DE1908833A1 - Verfahren zur Reinigung von Asparaginase - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von AsparaginaseInfo
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Description
Patentanwälte Dipl.-Ing. R Weickmann,
Dipl.-Ing. H.Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke
Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÜNCHEN 27, DEN HZW ' MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., Mannheim
Verfahren zur Reinigung von Asparaginase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Gewinnung
von Asparaginase aus Escherichia coli.
Es ist bekannt, daß L-Asparaginase ausgeprägte antineoplastische Eigenschaften aufweist und sowohl im Tierversuch als auch beim
Menschen erfolgversprechende Ergebnisse in der Behandlung von Leukämie und anderen Tumoren geliefert hat. Es wird angenommen,
daß die bereits erzielten Behandlungserfolge noch wesentlich verbessert werden können, wenn ausreichende Mengen L-Asparaginase
zur Verfügung stehen, da zumindest dn Teil der negativen Behandlungsergebnisse
auf Unterdosierung infolge Schwierigkeiten bei der Beschaffung des Enzyms zurückgeführt werden.
Es besteht daher ein großes Interesse an der Schaffung von Methoden, welche es ermöglichen, den Bedarf an L-Asparaginase zu befriedigen.
H.A.Campbell et al. beschreiben in "Biochemis-try" £, 721 ff.
,(1967) ein Reinigungsverfahren für L-Asparaginase, wobei
Escherichia coli-Zellen aufgeschlossen, die zellfreien Extrakte
einer Manganfällung unterworfen, der Überstand mit Ammoniumsulfat
fraktioniert und die erhaltene aktive Eiweißfraktion über eine Hydroxylapatitsäule chromatographiert wird. Das Eluat der
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Säule wird dann über DEAE-Zellulose chromatographiert. J.M.Hill
et al. beschreibt im "Journal of Bacteriology" _9j5, Seite 2117
bis 2123 (1968) ebenfalls ein Reinigungsverfahren, bei dem E. coli-Zellen aufgeschlossen, der Aufschluß einer Äthanolfraktionierung
unterworfen, die aktive Fraktion über eine DEAE-Zellulose
säule chromatographiert, das aktive Eluat mit Äthanol gefällt, dann über Carboxymethyl-Sephadex chromatographiert,
wieder mit Äthanol gefällt und gegebenenfalls durch Polyacrylamidelektrophorese
hochgereinigt wird.
Diese bekannten Verfahren haben den Fachteil, daß sie einerseits
bei vielen E. coli-Stämmen nicht zu befriedigenden Anreicherungen
führen und andererseits durch die Notwendigkeit wiederholter Säulenchromatographie sehr aufwendig hinsichtlich Arbeit und
Raumbedarf sind. Sie sind daher nur mit Einschränkung für ein
großtechnisches Herstellungsverfahren brauchbar* Außerdem erwies sich die Nacharbeitung als undurchführbar und die erhalte
liehen Handelspräparate weisen auch nicht/ die Reinheitsgrade
auf, welche nach den obigen Veröffentlichungen erzielt wurden,
Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines besonders für
die großtechnische Durchführung geeigneten Verfahrens zur Rei-r
nigung und Anreicherung von Asparaginase aus E. cöli, welches
die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist*
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Anreicherung und Eeinigung
von Ii-Asparaginase aus; E, eqli durch Aufschluß und anschließende
Manganfällung besteht darin, daß der Überstand der Manganfällung
mit Gel behandelt, das Gel abgetrennt und bei pH^Wfrten zwischen
8,5 und 10 eluiert wird. · : . !
Durch den erfindungsgemäßen Reinigungsschritt-wird neben einer
Reinigung auch eine erhebliche Konzentrierung erzielt, so daß die Weiterreini'gung nach irgendeinem geeigneten Verfahren mit
erheblich verringerten Mengen durchgeführt werden kann. Besonders
überraschendv/igjigfdaß ,mit nur einer sehr geringen Gelmenge
(10 bis 20 $, bezogen auf das Volumen desL ManganfallungsfII-
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"träte·)' eine praktisch vollständige Adsorption und Elution des
aktiven Proteins erfolgt obwohl ein verhältnismäßig hoher Salzgehalt
in dem Filtrat der Manganfällung vorliegt, welcheβ für
den Gelschritt eingesetzt wird.
