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Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Polymyxin Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Antibiotika, welche unter
dem Namen Polymyxin bekannt sind.
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Die Polymyxine sind in Kulturflüssigkeiten, in welchen Stämme von
Bacillus polymyxa und Bacillus aerosporus gezüchtetworden sind, erzeugte Stoffwechselprodukte.
Es wurde nachgewiesen, daB sie aus eine Aminogruppe aber keine sauren Gruppen enthaltenden
Polypeptiden bestehen und daß sie unterschiedlich in ihrem Aminosäuregehalt und
ihren spezifischen physiologischen Auswirkungen sind. Die hier benutzte Bezeichnung
wird auf alle Mitglieder dieser Gruppe von Antibiotika angewendet.
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Es ist bereits vorgeschlagen worden, Polymyxin aus Kulturflüssigkeiten
durch Adsorption an Aktivkohle und nachfolgendes Auslaugen mit Hilfe eines wäBrigen
oder organischen, als Auslaugemittel dienenden Lösungsmittels zu gewinnen. Das anfallende
Polymyxin besitzt jedoch einen niedrigen Reinheitsgrad, und der Wirkungsfaktor des
Verfahrens ist gering. Ein weiterer Vorschlag ging dahin, das Polymyxin aus seinen
Lösungen mittels komplexer organischer Reagenzien
oder Farbstoffen
niederzuschlagen. Diese Reagenzien sind aber kostspielig, und ihre Wiedergewinnung
ist nicht leicht.
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Es wurde nun festgestellt, daß Polymyxin aus Kulturflüssigkeiten,
in welchen Stämme von Bacillus polymyxa oder Bacillus aerosporus gezüchtet worden
sind, durch Adsorption an Iönenaustauscher mit nachfolgendem Auslaugen gewonnen
werden kann.
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Dementsprechend ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung und
Reinigung von Polymyxin dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von
Polymyxin mit einem Ionenaustauscher in Berührung bringt, welches seine Austauscheigenschaft
von der Anwesenheit von Carboxylgruppen herleitet, wobei das Polymyxin an das Material
adsorbiert wird, und hernach das Material mit der Lösung eines Elektrolyts auslaugt,
wodurch das adsorbierte Polymyxin daraus entfernt wird.
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Die Verwendung von Ionenaustauschern bei der Gewinnung von Antibiotika
ist grundsätzlich bekannt. So hat man schon Calciumpenicillin in Natriumpenicillin
durch Behandlung mit kationenaustauschenden Harzen umgewandelt. Auch die Reinigung
von Penicillin mittels anionenaustauschender Harze ist bekannt. Auch die Reinigung
von Streptomycin mittels ionenaustauschender Harze mit Carboxylgruppen ist schon
durchgeführt worden. Streptomycin und Polymyxin unterscheiden sich aber voneinander
in grundsätzlicher Weise. Streptomycin enthält zwei Guanidingruppen und ist daher
eine sehr starke Base. Polymyxin andererseits ist eine Polypeptidverbindung und
wegen seiner schwachen Aminogruppen nur ein schwach basischer Körper. Während daher
die Adsorption des stark basischen SUreptomycins von einem schwach sauren ionenaustauschenden
Harz ohne weiteres vorausgesagt werden konnte, ist es völlig unerwartet, daß das
schwach basische Polymyxin von der gleichen Harzart in merklicher Weise adsorbiert
wird. Viel eher hätte angenommen werden können, daß wegen der schwachen Basizität
des Polymyxins die Verwendung eines stark sauren Harzes, z. B. eines sulfonsauren
Harzes, notwendig gewesen wäre. Tatsächlich haben aber Versuche mit solchen Harzen
gezeigt, daß sie beträchtlich weniger wirksam als die schwachen carbonsauren Harze
sind.
