CH659713A5 - Spezifisches bindungs-testverfahren und reagenszusammensetzung zur durchfuehrung dieses verfahrens. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein spezifisches Bin-dungs-Testverfahren zur Bestimmung einer Substanz in einem flüssigen Medium. Die zu bestimmende Substanz wird von einem Bindungspartner für diese Substanz, der als Ligand bezeichnet wird, spezifisch gebunden.

Bei diesem spezifischen Bindungstestverfahren wird die Substanz in dem flüssigen Medium bestimmt, indem das flüssige Medium

(a) mit einem markierten Konjugat zusammengebracht wird, das eine markierende Substanz, gekuppelt an den Liganden oder ein Bindungsanaloges desselben enthält und

(b) mit einem spezifischen Bindungspartner des Liganden zusammengebracht wird und wobei diese markierende Sub-s stanz in der erhaltenen Reaktionsmischung bestimmt wird und in Beziehung zu dem Liganden in dem flüssigen Medium gebracht wird.

Beim erfindungsgemässen Verfahren wird als markierende Substanz Flavin-Adenin-dinucleotid verwendet und der io Reaktionsmischung wird Apoglucose-oxidase zugesetzt. In der Reaktionsmischung tritt dann eine Rekombination des als markierende Substanz dienenden Falvin-Adenin-dinu-cleotides mit der Apoglucose-oxidase auf und die dabei erhaltene Glucose-oxidaseaktivität wird gemessen.

is Des weiteren betrifft die Erfindung eine Reagenzzusammensetzung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, welche die folgenden Bestandteile enthält:

(a) ein markiertes Konjugat, welches eine markierende Substanz, gekuppelt an den Liganden, oder ein Bindungsana-

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(b) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden.

In dieser erfindungsgemässen Reagenzzusammensetzung ist wiederum die markierende Substanz Flavin-Adenin-dinu-cleotid, und die Reagenzzusammensetzung enthält zusätzlich 25 noch Apoglucose-oxidase, die in der Lage ist, sich mit dem als markierende Substanz dienenden Flavin-Adenin-dinucleotid zu verbinden, wobei sich aktive Glucose-oxidase bildet.

Bei den bisher üblichen spezifischen Bindungs-Testver-fahren wird die zu testende Probe mit Reagenzmitteln ver-30 schiedener Zusammensetzungen zusammengebracht, wobei diese ein Konjugat enthalten, welches eine feststellbare Markierungskomponente und eine Bindungskomponente aufweist, welche an Reaktionen mit anderen Bestandteilen des Reagenzmittels teilnimmt, sofern solche überhaupt vor-35 handen sind, und zwar unter Bildung eines Bindungsreak-tionssystemes, welches zwei Spezien oder zwei Formen des markierten Konjugates liefert, und zwar eine gebundene Spezies und eine freie Spezies. Die relative Menge oder der Anteil des markierten Konjugates, das in der gebundenen 40 Spezies gebildet wird, im Vergleich zu der freien Spezies ist eine Funktion der Anwesenheit oder der Menge des Liganden, der in der Testprobe festgestellt werden soll.

Zur Illustration wird eine übliche konkurrenzierende oder kompetitive Bindungstesttechnik nun beschrieben. Bei 45 einem derartigen Arbeitsverfahren enthält das Reagenzmittel

1. ein markiertes Konjugat in der Form des festzustellenden Liganden, beispielsweise ein Antigen oder ein Hapten, wobei ein derartiger Ligand die bindende Komposo nente des Konjugates darstellt, die chemisch an die Markierungskomponente gebunden ist, und

2. einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, beispielsweise einen Antikörper.