Der Aufschluß der Bakterienzellen erfolgt in bekannter Weise.
Geeignete Methoden sind z.B. Hochdruckdispersion, Einwirkung von Essigsäureäthylester, grenzflächenaktiven Stoffen, wie Triton X 100 oder Lysozym. Bevorzugt wird die Hochdruckdispersion.
Ebenfalls in bekannter Weise wird die Manganfällung durchgeführt. Beispielsweise wird hierzu auf die oben angegebene Mteraturstel-Ie
"Biochemistry" loc. cit. hingewiesen.
Als Gele eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren die anorganischen
Gele mit Adsorptionseigenschaften. Beispiele hierfür sind Calciumphosphatgel, Aluminiumhydroxydgel» Kieselsäuregel
und Zinnsäuregel· Vorzugsweise wird ein Calciumphosphatgel verwendet. BIe Calciumphosphatkonzentration im Gel liegt üblicherweise zwischen 10 und 30 mg/ml, vorzugsweise zwischen etwa
15 und 25 mg/ml. Das Gel wird dem Überstand der Manganfällung,
zweckmäßig nach einer Vorprobe, einfach zugesetzt und durch
Rühren verteilt und danach absitzen gelassen. Die vorhergehenden Schritte, Aufschluß der Bakterienzellpaste und Versetzen
der erhaltenen Zellsuspension mit einer verdünnten Mangansalzlösung sind bekannt. Der nach Abtrennen des Manganniederschlage
erhaltene Oberstand wird mit dem Gel behandelt und danach abgetrennt..
Nach dem Waschen und Trocknen des Niederschlags wird
dieser bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10, vorzugsweise bei etwa 9,3 bis 9,7, elüiert. Zweckmäßig wird hierbei der gewaschene
und getrocknete Niederschlag einfach mit einer Lösung des
angegebenen pH-Wertes, vorzugsweise einer verdünnten Pufferlösung, verrührt. Die L-Asparaginase geht hierbei in den Überstand
und läßt sich vom Calciumphosphatniederschlag einfach trennen.
Vorzugsweise erfolgt die Elution mit einer Pufferlösung. Als
sehr geeignet erwies sich beispielsweise 0,Ö2 M Dikaliumhydrogenphosphat
pH 9,5. Eine Elution bei einem°pH-Wert unter 8,5
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ist zwar im Prinzip möglich, hierbei sind jedoch so hohe Pufferbzw.
Salzkonzentrationen für die Elution erforderlich, daß anschließend
eine Dialyse erforderlich wäre, was in großtechnischem
Maßstabe schwierig ist. Bei pH-Werten über 10 erfolgt eine zunehmende Inaktivierung des Enzyms. Im angegebenen bevorzugten
pH-Wertbereich werden mehr als 80 % der ursprünglichen Aktivität
eluiert. "
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt kann
gegebenenfalls nach bekannten Verfahren weiter gereinigt werden. Beispielsweise kann eine Äthanolfällung und anschließend eine
Chromatographie über Carboxymethyl-Sephadex angeschlossen werden. Es ist auch möglich, in bekannter Weise direkt nach dem Aufschluß
eine Athanolfraktionierung durchzuführen, an die sich dann die
Manganfällung anschließt. Vorzugsweise wird jedoch das Geleluat einer Alkoholfraktionierung unterworfen. Da das Eluat eine sehr
niedrige Salzkonzentration aufweist, ist es möglich, vor der Fraktionierung die Lösung erheblich einzuengen, vorzugsweise auf
etwa 1/5 bis 1/7 des ursprünglichen Volumens. Die Alkoholfraktionierung
wird erfindungsgemäß durch Fällung mit Isopropanol, Lösen des Niederschlags und Fällung mit Methanol durchgeführt.
