DE2733565A1

DE2733565A1 - Verfahren zum isolieren und gewinnen von aus hypophysegeweben stammenden proteinhormonen

Info

Publication number: DE2733565A1
Application number: DE19772733565
Authority: DE
Inventors: Erik Pedersen
Original assignee: Nordisk Insulinlaboratorium
Current assignee: Nordisk Insulinlaboratorium
Priority date: 1976-07-30
Filing date: 1977-07-26
Publication date: 1978-02-02
Also published as: NL7708426A; DK144731C; IT1086345B; DK144731B; ES461179A1; BE857327A; SE7708678L; HU175512B; FR2359852A1; FI57669B; GB1537795A; AR213530A1; FR2359852B1; FI772297A; FI57669C; DK346876A; NO772697L; JPS5338611A; AU507547B2; DD131375A5

Description

VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING

PATENTANWÄLTE

Dr.-Ing. von Kruislcr f" 1973

Dr.-Ing. K. Schönwcild, Köln Dr.-ti-.rj. Th. Meyer, Köln Dr.-Inij. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. AIeIi von Kreiiler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln D.pl.-Iny. G. Selling, Köln

Ke/To.
5 KÖLN 1, 25. Juli 1977

DCKH-.-.ANNHAUS AM HAUHTÜAi INriOF Nordisk Insulinlaboratorium,

Ved Stadion 2, DK-2820 Gentofte (Dänemark)

Verfahren zum Isolieren und Gewinnen von aus Hypophysegeweben stammenden Proteinhormonen

709885/0875

T.l.fon; (0221) 234541-4 - Ttltx: 8882307 dopa d - Tele₀romm: Dompofenl Köln

Verfahren zum Isolieren und Gewinnen von aus Hypophyse geweben stammenden Proteinhormonen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren und Gewinnen von aus Hypophysegeweben stammenden Proteinhormonen, bei dem ein die Proteinhormone enthaltender wässriger Extrakt einer fraktionierten Fällung mit einem Fällungsmittel unterworfen wird. Durch dieses Verfahren soll insbesondere das reine Wachstumshormon von Extrakten aus Hypophysegeweben isoliert werden.

Die weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich das Wachstumshormon von anderen Proteinhormonen und Unreinheiten selektiv isolieren läßt und dadurch in besonders reinem Zustand und in hoher Ausbeute gewonnen wird.

Schließlich soll ein vereinfachtes Verfahren zur Verfügang gastollt werden, mit dem das Wachstumshormon und

andere Proteinhormone aus Hypophysegeweben isoliert und .- gewonnen werden.

Es ist bekannt, das Wachstumshormon durch Extraktion aus Hypophysegeweben und Ausfällen des Wachstumshormons aus dem Extrakt mittels eines Fällungsmittels zu isolieren.

Als Beispiele für Druckschriften, in denen Verfahren zum I

Gewinnen humanen Wachstumshormons beschrieben sind, seien ;

erwähnt: j

1) Biochemica et biophysica acta 1963, 74, Seite 525-531, ^; und ;

2) Acta endocrinologica 1971, 66, Seite 478-490. \

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Eine Methode zum Trennen von Gemischen aus Hypophysehormonen ist in der CH-PS 230 807 beschrieben. Aus den US-PSen 3 415 804, 3 652 530, 3 763 135 und 3 808 189 sind zwar Verfahren zum Fraktionieren von Proteinstoffen unter Verwendung von Polyäthylenglykol als Fällungsmittel bekannt. Es war jedoch nicht vorauszusehen, daß Polyäthylenglykol zum Fraktionieren von Hypophysehormonen oder zum selektiven Ausfällen des Wachstumshormons unter kontrollierten Bedingungen geeignet ist. Die Verwendung gewisser ülockpolymerer ist aus der DK-Anmeldung 3 321/74 bekannt.