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Das Verhalten der zwei Antibiotika hinsichtlich der Adsorption durch
Harze von carbonsaurem Typ ist völlig verschieden. Mit Streptomycin werden die besten
Ergebnisse erhalten, wenn das Streptomycin von dem Harz bei einem neutralen oder
alkalischen p11-Wert - adsorbiert und bei einem mäßig sauren p11-Wert, z. B. 2 bis
3, ausgelaugt wird, während mit Polymyxin die besten Ergebnisse durch Adsorbieren
bei einem sauren p11-Wert und Auslaugen unter stärker sauren Bedingungen, z. B.
I bis 2, erhalten werden.
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Zweifelsohne mußte im Hinblick auf den verschiedenen chemischen Charakter
der beiden Antibiotika die Anwendung des für Streptomycin bekannten Verfahrens auf
Polymyxin völlig zwecklos erscheinen. Dieses berechtigte Vorurteil mußte überwunden
und das Wagnis der Übertragung unternommen werden, um zu dem völlig überraschenden
Ergebnis zu gelangen, daß eine schwach basische Verbindung von einem schwach sauren
ionenaustauschenden Harz adsorbiert wird.
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Ionenaustauschmittel, welche polare Carboxylgruppen enthalten, sind
in der Technik bekannt. Verschiedene Arten derselben sind in den USA.-Patentschriften
2 319 359, 2 333 754, 2 340 ==O, 2 340- rrI und anderen beschrieben worden und sind
dadurch charakterisiert, daß ihre Ionenaustauscheigenschaften sich von der Anwesenheit
von Carboxylgruppen im Molekül herleiten. Im allgemeinen werden diese Stoffe entweder
durch Mischpolymerisation einer polymerisierbaren Säure mit einer Divinylverbindung,
d. h. einer zwei CH, = CH-Gruppen besitzenden Verbindung, beispielsweise
durch Mischpolymerisation von Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Divinylbenzol oder
durch Kondensation eines Aldehyds mit einem Phenol, erzeugt, von welchen eine dieser
Verbindungen eine Carboxylgruppe enthält, insbesondere Formaldehyd und Resorcylsäure.
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Durch die Anwendung von diesen Stoffen wird sowohl eine erhebliche
Reinigung wie auch eine Konzentration des Polymyxins bewirkt, da nur wenige oder
gar keine nicht basische, in der Kulturflüssigkeit anwesende Verunreinigungen zugleich
mit dem Polymyxin adsorbiert werden. Es lassen sich hohe Gewinnungswirkungsgrade
erzielen und, da es möglich ist, die Ionenaustauscher viele Male wieder zu gebrauchen,
weist das Verfahren große wirtschaftliche Vorteile auf.
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Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist irgendeine
wäßrige Lösung von Polymyxin anwendbar. Geeignet ist die Kulturflüssigkeit, in welcher
der Bazillus gezüchtet worden ist, nachdem diese zweckmäßig zur Entfernung von Feststoffen
filtriert worden ist. Gegebenenfalls kann man die Flüssigkeit einer Vorreinigungsbehandlung
unterziehen, z. B. einer Hydrolyse, Klärung, Erhitzung und chromatographischen Adsorption.
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Die Adsorption an die Ionenaustauscher kann entweder in Absätzen oder
mittels einer Kolonne geschehen. Im ersten Falle bringt man die Masse in einem Mischgefäß,
z. B. einem mit Rührvorrichtung versehenen Tank, mit der Flüssigkeit in Berührung,
trennt sie hernach von der ausgezogenen Flüssigkeit, beispielsweise durch Filtrieren,
und gewinnt das Polymyxin durch Auslaugen. Die für eine maximale Adsorption des
Polymyxins aus einer bestimmten Konzentration desselben erforderliche Menge Austauscher
und die hierfür benötigte Zeit lassen sich leicht durch Versuche feststellen, wobei
man Standardmethoden für die Gehaltsbestimmung der Flüssigkeit zur Anwendung bringt.
