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Verfahren zur Herstellung eines für therapeutische Zwecke geeigneten
Dextransulfates
Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß die Aktivität natürlicher gerinnungshemmender
Stoffe, wie z. B. des Heparins, bei der therapeutischen Verwendung auf der Gegenwart
einer teilweise veresterten Schwefelsäuregruppe beruht und daß die sauren Schwefelsäureester
von Kohlenhydraten, wie z. B. Dextran, Cellulose, Chondroitin und Mucoitin, eine
ähnliche Aktivität zeigen. Obwohl diese Verbindungen die Gerinnung von Blut oder
Blutplasma wirkungsvoll verhindern, sind sie doch mehr oder weniger giftig und daher
nicht zur klinischen Verwendung geeignet. Neuere Forschungsarbeiten haben jedoch
gezeigt, daß auch ein ungiftiges Dextransulfat hergestellt werden kann.
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Das dabei verwendete Verfahren umfaßt die selektive Entfernung der
größeren Moleküle des Dextrans, die in dem nach der Hydrolyse von Dextran hohen
Molekulargewichtes erhaltenen Gemisch vorhanden sind, sowie die anschließende Veresterung
der verbleibenden Moleküle von geringerem Molekulargewicht mit einem Sulfatierungsmittel
zwecks Bildung eines Schwefel-
säureesters. Die Eigenviskosität
des Dextrans hängt von der Größe der Moleküle ab und ist daher ein zweckmäßiger
Maßstab für diese. Die Viskosität wird darum auch im allgemeinen dazu benutzt, die
Molekülgröße des Dextrans zu bestimmen. Die in der Beschreibung angegebenen Zahlen
für die Viskosität wurden durch Messung bei 37° C in o,g0/,iger Kochsalzlösung unter
Verwendung eines B. B. S.-(British-Standard-Specifikation-)Viskosimeters Nr. I erhalten.
Bei den bisher verwendeten Verfahren beläuft sich die Eigenviskosität des Dextrans
nach Entfernung der größeren Moleküle auf weniger als 0,12.
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Es wurde nun gefunden, daß Dextransulfat selbst dann, wenn es eine
Eigenviskosität von weniger als 0,I2 hat, dadurch verbessert werden kann, daß man
es einer fraktionierten Fällung aus seiner Lösung unterwirft, um die großen Dextransulfatmoleküle,
die durch die Veresterung großer DextranmoIeküle entstanden sind oder möglicherweise
durch die Verbindung zweier Dextranmoleküle durch eine Sulfatbrücke gebildet wurden,
zu entfernen, und hierbei die Fraktion mit einer Eigenviskosität von etwa 0,035
oder darunter isoliert. Aus dieser Fraktion sind die großen Moleküle so weit entfernt,
daß in der klinischen Praxis größere Dosen als bisher auf längere Zeit mit größerer
Sicherheit gegeben werden können.
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Es ist selbstverständlich, daß die durch die fraktionierte Fällung
erhaltenen Fraktionen nicht völlig homogen in bezug auf die Größe der Moleküle sind,
denn es ist unmöglich, alle vorhandenen Moleküle irgendeiner bestimmter Größe völlig
auszufällen. Je verdünnter indessen die anfängliche Lösung und je geringer die prozentuale
Größe der erzeugten Fraktion ist, desto besser ist auch die Homogenität.
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Es ist zu beachten, daß das Dextransulfat stets in der Form eines
Salzes, im allgemeinen des Natriumsalzes, verwendet wird, und wo hier auf das Sulfat
Bezug genommen wird, handelt es sich um solch ein Salz.
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Bei der Durchführung der Erfindung ist es nicht notwendig, die großen
Dextranmoleküle vor der Veresterung zu entfernen, denn wenn diese in das Sulfat
umgewandelt werden, werden sie später bei der erfindungsgemäß angewandten fraktionierten
Ausfällung entfernt. Indessen ist es doch am besten, sie schon vorher zu entfernen,
um eine Vergeudung von Dextran und der Reagenzien, welche zu seiner Umwandlung in
das Sulfat verwendet werden, zu vermeiden. Die Sulfatierung wird gewöhnlich durch
die Einwirkung von Chlorsulfonsäure auf Dextran in Gegenwart von Pyridin ausgeführt.