Bei den bekannten Verfahren zum Gewinnen humanen Wachstumshormons werden die größten Ausbeuten mit tiefgefrorenen Hypophysen als Ausgangsmaterial und durch Anwendung schonender Extraktions- und Fällungsbedingungen erzielt. Hierbei wird in folgender Weise gearbeitet:

1) Tiefgefrorene Hypophysen werden mit einem neutralen oder basischen Puffer extrahiert.

2) Der Extrakt wird mit einem Fällungsmittel und/oder durch Einstellung des pH-Wertes auf 4,8 gefällt.

3) Der Niederschlag wird mit einem neutralen oder sauren Puffer extrahiert.

4) Der Extrakt wird weiterhin durch wiederholte Fällungen und/oder durch Säulenchromatographie, beispielsweise Gelfiltrieren auf Scphadex GlOO, gereinigt.

Als Fällungsmittel in der vorerwähnten Stufe 2 hat man früher entweder Ammoniumsulfat, das aber ein unreines Endprodukt ergibt, oder Aceton, das jedoch die Proteine in einem solchen Maße denaturiert, daß sie bei den nachfolgenden Extraktionen schwer löslich werden, was eine geringe Ausbeute zur Folge hat, verwendet.

Die Qualität des Wachstumshormons wird beispielsweise

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durch Anwendung der folgenden Methoden untersucht: Biologische Aktivität (Tibia-test)

Immunologische Aktivität (Radialimmundiffusion oder

Radioimmunoassay)

GeIfiltrierung (Prüfung auf Polymere)

Elektrophorese in Polyacrylamidgel (PAGE) (Prüfung auf

fremde Proteine).

Ein reines Via chs turns hormon hat folgende Eigenschaften:

1) eine Aktivität von mehr als zwei internationalen Einheiten pro mg Protein,

2) mehr aln 90 % liegen in der Monomer-Form vor,

3) durch Elektrophorese (PAGE) von 100 \iq lassen sich nach Proteinfärbung lediglich Bänder entsprechend dem Wachstumshormon oder neben dem Wachstumshormon 1 bis 2 deamidierte Formen des Wachstum davon nachweisen.

Die Lösung der der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe ist ein Verfahren zum Isolieren und Gewinnen von aus Hypophyse-fjtiweben stammenden Pro Leinhormonen, bei dem ein die Proteinhormone enthaltender wässriger Extrakt einer fraktionierten Fällung mit einem Fällungsmittel unterworfen wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den wässrigen Extrakt aus Hypophysegeweben mit einer oder mehreren Portionen Polyäthyienglykol bei einem pH-Wert von 4 bis 6 fällt, indem man die Menge von Polyäthyienglykol derart ^lnpaßt, daß das oder die erwünschten Proteinhormone in Fraktionen isoliert werden, worauf man dann diese Fraktionen in an sich bekannter Weise zum Isolieren der Proteinhormone in gereinigtem Zustand aufarbeitet.

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Bei der erfindungsgemäßen Durchführung der Fällung ist ein reines Produkt in hoher Ausbeute erhältlich. Somit wirkt Polyäthylenglykol (PEG) als Ausfällungsmittel selektiver als Ammoniumsulfat, und man gewinnt die Hypophysehormone, insbesondere das Wachstumshormon in reinerem Zustand. Weiterhin wird die durch Aceton verursachte Denaturierung vermieden und dadurch eine sehr hohe Ausbeute erreicht.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist nicht auf die Verwendung primärer Hypophyseextrakte beschränkt, sondern auch beim Isolieren von Peptid- und Protein-Hormonen von beispielsweise Züchtmedien aus Hypophysen-Gewebekulturen anwendbar.

Erfindunysgemäß führt man die Fällung mit Polyäthylenglykol bevorzugt bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,0 durch, der der optimale Wert ist. Besonders gute Ergebnisse werden bei einem pH-Wert von etwa 4,8 erreicht.

Das als Fällungsmittel verwendete Polyäthylenglykol hat erfindungsgemäß vorzugsweise ein Molekulargewicht von 30OO bis 6000. Es ist jedoch auch möglich, das Verfahren mit Polyäthylenqlykol mit einem höheren Molekulargewicht als 6OOO oder einem niedrigeren Molekulargewicht als 3000 durchzuführen.