Diese Fraktionierung mit Isopropanol und Methanol kann auch anstelle der bekannten Athanolfraktionierung direkt nach dem Aufschluß
durchgeführt werden. Bevorzugt ist die Isopropanol-Methanolfraktionierung
jedoch nach dem G-elschritt. ■
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausbildung des Verfahrens der
Erfindung wird nach dem Gelschritt, gegebenenfalls nach Zwischen·^-
schaltung des Isopropanol-Methanolschrittes, eine Protaminsulfatfällung
durchgeführt. Nach*dem Abtrennen des Protaminsulfatniederschhgs
wird der Überstand über eine. DEAE-Sephadexeäuie
chromatographiert. Die Kombination der Protaminsulf atf ällung mit
der DEAE-Sephadexehromatographie ergibt eine sehr gute Eeinigungs-
und Anreicherungswirkung und führt zu einem Produkt, dessen spezifische Aktivität etwa der der handelsüblichen Präparate
entspricht.
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. Die oben aufgeführten zusätzlichen Reinigungsschritte nach der
Elution des Calciumphosphatgels werden günstig bei pH-Werten
zwischen etwa 6,5 und 8,5, vorzugsweise zwischen 7 und 8, durchgeführt. Bei der Chromatographie über I)EAE-Sephadex wird zweckmäßig
mit 0,02 bis 0,03 M Phosphatpuffer gewaschen und mit-0,05
bis 0,06 M Phosphatpuffer eluiert. Aus dem Eluat wird das aktive
Protein zweckmäßig in bekannter Weise durch Alkohol gefällt und entweder als solches verwendet oder noch einer an sich bekannten
Feinreinigung, beispielsweise Chromatographie an Carboxymethyl-Sephadex,
zugeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet eine rasche und wirksame Reinigung und Anreicherung von L-Asparaginase aus E. coli
in großtechnischem Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet
raum-, zeit- und arbeitsaufwendige Verfahrensschritte,
wie Chromatographie größerer Substanzmengen. Soweit eine Chromatographie durchgeführt wird, erfolgt diese erst in einem späteren Verfahrensstand, wo die Reinigung bereits soweit fortgeschritten
ist, daß in wesentlich kleinerem Ausmaß gearbeitet werden kann, bzw. bei gleichem apparativem Aufwand, wie bei den
bekannten Verfahren ein wesentlich höherer Drehsatz, bezogen
auf aktives Protein, erzielt werden kann.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1 .
Aus zwei E. coli-Kulturansätzen zu je 500 1 werden die Zellen
abgetrennt und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen. Die Zellsuspension wird mit Wasser auf 150 1 aufgefüllt
und mit verdünnter Essigsäure auf pH 5»8 eingestellt.
Nach Erwärmen auf 400C wird mit verdünnter Manganacetatlösung
auf 0,05 M gebracht. Der pH-Wert wird nachgestellt und der Niederschlag
absitzen.gelassen und abgetrennt. Der Niederschlag
wird mit Wasser gewaschen und Überstand und Waschwasser vereinigt.
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Die vereinigten Überstände werden mit etwa15 % Calciumphosphatgel
(C~20 mg/ml) versetzt und abgetrennt. Der Niederschlag wird
mit Wasser gewaschen. Überstand und Waschwasser werden verworfen.
Der Gelniederschlag wird mit der dreifachen Menge,, bezogen auf
das ursprüngliche Gelvolumen, an 0,02 MKpHPO.-Iösung pH 9,5
verrührt. Erforderlichenfalls wird der pH-Wert nachgestellt.
Nach Beendigung der Elution wird das Gel vom Überstand abgetrennt. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen. Waschwasser
und Gelüberstand werden vereinigt und enthalten etwa 80 % der
ursprünglichen Aktivität.
