JPS59135886A - ビリルビン・オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
ビリルビン・オキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS59135886A JPS59135886A JP58010149A JP1014983A JPS59135886A JP S59135886 A JPS59135886 A JP S59135886A JP 58010149 A JP58010149 A JP 58010149A JP 1014983 A JP1014983 A JP 1014983A JP S59135886 A JPS59135886 A JP S59135886A
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- enzyme
- oxidase
- bilirubin oxidase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
- C12Y103/03005—Bilirubin oxidase (1.3.3.5)
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はスエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ
）に属する４＠−ｆ−菌をｉｉ２ Ｘし、ビリルビン
・オキシダーゼを制造する１５法に関する。
）に属する４＠−ｆ−菌をｉｉ２ Ｘし、ビリルビン
・オキシダーゼを制造する１５法に関する。
ビリルビンはヘモグロビンより０１１液中に生成する故
色物質である。ＩＩ〕［清中のビリルビンを迅速かつＩ
Ｅ確に検出することは、人間の病気（たとえば黄柏）の
状悼を医学的に訪問するのに非常に重要である。即ち音
珀の患者では血清中のビリルビンが異常に増加するので
、血清中のビリルビンを測定することにより黄柏の程度
が診断可能である。
色物質である。ＩＩ〕［清中のビリルビンを迅速かつＩ
Ｅ確に検出することは、人間の病気（たとえば黄柏）の
状悼を医学的に訪問するのに非常に重要である。即ち音
珀の患者では血清中のビリルビンが異常に増加するので
、血清中のビリルビンを測定することにより黄柏の程度
が診断可能である。
ビリルビン・オキシダーゼに関するＩ＋）初σ、）報告
はアール１１プロ５ルセン（Ｒ，Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ
）おヨヒヒ−”ボルフ ルス（Ｐ、Ｂｏｒｔｅｌ−＋ｑ
）によて）でなされ、ビリルビンかモルモットの１Ｉ
ｉ４から屯ｐ；ｉＩした不溶１１″のビリルビン拳オキ
シターゼによりビリベルジンへ１酸化された（ユアロピ
アン・ジャーナル・Ａブーバイオケミストリー（Ｋｕｒ
ｏｐ。
はアール１１プロ５ルセン（Ｒ，Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ
）おヨヒヒ−”ボルフ ルス（Ｐ、Ｂｏｒｔｅｌ−＋ｑ
）によて）でなされ、ビリルビンかモルモットの１Ｉ
ｉ４から屯ｐ；ｉＩした不溶１１″のビリルビン拳オキ
シターゼによりビリベルジンへ１酸化された（ユアロピ
アン・ジャーナル・Ａブーバイオケミストリー（Ｋｕｒ
ｏｐ。
Ｊ、Ｂｉｏｃｂｏｍ ） ￥ｇ １０巻第４６８ ｉｉ
（１９６９イＩ）〕。
（１９６９イＩ）〕。
ところが般Ｉ斤、ミロセシウム；ｊ↓に属するミロセシ
ウム轡ベルカリアＭＴ −１株（Ｍ３ｒｒｏｔｈｅｃｉ
ｕｍＶｅｒｒｕｃａｒｉａ、 ＭＴ −１）がビリルビ
ン・オキシダーゼを生産すること゛が見出され、培ＷＩ
＋’液より得られた精製酵素はビリルビンを酸比してビ
リベルジンを生成したことか報告されている〔アグリカ
ルチュラル−アンド・バイオロジカル・ケミストリー（
ＡＢｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｃｍ ）第４５巻第２３８
５頁（１９８１年）」。
ウム轡ベルカリアＭＴ −１株（Ｍ３ｒｒｏｔｈｅｃｉ
ｕｍＶｅｒｒｕｃａｒｉａ、 ＭＴ −１）がビリルビ
ン・オキシダーゼを生産すること゛が見出され、培ＷＩ
＋’液より得られた精製酵素はビリルビンを酸比してビ
リベルジンを生成したことか報告されている〔アグリカ
ルチュラル−アンド・バイオロジカル・ケミストリー（
ＡＢｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｃｍ ）第４５巻第２３８
５頁（１９８１年）」。