Zum Trennen und Isolieren der wichtigsten Hypophysehormone führt man das Verfahren gemäß der Erfindung zweckmäßig

so durch, daß man di«.,· Konzentration an Polyäthylenglykol in; Lxtrakt stuf·. nv.-jise von 0 au·: 30 % Gewicht/Volumen «,^vr;.üh-_. h.irc!; Λ1.: L Lur Urron des nach jeder Zugabe gebildeten :.ie::crL:::.la.jv., .·. i ra eine wirksame Trennung der ein-JO znilr^-ur. i.yrj:v/;,ysöicri;.r,t; erreicht* Die Fraktionen können dann jede fur sicn ^r Ccwinnur.ij der reinen Hormone aufgearbeitet werden.

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BAD ORIGINAL

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, bei der das Wachstumshormon gewonnen wird, ist es zweckmäßig, die aus dem Extrakt ausgefällten Fraktionen zu isolieren, wenn dieser 1.0 bis 14 % Gewicht/Volumen PoIyäthylenglykol enthält. Dadurch wird eine hohe Ausbeute ausgefällten Wachstumshormons erreicht, das sich in an sich bekannter Weise reinigen läßt.

Als Ausgangsmaterial kann beim Verfahren gemäß der Erfindung jeder beliebige bekannte Extrakt aus Hypophysegeweben oder Hypophysehormone enthaltenden Gewebekulturen verwendet werden. Der Extrakt kann in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Vermählen, Hacken oder sonstiges Fcinvcrtcilen von Hypophysen und Extrahieren mit wässrigen Pufferlösungen hergestellt sein. Ein geeignetes Extraktionsmittel ist ein wässriger Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8 bis 9, beispielsweise 8,7. Bei höherem oder niedrigerem pH-Wert können auch andere Puffer Verwendung finden.

Es ist zweckmäßig, dem filtrierten Extrakt Polyäthylenglykol (PEG) bei einem pH-Wert von 8 bis 9 zuzusetzen, wonach der pH-Wert durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Essigsäure, auf 4,5 bis 5,0, beispielsweise 4,8, herabgesetzt wird. Es ist jedoch auch möglich, zunächst den pH-Wert auf 4,5 bis 5,0 einzustellen und dann PEG zuzusetzen. Gegebenenfalls kann die pH-Einstellung gleichzeitig mit der PEG-Zugabe erfolgen.

Die Menge an Polyäthylenglykol hängt von dem auszufällenden Hypophysehormon ab, und ein stufenweiser Zusatz wird dann durchgeführt, wenn möglichst viele Hypophysehormone zu trennen sind. Somit kann man mit einem Zusatz an PEG in Höhe von etwa 10 % beginnen, worauf das Gemisch filtriert und dann der pH-Wert auf beispielsweise 4,8 eingestellt wird. Nach einem eventuell nochmaligen Filtrieren

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wird weiteres PEG in einer oder mehreren Portionen bis zu einer Gesamtmenge von etwa 14 % PEG zugegeben. Die dadurch erhaltenen Fraktionen enthalten das Wachstumshormon in hoher Ausbeute. Durch weitere Zusätze werden andere Fraktionen ausgefällt, die vorzugsweise die Hypophysehormone FSH und LH enthalten können.

Die ausgefällten Fraktionen werden in an sich bekannter Weise aufgearbeitet. Beispielsweise wird der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert und dann in einem Puffer bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8, beispielsweise bei einem pH-Wert von 7, wiedergelöst. Dann wird mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung gefällt. Der sich ergebende Niederschlag wird abzentrifugiert und in einem Puffer erneut gelöst. Die Lösung wird dann in einer ein Molekularsieb oder einen sauren oder basischen Ionenaustauscherharz enthaltenden Kolonne chromatographiert. Beim Chromatographieren werden die Fraktionen isoliert, die die reinen Hypophasehormone, beispielsweise das Wachstumshormon, enthalten.