Di blutgerinnungshemmende Wirkung von Dextransulfat hängt von dem Schwefelgehalt
der. Verbindung ab. Für eine Verabfolgung in vivo muß der Schwefelgehalt höher als
9°/0 sein. Die Sulfatierung muß daher so weit durchgeführt werden, daß die Fraktion
einen für die therapeutische Verwendung genügend hohen Schwefelgehalt hat.
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Die selektive Entfernung der großen Sulfatmoleküle kann am zweckmäßigsten
durch fraktionierte Ausfällung aus einer wäßrigen Dextransulfatlösung mit Hilfe
eines wassermischbaren oder teilweise wassermischbaren organischen Lösungsmittels
oder Lösungsmittelgemisches, in dem das Dextransulfat nicht löslich ist, durchgeführt
werden. Die fraktionierte Ausfällung erfolgt nach an sich bekannten Methoden.
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Wenn das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch allmählich zu einer
neutralisierten oder schwach alkalischen, wäßrigen I,ösung von Dextransulfat hinzugesetzt
wird, entsteht ein Niederschlag, der durch Filtrieren oder, wenn er harzig ist,
durch Absitzenlassen entfernt werden kann. Das zuerst ausgefällte Sulfat besitzt
eine höhere Viskosität als das später ausgefällte Sulfat, woraus sich ergibt, daß
die größeren Moleküle zuerst ausgefällt werden. Mit zunehmender Konzentration des
Lösungsmittels ist eine zunehmende Ausfällung der großen Dextransulfatmoleküle zu
beobachten. Durch Hinzufügen einer geeigneten Menge an Lösungsmittel kann man also
Moleküle jeder gewünschten Größe ausfällen und beseitigen. Bei weiterem Hinzufügen
von Lösungsmitteln zu der nach Entfernung des Niederschlages verbleibenden Lösung
wird weiteres Dextransulfat ausgefällt, welches als ungiftige, gerinnungshemmende
Substanz verwendet werden kann.
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Wahlweise kann bei der Fraktionierung die mit der Temperatur abnehmende
Löslichkeit des Sulfates ausgenutzt werden. Bei diesem Verfahren wird das Fällmittel
der Lösung so lange hinzugesetzt, bis eine leichte Trübung auftritt. Das Gemisch
wird erwärmt, um die Trübung wieder aufzulösen, und dann gekühlt, worauf sich ein
Niederschlag bildet. Die Fraktionierung kann beliebig oft wiederholt werden.
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Im allgemeinen ist Dextransulfat mit einer Eigenviskosität von weniger
als 0,035 praktisch ungiftig.
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Andererseits hat Dextransulfat mit einer Eigenviskosität unter 0,OI
praktisch keine gerinnungshemmende Wirkung, weshalb Fraktionen mit einer Eigenviskosität
unter dieser Zahl vorzugsweise ebenfalls entfernt werden. Es werden daher bei einer
bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zwei Ausfällvorgänge durchgeführt, nämlich
einer, um die großen Moleküle zu entfernen und in der Lösung nur ein Dextransulfat
mit einer Eigenviskosität von weniger als 0,035 zu belassen, und ein weiterer Ausfällvorgang,
um das gewünschte Dextransulfat mit einer Eigenviskosität von mehr als 0,OI auszufällen.
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Nachstehend folgen einige Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren
der fraktionierten Ausfällung und die Ergebnisse einiger mit den erhaltenen Fraktionen
vorgenommenen Versuche.
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Beispiel I Zuerst wurde eine Io°/Oige Lösung rohen Dextrans in bekannter
Weise durch saure Hydrolyse abgebaut, um die Größe der Moleküle herabzusetzen. Die
Lösung mit einem pE-Wert von I,02 wurde bei 98° C erhitzt, bis eine relative Viskosität
von I,62 erreicht war.
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Unter relativer Viskosität ist das Verhältnis der Viskosität dieser
Io°/Oigen Lösung zu derjenigen von destilliertem Wasser bei 37° C zu verstehen.