ビリルビン・オキシダーゼは血清中のヒリ）Ｉｉビン以
外の被検体を分析する場合に測定（ｉｌ！ｉの誤差要因
となるビリルビンを除去するのにも有用である。ｌｉＩ
Ｉち、面清中のグルコースあるいはコレスデＤ−）しな
と゛を＋ｆ’ｌｌ 定する１％合、クルコース・オキシ
ダーゼ、コレスプロール−オキシダーゼなどｆ［ｎ［清
１こ作用さ）Ｊ′、生成する過ｒ１つ化水素をパーメキ
シダーゼＣ捕獲する比色法が日常検査法としてｈ）も１
１．１川されている。特に４−アミノアンＬピリンフエ
／−ルを用いる発色法は簡単かつ迅速の１−１試糖の安
定性の而から、酵素法の主流となってきている。この比
色法は生成する赤ｒｔ５キノンＱｇを５００ ｎｍ で
測定するのであるが、１１１■清中のビリルビンの存（
’Ｉ：は負の誤差をｑ・える。そこで、あらかじめビリ
ルビン・オキ・ンダーゼをｆｌｉｔン−１１こイ乍用さ
ぜ、ヒ゛リルビンを除去した後、Ｉｔ′１１清にグルコ
ース・オキシダーゼあるいはコレステロールψ第１シダ
ーゼを作用させれば、Ｉ１１＋清［４コの正錦なグルコ
ース値あるいはコレステロール値を得るこ々ができる。
外の被検体を分析する場合に測定（ｉｌ！ｉの誤差要因
となるビリルビンを除去するのにも有用である。ｌｉＩ
Ｉち、面清中のグルコースあるいはコレスデＤ−）しな
と゛を＋ｆ’ｌｌ 定する１％合、クルコース・オキシ
ダーゼ、コレスプロール−オキシダーゼなどｆ［ｎ［清
１こ作用さ）Ｊ′、生成する過ｒ１つ化水素をパーメキ
シダーゼＣ捕獲する比色法が日常検査法としてｈ）も１
１．１川されている。特に４−アミノアンＬピリンフエ
／−ルを用いる発色法は簡単かつ迅速の１−１試糖の安
定性の而から、酵素法の主流となってきている。この比
色法は生成する赤ｒｔ５キノンＱｇを５００ ｎｍ で
測定するのであるが、１１１■清中のビリルビンの存（
’Ｉ：は負の誤差をｑ・える。そこで、あらかじめビリ
ルビン・オキ・ンダーゼをｆｌｉｔン−１１こイ乍用さ
ぜ、ヒ゛リルビンを除去した後、Ｉｔ′１１清にグルコ
ース・オキシダーゼあるいはコレステロールψ第１シダ
ーゼを作用させれば、Ｉ１１＋清［４コの正錦なグルコ
ース値あるいはコレステロール値を得るこ々ができる。
本発明者らは１．Ｚ述したビリルビン。オギシター＝ゼ
生産菌以外で担子菌の生産するビリルビン・オキシダー
ゼについで検ホｊを１Ｒね、ある種の担子菌ろく培養液
中に強力なビリルビン拳オキシダーゼ発生産することを
知り、本発明を完成した。
生産菌以外で担子菌の生産するビリルビン・オキシダー
ゼについで検ホｊを１Ｒね、ある種の担子菌ろく培養液
中に強力なビリルビン拳オキシダーゼ発生産することを
知り、本発明を完成した。
本２ｊ６明に使用されるＬＥＡ Ｔ−閑はスエヒロタケ
属にξ１する菌株であり、例えばスエヒロタケ〔シゾフ
ィラム管コミューンＫ −１，７（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙ
ｌｌｕｍＯｏｍｍｕｎｅ Ｋ、 −１７））である。本
菌株は京都市岩倉にて枯木−１−に群生していたｆ′夷
体より分離され メこ 。
属にξ１する菌株であり、例えばスエヒロタケ〔シゾフ
ィラム管コミューンＫ −１，７（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙ
ｌｌｕｍＯｏｍｍｕｎｅ Ｋ、 −１７））である。本
菌株は京都市岩倉にて枯木−１−に群生していたｆ′夷
体より分離され メこ 。
本菌株の子実体および＋にｇ子の形態的特徴は以−トの
とおりである。
とおりである。
傘は径が１０〜３０聰、表面は粗毛を密面し、白色また
は灰色、肉色、褐色などを呈１７ている。
は灰色、肉色、褐色などを呈１７ている。
ヒゲは白色、灰色、淡い肉色で、その縁は縞に裂け２枚
ずつ重なっているように見える。肉は値質で強靭で、乾
燥すれば収縮するが水分を得れば再び原形にもどる。胞
子文は白色、ＪＪ９ｄ、子は４〜６×１．５〜２声の円
筒＋ｂで平滑である。以上の特徴を伊藤誠也著「日本画
１ｊ′１誌、ｉｐ２％第５号Ｊ１９５５年養腎堂出版お
よび今閏六也、本郷次７１１共著１− ｉｌＥ・続原色
］」本閃ｈ１図”；ｊ４ Ｊの；？１ル・１４１９と比
較すると、本菌はスエヒ「Ｊタケであることが明瞭であ
る。本１■は工業技やは院南生物工業技体研究所にｌｉ
：’（手動・受託州寸哉工（＋Ｊｆ菌寄ｖ＋＜６ｓ２ｓ
号として’ｉＦｆ託されでいる。本閑はｌ’Ｍ成的（こ
ビリルビン・オキシダーゼを生成する能力を（ｉ して
いる。
ずつ重なっているように見える。肉は値質で強靭で、乾
燥すれば収縮するが水分を得れば再び原形にもどる。胞
子文は白色、ＪＪ９ｄ、子は４〜６×１．５〜２声の円