Durch die folgenden Beispiele wird das Verfahren gemäß der Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

24 tiefgefrorene humane Hypophysen werden unter Zusatz von 100 ml eines wässrigen Puffers (I) mit 1,8 % Dinatriumhydrogenphosphat und Zugabe von 1N Natriumhydroxid bis zu oincffl pH von Β,Ί hoTnogenisiert. Das Gemisch wird zentrifugiert. Zu 90 ml Supernatanten werden 24 ml einer wässrigen Lösung von 50 g Polyäthylenglykol 6000 zu 100 ml Lösung zugesetzt. Nach 30 Minuten Rühren wird zentrifugiert und der pH-Wert des Supernatanten mit in Salzsäure auf 4,8 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren wird der Niedersc hlag mit 60 ml eines wässrigen Puffers (II) mit 1,4 % Dinatriumhydrogenphosphat,

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4,9 % Mononatriumdihydrogenphosphat und Zugabe von 1N Natriumhydroxid bis zu einem pH von 7,0 extrahiert. Nach einstündigem Rühren wird zentrifugiert, und dem Supernatanten werden 60 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugesetzt. Es wird wieder zentrifugiert und der Niederschlag in 25 ml einer wässrigen Lösung (III) mit 2 % Aminoessigsäure und 0,25 % Natriumhydrogencarbonat gelöst. Die Lösung wird auf eine Säule von 79 cm Länge und 2,5 cm Durchmesser gegeben, die Sephadex G100 enthält, u.z. mit Lösung (III) equilibriert. Die Säule wird mit Lösung (III) eluiert und die Fraktionen entsprechend dem Eluiervolumen von 260 bis 320 ml werden gesammelt. Diese Fraktionen enthalten 260 Einheiten humanes Wachstumshormon mit einer spezifischen Aktivität von 2,2 Einheiten pro mg Protein. Die Elektrophorese an Polyacrylamidgel von 100 μg Protein zeigt lediglich drei Bänder entsprechend dem Wachstumshormon und den deamidierten Formen.

Beispiel 2

250 tiefgefrorene humane Hypophysen werden wie im Beispiel 1 angegeben mit 1500 ml des Puffers I extrahiert. Dem Supernatanten werden 460 ml einer Lösung aus 23Ο g Polyäthylenglykol 3000 und 270 ml Wasser zugesetzt. Nach 20 Minuten Rühren und Zentrifugieren wird der pH-Wert des Supernatanten mit 1 N Salzsäure auf 4,9 eingestellt. Nach 20 Minuten Rühren und Zentrifugieren wird der Niederschlag wie im Beispiel 1 angegeben mit 10OO ml des Puffers II extrahiert. Nach Rühren über Nacht und Zentrifugieren werden dem Supernatant en 1000 ml gesättigte Ammor.iumsuHat lös;un<j zugesetzt. Es wird wieder zentrifugiert, und der Niederschlag wird in 300 ml einer Lösung von 126 g Harnstoff in 207 ml Puffer III (des Beispiels 1) gelöst. Die Lösung wird auf eine Säule von 100 cm Länge und 11,4 cm Durchmesser gegeben, die Sephadex GlOO enthält, u.z. mit Puffer III equilibriert. Die Säure wird

mit Puffer III eluiert. Die Fraktionen entsprechend dem Eluiervolumen für Wachstumshormon werden gesammelt; diese enthalten 2900 Einheiten humanes Wachstumshormon mit einer spezifischen Aktivität von 2,6 Einheiten pro mg Protein. Die Elektrophorese an Polyacrylamidgel von 100 ug weist lediglich zwei Bänder auf entsprechend dem Wachstumshormon und einer deamidierten Form.

Beispiel 3

500 tiefgefrorene humane Hypophysen werden wie im Beispiel 1 angegeben mit 2000 ml Puffer I extrahiert. Nach erfolgtem Zentrifugieren wird der pH-Wert auf 4,8 eingestellt und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wird durch Extraktion mit Puffer II, Fällung, Wiederlösung im Puffer III und Säulenchromatographie wie im Beispiel 2 angegeben zu reinem Wachstumshormon aufgearbeitet. Es werden 3400 Einheiten Wachstumshormon mit einer spezifischen Aktivität von 2,7 Einheiten pro my Protein erreicht.