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Bei der Benutzung der Iönenaustauscher in Kolonnen werden vorzugsweise
zwei oder mehr Kolonnen, welche mit dem Ionenaustauscher gefüllt sind, vorgesehen,
so daß die Flüssigkeit die Kolonnen nacheinander durchfließt. Die erste Kolonne
wird dann ausgesondert und ausgelaugt, wenn durch eine . Gehaltsbestimmung gefunden
wird, daß die Masse gesättigt ist und kein Polymyxin mehr aus der Flüssigkeit ädsorbiert.
Zusätzliche Kolonnen lassen sich am entgegengesetzten Ende des Systems nacheinander
anfügen in dem Maße, wie eine jede gesättigte
Kolonne zum Zweck
des Auslaugens ausgeschieden wird. Ein derartiges System ist in der Abb. i bildlich
dargestellt. Diese zeigt vier hintereinander angeordnete, mit Ionenaustauscher gefüllte
Kolonnen. Die Polymyxin enthaltende Flüssigkeit wird nach der Darstellung durch
das Ventil 5 in die Kolonne -- eingeführt und strömt durch die Kolonne und Ventil
6 in die Kolonne 3. Die erschöpfte Flüssigkeit verläßt die Kolonne durch Ventil
7. Die Ventile 8, g, 13 und 14 sind geschlossen. Kolonne i stellt eine mit Polymyxin
gesättigte Kolonne dar, welche von der übrigen Reihe abgesondert ist und dadurch
ausgelaugt wird, daß man ein Auslaugemittel durch Ventil ii einlaufen läßt und die
Polymyxin enthaltende Auslaugeflüssigkeit durch Ventil 12 abzieht. Ventil io ist
geschlossen. Kolonne 4 stellt eine wieder aufgefrischte Kolonne dar, welche dem
System wieder angeschlossen wird, sobald Kolonne 2 gesättigt ist, indem man die
Ventile g und 17 öffnet, während Ventile 15 und 16 geschlossen bleiben. Obgleich
das in Abb. i dargestellte System nur aus vier hintereinander angeordneten Kolonnen
besteht, ist die Anzahl nicht beschränkt. Diese Durchführungsart hat die Wirkung,
das Auslaugeprodukt zu reinigen und macht das Verfahren wirtschaftlicher. Bei der
Verwendung von einer einzigen Kolonne neigen die ausgelaugten Flüssigkeiten zur
Zurückhaltung eines höheren Prozentgehaltes Polymyxin. Der Durchfluß durch die Kolonnen
kann entweder von unten nach oben oder in umgekehrter Richtung vor sich gehen.
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Die Adsorption kann innerhalb einer pH-Spanne von 3,5 bis g vorgenommen
werden, wobei die Ionenaustauscher entweder als freie Säure oder in Gestalt ihrer
teilweise umgewandelten, leicht ersetzbaren Salze angewendet werden. Vorzugsweise
bewirkt man die Adsorption bei einem pff von ungefähr 4,5 bei Anwendung der Masse
als freie Säure. In diesem Falle läßt sich die Masse vor dem Gebrauch durch absatzweise
oder gegebenenfalls in Kolonnenbehandlung mit verdünnter Mineralsäure, bis der pH-Wert
der Suspension oder der austretenden Flüssigkeit ungefähr i oder 2 beträgt, und
nachfolgendes Auswaschen des Kunstharzes mit Wasser, bis der p$-Wert auf zwischen
3,5 bis 5 zurückgegangen ist, regenerieren. Wenn man die Masse in Gestalt des teilweise
umgewandelten, leicht ersetzbaren Salzes zur Anwendung zu bringen wünscht, kann
man sie vor dem Gebrauch dadurch auf die erforderliche p$ regenerieren, daß man
sie mit einer angepaßten Pufferlösung, z. B. von Natriumacetat/Essigsäure, behandelt.
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Vor dem Auslaugen des Polymyxins wäscht man die Masse vorteilhafterweise
mit geringen Mengen Wasser.
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Zum Auslaugen des adsorbierten Polymyxins aus den Ionenaustauschern
kann man sich im allgemeinen irgendeines Elektrolyts als Auslaugemittel bedienen.