Nach dem Neutralisieren mit Kalk wurde die Lösung filtriert, und 260/, des Dextrans
wurden durch Hinzufügen von Aceton ausgefällt. Weitere Ion!, Dextran erhielt man
durch erneutes Hinzufügen von Aceton, und dieses Dextran war durch eine relative
Viskosität
von I,55 gekennzeichnet. Es wurde mittels Aceton entwässert
und bei einer Temperatur von 500 C im Vakuum getrocknet, um als Ausgangsmaterial
für die Erzeugung von Dextransulfat zu dienen.
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Zur Herstellung des Sulfats wurden 541 wasserfreien Pyridin in ein
Reaktionsgefäß eingebracht und 7,04 ccm Chlorsulfonsäure unter Kühlen hinzugesetzt,
wobei die Temperatur unter 20° C gehalten wurde. Dann wurde die Temperatur auf 60°
C erhöht, und es wurden 4,8 g Dextran hinzugefügt. Die Temperatur wurde nun 4 Stunden
auf 65 bis 70" C gehalten, worauf die Sulfatierung beendet war. Die viskose Flüssigkeit
wurde in 180 1 Wasser von 200 C gegossen, und das Pyridinsalz des Dextransulfats
wurde zusammen mit einer geringen Menge von Pyridinhydrochlorid und Pyridinsuliat
durch Zusatz von 2 Volumina Aceton ausgefällt. Das Gemisch trennte sich in Schichten,
wobei das Pyridinsalz des Dextransulfats die untere Schicht bildete. Diese Salzschicht
wurde abgezogen und in 150 1 destillierten Wassers gelöst.
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Hierauf wurde Natriumhydroxyd hinzugefügt, bis ein pH-Wert von 8,o
erreicht war.
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Das entstandene Natriumsalz des Dextransulfates wurde darauf gereinigt.
Es handelte sich um ein harziges Produkt, welches in 8o 1 Wasser gelöst und von
dem größeren Teil anorganischer Verunreinigungen sowie von Pyridin befreit wurde,
indem man die Lösung nacheinander durch Kationenaustausch-und Anionenaustauschharze
leitete. Die Lösung wurde dann mit Natriumhydroxyd auf einen pE-Wert von 7,4 neutralisiert
und auf 136,5 1 verdünnt.
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Die gereinigte Lösung des Natriumsalzes von Dextransulfat verursachte,
obwohl sie für die Verwendung als gerinnungshemmendes Mittel von geeigneter Potenz
war, bei Meerschweinchen im Falle intravenöser Injektion heftige Reaktionen und
führte auch zu einer leichten Ablagerung metachromatisch färbbarer Stoffe in Rattenlebern.
Diese Sulfatlösung wurde sodann gemäß der Erfindung einer fraktionierten Ausfällung
mit Aceton unterzogen. Zuerst wurde die Lösung mit 55 ] Aceton bei 20° C behandelt.
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Es schied sich eine geringe Menge flockigen Materials aus, das durch
Absitzenlassen entfernt wurde. Dann wurde noch mehr Aceton zugesetzt, und die ausgefällten
Dextransulfatfraktionen wurden abgezogen, sobald die darüberschwimmende Flüssigkeit
klar erschien. Es wurden fünf weitere Fraktionen auf diese Weise entfernt und ihre
Viskosität gemessen.
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Lösungen dieser Fraktionen wurden Meerschweinchen intravenös eingespritzt.
Die ersten beiden Fraktionen waren giftig; die nächsten drei Fraktionen waren hingegen
ungiftig und besaßen eine gerinnungshemmende Wirkung von I2 Internationalen Einheiten
je Milligramm, waren also zur Herstellung von Inj ektionspräparaten geeignet.
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Nach Abtrennen der fünften Fraktion war die obenauf schwimmende Flüssigkeit
und damit die sechste Fraktion durch Natriumsu]fat stark verunreinigt.
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Darüber hinaus hatten diese sechste Fraktion und das verbleibende
Material eine gerinnungshemmende Wirkung von weniger als 10 Internationalen Einheiten
je Milligramm und waren daher zur Verwendung als gerinnungshemmende Mittel nicht
geeignet.
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Einzelheiten der Versuchsergebnisse zeigt die Tabelle I.
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Tabelle I
| Volumen Ausge- Giftig- |
| des fälltes keit bei |
| hinzu- Dextran Viskosität Meer 1. Em |
| gesetzten sulfat schwein- I. E./mg |
| Acetons chen |
| Liter o/o |
| 55 6,7 0,0362 + |
| 3 6,7 0,0350 + - |
| 5 7,9 0,0336 o 12 |
| 7 8,6 0,03Ig o I2 |
| 94 43,I o,o289 O 12 |
| IOO (mit Natriumsulfat verunreinigt) |
Von dem ursprünglichen Dextransulfat wurden also 59,6 O/o in für therapeutische
Zwecke geeigneter Form wiedergewonnen.
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Beispiel 2 Dieses Beispiel beschreibt die fraktionierte Ausfällung
von Dextransulfat unter Ausnutzung der verringerten Löslichkeit des Materials bei
sinkender Temperatur. Um zu veranschaulichen, daß ein für die Verabfolgung an Menschen
geeignetes Dextransulfat aus einem nicht dafür geeigneten Dextransulfat hergestellt
werden kann, wurde auch in diesem Beispiel eine Partie Dextransulfat, welches keine
guten biologischen Eigenschaften besaß, verwendet. Bei einer Temperatur von 30°
C wurde Äthylalkohol zu 77 ccm einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von I5,4 g
des Natriumsalzes eines Schwefelsäureesters von fraktioniertem Dextran mit einer
Eigenviskosität von 0,04 hinzugesetzt, bis eine Trübung eintrat; hierzu waren Io8
ccm Äthylalkohol erforderlich. Das Gemisch wurde erwärmt, bis es homogen wurde,
was bei 33° C eintrat, und dann langsam wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt. Es
wurde ein Sirup ausgeschieden; dieser wurde von der obenauf sdwimmenden Flüssigkeit
abgetrennt und mit Äthylalkohol verrieben. Das so erhaltene Pulver bildete die erste
Fraktion.
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Die obenauf schwimmende Flüssigkeit wurde wiederum auf eine Temperatur
von 300 C gebracht und Äthylalkohol hinzugesetzt, bis eine Trübung eintrat.
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Dann wurde das Gemisch erwärmt, bis es homogen wurde, und wieder langsam
abgekühlt. Der ausgefällte Sirup wurde abgetrennt und mit Äthylalkohol verrieben.
Er bildete die zweite Fraktion, ebenfalls in Form eines Pulvers. Auf diese Weise
erhielt man fünf weitere Fraktionen.
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Durch Vermischen gleicher Volumina einer 1 0/0igen Lösung der einzelnen
Fraktionen mit einer 1 0/0igen Lösung menschlichen Fibrinogens wurden die verschiedenen
Fraktionen daraufhin untersucht, ob sie irgendwie menschliches Fibrinogen ausfällten.
Gemische, welche eine größere Opaleszenz zeigten als ein Gemisch gleicher Volumina
o,g °/Oigen Natriumchlorids und I°/Oigen menschlichen Fibrinogens, sind in der Tabelle
II durch ein oder mehrere Pluszeichen
gekennzeichnet, je nach dem
Grade der Opaleszenz.
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Gemische, welche eine geringere Opaleszenz aufweisen, sind mit O bezeichnet.
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Lösungen der Fraktionen wurden außerdem Versuchstieren in einer Dosierung
von 50 mg je Kilogramm Körpergewicht injiziert. Dort, wo die Injektion nach 24 Stunden
in den Zellen der Leber, der Milz oder des Knochenmarks eine Ablagerung erzeugte,
die mit Toluidinblau metachromatisch anfärbbar war, ist das Ergebnis durch ein Pluszeichen
gekennzeichnet. Ein »O« bedeutet keinen färbbaren Niederschlag. Die verschiedenen
Fraktionen wurden auch daraufhin untersucht, ob sie bei Meerschweinchen irgendwelche
unerwünschten Reaktionen hervorriefen. Das Fehlen einer solchen Reaktion wird durch
ein »O«, eine posi tive Reaktion durch ein Pluszeichen angedeutet.
