DE1695315A1 - Verfahren zum Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid - Google Patents

Description

-VERS¹AHEEN ZTOI HBINICrEN VOH ΡϊίΥΙΝ-ΑΒΕΝΙΝ-ΒΙΝϋΟΙΒΟΙΙΪ)

Vorliegende lief indung betrifft ein. Verfahren zum Reinigen von ]?lavin-Adenin-Dinuoleotiä. Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reinigen von Plavin-ldenin-Dinueieotiidi «tlches haiiptsäehlicih dtiroJk■"flavine, insbesondere durqh j?lavin-mononuGleotid· und/oder syalisohe Ilavin-mononiiOleQ-tide verunE#ijiigt ist, wobei ein hoch gepeinigtes SlsvAn-idesiii·- Dinucleotid in einer bezogen auf die industrielle Gewinnung mit geringeren Kosten bzw, Nachteilen verbundenen Art erhalten wird·

T?lavin-idenin~I)inucleotid ist in den mannigfaltigsten Substanzen, die in verschiedenen enzymatischen Reaktionen in oder bei lebenden Körpern von Wichtigkeit sind, vorhanden und stellt eine der i biologisch aktiven Formen des Vitamins Bp (Riboflavin) dar, Flavin-Adenin-Dinucleotid ist als Substitut für Riboflavin sowohl als Medikament als auch als Zusatz zu lahrungs- und Futtermitteln infolge seiner starken Aktivität und hohen Löslichkeit in Wasser verwendet worden. Daher ist es seit Jahren erwünscht, ein ökonomisches und industrielles Verfahren zur Gewinnung iron flavin-•idenin-DinucleOtid einzuführen.

Bs ist bekannt, daß flavin-Menin-Dinueleotid z.B. gereinigt <

wenden kann, durch chromatographische üdsorptionsmethoden unter· ·

Verwendung von ünionenaustauscherharzen, Eationenaustauscherhar- " zen, üic^ivkohle» Tdrra alba, Florisil ( Handelsname des synthetischen, analytischen Adsorbens der floridin Go., Ine,, Tallahassee, .Li¹Ia. USA ) oder durch ffäl lungs methoden entweder durch Zusatz von Metallsalze,!! ader lurch die Eildung von reduziertem Havin-ldenin- !'Jinucleotid, Üblicherweise haben sich Anionenaustauscherharze zur industriellen Reinigung von Flavin-Adenin-DinuGleotid geeigneter erwiesen als andere Materialien, und diese sind auch einschließlich stark basischer Artionenaustauscherharze zur Reinigung relativ gro4«sr Mengen von fflavin-Adenin-Mnucleotid verwendet worden«

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Im Falle der Reinigung von iabraiK Flavia-ldeniaDiiiuoleofeiqL. ; • unter Verwendung stark basischer Anioneriaustauscherhsrii» wird - ^J die Mutterlauge von dem Harzbett' in der Cl-Form adsorbiert mit anschließender, Eluierung' mit Salzsäure, wobei die Pufferlösung Natriumchlorid und Lifehiumchlorid enthält, um das gewüsiehte . Flavin-Adenin-Dinucleotid und die Verunreinigungen durch Verän- « derung der Konzentration des Salzes und/oder der 4eiclit5&ti der Lösung abzutrennen. Es ist beobachtet worden_tda£ diesfß VeKfah*» ^; =ren bezüglich der Leichtigkeit der verwendbaren Opera tion, und

der Wiederverwendbarkeit des preiswerten EluieriBittels sehr geeignet ist. -Jedoch führte es nickt immer zu einer aüsreiehendftB pf *. üb trennung des Flavin*Adenin-*Pinucleotids von den Verunreinigungen, wie z.B· Flavin-mononucleotid, vrnxm es in der industriellen Praxis angewendet wurde. Is stimmt, daß -»■ wenn größere Mengen ah Mutterlauge mit einem bestimmten Harzvolumen behandelt werden,— verschiedene Störungen, wie z.B. Trennungsschwierigkeiten.» ! ein Erfordernis für eine gewagte Kontrolle u. dgl, auftraten· ' .Außerdem können verschiedene andere Flavin^Verunreinigungen als die von Flavin-mononueleotid, wie z,B* solche von cyclischen Flavin-moiionucleotiden in dea Flavin-Adenin-Binucleotid-haltigen Fraktionen unter normalen Bedingungen eluiert werden unter Verwendung irgendeiner ler konventionellen Eluierlösungen, wobei es dann aber schwierig ist, hoch greinigtes Flavin-Adenin-Dinucleotid zu erhalten. Biese Nachteile verhindern so natürlich die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens in der Praxis.