Wenn man die Testprobe und das Reagenzmittel zusammen-55 bringt, dann stehen der festzustellende Ligand und die Bindungskomponente des markierten Konjugates in einer im wesentlichen nicht diskriminierenden Art in Konkurrenz gegenüber der nicht kovalenten Bindung an den spezifischen Bindungspartner. Das Ergebnis davon kann entweder die 60 Menge von markiertem Konjugat, das an den Bindungspartner gebunden wird, (d.h. dasjenige Material, das in der gebundenen Spezies vorliegt) gemessen werden, oder es kann auch diejenige Menge gemessen werden, die frei bleibt (d.h. die ungebunden an den Bindungspartner vorliegt, und 65 dementsprechend in Form der freien Spezies vorliegt). Die gemessene Menge in der freien Spezies, bzw. in der gebundenen Spezies, ist eine Funktion der Menge an dem im Wettstreit stehenden Liganden der anwesend ist. Die Menge an

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markiertem Konjugat, die in einer der beiden Spezien vorliegt, wird durch Messung bestimmt, nämlich dadurch, dass man die darin enthaltene Menge an Markierungskomponente bestimmt.

Wenn das markierte Konjugat in der gebundenen Spezies und dasjenige in der freien Spezies im wesentlichen durch diejenigen Mittel ununterscheidbar sind, die verwendet werden um die Markierungskomponente festzustellen, dann müssen die gebundene Spezies und die freie Spezies physikalisch voneinander getrennt werden, um diesen Prüftest zu vervollständigen. Diese Art von Test wird in der Literatur als «heterogener Test» bezeichnet. Wenn jedoch die Formen der gebundenen Spezies und der freien Spezies des markierten Konjugates voneinander unterschieden werden können,

dann kann ein «homogenes», gebildetes Material verfolgt werden, und in diesem Fall kann ein Trennschritt vermieden werden.

Der zuerst gefundene Typ eines hoch-empfindlichen spezifischen Bindungstyps war das ràdioimmunologische Testverfahren, bei dem ein radioaktives Isotop als Markierungskomponente eingesetzt wurde. Ein derartiges Testverfahren muss notwendigerweise in der heterogenen Weise, also nach dem heterogenen Format, ablaufen weil der feststellbare Charakter der Markierung in qualitativer Weise unverändert in der freien Spezies und der gebundenen Spezies vorliegt. Aufgrund der Unannehmlichkeit und Schwierigkeit bei der Behandlung von radioaktiven Materialien wurden viele neue Testsysteme entwickelt, bei welchen andere Materialien als Markierungskomponente eingesetzt werden, als radioaktive Isotope, wobei Beispiele für derartige andere Materialien Enzyme, fluoreszierende Moleküle, Bakteriophagen,

Metalle, organometallische Komplexe, Coenzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, cyclische Reaktanten und chemiluminiszente Reaktanten sind. Dabei versteht man unter cyclischen Reaktanten solche Reaktanten, die an cycli-schen Reaktionen teilnehmen, in denen ein Reaktant (1) in einer ersten Reaktion reagiert, wobei sich ein Produkt bildet, welches ein Reaktant (2) ist, der in einer zweiten Reaktion oder nachfolgenden Reaktion unter Regenerierung des Reaktanten ( 1 ) reagiert und diese Reaktion in cyclischer Weise immer weiterläuft.

In den folgenden Veröffentlichungen werden verschiedene unterschiedliche heterogene Bindungsreaktionssysteme beschrieben, bei welchen ein Enzym als Markierungskomponente eingesetzt wird, nämlich in den USA-Patentschriften Nr. 3,654,090, Nr. 3,791,932, Nr. 3,839,153, Nr. 3,850,752 und Nr. 3,879,262, sowie ferner in den Zeitschriften «J. Immunol. Methods 1:247 (1972)» und «J. Immunol. 109:129 (1972)». Ein heterogener Bindungstest, bei dem ein nicht aktiver Vorläufer einer spektrophotometrisch feststellbaren Substanz als markierende Substanz verwendet wird, wird in der USA-Patentschrift Nr. 3,880,934 vorgeschlagen. Des weiteren sei zur näheren Erläuterung des Hintergrundes der vorliegenden Erfindung auf die heterogenen Testverfahren hingewiesen, die in der Veröffentlichung «Principles of Competitive Pro-tein-Binding Assays» von Odell und Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972) beschrieben sind.