Besonders geeignet hierfür haben sich verdünnte, wäßrige Lösungen von Mineralsäuren,
z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in einer Konzentration von etwa 1,5 normal
erwiesen. Gute Ergebnisse lassen sich auch durch Anwendung einer wäßrigen Lösung
von Calciumchlorid, z. B. ioprozentig, erzielen. Es soll jedoch bemerkt werden,
daß die Aufgabe der Auslaugung des Polymyxins aus den Ionenaustauschern keine besondere
Schwierigkeiten darbietet und daß die Auslaugung mit Hilfe irgendeines gewöhnlichen
Auslaugemittels, einschließlich z. B. von wäßrigen organischen Lösungen von Elektrolyten,
vorgenommen werden kann.
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Ebenso wie das Adsorptionsverfahren kann das Auslaugen des Polymyxins
aus den Ionenaustauschern absatzweise oder durch Kolonnen geschehen. Die bevorzugte
Methode des Auslaugens besteht in der Anwendung von Kolonnen, indem man verdünnte,
wäßrige Lösungen einer Mineralsäure durch die Kolonne im Kreislauf zirkulieren läßt,
wobei man weitere Mengen Mineralsäure zufügt, bis ein gleichmäßiger p],-Wert von
weniger als 3 und zweckmäßig von etwa 1,5 in dem ganzen System erreicht ist. Die
saure Auslaugeflüssigkeit, welche das Polymyxin in praktisch stöchiometrischen Verhältnissen
enthält, wird sodann schleunigst durch die Zugabe von verdünntem Alkali oder eines
basischen Ionenaustauschers auf ein p$ zwischen 4,5 und 7 gebracht.
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Die Auslaugung kann auch dadurch vorgenommen werden, daß man Mengen
des Auslaugemittels bei einer festgesetzten Konzentration durch die Kolonne laufen
läßt, oder durch ein absatzweises `erfahren. Im letzteren Falle besteht die bevorzugte
Methode darin, daß man die Masse in Wasser suspendiert und Mineralsäure zufügt,
bis das p$ der Suspension während etwa 2o Minuten bei einem Werte zwischen ungefähr
i und 3 konstant bleibt. Die Suspension wird sodann filtriert und das saure Filtrat
wie oben beschrieben neutralisiert.
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Nach dem Auslaugen kann man das Polymyxinkonzentrat für die Gewinnung
der reinen Substanz nach den in der Technik bekannten Methoden behandeln.
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Die folgenden Beispiele sollen die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens erläutern. Für die Bestimmung des Polymyxins wurde der willkürlich gewählte
Wellcome-standard benutzt, welcher dem reinen Material eine Wirkungskraft von io
ooo Einheiten per mg gibt. Beispiel i Eine Charge Ionenaustauscher obiger Bedingungen
wurde mit Schwefelsäure auf ein p$ o,8 regeneriert und mit Wasser gewaschen, bis
das p$ der Aufschlemmung 3,5 betrug. 50 ccm dieses Materials wurden in Absätzen
mit 2ooccm einer filtrierten Kulturflüssigkeit, inwelcher Bacillus polymyxa gezüchtet
worden war und welche nach der Analyse 77o Einheiten je ccm enthielt, gemischt.
Die Aufschlemmung des Ionenaustauschers und der filtrierten Flüssigkeit wurde 2o
Minuten gerührt und das pg der Mischung durch Zusatz von wäßriger Natriumbicarbonatlösung
auf 4,6 gehalten. Die Aufschlemmung wurde dann filtriert. Das anfaP lende Filtrat
(255 ccm) analysierte 55 Einheiten j e ccm, was ungefähr 8°/a Polymyxin in der Flüssigkeit
darstellt.
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Das Ionenaustauschkunstharz wurde darauf mit einer kleinen Menge Wasser
gewaschen, ehe man es in Wasser suspendiert. Sodann wurde Schwefelsäure zugesetzt,
bis das pH der Suspension 2o Minuten
konstant auf 1,2 stehenblieb.