Wir haben nun in der Anionenaustausch-Chromstographie verschiedene Flavinverbindungen einschließlich ilavin-ideneedn-Mnucleotid und Flavin-Adene«in~Mononuoleotid untersucht und haben dabei gefunden, daß Flavin-AdenwBin-Dinucleotid vorteilhaft fraktioniert von den verschiedenen Verunreinigungen, die nicht nur Flavinmononucleotide, sondern auch andere Hucleotide mit umfassen, ' * abgetrennt werden kann durch Verwendung einer wässrigen Salzsäure-Lösung, die Calciumchlorid enthält, als Ilrsatz für die üblicherweise verwendeten Bluiermittel.

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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung-v-'ursie gefunden, daß Natriumchlorid als vorteilhaftes Sluiermicfcel für die lonenaustausch-Ghroaiatographie von Flavin-Veroind-ohgen verwendet werden kann, wobeivionenaus-tausöJierliarze zu verwenden sind, und wir ,können damit ein ausgezeieiinetes Verfahren zur .Anwendung der lcommersiellen "Reinigung von Flavin-Aaenin-Binucleotid bieten«

ißt das Verfahren gum Reinigen von ¥laνin-Adenin-Dinucleotid mit Hilfe der Ionenaustauscher-Chromatographiö unter Verwendung stark basiseher Anionenaustauscherharze dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung von rohem ^ :Fäa¥in*A&eniJä~Dinucleotid, welche noch Verunreinigungen, wie z.I* r Flavin-mononucleotide enthält» auf ein mehr als leicht saures ι. p„ eingestellt wird, und über oder aurch ein stark basisches ' AnioneaattßtauschejBharzbett geleitet wird, um die P la ν in- Verb indungen daran zu adsorbieren, das Bett mit einer schwach sauren, wässrigen Salzsäurelösung, welche eine relativ geringe Konzentration an Oalöiumehlorio! enthält, zu waschen, wobeivflBuIireinigungen wie llavin-mononueleotide und cyclische flavin-mononucleoals auch nucleotide eluiert werden· ' ,.

Unter diesen üedingungen ist beobachtet; worden, daß Flavin-Ädenin-DiJaucleotid, wenn es von dem Harzbett adsorbiert worden ist, nicht vollständig eluiert wird und so - nachdem mit diesem EluierJBittel gut ausgewaschen worden ist ** nur Flavin-Adenin-Dinucleotid aait Hilfe der v-'äserigen Salzsäurelösung, die eine genügend hohe Eo-nzentra tion an Katriurnehiorid, Ca lciumchlorId u* dgl* enthält, eluiert werden kann, wobei eine hochreine wässrige iiQSung von Flavin-Adenin-Dinucleotid erhalten wird.

Bezüglich der für das erfindungsgemäße Verfahren zu verwendaiden Ionenaustauscherharze können versoh'ieaene stark basische inioneiiaustauscherharze der üblichen 5D7pen für dieeen Zweck ohne Rücksicht auf die üiypen 1 oder II verwendet werden. Bevorzugte lustauscherharze sind ζ*B. handelsübliche Produkte, wie Dowex 1x2 (Dow Chemical Go., USA), Ambarlite IHA-^11 (Eöfam & Haas Co., USA), Diaion SA 21 A (Mitsubishi Käse! Kogyo K.IU, fokio, Japan) und Düolite A 40 (Diamond Alkali Co., USA). Vor der Verwendung ;,

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wird das Harz mit einer geeigneten Saure oder Base gewaschen und wird dann mit Salzsäure oder einem geeigneten Chlorid in die Cl-Form übergeführt. Obwohl auch Harze, die mit verschie*- · denen anderen Unionen als denen der Harze in der Salzform verwendet werden können, sind doch bessere Ergebnisse durch Verwendung von Harzen in der Cl-Form im Hinblick auf leichter durchzuführende Operationen und bessere Ausbeutergebniese er* halten worden. Man läßt am vorteilhaftesten die rohe wässrige Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lösung eine entsprechend gepackte s oder geschichtete Harzkolonne passieren, zwecks Durchführung r der nachfolgenden Chromatographie-Stufe» *

Die das Harzbett passierte Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lösung * wird dann vorzugsweise auf ein Pjj von ca, 4,0 eingestellt* Die ! Adsorptionswirkung kann bei einem höheren p_H*¥/ert verbessert S werden, während ein höherer Pjj-Wert jedoch für die Rentabilität des Flavin-Adenin-Dinucleotid verantwortlich sein kann. Daher-ist es notwendig, den p„-i^rert des Flavin-Adenin-DinucleGtids auf ca· ife^S 4,0 - 8,0 zu halten.

Wenn die Hmbc die Harzkolonne passierende Lösung große Mengen an Salzen enthält, kann die Adsorption des Flavin-Adenin-Dinucleotids beeinträchtigt werden} sie ist von verschiedenen Stö-~ ι rungen in Verbindung mit der nachfolgenden lönenaustauscJht-Chroma'» , _v tographie-Behandlung abhängig* Um-unter solchen Bedingungen fces-} i sere Ergebnisse zu erhalten! ist es wünschenswert* Ate Salzkonzentration durch Erhöhung des Volflunens der Ijösung derart «u irei?- dünnen, daß mehr als 5-1Ö g Flavin-Adenin-Dinuoieotid von einem Äquivaliftt des Harzes adsorbiert werden kann. _#

Brfiadungigemäß ist es daher möglich, eine wässrige, Calciumchlotid-haltlge Salzsäure lösung iiül Auswaechen versehiedeiier, anderer iiavin-haltiger Ver(Reinigungen als Flavin-Adinii tid üjQd i»tiimciienswerterw»iiit auch verschiedener anderer . veruntiinigungen zu verwenden» Obgleieb.vei!schie;d.ene Kombinationen bezüglich der Konzentjretlonen de» OfilciMiieh|»%fids und dea? Selteäure für diesen Zweck möglich sein werden, können gute

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.j Ergebnisse z.B. durch. Verwendung einer Wässrigen 0,01 η HCl-Lösuiig mit 0,02 - 0,04 Mol-Gehalt an CalöiumGhlQ^id erzielt werden.

' Es wurde beobachtet;, daß Piavin-Verbindungen, wie z.B. üdenisin-monophos^hat, Adenisin-diphosphat und Inosin-monophosphat fast vollständig eluiert werden können, während keine oder nur eine geringe Menge an Flavin-Adenin-Dinucleotid von der oberen Harzbett schicht» in die Verunreinigungen enthaltenden Fraktionen verlagert wird, wobei eine vollständige Trennung erreicht wird.

Es ist zwar möglich, irgendeines der»üblichen Eluiermittel zwecks Eluierung des Flavin-Adenin-Dinucleotids aus dem Ionen- ä austauscherharzbett zu verwenden, von welchem"verschiedene Verunreinigungen vollständig entfernt worden sind, -jedoch können gute Ergebnisse durch Verwendung einer wässrigen Salzsäurelösung erhalten werden, welche eine höhere Konzentration an Calciumchlorid enthält als die sbrc Waschlösung. Bevorzugtes ■ Eluiermittel dieses Typs ist z.E. sine wässrige Salzsäure-Losung, z.B. eine 0,1 η Salzsäurelösung, die Natriumchlorid (z.B. 1 Mol Natriumchlorid - 0,005 h HCl ) oder Calciumchlorid ( z.B. 0,1 Mol Calciumchlorid - 0,01- η HCl ) u. dgl. enthält. Unter den verschiedenen Sluiermitteln, die für diesen Zweck zu verwenden sind, können bessere Ergebnisse erhalten werden durch Verwendung einer verdünnten wässrigen.SaIzsäurelöaung, die ein _; solches Salz enthält, daß bei dessen Verwendung der p_H-Wert der ^: ( Lösung nicht zu tief absinkt, so daß keine G-efahr einer Zersetzung -"' des Flavin-Adenin-Dinucleotid© besteht, und daß das Volumen der Flavin-Adenin-Dinucleotid-haltigen Fraktion nicht groß ist , und daß außerdem eine bessere Gewinnung erreicht wird'". j

Die so erhaltene Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lösung, welßhe fast keine Verunreinigungen, wie Fiavin-mononucleotide, cyolische Flavin-niononucleotide u. dgl» enthält, wird auf einen entsprechenden ρ -Wert eingestellt und konzentriert. Is ist auch

möglich, Flavin-Adenin-Dinucleotid hoher Reinheit durch Fällung

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zu erreichen. Jedoch, ist es erwünscht, zwecks Verhinderung ·* > 'einer möglichen Verunreinigung durch in dem iSluat enthaltene Salze die Salze von dem Bluat durch eine der üblichen Methoden zu" entfernen und - nachdem man den P₁, Wert eingestellt hat - das Eluat zu konzentrieren, um gereinigtes Flavin-Adenin-

■ Dinucleotid auszufällen.

Wenn die Eluierung durch Verwendung eines Galciumchlorid-ent«· haltenden Eluiermittels durchgeführt ist, so wird das Bluat z.B. mit Oalciumcarbonat neutralisiert, und dann kann das Calciumsalz des j/L Flavin-Adenin-Binucleotids leicht durch Konzentrieren des Filtrats auskristallisiert werden. Das erhaltene Flavin-Adenin-Dinucleotid hat=eine hohe Reinheit und enthält überhaupt keine Verunreinigungen. v:xe_a z.B· Flavin-mononucleotid, cyclisches Flavin-mononucleotid und Riboflavin mehr. BTach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Flavin-Adenin-Dinucleotid dieser hohen Reinheit leicht auch mit einer guten Ausbeute erhalten werden.

Die folgenden, das Verfahren jedoch nicht begrenzenden Beispiele erläutern die Erfindung. Es soll noch bemerkt werden, daß verschiedene Kombinationen der in den Beispielen erläuterten Calciumchlorid- und Salzsäure-Mengen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht begrenzen sollen«

Beispiel 1

Ein rohes fflavin-Adenin-Dinucleotid-Pulver ( Gewicht 6 g) jnit einer Reinheit von 82,1 %„ das neben fflavin-mononucleotid und cyclischen Flavin-mononucleotid noch färbende Substanzen u. dgl, enthält, wird in 2 1 Wasser gelöst und durch eine mit Dowex 1x2 (Handelsname eines stark basischen Anionenaustpuscherharzes der Dow Chemical Co., USA) , das zu seiner Cl-Form regeneriert worden ist, bepackte Kolonne abwärts geschickt» Sowohl Flavin-Adenin-Dinucleotid, wie auch die Verunreinigungen werden von der äußeren Oberfläche des Harzes adsorbiert« Das Ha-rzbett wird dann mit Wasser gewaschen, um nicht-adsorbierbare

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Verunreinigungen, wie ζ «Β» Hibof lavin auszutreiben. Dann IaBt man mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 1/Std* 50 1 einer O-i02. Hol GaOl₂- 0,001 η wässrigen BGl-iösung passieren» Kleine Mengen von Verunreinigungen, wie Adenylsaure» Gtuanylsäure, Inasinsaure u» dgl* werden ζuerst und Flavin-toononucleotid sowie andere Verunreinigungen, wie . cyelisch.es Flavin-mononucleotid werden alsdann eluiert. Andererseits zeigt Flavin^Adeniii-Dinucleotid fast keine Über*· tragung von dem äußeren ÖJeil des Harzbetts während dieser Eliiiers tuf e, und in dem lluat ist davon absolut nieJtits ent*· halten* Wenn die UV-Adsorption des Sluats fast verschwunden ist, wird Flävin-ideniix^Dinucleötld mit einer .0,5 Mol GaOIg - 0,001 η HOl-Lösung eluiert. Man ernärt 1 1 des nochreines Plavin-Adenifi-Dinucleotid enthaltenden lluate* Dessen pg beträgt 3,2 und wird durch. Zusatz Van GaöOa aöf" 5»^ eingestellt* Man filtriert den Niederschlag ab, konzentriert das filtrat unter reduzieJ?tem Brück bei 40⁰O auf 100 ml, kühlt und läßt es «weeks Auskristallisieren des Calciumsalzes des Jlavin-Adenin-DtttUßleatids stehen. Me Kri:3⁴aeλ^%® werden später abfiltriert Uttd ergeben nach dem Trocknen 4,^ g .ins® uelciuasalaes des Flaviß-Adenin-Dinucleotidß einer Reinheit von 98,2 %* Di©Bes Plavirn-Adenin-Dinucleotid enthält absolut keine Verunreinigungen au Flavinen, wie b*B» ^lavinw-mononucleotid.

Beispiel 2 . .

θ g einöE rohen i'lavin-ldfeniii^Dinueleotids einer Reinheit von 72,6 % werden in 2 I Wasser gtlöst, und maa läßt dies· lösung eine Harakolonne passieren, die mit 1 1 eines stark beeischen Anionenaaefeeuseherhareesi Diaion SA 21 A ( einen Produkt &·* Mitsubishi Kssti Kogyo K.K., Tokio, Japan), des ähnlich der la Beispiel 1 beschriebenen Weise zur G1-Form regeneriert war, gepackt war« Mach dem Auswaschen mit Waeier wird daa B«tt Alt 50 1 ·ine* 0,03 Mol GaOl₂-OjOI *» HCi*2iö6ttag eluiert, am durch dteee Eluierung Verunreinigungen, wie ä*1« levirn-eononucleotid tu entfernen. Dann wird das Harcbiti, aa? w#A»h··

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. nur Flavin-Adenin-Dinucleotid durch Adsorption zurückgehalten ist, mit es. 2 1 Wasser gewaschen, um die Ca-Ionen zu beseitigen, und anschließend wird das Flavin-Adenin-Dinucleotid, durch eine 1 Mol NaCl - 0,05 η HCl-Lösung eluiert. Bas Eluat . , läßt man 1 1 eines Harzbettee eines phenolischen Kationenaustauscherharzes - Duolite C-10 -,' welches zur Na-Form regeneriert war, passieren. Dabei wird lediglich das Flavin-Adenin-Dinucleotid auf dem Harz aasorbiert. Dieses eluiert man mit reinem . < Wasser, und konzentriert das Elupt unter reduziertem. Druck bei einer Temperatur unter 40⁰G auf 50 mg/ml Flavin-Adenin-Dinueleotid. Durch einer· doppelten Volumenzusetz an Aceton ™ kristallisiert man aus dem Konzentrat ein Natriumsalz des Flavin-Alenin-Dinuoleotids« Die so erhaltenen 40 g Natriumsalz des Flavin-Adenin-Dinucleotids haben eine !Reinheit von 97»3 % und enthalten absolut kein Flavin-mononucleotid eier dgl.

Beispiel ~$

5 S ^es gleichen !räp?rats wie r<ech jeispiel 2 v/erden i.n

1 1 Vis ε s er C₃ si Ost und 2:. einem Liter eines stark-basischen AnioneneustsuEcherharzes, nüxilich Amberlice IRA-411 ( einem Produkt eier Rohffi ·- Haas £0., USA)» das 'ihnlich der in Beispiel

2 beschriebenen V/eise au seiner Cl-Form regeneriert war, adsorbiert. Kech dem Waschen mit V/a ε ε er v.'erden die Verunreinigungen mit 10 1 einer 0,0? Mol CeGl₂ - 0,001 η wässrigen HCl-Lösung eluiert und dann mit 5 1 einer 0,04 Hol CsGl₂ - 0,001 η HCl-Lösung behandelt. Das von. dem Harz adsorbierte Flavin-Adenin-Dinucleotid vird eluiert, entsalzt, konzentriert und kristallisiert. Ausbeute: 2,9 g eines NatriumsaIzes des Flavin-Adenin-Dinucleotids einer Reinheit von 98,6 %►

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Claims (1)

1. . ■■ 9

   Pa t entanspr liehe

   1. Verfahren zum Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid aus noch andere flavinhaltige Verunreinigungen enthaltenden Losungen durch.-Adsorption, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Rohlösung auf einen schwach sauren Pg-Wert eingestellt und durch ein stark basisches Anionenaustauseherharz geleitet wird, das Austauscherharz anschließend mit einer schwach sauren, wässrigen Salzsäurelösung, die eine relativ geringe Menge an Calciumchlorid gelöst enthält, zwecks Eluierung der verschiedenen Adenin-Mononucleotide und ggf. auch Nucleotide gewaschen und zum Schluß das Austauscher- i harz - zwecks Eluierung der adsorbierten Flavin-Adenin-Dinucleotide - nochmals mit einer wässrigen Salzsäurelösung gewaschen wird, die nun aber eine höhere Konzentration an Calciumchlorid, Natriumchlorid oder dgl„ enthält»

   2» Verfahren nach Anspruch 1, ...dadurch, gekennzeichnet, daß zur Adsorption ein stark basisches Anionenaustauseherharz verwendet wird, das in der Cl-Form vorliegt und in diese übergeführt worden ist.

   3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder.; 2, dadurch gekennzeichnet, daß aer ρ -Wert der wässrigen Salzsäurelösung auf ca. 4,0 eingestellt wird.

   4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß zur Eluierung der Verunreinigungen eine wässrige ca» 0,01 η Salzsäurelösung mit ca, 0,02 - 0,04 Mol Calciumchlorid verwendet wird. ·■"-■'

   ^. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Eluierung des Flavin-Adenin-Binucleotids eine wässrige 0,1 Ά SaIzsäurelösung, die 1 Mol Natriumchlorid enthält, oder eine wässrige 0,01 η Salzsäurelösung, die ca, 0,1 Mol Calciumchloril enthält, verwendet wird»

   bad-

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   6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-i>, daaarch gekennzeichnet, daii die Sluierung beendet ist, wenn die .,aschlösungen im ■,wesentlichen farblos sina und keine nennenswerte UV-Adsorption mehr zeigen.

   Dr· AiK?

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