Ein Enzymmarkierungs-Immunotest des homogenen Typs wird in der USA-Patentschrift Nr. 3,817,834 beschrieben, und in diesem Test wird ein Ligand-Enzym-Konjugat verwendet. Die enzymatische Aktivität des Konjugates in der gebundenen Spezies ist messbar geringer als diejenige in der freien Spezies, wobei dadurch ein Test nach dem homogenen Format verwendet werden kann. Die Verwendung von speziellen einzigen Materialien als markierende Substanzen, zu denen Coenzyme, chemiluminiszente Moleküle, cyclische Reaktanten und spaltbare fluoreszierende Enzymsubstrate gehören, sowohl beim homogenen Format als auch beim heterogenen Format, sind in den deutschen Patentschriften Nr. 2,618,419 und Nr. 2,618,511 der Firma Miles Laboratories beschrieben.

Obwohl die Suche nach anderen Markierungsmitteln als radioaktive Isotope bei Bindungstests zu einer Anzahl von nacharbeitbaren Lösungen geführt hat, so sind immer noch Verbesserungswünsche vorhanden. Die Versuche auf Basis von Enzymmarkierungen erschienen anfänglich am vielversprechendsten, jedoch traten in der Praxis verschiedene Schwierigkeiten zuTage. Das hohe Molekulargewicht und die heterogene Natur der Enzyme führen zu Problemen bei der Charakterisierung, bei der Stabilisierung und auch bezüglich der Reproduzierbarkeit bei der Herstellung der markierten Konjugate. Diese Probleme wurden dadurch überwunden, indem man Enzymmarkierungen durch Markierungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht ersetzte, welche durch ihre Reaktantaktivität messbar sind. Zu diesen neuen Markierungengehören Coenzyme, Enzymsubstrate, cyclische Reaktanten und chemiluminiszente Reaktanten, und diese neuen markierenden Materialien können verwendet werden, um Tests mit hoher Empfindlichkeit und weitem Anwendungsbereich zu entwickeln. Zur Feststellung und Messung derartiger Markierungsmittel werden jedoch oft instrumentalische Ausrüstungen benötigt, die bisher üblicherweise in klinischen Laboratorien nicht vorhanden sind.

Dementsprechend war es ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ein Bindungstestverfahren auf anderer Basis als von radioaktiven Isotopen zu entwickeln, bei dem ein neues Markierungsmittel angewandt wird, welches mit einer in klinischen Laboratorien vorliegenden Standardausrüstung festgestellt werden kann, während dennoch die Vorteile einer Reaktantenmarkierung bezüglich der Empfindlichkeit, der Anpassbarkeit und der Leichtigkeit der Synthese, sowie der Feststellung des markierten Konjugates aufrecht erhalten werden.

Es zeigte sich überraschenderweise, dass man ein verbessertes spezifisches Bindungstestverfahren durchführen kann, indem man als markierende Substanz Flavin-Adenin-dinu-cleotid verwendet, wobei die Eigenschaft dieser markierenden Substanz, die in der Reaktionsmischung bestimmt wird, dadurch bestimmt wird, dass man ferner Apoglucose-oxidase zusetzt und die erhaltene Glucose-oxidase-Aktivität misst, die sich in der Reaktionsmischung durch die Rekombination des als markierende Substanz dienenden Flavin-Adenin-dinucleotides und der Apoclucose-oxidase gebildet hat.

Die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzte markierende Substanz, nämlich das Flavin-Adenin-dinucleotid, ist eine organische prosthetische Gruppe und der Rest dieser organischen prosthetischen Gruppe wird also als Markierungskomponente in dem markierenden Konjugat verwendet.

Prosthetische Gruppen sind eine in der Literatur bekannte Klasse von Enzym-Cofaktoren. Ein Enzym-Cofaktor ist dabei eine nicht-proteinische Substanz, deren Anwesenheit nötig ist damit ein Enzym seine katalytische Aktivität zeigen kann, und die eine chemische Veränderung während des katalytischen Zyklusses des fraglichen Enzymes (dieses wird als Eltern-Enzym bezeichnet) erleidet. Ein Coenzym ist eine solche Art eines Enzym-Cofaktors, die chemisch während der Reaktion verändert wird, die durch das Eltern-Enzym katalysiert wird. Eine Regeneration der ursprünglichen Form des Cofaktors benötigt dessen Teilnahme an einer getrennten Reaktion, die durch ein anderes Enzym katalysiert wird als das Eltern-Enzym. Im Gegensatz dazu ist eine prosthetische Gruppe ein Enzym-Cofaktor, der chemisch im Verlauf derjenigen Reaktion modifiziert wird, die durch das

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Eltern-Enzym katalysiert wird, und die durch eine zweite Reaktion welche von dem gleichen Eltern-Enzym katalysiert wird wieder regeneriert wird, d.h. in ihre ursprüngliche Form zurückverwandelt wird.