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Ebenso wurden die Fraktionen auf ihre gerinnungshemmende Wirkung untersucht,
wobei die Ergebnisse in Internationalen Einheiten je Milligramm angegeben sind.
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Tabelle II
| Ausge- |
| fällter Eigen- Schwefel- Ausge- Färbbare Meer- Gerinnungs- |
| Anteil viskosität gehalt fäiltes Ablagerung Reaktion |
| % % Fibrinogen Ablagerung Reaktion Wirkung |
| Ursprüngliches Salz - 0,044 I7,9 + + + I6,5 |
| Fraktion I......... 1 14,69 0,070 19,4 +++ + + 20,7 |
| Fraktion 2 ......... II,44 o,o58 I9,3 ++ + + 20,2 |
| Fraktion 3 ......... 10,25 0,054 20,6 ++ + + 20,7 |
| Fraktion 4 ......... II,23 0,044 19,4 ++ + 0 I7,7 |
| Fraktion 5 ......... 15,44 0,035 I9,6 0 0 O 14,2 |
| Fraktion 6 ......... 9,83 o,o26 I9,3 0 0 0 II,9 |
| Fraktion 7 ......... 3,95 - I4,9 0 0 0 4,6 |
Die Prozentzahlen in dieser Tabelle beziehen sich auf Trockenbasis nach Bestimmung
des Feuchtigkeitsgehaltes durch Trocknen auf konstantes Gewicht im Vakuum bei 60°
C. Man sieht, daß die Fraktionen 5 und 6 die gewünschten biologischen Eigenschaften
besitzen und daher für den therapeutischen Gebrauch geeignet sind.
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Wie oben bereits ausgeführt wurde, kann Dextransulfat in einer ungiftigen
Form hergestellt werden.
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Man muß dabei nur darauf achten, daß keine großen Moleküle vorhanden
sind. Die Sulfatierungsreaktion erfordert aber kostspielige Chemikalien und ist
nicht leicht auszuführen. Demzufolge ist es klar, daß man, um die Kosten der Reaktion
herabzusetzen, den Weg einschlagen muß, eine Dextranfraktion geeigneter Größe zu
wählen und diese Fraktion zu sulfatieren.
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Die Herstellung der geeigneten Dextranfraktion kann in bekannter Weise
durch Fraktionierung bewerL-stelligt werden.
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Experimente haben indessen gezeigt, daß dieses Verfahren zur Herstellung
von Dextransulfat nicht zufriedenstellend ist, da die Sulfatierung von Dextran zu
der Bindung zweier Dextranmoleküle aneinander durch eine Sulfatbrücke unter Bildung
eines großen und daher giftigen Moleküls führen kann. Weiterhin nehmen die größten
der in einer sonst geeigneten Dextranfraktion vorhandenen Dextranmoleküle beim Sulfatieren
noch ein wenig in ihrem Molekulargewicht zu, was wiederum Anlaß zur Giftigkeit geben
kann.
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Die Erfindung weicht von dem bekannten Verfahren ab, indem ein rohes
Dextranmaterial von unbestimmter Molekulargröße sulfatiert und das erhaltene Dextransulfat
alsdann einer fraktionierten Ausfällung unter Gewinnung einer Fraktion mit einer
Eigenviskosität von etwa 0,035 oder darunter unterworfen wird. Obwohl das bedeutet,
daß sowohl Dextran als auch Sulfatierungschemikalien in gewissem Umfange vergeudet
werden, wird dadurch doch die Erzeugung einer ungiftigen Dextransulfatfraktion gesichert.
Natürlich kann man das Dextran auch einer Vorfraktionierung unterziehen, wie dies
im Beispiel 1 erläutert wird.
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PATENTANspn0cHE: I. Verfahren zur Herstellung eines für therapeutische
Zwecke geeigneten Dextransulfates, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus Molekülen
verschiedener Größe bestehendes Dextransulfat einer fraktionierten Ausfällung aus
seiner Lösung unter Isolierung einer Fraktion mit einer Eigenviskosität von etwa
0,035 oder darunter unterworfen wird.