-δ-Fraktion durch
HPLC sind in Fig. 4 dargestellt.
Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, haben die Konzentrationen
für die Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen durch HPLC und jene
gemäß der vorliegenden Erfindung eine sehr gute Korrelation,
wie es durch eine Regressionsgleichung Y = 0,98X - 0,29 und
durch einen Korrelationskoeffizienten r = 0,999 angegeben
ist, was die Genauigkeit der Analyseresultate des
vorliegenden Verfahrens zeigt.
Wie auch aus Fig. 4 hervorgeht, zeigen die Konzentrationen
der Bilirubin-δ-Fraktion durch HPLC und jene durch das
vorliegende Verfahren eine sehr gute Korrelation, wie sie
durch die Regressionsgleichung Y = 1,23X - 0,04 und durch den
Korrelationskoeffizienten r = 0,990 angegeben wird, was
außerdem die Genauigkeit der erfindungsgemäßen
Analysenresultate zeigt.
Eine Differenz bei der Inklination von 23% scheint den Grund
in einer besonders großen Schwankung beim molaren
Extinktionskoeffizienten in den hydrophilen Fraktionen
aufgrund der Vorliegens einzelner Fraktionen im organischen
Lösungsmittel, das einen Konzentrationsgradienten der HPLC-
Elutionsbedingungen hat, zu liegen.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration an
Gesamtbilirubin und das vorliegende Verfahren zur Bestimmung
der Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen, wie sie
oben eingesetzt werden, werden nachfolgend beschrieben:
Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen an
Gesamtbilirubin und direktem Bilirubin auf der Basis des
Oxidationsverfahrens mit salpetriger Säure, welches
Analysenresultate erzielen kann, die denen durch das Diazo-
Verfahren äquivalent sind, und das verschiedene Probleme des
Diazo-Verfahrens gelöst hat, wurde von den Erfinern der
vorliegenden Erfindung offenbart (WO 96/17251). Die
Konzentration an Gesamtbilirubin wurde nach dem
Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure bestimmt, wobei die
folgenden Reagenzien unter den folgenden Analysenbedingungen
verwendet wurden:
Analysenreagens: N-Analyse L T-Bil Nittobo (im Handel erhältlich von Nitto Boseki Co., Ltd., Japan),
Erstes Reagens (R-1): 100 mM Citronensäure-Pufferlösung (pH 3,70)
Zweites Reagens (R-2): 5 mM Natriumnitrit-Lösung
Analysenreagens: N-Analyse L T-Bil Nittobo (im Handel erhältlich von Nitto Boseki Co., Ltd., Japan),
Erstes Reagens (R-1): 100 mM Citronensäure-Pufferlösung (pH 3,70)
Zweites Reagens (R-2): 5 mM Natriumnitrit-Lösung
In einem automatischen Analysator (Hitachi Modell 7150, im
Handel erhältlich von Hitachi Ltd., Japan) wurden
Veränderungen der Extinktion bei einer Hauptwellenlänge von
450 nm und einer Unterwellenlänge von 546 nm nach einem
Zweipunkt-Verfahren für 8 µl R-1 gemessen; die
Konzentrationen an Gesamtbilirubin in Proben wurden aus einer
Eichkurve, die auf Veränderungen bei der Bilirubin-Extinktion
in der Standardlösung basierte, bestimmt.
D. h., um eine Konzentration an Gesamtbilirubin zu bestimmen,
wurde das Reagens (R-1) des im Handel erhältlichen
Analysenreagenzes und eine Serumprobe in dem atomatischen
Analysator vermischt, anschließend für 5 min bei 37°C
inkubiert; danach wurde die Extinktion aufgrund des
Bilirubins in der Lösung bei einer Hauptwellenlänge von
450 nm und der Unterwellenlänge von 546 nm (Extinktion 1)
gemessen. Danach wurde das zweite Reagens, das das Nitrit des
handelsüblichen Analysenreagenzes enthielt, zu der Lösung
gegeben, worauf sich eine Oxidation von Bilirubin bei 37°C
über 5 min anschloß; dann wurde die Extinktion aufgrund des
Bilirubin in der Lösung erneut gemessen (Extinktion 2). Die
Analysenwerte für die Extinktionen 1 und 2 wurden einer
Flüssigkeitsvolumenkorrektur, usw. unterworfen; danach wurde
eine Änderung der Extinktion vor und nach der Oxidation
bestimmt. Die Konzentration an Gesamtbilirubin in der Probe
wurde aus der so bestimmten Veränderung der Extinktion und
einer Eichkurve bestimmt, welche vorher auf der Basis von
Veränderungen der Extinktion, die in der gleichen Weise wie
oben erhalten worden waren, wobei aber die Standardlösung mit
bekannter Bilirubin-Konzentration verwendet wurde,
hergestellt worden war.