Prosthetische Gruppen zeichnen sich üblicherweise dadurch aus, dass sie in relativem Massstab fest gebunden an den Proteinteil des Eltern-Enzyms sind, wobei ein derartiger Proteinteil als Apoenzym bezeichnet wird, und das kataly-tisch aktive Eltern-Enzym als Holoenzym bezeichnet wird. Die Gleichgewichtsreaktion für die Wechselwirkung zwischen einer prosthetischen Gruppe und dem Apoenzym kann anhand der folgenden Reaktion veranschaulicht werden:

Prosthetische Gruppe + Apoenzym ^ konjugiertes Enzym oder Holoenzym (Pr) (Apo) (Pr-Apo)

In der vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Ausdruck «konjugiertes Enzym» auf den Komplex der gebildet wird, indem man die prosthetische Gruppe mit dem Apoenzym kombiniert, wobei diese Bezeichnung unabhängig davon ist ob ein derartiger Komplex eine katalytische Aktivität zeigt oder keine derartige katalytische Aktivität besitzt. Andererseits wird mit dem Ausdruck «Holoenzym» nur ein katalytisch aktives konjugiertes Enzym bezeichnet.

Weitere Informationen bezüglich prosthetischer Gruppen, deren Eigenschaften und deren Wechselwirkungen mit Apoenzymen können dem Buch «Enzyme» von Dixon und Webb, 1. Ausgabe, Longmans, Green & Co. (London 1958) entnommen werden.

Um das erfindungsgemässe Testverfahren durchführen zu können wird eine markierende Substanz, nämlich eine organische prosthetische Gruppe, an den Liganden oder ein Bindungsanaloges desselben gekuppelt, wobei sich ein markiertes Konjugat bildet, das im Bindungstest verwendet wird. Ein ganz wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die so erhaltene Wechselwirkung zwischen der konjugierten prosthetischen Gruppe und dem Apoenzym, und diese Wechselwirkung kann anhand des folgenden Schemas erläutert werden:

O-Pr + Apo — 0-Pr-Apo Katalytisch nicht- Aktiver Holoenzym-

aktive Komponenten komplex

Obwohl die oben veranschaulichte Reaktion die normalerweise festgestellte Wechselwirkung ist, sei vorweggenommen, dass unter bestimmten Umständen der konjugierte Enzymkomplex geringe oder keine Holoenzym-Aktivität zeigen wird, wie dies der Fall ist wo eine Konjugation der prosthetischen Gruppe die normale Holoenzym-Substrat-Wechselwirkung verhindert. Markierte Konjugate, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können trotzdem entstehen, wenn nach dem Binden der Liganden oder des Bindungsanaloges desselben (diese werden in dem obigen Schema durch das Symbol O veranschaulicht) der konjugierten prosthetischen Gruppe in der Test-Bindungsreaktion der gebundene konjugierte Enzymkomplex dann eine Holoenzym-Aktivität zeigt, wie dies der Fall ist wo eine derartige Bindung die Hemmung der Holo-enzy m-Substrat-W echselwirkung beseitigt.

Es gibt viele mögliche Schemen zur Messung oder Bestimmung der Markierung, und einige dieser Schemen werden in der Folge näher beschrieben. Diese Schemen können nach irgendeiner der verschiedenen bekannten homogenen Bindungsmethoden oder heterogenen Bindungsmethoden verlaufen. In allen Fällen jedoch enthält die Markierungskomponente des markierten Konjugates, welches an der Bindungsreaktion teilnimmt, einen Rest einer organischen prosthetischen Gruppe, und im Zuge des Feststellungs-Schemas oder Bestimmungs-Schemas wird die Markierungskomponente in der gebundenen Spezies oder in der freien Spezies, oder in beiden diesen Spezien bestimmt, je nach dem jeweiligen Fall, und zwar basierend auf der Bestimmung der Aktivität des Holoenzyms.