Die so erhaltene Lösung wird bei pH-Wert 7,0 unter Erwärmen auf
einen Proteingehalt von etwa 20 mg/ml konzentriert.
Aus dem so erhaltenen Konzentrat wird das Protein durch Zusatz
von 1,2 Vol. Äthanol gefällt.
Aktivität: 15 bis 20 Tl/mg, Ausbeute: 58 $, bezogen auf Zeil—
Suspensionsüberstand.
_ Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch wird
^ das Calciumphosphatgeleluat nach dem Einengen bei pH 7,0 stufenweise
mit soviel 90$igem Isopropanol versetzt, bis im Überstand weniger als 5 % AsparaginaseaJEtivität verbleiben (etwa 1VoI.).
Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 0,02 M Puffer pH 7,0 aufgenommen und mit insgesamt etwa 1,15 Vol. Methanol bei pH 7,0
und 100O stufenweise gefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt,
mit 0,02 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,6 aufgenommen und mit 10$iger Protaminsulfatlösung versetzt, bis keine Trübung mehr
eintritt. Der Niederschlag wird abgetrennt und verworfen. Der Überstand wird auf eine mit 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,6 äquilibrierte
DEAE-Sephadexsäule gegeben, mit zwei Säulenvolumen 0,025 M Puffer gewaschen und mit 0,055 H Phosphatpuffer eluiert.
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Die Fraktionen, welche die L-Asparäginase enthalten, werden vereinigt
und das Eiweiß mit Alkohol gefällt* Der Niederschlag besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 180 bis 200 U/mg. Die
Gesamtausbeute beträgt etwa 36 #.
Es wird wie in Beispiel 2 beschrieben vorgegangen, jedoch wird
der Niederschlag der Alkoholfällung in 0,05 M Natriumacetat-.puffer
pH 5,0 aufgenommen und auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Carboxymethyl-Sephadexsäule gebracht. Die Säule
wird mit dem gleichen Puffer unter Zusatz von 0,05 M Kaliumchlorid
gewaschen und mit gleichem Puffer unter Zusatz von 0,1 M Kaliumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt,
auf pH 7fO eingestellt und mit Alkohol gefällt. Der Niederschlag
wird in Wasser aufgenommen, wieder auf pH 7,0 eingestellt und
vom Unlöslichen getrennt. Durch Zusatz von Ammoniumsulfat auf
3,5 M kristallisiert das Enzym. Spezifische Aktivität: 230 U/mg. Das kristallisierte Präparat ist in der Elektrophorese bei pH 5
und 8,6 einheitlich. Gesamtausbeute, bezogen auf die im Aufschluß
gemessene Aktivität: 29 #.
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Claims (6)
1. Verfahren zur Anreicherung und Reinigung von L-Asparaginase
aus Escherichia coil durch Aufschluß der Zellsuspension und anschließende Manganfällung, dadurch gekennzeichnet, daß das S1U-trat
der Manganfällung mit Gel behandelt, das Gel abgetrennt und bei einem pH-Wert zwischen 8,5 "und 10 elulert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor
oder vorzugsweise nach dem Phosphatgelschritt eine Alkoholfraktionierung
durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst
eine Isopropanolfällung und dann eine Methanolfällung durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3i dadurch gekennzeichnet,
daß bei Alkoholfraktioniening nach dem Gelschritt anschließend
eine Protaminsulfatfällmig äur-chgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Piltrat der Protaminsulfatfällung einer DEAE-Sephadexchromatographie
unterworfen wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß Calciumphosphatgel oder Aluminiumhydroxidgel verwendet wird.
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Priority Applications (3)
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1969
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1970
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- 1970-02-09 US US10031A patent/US3684659A/en not_active Expired - Lifetime
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US9145798B2 (en) | 2012-01-30 | 2015-09-29 | Kolbenschmidt Pierburg Innovations Gmbh | Mechanically controllable valve drive arrangement |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |