DE2224131A1 - Verfahren zur gewinnung von cholesterinoxydase - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von cholesterinoxydase

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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,
Dipl.-Ing. H.Wetckmann, D1PL.-P11YS. Dr.K. Fincke Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
222A1 "31
8 MÜNCHEN 86, DEN '
POSTFACH 860 820 HZW MOHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., 68 Mannheim, San&hofer Straße 112-132
Verfahren zur Gewinnung von Cholesterinoxydase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des neuen Enzyms Cholesterinoxydase.
Es ist bekannt» daß eine Anzahl von Mikroorganismen Cholesterin umzusetzen vermögen. So beschreibt beispielsweise Turfitt in J.Bacteriol. 47» 487 bis 493 (1944) 188 Bakterien-Stämme, die Cholesterin als einzige Kohlenstoffquelle ausnutzen konnten» Über den Mechanismus der Cholesterinverwertung und die daran beteiligten Enzyme war jedoch nichts bekannt» Es besteht jedoch Interesse an der Auffindung eines Cholesterin --amsetseaden Enzyms, da su erwarten ist, daß ein derartiges Enzym für. eine spezifische Cholesterinbestimmuiägsmethode tob Interesse ist. Eine derartige spezifische ChoIesterinbestiiEmimgsmethoäe fehlt ■bisher, wäre jedoch in der medizinischen Diagnostik τοη großer Bedeutung.
Nunmehr wurde gefunden, daß aus Cholesterin; laasetsezulexL. lifero«·
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Organismen ein Enzym, isoliert werden kann, welches die Umsetzung von Cholesterin gemäß nachstehender Gleichung katalysiert:
Cholesterin(HH) + O2 *· Cholestenon + H2O2
Entsprechend der obigen Reaktion wird das neue Enzym als Cholesterinoxydase bezeichnet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Cholesterinoxydase bestoht darin, daß ein Cholesterin umsetzender Mikroorganismus, gegebenenfalls nach Waschung mit Butanol-Wasser-Mischung, durch Zerstörung der Zellwand mit einer ein nicht ionogenes oberflächenaktives Mittel enthaltenden Pufferlösung aufgeschlossen und extrahiert, der Extrakt über einen Anionenaustauscher gegeben und das Enzym mit einer das oberflächenaktive Mittel enthaltenden Pufferlösung eluiert wird.
Bei der Oholesterinoxydase handelt es sich um ein Enzym, welches einerseits in der Zellmembran des Mikroorganismus gebunden ist und andererseits eine extrem hydrophobe Substanz, nämlich das Cholesterin, umzusetzen hat. Enzyme dieser Art zeigen bei den klassischen Gewinnungsverfahren eine besonders unangenehme· Eigenschaft. Sie lassen sich nämlich äußerst schwer aus der Membran freisetzen und neigen, selbst wenn die Freisetzung gelungen ist, stets dazu, sich zusammenzuklumpen und an Gefäßwänden, Phasengrenzschichten oder auch Adsorptionsmitteln und Austauschermaterialien zu binden. Es ist daher nicht möglich, die üblichen Methoden der Enzymgewinnung und Isolierung anzuwenden. Eine besondere Schwierigkeit liegt dabei darin, daß Aktivität und Spezifität des Enzyms nicht verändert werden dürfen.
Als Mikroorganismus eignet sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wie erwähnt im Prinzip jeder Cholesterin umsetzende Mikroorganismus. Besonders gute Ergebnisse wurden
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mit Bakterien der Gattung Proactinomyces erzielt und bevorzugt werden die zu dieser Gattung gehörenden Bakterien Proactino- . myces erythropolis NBC 9158, ATCC 17895, ATCC 4277 und Uocardia formica ATCC 14811- Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch in gleicher Weise auch auf andere Mikroorganismen, Bakterien wie "Pilze, anwendbar, welche Cholesterin umzusetzen vermögen.
Dor Aufschluß von Mikroorganismen durch Zerstörung der Zellwand mittels Detergentien ist an sich bekannt und grundsätzlich lassen sich alle der hierzu beschriebenen und in die Praxis eingegangenen Methoden anwenden.
Der Mikroorganismus wird mit einer ein nicht ionogenes oberflächenaktives Mittel enthaltenden Pufferlösung aufgeschlossen und extrahiert. Bevorzugte nicht ionogene oberflächenaktive Mittel sind die Alkylaryläthylenglycole und Polyäthylenoxyd-Polypropylenoxyd-Addukte, insbesondere deren Ester. Die anzuwendende Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der zum Aufschluß und zur Extraktion verwendeten Pufferlösung hängt in gewissem Ausmaß von dem jeweils verwendeten oberflächenaktiven Mittel ab und kann durch Vorversuche bestimmt werden. Im allgemeinen eignen sich Konzentrationen zwischen etwa 0,01 und 3 $>' vorzugsweise zwischen 0,1 und 1 #. Die Pufferlösung kann pH-Werte zv/ischen etwa 5 und 9 aufweisen, bevorzugt wird ein pH zwischen 6 und 8.
Durch die beschriebene mit dem Aufschluß kombinierte Extraktion in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels läßt sich die spezifische Aktivität des gesuchten Enzyms auf das 100-fache erhöhen im Vergleich zu einer mit dem gleichen Puffer in Abwesenheit des oberflächenaktiven Mittels, aber mit Ultraschall durchgeführten Extraktion.
Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn der Mikroorganismus vor dem Aufschluß und vor der Extraktion in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels einer Wäschung mit einem Butanol-, Wasser-Gemisch unterzogen wird. Überraschenderweise führt diese Waschung mit einer Butanol-Wasser-Emulsion nicht zur erwarteten
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Zusammenballung oder Denaturierung des Enzyms an Grenzflächen, obwohl eine solche Maßnahme bei üblichen nicht zur Zusainmenballung neigenden Enzymen bereits zu Grenzflächenanreicherungen und zu einer starken Beeinträchtigung der Aktivität führen kann. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich jedoch durch diese Waschung vorab eine weitere erhebliche Anreicherung erzielen. Die Butanol-Wasser-Waschung kann dabei in einem oder mehreren Schritten durchgeführt werden.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verfahrensschritte läßt sich zahlenmäßig durch Vergleich mit einem gewöhnlichen Ultraschallaufschluß demonstrieren. So lassen sich durch Ultraschallaufschluß einer bestimmten Menge des Mikroorganismus mit 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 30 Einheiten Cholesterinoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 0,01 erhalten. Wird hingegen der Aufschluß des Organismus mit dem gleichen Puffer, dem etwa 0,5 f° oberflächenaktives Mittel zugesetzt wurden, durchgeführt, so erhält man eine Gesamtaktivität von 60 Einheiten und eine spezifische Aktivität von 1,0. Dies entspricht einer Verdoppelung der Ausbeute und einer 100-fachen Anreicherung. Wird das letztgenannte Verfahren wiederholt, vor dem Aufschluß aber eine Waschung mit Butanol-Wasser-Gemisch durchgeführt, so erhält man 60 Einheiten Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 3,0, also insgesamt 300-fache Anreicherung.
Der erfindungsgemäß erhaltene Extrakt, welcher die Cholesterinoxydase gelöst enthält, wird anschließend über Ionenaustauscher gereinigt. Es hat sich herausgestellt, daß es dabei jedoch nicht möglich ist, die üblichen Methoden einer derartigen Reinigung anzuwenden. Es stellte sich nämlich heraus, daß das Enzym vom Austauscher nicht mehr eluiert werden konnte. Selbst unter Anwendung hoher Ionenkonzentrationen konnte das Enzym nicht mehr wiedergewonnen werden. Desgleichen gelang es auch mit Lösungen oberflächenaktiver Mittel nicht mehr, das Enzym zurückzugewinnen. Überraschenderweise konnte jedoch mit einer Kombination
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von Puffer und oberflächenaktivem Mittel von relativ geringer Konzentration das Enzym praktisch vollständig wieder vom Austauscher heruntergewaschen v/erden.
Als Austauscher eignen sich die Anionenaustausch^, insbesondere die "schwachbasischen Sorten. Bevorzugt v/erden Austauscher, die eine Diäthylamirioathanolgruppe tragen- Andere Austauscher mit vergleichbarer Basizität eignen sich jedoch ebenfalls gut.
Die Elution vom Austauscher w.ird vorzugsweise mit einer 0,01 bis 0,2 molaren Pufferlösung des oben angegebenen pH-Wertbereichs durchgeführt. Die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels liegt dann, vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 2 #. Besonders bevorzugt wird die Verwendung von O5 03 bis 091 molarem Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 0^2 bis 0,7 $> oberflächenaktivem nicht ionogenem Mittel.
Aus dem so erhaltenen Eluat läßt sich das Enzym in üblicher Weise isolieren, beispielsweise durch Ausfällung mit Salzen . oder -organischen Sölventien wie Ammonsulfat, Methanol und dgl. Es kann auch zweckmäßig sein, vor der Austauscherchromatographie das Enzym aus der Lösung auszufällen, um die Lösungsmittel« menge zu erniedrigen. Für die 'Wie derauf lösung einer ausgefällt ten Cholesterinoxydase wird vorzugsweise ein Puffer verwendet, welcher eine geringe Menge eines oberflächenaktiven Mittels enthält. Es wurde nämlich beobachtet, daß gelegentlich die Wiederauflösung des gefällten Enysms große Schwierigkeiten bereitet, die jedoch bei Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels nicht auftreten.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich eine etwa 3000-fache Anreicherung des Enzyms durchführen,, Eine weitere Reinigung nach üblichen biochemischen Peinreinigungs^tlroden ist möglich. Soweit das Enzym dabei gefällt oder an Oberflächen adsorbiert oder gebunden wird, sollen derartige Methoden in
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Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt werden.
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren nach der Austauscherelution erhaltene Enzympräparat läßt sich direkt für die quantitative Cholesterinbestiminung gemäß der oben angegebenen Reaktionsgleichung einsetzen.
Die Aktivität des Enzyms und damit die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde verfolgt, indem das gemäß obiger Gleichung gebildete H2O2 nach bekannten Methoden der HgC^-Be-1 Stimmung gemessen wurde.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1
40 ml einer Suspension von üFocardia erythropolis (ca. 10 g Trockengewicht) v/erden mit 40 ml n-Butanol versetzt und einige Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird zentrifugiert und sowohl das Butanol als auch die überständige wässrige Phase abgegossen. Der Niederschlag wird erneut mit 40 ml Wasser versetzt und nach Herstellen einer homogenen Suspension der Zellen wieder mit 40 ml n~Butanol versetzt, einige Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 40 ml 0,01 molareia Phosphatpuffer, pH = 7,0, suspendiert, dem 0,3 $ eines nicht ionogenen oberflächenaktiven Mittels (Alkylarylpolyäthylenglycol) zugesetzt sind,und bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt« Anschließend wird zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der Extrakt enthält ca. 120 Einheiten Cholesterinoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 3 Einheiten/ml Protein.
Dieser Extrakt wird mit festem Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 1,3 M an Ammonsulfat bei O0C versetzt. Anschließend wird die Suspension zentrifugiert, wobei der Niederschlag sich aufgrund eines offensichtlich lipophilen Anteils auf der Ober-
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fläche der Lösung sammelt. Der zusammengebackene Niederschlag wird filtriert, mit 0,01 molarem Phosphatpuffer, pH = Ί, gelöst und anschließend gegen denselben Puffer bei O0C erschöpfend dialysiert.
Die dialysierte Lösung wird auf eine mit 0,01 molar Phosphatpuffer, pH = 7, äquilibrierte Säule eines handelsüblichen Anionenaustauschers mit Diäthylaminoäthanolgruppen auf Dextranbasis gezogen. Dabei wird das Enzym adsorbiert. Nach Waschen der Säule mit demselben Puffer wird nach-einander mit Lösungen von 0,5 f°, 2 % und 5 $ des obigen oberflächenaktiven Mittels in V/asser gewaschen. Dabei werden große Mengen an Verunreinigungen eluiert. Anschließend wird nacheinander mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH = 7, 0,05 M Phosphatpuffer, pH = 7, 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7, und 0,5 M Phosphatpuffer, pH = 7, gewaschen. Anschließend wird erneut mit 0,05 molarem Phosphatpuffer, pH = 7, gewaschen und- anschließend das gewünschte Enzym mit 0,05 molarem Phosphatpuffer, dem 0,5 % oberflächenaktives Mittel zugesetzt sind, eluiert. Im Eluat finden sich ca. 80 <fo der an der Säule adsorbierten enzymatischen Aktivität an Cholesterinoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 25 bis 30 U/mg Protein.
Beispiel 2
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde die Waschung mit Butanol-Wasser weggelassen. Man erhielt so einen Extrakt für die Ammonsulfatfällung, welcher etwa 120 Einheiten Cholesterinoxydase mit"einer spezifischen Aktivität von 1 Einheit/ml Protein enthielt. Die weitere Aufarbeitung in der beschriebenen Weise führte zu einem Produkt mit einer spezifischen Aktivität von 8 bis 10 U/mg Protein.
Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel)
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch erfolgte die Elution des Austauschers mit einer wässrigen Losung, die
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5 io des gleichen oberflächenaktiven Mittels gelöst enthielt. Es konnte keinerlei Enzymaktivität wieder eluiert v/erden. Das Enzym zog irreversibel am Austauscher auf.
1 U Protein ist diejenige Aktivität, bei der 1 Mikromol .FLpO2' pro Minute imter folgenden Bedingungen gebildet wird:
2>31 ml PO4-Puffer, 0,05 M, pH 7,0 (+ ABTS 2 ml, c = 50 auf
100 ml Puffer)
0,05 ml Cholesterin-Lösung, c = 3,7 intertiären Butanol 0,6 ml tertiäres Butanol, 0,02 ml POl), c = 1, 0,02 ml Bakterienextrakt.
ORIGfNAL
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Claims (4)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Gholesterinoxydase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Cholesterin-uiasetzehder Mikroorganismus, gegebenenfalls nach Waschen mit Butanol-Wasser-Mischung, mit einer ein nicht ionogenes oberflächenaktives Mittel enthaltenden Pufferlösung durch Zerstörung der Zellwand aufgeschlossen und extrahiert, der Extrakt über einen Anionenaustauscher gegeben und das Enzym, mit einer das oberflächenaktive Mittel enthaltenden Pufferlösung eluiert wird«,
2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus dem Extrakt durch Zusatz von Ammonium sulfat gefällt und danach wieder in Pufferlösung aufgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Puffer pH 5· bis 9 verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Elution des Austauschers eine 0,01 bis 0,2 molare Pufferlösung verwendet wird.
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DE2224131A 1972-05-17 1972-05-17 Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Cholesterinoxydase, welches Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon und H tief 2 O tief 2 oxydiert Granted DE2224131B2 (de)

Priority Applications (19)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2224131A DE2224131B2 (de) 1972-05-17 1972-05-17 Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Cholesterinoxydase, welches Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon und H tief 2 O tief 2 oxydiert
DE2224133A DE2224133B2 (de) 1972-05-17 1972-05-17 Verwendung von bestimmten Mikroorganismen-Stämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon + H tief 2 O tief 2 oxydiert
DE2307518A DE2307518C3 (de) 1972-05-17 1973-02-15 Gewinnung von Cholesterinoxidase
AT362473A AT323101B (de) 1972-05-17 1973-04-24 Verfahren zur isolierung von cholesterinoxidase
DK255573A DK131784C (da) 1972-05-17 1973-05-09 Fremgangsmade til udvinding af cholesterinoxidase
CH681373A CH592108A5 (de) 1972-05-17 1973-05-14
BE131116A BE799542A (fr) 1972-05-17 1973-05-15 Cholesterol-oxydase et son procede de preparation,
NL7306737.A NL164604C (nl) 1972-05-17 1973-05-15 Werkwijze voor het bereiden van een cholesteroloxydase- preparaat.
GB2308173A GB1391876A (en) 1972-05-17 1973-05-15 Cholesterol oxidase
ZA733259A ZA733259B (en) 1972-05-17 1973-05-15 Improvements relating to enzymes
US05/360,490 US4144129A (en) 1972-05-17 1973-05-15 Cholesteroloxidase and method for its production from microorganisms
SE7306914A SE413246B (sv) 1972-05-17 1973-05-16 Forfarande for framstellning av kolesteroloxidas
IT24187/73A IT987645B (it) 1972-05-17 1973-05-16 Ottenimento di colesterinossi dasi
IL42292A IL42292A (en) 1972-05-17 1973-05-16 Cholesterol oxidase and process for obtaining the same
HUBO001437 HU169971B (de) 1972-05-17 1973-05-16
SU7301934663A SU584801A3 (ru) 1972-05-17 1973-05-17 Способ получени фермента, окисл ющего холестерин до перекиси водорода и холестенона
JP5515673A JPS5728552B2 (de) 1972-05-17 1973-05-17
FR7317899A FR2184968B1 (de) 1972-05-17 1973-05-17
NL8000305A NL8000305A (nl) 1972-05-17 1980-01-17 Werkwijze voor het kweken van een micro-organisme.

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2224133A DE2224133B2 (de) 1972-05-17 1972-05-17 Verwendung von bestimmten Mikroorganismen-Stämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon + H tief 2 O tief 2 oxydiert
DE2224131A DE2224131B2 (de) 1972-05-17 1972-05-17 Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Cholesterinoxydase, welches Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon und H tief 2 O tief 2 oxydiert
DE2307518A DE2307518C3 (de) 1972-05-17 1973-02-15 Gewinnung von Cholesterinoxidase

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Publication Number Publication Date
DE2224131A1 true DE2224131A1 (de) 1973-12-20
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DE2224133A Granted DE2224133B2 (de) 1972-05-17 1972-05-17 Verwendung von bestimmten Mikroorganismen-Stämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon + H tief 2 O tief 2 oxydiert
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NL (2) NL164604C (de)
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5724875B2 (de) * 1974-03-07 1982-05-26
DE2456586C3 (de) * 1974-11-29 1979-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verwendung von bestimmten Mikroorganismenstämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxidase, welche Cholesterin mit O2 zu Cholestenon + H2 O2 oxidiert
CA1067844A (en) * 1975-12-11 1979-12-11 Eastman Kodak Company Method and medium for producing cholesterol oxidase
US4043870A (en) * 1976-05-11 1977-08-23 The Upjohn Company Process of purifying cholesterol oxidase
JPS5530670A (en) * 1978-08-25 1980-03-04 Seiko Instr & Electronics Ltd Electronic watch
JPS56109586A (en) * 1980-02-05 1981-08-31 Cpc International Inc Production of fixed glucoseisomerase
US5156954A (en) * 1989-03-08 1992-10-20 Cholestech Corporation Assay device and method using a signal-modulating compound
US5171688A (en) * 1988-08-30 1992-12-15 Cholestech Corporation Self-corrected assay device
CA2002890C (en) * 1988-11-14 1999-12-14 Susan Long Expression of dna sequences derived from nocardioform microorganisms
JP2514087B2 (ja) * 1989-01-06 1996-07-10 富士写真フイルム株式会社 総コレステロ―ル分析要素
US5114350A (en) * 1989-03-08 1992-05-19 Cholestech Corporation Controlled-volume assay apparatus
US5340539A (en) * 1989-03-16 1994-08-23 Chemtrak, Inc. Non-instrumented cholesterol assay
US5206148A (en) * 1989-07-24 1993-04-27 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for assaying aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or ω-carboxylic acid derivatives thereof
US5238816A (en) * 1989-07-24 1993-08-24 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Omega carboxyalcohol oxidase enzyme
JP2786679B2 (ja) * 1989-07-24 1998-08-13 旭化成工業株式会社 新規なω位カルボキシアルコール酸化酵素
US5110724A (en) * 1990-04-02 1992-05-05 Cholestech Corporation Multi-analyte assay device
ATE365537T1 (de) * 2001-08-06 2007-07-15 Astrazeneca Ab Wässrige dispersion stabiler nanopartikel eines wasserunlöslichen wirkstoffs und ein hilfsstoff wie mittelkettige triglyceride (mct)
DE60207196T2 (de) * 2002-04-09 2006-07-20 Cholestech Corp., Hayward Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung von Lipoprotein-Cholesterol hoher Dichte
DE602008002825D1 (de) * 2007-01-09 2010-11-11 Cholestech Corp Vorrichtung und verfahren zur messung des ldl-assoziierten cholesterols
WO2022032148A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Mate Precision Technologies Inc. Tooling base assembly
US11759914B2 (en) 2020-08-06 2023-09-19 Mate Precision Technologies Inc. Vise assembly

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3607093A (en) * 1968-02-15 1971-09-21 Schering Corp Devices for testing biological liquids
FR2047147A5 (de) * 1969-05-06 1971-03-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk
GB1385319A (en) * 1971-09-22 1975-02-26 Nat Res Dev Enzyme preparations

Also Published As

Publication number Publication date
US4144129A (en) 1979-03-13
DE2307518A1 (de) 1974-10-10
FR2184968B1 (de) 1977-12-30
CH592108A5 (de) 1977-10-14
NL164604C (nl) 1981-01-15
DK131784B (da) 1975-09-01
IT987645B (it) 1975-03-20
DE2224131B2 (de) 1974-06-27
BE799542A (fr) 1973-11-16
FR2184968A1 (de) 1973-12-28
NL7306737A (de) 1973-11-20
IL42292A (en) 1976-12-31
DE2307518B2 (de) 1978-10-19
SE413246B (sv) 1980-05-12
NL8000305A (nl) 1980-06-30
DK131784C (da) 1976-02-09
DE2224133B2 (de) 1974-06-20
JPS4947582A (de) 1974-05-08
DE2224133A1 (de) 1973-12-20
GB1391876A (en) 1975-04-23
JPS5728552B2 (de) 1982-06-17
DE2307518C3 (de) 1979-07-19
AT323101B (de) 1975-06-25
IL42292A0 (en) 1973-07-30

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