Beim erfindungsgemässen Verfahren handelt es sich um ein kompetitives Bindungstestverfahren, in dem als markierende Substanz Flavin-Adenin-dinucleotid verwendet wird, und zwar in Kombination mit Apoglucose-oxidase, wobei in der Reaktionsmischung dann eine Rekombination des Flavin-Adenin-dinucleotides mit der Apoglucose-oxidase auftritt und man so eine Glucose-oxidase-Aktivität erhält, die gemessen wird, beispielsweise nach einem kolorimetrischen Arbeitsverfahren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein spezifisches Bindungstestverfahren zur Bestimmung einer Substanz, die als Ligand bezeichnet wird und die von einem Bindungspartner für diese Substanz spezifisch gebunden wird, in einem flüssigen Medium, wobei das flüssige Medium

(a) mit einem markierten Konjugat zusammengebracht wird, das eine markierende Substanz, gekuppelt an den Liganden oder ein Bindungsanaloges desselben enthält und

(b) mit einem spezifischen Bindungspartner des Liganden zusammengebracht wird und wobei diese markierende Substanz in der erhaltenen Reaktionsmischung bestimmt wird und in Beziehung zu dem Liganden in dem flüssigen Medium gebracht wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz Flavin-Adenin-dinucleotid ist und dass diese in der Reaktionsmischung bestimmt wird, indem man Apoglucose-oxidase der Reaktionsmischung zusetzt und die erhaltene Glucose-oxidase-aktivität misst, die in der Reaktionsmischung durch die Rekombination des als markierende Substanz dienenden Flavin-Adenin-dinucleotides mit der Apoglucose-oxidase gebildet wurde.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Glucose-oxidase-Aktivität durch ein kolorimetrisches Arbeitsverfahren gemessen.

Wenn der beim erfindungsgemässen Verfahren teilnehmende Ligand ein Antigen oder ein Hapten ist, dann soll der bindende Partner ein Antikörper dafür sein. Speziell bevorzugt ist der Ligand ein Hapten, das ein Molekulargewicht im Bereich von 100-10,000 aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Reagenzzusammensetzung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, welche die folgenden Bestandteile enthält:

(a) ein markiertes Konjugat, welches eine markierende Substanz, gekuppelt an den Liganden, oder ein Bindungsanaloges desselben enthält,

(b) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden. Diese Reagenzzusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz Flavin-Adenin-dinucleotid ist und dass die Reagenzzusammensetzung zusätzlich noch Apoglucoseoxidase enthält, die in der Lage ist, sich mit dem als markierende Substanz dienenden Flavin-Adenin-dinucleotid zu verbinden, wobei sich aktive Glucose-oxidase bildet.

Beim erfindungsgemässen Bindungs-Testverfahren ist also die prosthetische Gruppe der Rest des Flavin-Adenin-dinucleotides und das Paar aus dem Rest der prosthetischen Gruppe und dem Apoenzym ist Flavin-adenin-dinucleotid gepaart mit Apoglucose-oxidase. Das Holoenzym, das sich durch die Rekombination des Flavin-adenin-dinucleotides mit der Apoglucose-oxidase gebildet hat, ist leicht feststellbar, indem man bekannte Wasserstoffperoxid-Messtech4

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niken anwendet, zu denen colorimetrische Methoden und fluorimetrische Methoden gehören. Aufgrund der katalyti-schen Natur des festgestellten Holoenzymes wird die Anwesenheit der Markierungskomponente um ein Vielfaches bei der Feststellungsreaktion vergrössert, sodass eine hoch-empfindliche Feststellung des zu testenden Liganden möglich ist, indem man relativ unempfindliche, jedoch leicht erhältliche und einfache Instrumente verwendet, wie zum Beispiel Spek-trophotometer. Die Niveaus, in denen der festzustellende Ligand bei diesem Test noch bestimmt werden kann, liegen bei ng/ml. Durch die Kombination der Möglichkeit das Molekül einer prosthetischen Gruppe mit niedrigem Molekulargewicht als Komponente zu verwenden durch welche die Markierung an die bindende Komponente in dem markierten Konjugat gekuppelt ist, und die Möglichkeit eine hoch-empfindliche Messung mit einem Spektrophotometer durchzuführen, und zwar insbesondere eine colorimetrische Messung, führen dazu, dass der erfindungsgemässe spezifische Bindungstest in einzigartiger Weise vorteilhaft ist.