Die Suspension wurde darauf filtriert und das Filtrat nach Einstellung des p$ auf
4,5 mittels wäßrigen Natriumbicarbonats analysiert. Es wurde ein Gehalt von 15?
72o Einheiten Polymyxin gefunden. Innerhalb der Fehlergrenze der Analyse wurde somit
das Polymyxin in theoretischer Menge aus dem Ionenaustauscher ausgelaugt.
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Beispiel 2 Der im Beispiel z in Umrissen geschilderte Vorgang wurde
bei einem pH-Wert während der Adsorption von 5,5 wiederholt. Von den 154
000 Einheiten Polymyxin, welche ursprünglich in dem Filtrat enthalten waren,
verblieben weniger als 88oo Ein-. heiten in dem ausgelaugten Filtrat. Nach dem Auslaugen
auf ein pg 1,2, wie oben beschrieben, analysierte die Auslaugefiüssigkeit 134 68o
Einheiten Polymyxin. Die Auslaugewirksamkeit betrug daher 93%._ Beispiel 3 Eine
1,35 hohe und 15 cm weite Kolonne wurde mit 4,5 kg eines Ionenaustauschkünstharzes
obiger Bedingungen gefüllt. Das Kunstharz wurde durch Umlaufenlassen von wäßriger
Schwefelsäure, bis ein konstantes p$ 2 in der ausfließenden Flüssigkeit erreicht
war, vorbereitet. Die Kolonne wurde dann mit Wasser gewaschen, bis das abfließende
Wasser auf p$ 4,5 zurückgekehrt war.
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3z81 einer hydrolysierten Kulturflüssigkeit, in welcher Bacillus polymyxa
gezüchtet worden war, welche ein p$ 4,5 besaß und ungefähr 5oo Einheiten je ccm
analysierte, wurden von unten nach oben mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa
4,51 in der Minute durch die Kolonne fließen gelassen. Die Ablauge von der Kolonne
analysierte 22o Einheiten je ccm. Unter gewöhnlichen Umständen würde man diese weiteren
Kolonnen zuführen.
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Somit waren z2o ooo ooo Einheiten an den Ionenaustauscher adsorbiert,
mit dem sodann zwei Auslaugeoperationen vorgenommen wurden. Jede Auslaugung bestand
darin, daß man 45,51 Wasser durch die Kolonne umlaufen ließ und dauernd konzentrierte
Schwefelsäure zugab, bis ein unveränderliches p$ erreicht wurde.' Die erste Auslaugung
wurde bis zu einem unveränderlichen pH 2 ausgeführt. Nach Einstellung des p$ auf
4,5 mit Alkali analysierte das Eluat 83 000 000 Einheiten Polymyxin. Die
zweite Auslaugung geschah bis zu einem unveränderlichen pn =, und nach Einstellung
des pH-Wertes auf 4,5 mit Alkali analysierte die Lösung 29 ooo ooo Einheiten Polymyxin.
Somit waren zzz ooo ooo Einheiten Polymyxin insgesamt ausgelaugt worden, was eine
Wirksamkeit von 93,7 °/° ausmacht. Die Reinheit des gewonnenen Materials, bezogen
auf die Bestimmung der gesamten festen Stoffe, ließ eine zehnfache Zunahme der Reinheit
von derjenigen in der hydrolysierten Flüssigkeit zu, der in dem Eluat mit p$ 4,5
erkennen.
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Obwohl diese Beispiele nur die Benutzung von Schwefelsäure als Auslaugemittel
schildern, werden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse mit anderen Auslaugemitteln,
beispielsweise -wäßriger, verdünnter Salzsäure, zehnprozentiger wäßriger Calciumchloridlösung
und im allgemeinen Lösungen von Elektrolyten, einschließlich wäßriger organischer
Lösungen von solchen Elektrolyten erhalten.