筒＋ｂで平滑である。以上の特徴を伊藤誠也著「日本画
１ｊ′１誌、ｉｐ２％第５号Ｊ１９５５年養腎堂出版お
よび今閏六也、本郷次７１１共著１− ｉｌＥ・続原色
］」本閃ｈ１図”；ｊ４ Ｊの；？１ル・１４１９と比
較すると、本菌はスエヒ「Ｊタケであることが明瞭であ
る。本１■は工業技やは院南生物工業技体研究所にｌｉ
：’（手動・受託州寸哉工（＋Ｊｆ菌寄ｖ＋＜６ｓ２ｓ
号として’ｉＦｆ託されでいる。本閑はｌ’Ｍ成的（こ
ビリルビン・オキシダーゼを生成する能力を（ｉ して
いる。
本発明を更に詳しく説明ずれは、培１ｉＢ、にＩＪｌｌ
える栄養ｉｔ＠は使用する閑（ｌ［８うく利１１Ｊシ得
るものであればよく、炭素源としては例えはグリセリン
、グルコース、デンプン、シュクロース、マルトース、
ラクｌ−−−−ス、デキストリン、油脂１〕゛ｊ、糖蜜
などが利用でき、窒素源としては６１′１寸エキス、ペ
プトン、コーンスディープリカー、脱脂大（ｊ、大豆粉
、肉エキスなどが適当である。その他にリンｉｌ？ ｌ
工ｘ、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、損鉛塩ＩＳ
どの無機質および金属塩類を廂えてもよく、咀にはビタ
ミン類、生長促進因子を卯えてもよい。
える栄養ｉｔ＠は使用する閑（ｌ［８うく利１１Ｊシ得
るものであればよく、炭素源としては例えはグリセリン
、グルコース、デンプン、シュクロース、マルトース、
ラクｌ−−−−ス、デキストリン、油脂１〕゛ｊ、糖蜜
などが利用でき、窒素源としては６１′１寸エキス、ペ
プトン、コーンスディープリカー、脱脂大（ｊ、大豆粉
、肉エキスなどが適当である。その他にリンｉｌ？ ｌ
工ｘ、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、損鉛塩ＩＳ
どの無機質および金属塩類を廂えてもよく、咀にはビタ
ミン類、生長促進因子を卯えてもよい。
担子菌を培養するにあ！こり、ビリルビン・オキシダー
ゼの生産ｌｉｔは培養条件により大きく変動するが、一
般に培イＩＣ温度は２０〜３５゛Ｃ１培地のｐＨ４〜７
が良く、３〜１０目間（７） １ｌＴｊ ’Ｋ ｆＷ打
培養でビリルビン・オキシダーゼの生産はＩｉ季高に達
する。培養条件は使用する菌株、培＋（ｉ！、組成など
に応じ、ビリルビン拳オキシダーゼの生産喰が醍大にな
るように設定するのは当然であ２、。
ゼの生産ｌｉｔは培養条件により大きく変動するが、一
般に培イＩＣ温度は２０〜３５゛Ｃ１培地のｐＨ４〜７
が良く、３〜１０目間（７） １ｌＴｊ ’Ｋ ｆＷ打
培養でビリルビン・オキシダーゼの生産はＩｉ季高に達
する。培養条件は使用する菌株、培＋（ｉ！、組成など
に応じ、ビリルビン拳オキシダーゼの生産喰が醍大にな
るように設定するのは当然であ２、。
本発明の曲によって生成されたビリルビン−オキシダー
ゼは培養液中にあり、培養ｐ液にイ１機溶媒例えはアル
コール、アセトンなどを５０〜８０ ｖ／ｖ％加えるこ
と（こよｔ′）、あるいは沈殿剤例えは硫安、塩化カル
シラｉ、 ｙ：、ｉとを２０〜８０ｗ／ｖ％１１１１え
ることに２しり沈殿・とじて分離される。
ゼは培養液中にあり、培養ｐ液にイ１機溶媒例えはアル
コール、アセトンなどを５０〜８０ ｖ／ｖ％加えるこ
と（こよｔ′）、あるいは沈殿剤例えは硫安、塩化カル
シラｉ、 ｙ：、ｉとを２０〜８０ｗ／ｖ％１１１１え
ることに２しり沈殿・とじて分離される。
得られた沈殿物より透析あるいはセファデックス処理に
よって脱塩し、粗酵素液を得る。得られた粗酵素液を１
′〜製するには、あらかじめ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０） ”Ｃ：０衝化したセファデックスＧ−７５の
カラムでゲルＭ’ｈ％を行ない、活性区分を集める。次
にこの活性区分をあらかじめ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で緩衝化した：ｏ、ｙｃＡｇ−セファデック
ス（Δ−５０）のカラムに１吸着させ、吸着物をＱ、
３ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７、Ｏ）で溶出して活性
区分を集める。次にこの活性区分を０．０１ Ｍのリン
酸緩衝液（ＴＩＨ７，０）に透析し、Ｔ％析内液をコロ
ジオン＋＋ｔＳで濃縮後ン束結乾燥し、精製酵素粉末を
得る。
よって脱塩し、粗酵素液を得る。得られた粗酵素液を１
′〜製するには、あらかじめ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０） ”Ｃ：０衝化したセファデックスＧ−７５の
カラムでゲルＭ’ｈ％を行ない、活性区分を集める。次
にこの活性区分をあらかじめ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で緩衝化した：ｏ、ｙｃＡｇ−セファデック
ス（Δ−５０）のカラムに１吸着させ、吸着物をＱ、
３ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７、Ｏ）で溶出して活性
区分を集める。次にこの活性区分を０．０１ Ｍのリン
酸緩衝液（ＴＩＨ７，０）に透析し、Ｔ％析内液をコロ
ジオン＋＋ｔＳで濃縮後ン束結乾燥し、精製酵素粉末を
得る。
本発明により得られるビリルビン・オキシダーゼの特徴
的な性質は次のとおりである、（１）作用 本へと明の酵素がビリルビンに作用した１１４合、ビリ
ベルジンが生成さオ］る。寸た、ビリベルジンをも酸化
して未知の淡紮（！！、物１７を生成する。即ち、次の
ような２段階の反応をｆｌＩＪ！媒する。
的な性質は次のとおりである、（１）作用 本へと明の酵素がビリルビンに作用した１１４合、ビリ
ベルジンが生成さオ］る。寸た、ビリベルジンをも酸化
して未知の淡紮（！！、物１７を生成する。即ち、次の
ような２段階の反応をｆｌＩＪ！媒する。
ビリルビン＋＝（１２−−＞ ビリベルジン＋Ｈ２０（
１）１＋ ＋ ］ ビリへ／ｌ／ ’／ ７ ＋０２−一→’１１紫色’Ｉ
’Ｑ’ｌｆ −１−Ｈ＊Ｏ（２）（２）至適ｐＨおよび
ｐＨ安定性 本酵素の至１１〜ｐＨは第１図の曲線で表わされるとと
＜ ＴＩＨ５，５〜６．０付近に極めて高い活性を有し
ている。４（酵素を４パＣにおいてヒれ（’れのｐＨで
７日間処理したときのｐＨ安定性を第３図に示した。第
３図より明らかなように本酵素はｐＨ１’（で安定であ
る。
１）１＋ ＋ ］ ビリへ／ｌ／ ’／ ７ ＋０２−一→’１１紫色’Ｉ
’Ｑ’ｌｆ −１−Ｈ＊Ｏ（２）（２）至適ｐＨおよび
ｐＨ安定性 本酵素の至１１〜ｐＨは第１図の曲線で表わされるとと
＜ ＴＩＨ５，５〜６．０付近に極めて高い活性を有し
ている。４（酵素を４パＣにおいてヒれ（’れのｐＨで
７日間処理したときのｐＨ安定性を第３図に示した。第
３図より明らかなように本酵素はｐＨ１’（で安定であ
る。
（３）至適温度および１；＾安定性
本酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされるごと＜
５０ Ｃ付近に至ｉＮ温度を有している。本酵素をｐＨ
（ｉ、ｏにおいてそれぞれの温度で１０分間処理したと
きの熱安定性を第４図に示した。本酵素は４５°Ｃまで
安定であった。
５０ Ｃ付近に至ｉＮ温度を有している。本酵素をｐＨ
（ｉ、ｏにおいてそれぞれの温度で１０分間処理したと
きの熱安定性を第４図に示した。本酵素は４５°Ｃまで
安定であった。
（４）分子は
セファデックスＧ−１００を用いたゲルｊ濾過により求
めた本酵素の分子■は約５８０００であった。
めた本酵素の分子■は約５８０００であった。
（５）等電点
焦点１１２気泳動より求めた本酵素の等得点は６．０〜
６．１であった。
６．１であった。
（６）阻害剤
本酵素はＦｅ ５ＮａＮ３、ＫＯＮ、アスコルビン醪
すＩ・リウム、Ｃｕ２＋、ｏ−フェナントロリン、α、
α１−ジピリジル、還元型グルタチオン（各１ｍＭ１こ
、にり阻害された。
すＩ・リウム、Ｃｕ２＋、ｏ−フェナントロリン、α、
α１−ジピリジル、還元型グルタチオン（各１ｍＭ１こ
、にり阻害された。
（７）酵素活性測定法
酵素活性のＡ１１１定はビリルビンの４６０ ｎｍの吸
収の減少より求めた。、Ｉｆｌｌら、オメガ高ビリルビ
ンコントロール血清（米国）＼ライド社’ｔ＋！Ｊ）８
■、リン酸ｆｌｉＭＮｉｉｆＶ （ｐＨ６，０） ３０
０ ｚｍｏｌおよび４当に稀釈１．た酪ｇ液（１，１ｍ
ｅ、反１ｊれ、滝川３、 Ｏｍｌ！−７Ｅ ３７°Ｃ、
１０分間１’Ｚ １５ サｌ−、ヒ” ＩＪ ＃ビン（
こ基づ（４６０ｎｍｏ＞ｌＩ’７１１ｖ、減’、りを測
定した。
収の減少より求めた。、Ｉｆｌｌら、オメガ高ビリルビ
ンコントロール血清（米国）＼ライド社’ｔ＋！Ｊ）８
■、リン酸ｆｌｉＭＮｉｉｆＶ （ｐＨ６，０） ３０
０ ｚｍｏｌおよび４当に稀釈１．た酪ｇ液（１，１ｍ
ｅ、反１ｊれ、滝川３、 Ｏｍｌ！−７Ｅ ３７°Ｃ、
１０分間１’Ｚ １５ サｌ−、ヒ” ＩＪ ＃ビン（
こ基づ（４６０ｎｍｏ＞ｌＩ’７１１ｖ、減’、りを測
定した。
ビリルビン＠号オシターゼ１−ｔ］ｑ（＜ｔは３７°Ｃ
で１分間に４６０ ｎｍに−１； ＋：Ｉる吸’Ｉｇ
’ｉ１．０ （ｌ ｉＡ少させる酊Ｘ ｊｌ（：とじて
表示した。
で１分間に４６０ ｎｍに−１； ＋：Ｉる吸’Ｉｇ
’ｉ１．０ （ｌ ｉＡ少させる酊Ｘ ｊｌ（：とじて
表示した。
以下に本発明によるビリルビン・オキシダーゼの製造方
法を実施例をもって示すか、本発明が以下の実施例の範
囲のみに限定されるものではない。
法を実施例をもって示すか、本発明が以下の実施例の範
囲のみに限定されるものではない。
実施例 １
グルコース２％、エビオス０５％および寒天１．５％（
エビオス培地）の組成の斜面培地にシゾフィラム−コミ
ューンに−１７を接種し、２５°Ｃにて１週間静置培養
して種菌とした。グリセリン３％、酵母エキス０．３％
、ペプトン１％、ＫＨｔＰＯ４０，３％およびＭｇ５Ｏ
４・７ Ｈ２Ｏ０，１％の組成の培地１０ （ｌ ｍｌ
を５００ ｍｅ容の三角フラスコに分注し、１２０°Ｃ
で２０分間殺菌後、冷却し、これに上記の種菌をかきと
り接種して、２７ ”Ｃで７日間、毎分１２０回転で振
盪培養した。培置終丁後、７濾過して菌体を除き、２戸
液を得た。このビリルビン書オキシダーゼ活性は１．５
屯位／ｍｅであった。
エビオス培地）の組成の斜面培地にシゾフィラム−コミ
ューンに−１７を接種し、２５°Ｃにて１週間静置培養
して種菌とした。グリセリン３％、酵母エキス０．３％
、ペプトン１％、ＫＨｔＰＯ４０，３％およびＭｇ５Ｏ
４・７ Ｈ２Ｏ０，１％の組成の培地１０ （ｌ ｍｌ
を５００ ｍｅ容の三角フラスコに分注し、１２０°Ｃ
で２０分間殺菌後、冷却し、これに上記の種菌をかきと
り接種して、２７ ”Ｃで７日間、毎分１２０回転で振
盪培養した。培置終丁後、７濾過して菌体を除き、２戸
液を得た。このビリルビン書オキシダーゼ活性は１．５
屯位／ｍｅであった。
実施例 ２
実施例１のエビオス培地で培養したシゾフィラム・コミ
ューンに−１７を、クリセリン３％、酵母エキス０３％
、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ＋（１，３％およびＭｇ５
Ｏｔ ＊ ７Ｈ２００，１％組成の培地１００ｍ１を分
注して殺菌（１２０°Ｃｌ２Ｏ分間）シタ５００ ｍｅ
容の三角フラスコに接種し、２７’Ｃで５日間培養して
、種培養液とした。グリセリン３％、酵母エキス０．３
％、ペプトン０．５％、コ−ンステイーブリカー１％、
脱脂大豆１％、ＫＨｇＰＯａ Ｏ，３％、ＭｇＳＯ４ｅ
７ Ｈ２Ｏ０，１％オヨヒ？ｎ ｉ’ｒＪ剤（Ｈ本油
脂社１１１ａＢ−４４２）０．０３％ノ組成ノ”１地１
５ ｔを３ｏｔ容のジャーツアーメンタ−（こ入れ、１
２０″Ｃで２０分間殺菌した。冷却後、−Ｉ−記の穐培
ｔ ？Ｉ’ｆ、を１００ ｍｌ 接Ｉ’ｌｌし、２７℃
で６ト１間、毎分１（）ｔの通気速度と毎分２０゜［１
Ｍ転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、沖過１
−２で菌体を除き、ｐ液を得た。このビリルビン−オキ
シダーゼ活性は６．５ 、ｉｐ位／ ｍｌ （２あっブ
、二。この培−１９／ｒｉン今１３１（こ（砲酔丁ンＬ
ニウノ、をまず５０％飽、和になるように加えて不紳１
物を沈殿と１７て陰火］、た。その後、その十清イタに
さらに硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え
“Ｃ１−昼怜１ｊＦ置後、得た齢安沈殿物を大晴の蒸留
水に対しｃ−・昼夜透析した。透析内２ｍを凍結乾・操
して得た乾燥粉末を０．１． Ｍ ＩＪン酸緩衝液０）
Ｈ７，Ｏ）に溶解し、同緩衝ｉｌｌで緩山化したセフ７
デツクスＧ −７５ＣＤ カラＡ （５，ＯＸ ７０印
）でゲル沖過を行なった。活性区分を集め、アｌ”＋
カシメＯ，ＪＭ ＩＪ ７１”！８１ｒＪ ｌｌｉン（
’ｉ （ｐＩ１７．０ ） （”Ｊ 様衝化したＪ）
［１；Δ［１：−セフ７デツクス（Δ−５（））のカラ
ム（５，０Ｘ ２０αうに吸着さリ−１ＩＩＩり青物・
り０、３ Ｍ ＩＪン酸にυ雨滴（ｐＨ７゜０）で溶出
した。この活″ト１４区６）を（１，０１ＭリンＣ・叩
糸ｌ？棹１１り（ｐＨ７，０）に対［７て透析後、透析
内液をコロジＡン膜で４縮し、凍結乾Ｉｒｅ！ ＋、て
、粕興１酵朱粉木３２０ ”１ｇを得た１、この粉末の
比活′１１゛けＱ ：） 、ｉｌ／。位／ｒｔｑであっ
た。
ューンに−１７を、クリセリン３％、酵母エキス０３％
、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ＋（１，３％およびＭｇ５
Ｏｔ ＊ ７Ｈ２００，１％組成の培地１００ｍ１を分
注して殺菌（１２０°Ｃｌ２Ｏ分間）シタ５００ ｍｅ
容の三角フラスコに接種し、２７’Ｃで５日間培養して
、種培養液とした。グリセリン３％、酵母エキス０．３
％、ペプトン０．５％、コ−ンステイーブリカー１％、
脱脂大豆１％、ＫＨｇＰＯａ Ｏ，３％、ＭｇＳＯ４ｅ
７ Ｈ２Ｏ０，１％オヨヒ？ｎ ｉ’ｒＪ剤（Ｈ本油
脂社１１１ａＢ−４４２）０．０３％ノ組成ノ”１地１
５ ｔを３ｏｔ容のジャーツアーメンタ−（こ入れ、１
２０″Ｃで２０分間殺菌した。冷却後、−Ｉ−記の穐培
ｔ ？Ｉ’ｆ、を１００ ｍｌ 接Ｉ’ｌｌし、２７℃
で６ト１間、毎分１（）ｔの通気速度と毎分２０゜［１
Ｍ転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、沖過１
−２で菌体を除き、ｐ液を得た。このビリルビン−オキ
シダーゼ活性は６．５ 、ｉｐ位／ ｍｌ （２あっブ
、二。この培−１９／ｒｉン今１３１（こ（砲酔丁ンＬ
ニウノ、をまず５０％飽、和になるように加えて不紳１
物を沈殿と１７て陰火］、た。その後、その十清イタに
さらに硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え
“Ｃ１−昼怜１ｊＦ置後、得た齢安沈殿物を大晴の蒸留
水に対しｃ−・昼夜透析した。透析内２ｍを凍結乾・操
して得た乾燥粉末を０．１． Ｍ ＩＪン酸緩衝液０）
Ｈ７，Ｏ）に溶解し、同緩衝ｉｌｌで緩山化したセフ７
デツクスＧ −７５ＣＤ カラＡ （５，ＯＸ ７０印
）でゲル沖過を行なった。活性区分を集め、アｌ”＋
カシメＯ，ＪＭ ＩＪ ７１”！８１ｒＪ ｌｌｉン（
’ｉ （ｐＩ１７．０ ） （”Ｊ 様衝化したＪ）
［１；Δ［１：−セフ７デツクス（Δ−５（））のカラ
ム（５，０Ｘ ２０αうに吸着さリ−１ＩＩＩり青物・
り０、３ Ｍ ＩＪン酸にυ雨滴（ｐＨ７゜０）で溶出
した。この活″ト１４区６）を（１，０１ＭリンＣ・叩
糸ｌ？棹１１り（ｐＨ７，０）に対［７て透析後、透析
内液をコロジＡン膜で４縮し、凍結乾Ｉｒｅ！ ＋、て
、粕興１酵朱粉木３２０ ”１ｇを得た１、この粉末の
比活′１１゛けＱ ：） 、ｉｌ／。位／ｒｔｑであっ
た。
この精製酵亨苓、オメガ高ビリルビンコントロール血清
に作用さ仕た１４１合、ビリルビン１こ基づ＜ ４６０
ｎｍ（Ｊ）ＩＩｓ収減少（△Ａ４６０ｎｍ）におよは
１−反Ｉ心時間（精製酊青０．２ 、ｅＶ使使用と酊孝
は（反応時間１０分）との関係を検討１７た。
に作用さ仕た１４１合、ビリルビン１こ基づ＜ ４６０
ｎｍ（Ｊ）ＩＩｓ収減少（△Ａ４６０ｎｍ）におよは
１−反Ｉ心時間（精製酊青０．２ 、ｅＶ使使用と酊孝
は（反応時間１０分）との関係を検討１７た。
反ｉｉ’、ｉ時間６）１ △Ａ ４６ （ｌ ｎｍ
酵素）ｆ’ｔ（）ｉ９） △Ａ ４ ｎ Ｑｎｍｌ
ｏｏ、０４８ ０．２ ０．０
４７２０ ０．０９３ （１
，４０，０９１２３００，１３５０，６０，１３５ ４００，１６８住８ ０．１７０ このように精製酵宋はビリルビンに作用した場合、ビリ
ルビンを減少さぜる性″ｈを有していた。次１ｒｌ 、
精Ｉ（櫂酵素を、オメガ高ビリルビンコントロール１１
１［清に作用された場合のＩＪ！＆収スペクトル（第５
図とクロロホルム：メタノール−１：１の溶ηρを用い
るＩ・９層り［１７トグノーフイー （第６図の結果か
ら、ビリルビンの酸化物′１１１ ビリベルジンの生成
が認められた。それ故、本酵素はビリルビンをｔ％セ化
してヒリ・＼ルジンを生１１見するビリルビン０オー）
・シダーゼてあった。また、本酵素はビリベルジンをも
１″１夕化しｃ１未知の淡紫色物質を生成するｉｊ４
”ｊ！ｔをａしていた（ 、’、５７ Ｆ’ｓに吸収ス
ペクトルを示す′）。
酵素）ｆ’ｔ（）ｉ９） △Ａ ４ ｎ Ｑｎｍｌ
ｏｏ、０４８ ０．２ ０．０
４７２０ ０．０９３ （１
，４０，０９１２３００，１３５０，６０，１３５ ４００，１６８住８ ０．１７０ このように精製酵宋はビリルビンに作用した場合、ビリ
ルビンを減少さぜる性″ｈを有していた。次１ｒｌ 、
精Ｉ（櫂酵素を、オメガ高ビリルビンコントロール１１
１［清に作用された場合のＩＪ！＆収スペクトル（第５
図とクロロホルム：メタノール−１：１の溶ηρを用い
るＩ・９層り［１７トグノーフイー （第６図の結果か
ら、ビリルビンの酸化物′１１１ ビリベルジンの生成
が認められた。それ故、本酵素はビリルビンをｔ％セ化
してヒリ・＼ルジンを生１１見するビリルビン０オー）
・シダーゼてあった。また、本酵素はビリベルジンをも
１″１夕化しｃ１未知の淡紫色物質を生成するｉｊ４
”ｊ！ｔをａしていた（ 、’、５７ Ｆ’ｓに吸収ス
ペクトルを示す′）。
第１図は本゛チ明（こより得られるビリルビン・オキシ
ダー（−のｐｌ＋と活性の関係をＨわし、第２１図は温
バフ１と活性の１４゛、ｉ係を表わ１゜弔３！−゛１は
ビリルビン・オキシダーゼを４℃においてそれぞれのｐ
■■で７ト１間処理した後のｐＩ（と活１・１、の関係
を表わし、第４図はｐＨ（ｉ、０においてそれぞれの温
度で１０分間処理した後の温度と活性の関係を表わす。 ４′ｆＳ５図日本酊素を刊メが高ビリ・トビンコントロ
ール血）７（に作用さ１シた＋４合の１段数スペクトル
の変化を表わす。第６図は木酢−Ｋをオメガ高ビリルビ
ンコントＣＩ−ル１！１１清に作用させた場合の反応生
成物の−ず・６層り■］７トカーラフイーを表わす。 第７図は本酵素をビリベルジン（テ二作用さｌた場合の
＋ｐ４ ＋ＩＶスペクトルの変化を表わす。 特訂出１幀人 ）゛＜１１・ｌＩ造株式会化ｌ賜１ 第５図 第６１ −４６７− 第７図 波長（ｎｍ）
ダー（−のｐｌ＋と活性の関係をＨわし、第２１図は温
バフ１と活性の１４゛、ｉ係を表わ１゜弔３！−゛１は
ビリルビン・オキシダーゼを４℃においてそれぞれのｐ
■■で７ト１間処理した後のｐＩ（と活１・１、の関係
を表わし、第４図はｐＨ（ｉ、０においてそれぞれの温
度で１０分間処理した後の温度と活性の関係を表わす。 ４′ｆＳ５図日本酊素を刊メが高ビリ・トビンコントロ
ール血）７（に作用さ１シた＋４合の１段数スペクトル
の変化を表わす。第６図は木酢−Ｋをオメガ高ビリルビ
ンコントＣＩ−ル１！１１清に作用させた場合の反応生
成物の−ず・６層り■］７トカーラフイーを表わす。 第７図は本酵素をビリベルジン（テ二作用さｌた場合の
＋ｐ４ ＋ＩＶスペクトルの変化を表わす。 特訂出１幀人 ）゛＜１１・ｌＩ造株式会化ｌ賜１ 第５図 第６１ −４６７− 第７図 波長（ｎｍ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 スエヒロタケ属 シダーゼ生産１ｆｆｉｔを培養し、培養物よりビリルビ
ンΦオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビ
ン−オキシダーゼの１堺清法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58010149A JPS59135886A (ja) | 1983-01-25 | 1983-01-25 | ビリルビン・オキシダ−ゼの製造法 |
| GB08400674A GB2134116B (en) | 1983-01-25 | 1984-01-11 | Production of bilirubin oxidase |
| US06/570,027 US4569912A (en) | 1983-01-25 | 1984-01-11 | Production of bilirubin oxidase |
| CA000445892A CA1207261A (en) | 1983-01-25 | 1984-01-23 | Production of bilirubin oxidase |
| FR8401031A FR2539757B1 (fr) | 1983-01-25 | 1984-01-24 | Procede de production de bilirubine-oxydase |
| DE3402504A DE3402504C2 (de) | 1983-01-25 | 1984-01-25 | Verfahren zur Gewinnung von Bilirubinoxidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58010149A JPS59135886A (ja) | 1983-01-25 | 1983-01-25 | ビリルビン・オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59135886A true JPS59135886A (ja) | 1984-08-04 |
Family
ID=11742216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58010149A Pending JPS59135886A (ja) | 1983-01-25 | 1983-01-25 | ビリルビン・オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4569912A (ja) |
| JP (1) | JPS59135886A (ja) |
| CA (1) | CA1207261A (ja) |
| DE (1) | DE3402504C2 (ja) |
| FR (1) | FR2539757B1 (ja) |