Die Konzentration von Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen in
Serumproben wurden unter den folgenden Reagenzbedingungen
bestimmt:
Kaliumhydrogenphthalat: 50 mM
Tetradecyltrimethyl ammoniumbromid: 1%
Brij-58: 1%
Adekatol SO-135 (Asahi-Denka): 0,2%
Emulgen 707 (Kao): 0,2%
BSA: 0,2%
pH: 5,5
Tetradecyltrimethyl ammoniumbromid: 1%
Brij-58: 1%
Adekatol SO-135 (Asahi-Denka): 0,2%
Emulgen 707 (Kao): 0,2%
BSA: 0,2%
pH: 5,5
Isotonische Natriumchlorid-Lösung,
die 6 KU/l Bilirubinoxidase (von
Pleurotus ostreatus) enthält.
Die Bestimmung wurde unter denselben Analysen-Bedingungen wie
in (1) dem Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von
Gesamtbilirubin durchgeführt, außer daß das oben genannte
erste bzw. zweite Reagens als Analysenreagenz eingesetzt
wurde.
Claims (7)
1. Verfahren zum Analysieren einer Bilirubin-δ-Fraktion
oder von Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen in einer lebenden
Körperflüssigkeitsprobe, das die folgenden Schritte
umfaßt:
- - das Reagieren einer Bilirubinoxidase, die von der Gattung Pleurotus, Melanoleuca oder Agaricus stammt und die in Gegenwart mindestens eines kationischen oberflächenaktiven Mittels und/oder eines nicht- ionischen oberflächenaktiven Mittels, ausgewählt aus einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso-alkylphenyl)ether, nicht fähig ist, eine Bilirubin-δ-Fraktion zu oxidieren, aber fähig ist, Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen zu oxidieren, als Oxidationsmittel mit der lebenden Körperflüssigkeitsprobe in Gegenwart des besagten kationischen oberflächenaktiven Mittels und/oder nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, wobei das kationische oberflächenaktive Mittel und/oder das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration vorliegen (vorliegt), die wirksam ist, um die Oxidation der Bilirubin-δ- Fraktion zu unterdrücken; und
- - das Bestimmen der Menge der so oxidierten Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder der nicht- oxidierten Bilirubin-δ-Fraktion, um auf diese Weise die Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder die Konzentration der Bilirubin-δ-Fraktion der lebenden Körperflüssigkeitsprobe zu erhalten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kationische
oberflächenaktive Mittel Alkyltrimethylammoniumsalz ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nicht-ionische
oberflächenaktive Mittel ein nicht-ionisches
oberflächenaktives Mittel ist, dessen Polyoxyethylen-
Kette als hydrophiler Bereich dient.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentrationen der
umgesetzten Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder die
Konzentration der nicht-umgesetzten δ-Bilirubinfraktion
durch Messung von optischen Veränderungen der lebenden
Körperflüssigkeitsprobe bestimmt werden.
5. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer
Bilirubin-δ-Fraktion in einer lebenden
Körperflüssigkeitsprobe, das die folgenden Schritte
umfaßt:
- a) Das Umsetzen eines Reagenzes, das fähig ist, mit dem gesamten Bilirubin in der lebenden Körperflüssigkeitsprobe zu reagieren, um dadurch die Konzentration an Gesamtbilirubin in der lebenden Körperflüssigkeitsprobe zu bestimmen;
- b) Bestimmen der Konzentration der Bilirubin-Nicht- δ-Fraktionen in der lebenden Körperflüssigkeits probe nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 4, und
- c) Subtrahieren der in Schritt ii) bestimmten Konzentration der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen von der in Schritt i) bestimmten Konzentration an Gesamtbilirubin, um dadurch die Konzentration der Bilirubin-δ-Fraktion in der lebenden Körperflüssigkeitsprobe zu erhalten.
6. Analyse-Set zur Bestimmung der Konzentration der
Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen oder der Konzentration der
Bilirubin-δ-Fraktion in einer lebenden
Körperflüssigkeitsprobe, das
- a) mindestens ein kationisches oberflächenaktives Mittel und/oder ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso-alkylphenyl)ether; und
- b) eine Bilirubinoxidase, die von der Gattung Pleurotus, Melanoleuca oder Agaricus stammt und die in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels nicht fähig ist, die Bilirubin-δ-Fraktion zu oxidieren, aber fähig ist, die Bilirubin-Nicht-δ-Fraktion zu oxidieren,
7. Verwendung einer Bilirubinoxidase, die von der Gattung
Pleurotus, Melanoleuca oder Agaricus stammt und die in
Gegenwart mindestens eines kationischen
oberflächenaktiven Mittels und/oder eines nicht-
ionischen oberflächenaktiven Mittels, ausgewählt aus
einem Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, einem
Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, einem Polyoxyethylen(n-
alkylphenyl)ether und einem Polyoxyethylen(iso-
alkylphenyl)ether, nicht fähig ist, die Bilirubin-δ-
Fraktion zu oxidieren, aber fähig ist, Nicht-δ-
Fraktionen zu oxidieren, bei der Bestimmung der
Konzentration der Bilirubin-δ-Fraktion oder der
Konzentrationen der Bilirubin-Nicht-δ-Fraktionen in
einer lebenden Körperflüssigkeit.
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