Dem Supernatanten werden 650 ml einer Lösung aus 325 g Polyäthylenglykol 3000 und 38O ml Wasser zugesetzt. Es wird zentrifugiert und der Niederschlag mit Puffer II extrahiert, mit Ammoniumsulfat gefällt, wieder gelöst und mit Puffer III und an der Säule chromatographiert, wie im Beispiel 2 angegeben. Die gesammelten wachstumshormonhaltige Fraktionen enthalten 42 30 Einheiten Wachstumshormon mit einer spezifischen Aktivität von 2,6 Einheiten pro mg Protein. Die Gesamtausbeute aus 500 Hypophysen betrug somit 7C3O Einheiten.

Beispiel -1

500 tiefgefrorene huir.ane Hypophysen werden wie im Beispiel 1 angegeben mit 2000 ml Puffer I extrahiert. Nach dem Zentrifugieren wird der pH-Wert auf 4,8 eingestellt und erneut zentrifugiert. Dem Supernatanten werden 1300 ml

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einer Lösung aus 650 g Polyäthylenglykol 3OOO und 760 ml Wasser zugesetzt. Es wird zentrifugiert und der Niederschlag mit Puffer II extrahiert und mit Ammoniumsulfat gefällt, wie im Beispiel 2 angegeben. Zu 2OOO ml des Supernatanten werden 1000 ml einer Lösung aus 500 g Polyäthylenglykol 3000 und 585 ml Wasser zugesetzt. Nach einer Stunde Rühren wird zentrifugiert. Der Niederschlag enthält die Hypophysehormone FSH und LH.

Beispiel 5

100 ml Züchtmedium aus Hypophysevorderlappen-Gewebekultür mit einem Gehalt an fünf Einheiten Wachstumshormon wird durch Ultrafiltrieren auf 1 ml konzentriert. Es werden 0,5 *ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 0,5 g Polyäthylenglykol 6000 pro ml zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 4,8 eingestellt. Der Niederschlag wird abgetrennt, in 0,5 ml Wasser gelöst und auf eine Säule von 63 cm Länge und 0,9 cm Durchmesser, gegeben, die Sephadex GlOO enthält, u.z. mit Puffer III equilibriert. Es wird mit Puffer III eluiert. Die das Wachstumshormon enthaltenden Fraktionen werden gesammelt? diese enthalten 1,0 Einheiten humanes Wachstumshormon mit einer spezifischen Aktivität von· 2,0 Einheiten pro mg Protein.

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Claims

·ι η 273356:· entansprüche

1. Verfahren zum Isolieren und Gewinnen von aus Hypophysegeweben stammenden Proteinhormonen, bei dem ein die Proteinhormone enthaltender wässriger Extrakt einer fraktionierten Fällung mit einem Fällungsmittel unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man den wässrigen Extrakt aus Hypophysegeweben mit einer oder mehreren Portionen Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 4 bis 6 fällt, indem man die Menge von Polyäthylenglykol derart anpaßt, daß das oder die erwünschten Proteinhormone in Fraktionen isoliert werden, worauf man dann diese Fraktionen in an sich bekannter Weise zum Isolieren der Proteinhormone in gereinigtem Zustand aufarbeitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fällung mit Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,0 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fällungsmittel ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 3000 bis 6000 verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration an Polyäthylenglykol im Extrakt stufenweise von 0 auf 30 % Gewicht/Volumen , erhöht. |

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 zum Gewinnen des ! Wachstumshormons, dadurch gekennzeichnet, daß man Fraktionen isoliert, die aus dem Extrakt ausgefällt werden, wenn dieser 10 bis 14 % Gewicht/Volumen Polyäthylenglykol enthält. ^;

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ORIGINAL INSPECTED