| GB (1) | GB2134116B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012153791A1 (ja) | 2011-05-11 | 2012-11-15 | 天野エンザイム株式会社 | 染色剤及びその用途 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59198971A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ビリルビンオキシダ−ゼの製造法 |
| CA1279207C (en) * | 1986-02-27 | 1991-01-22 | William R. Stott | Method and apparatus for trace sample collection |
| US4746606A (en) * | 1986-05-27 | 1988-05-24 | Eastman Kodak Company | Bilirubin-specific enzyme and its analytical use |
| JP2578430B2 (ja) * | 1987-06-10 | 1997-02-05 | 旭化成工業株式会社 | 新規なビリルビン．オキシダーゼおよびその製造法 |
| DE4406379A1 (de) * | 1993-03-24 | 1994-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Bilirubinoxidase aus Alfalfa und Verwendung des Enzyms |
| JP3734115B2 (ja) * | 1997-02-28 | 2006-01-11 | 日東紡績株式会社 | ビリルビン画分の測定方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4211844A (en) * | 1978-05-19 | 1980-07-08 | Eastman Kodak Company | Bilirubin-specific fungal enzyme preparation |
| JPS6012031B2 (ja) * | 1981-03-30 | 1985-03-29 | 天野製薬株式会社 | ビリルビンオキシダ−ゼの製造法 |
| DE3239236A1 (de) * | 1982-02-18 | 1983-09-01 | Amano Pharma Co Ltd | Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen |
-
1983
- 1983-01-25 JP JP58010149A patent/JPS59135886A/ja active Pending
-
1984
- 1984-01-11 GB GB08400674A patent/GB2134116B/en not_active Expired
- 1984-01-11 US US06/570,027 patent/US4569912A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-01-23 CA CA000445892A patent/CA1207261A/en not_active Expired
- 1984-01-24 FR FR8401031A patent/FR2539757B1/fr not_active Expired
- 1984-01-25 DE DE3402504A patent/DE3402504C2/de not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012153791A1 (ja) | 2011-05-11 | 2012-11-15 | 天野エンザイム株式会社 | 染色剤及びその用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1207261A (en) | 1986-07-08 |
| DE3402504A1 (de) | 1984-07-26 |
| GB2134116A (en) | 1984-08-08 |
| US4569912A (en) | 1986-02-11 |
| DE3402504C2 (de) | 1986-09-18 |
| GB2134116B (en) | 1986-02-12 |
| GB8400674D0 (en) | 1984-02-15 |
| FR2539757A1 (fr) | 1984-07-27 |
| FR2539757B1 (fr) | 1986-04-25 |
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