Der erfindungsgemässe Test zeichnet sich durch eine sehr hohe Empfindlichkeit der Feststellungsgrenzen aus und dadurch, dass er leicht an eine automatische Testauswertung anpassbar ist, indem es möglich ist das Markierungsmittel mit solchen Instrumenten zu messen, aufzuzeichnen und zu überwachen, die üblicherweise in klinischen Laboratorien zu finden sind, und indem man markierte Konjugate verwendet, die in reproduzierbarer Weise und relativ leicht synthetisiert werden können.

Beim erfindungsgemässen Bindungs-Testverfahren wird diejenige Substanz, die bestimmt werden soll, als «Ligand» bezeichnet. Die Anwesenheit dieses Liganden oder Menge dieses Liganden soll in einem flüssigen Medium bestimmt werden.

Das flüssige Medium wird mit einem markierten Konjugat zusammengebracht, das eine markierende Substanz, gekoppelt an den Liganden oder ein «Bindungsanaloges des Liganden» enthält.

Unter dem Ausdruck «Bindungsanaloges des Liganden» oder «spezifisches Bindungsanaloges des Liganden» ist eine beliebige Substanz oder eine Klasse von Substanzen zu verstehen, die sich im wesentlichen in der gleichen Weise verhalten wie der Ligand, und zwar bezüglich der Bindungsaffinität des spezifischen Bindungspartners gegenüber dem Liganden.

Beim erfindungsgemässen spezifischen Bindungs-Testverfahren ist die markierende Substanz Flavin-Adenin-dinucleotid, das in der Folge auch mit «FAD» bezeichnet wird.

Wie bereits erwähnt wurde, wird bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens der Reaktionsmischung Apoglucoseoxidase zugesetzt und durch die Rekombination des als markierende Substanz dienenden Flavin-Adenin-dinucleotide und der Apoglucose-oxidase erhält man eine Glucose-oxidase-Aktivität, die gemessen wird, beispielsweise durch ein kolorimetrisches Arbeitsverfahren.

Unter «Überwachungsreaktion» oder «Messreaktion» versteht man diejenige Reaktion, bei welcher das als markierende Substanz dienende Flavin-Adenin-dinucleotid bestimmt wird, und zwar indem man die Glucose-oxidase-Aktivität misst.

Unter «Niederalkyl» versteht man eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe, welche 1 bis einschliesslich 6 Kohlenstoffatome aufweist, und Beispiele für derartige Gruppen sind die Methylgruppe, die Äthylgruppe, die Iso-propylgruppe, die Butylgruppe, die Pentylgruppe und die Hexylgruppe.

Das erfindungsgemässe spezifische Bindungs-Testverfahren kann zur Bestimmung beliebiger Liganden herangezogen werden, die von einem Bindungspartner für diese Liganden spezifisch gebunden werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Testverfahrens ist der Ligand üblicherweise ein Peptid, ein Protein, ein Kohlehydrat, ein Glycoprotein, ein Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für welches ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens ist der Ligand ein Antigen oder Hapten und der bindende Partner ein Antikörper für dieses Antigen oder Hapten.

Der Ligand kann bezüglich seiner Wirkungsweise und seiner Funktionalität üblicherweise aus derjenigen Gruppe von Materialien ausgewählt werden, welche die folgenden Komponenten umfasst : Antigene oder Antikörper gegenüber diesen Antigenen, Haptene, bzw. Antikörper gegenüber denselben, Hormone, Vitamine, Stoffwechselprodukte, Abbauprodukte (Metaboliten), pharmakologische Mittel, sowie die entsprechenden Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Spezielle Beispiele für Liganden, die unter Verwendung der erfindungsgemässen Tests bestimmt oder festgestellt werden können, sind Hormone wie zum Beispiel Insulin, Choriongo-nadotropin, Schilddrüsenhormone (Thyroid-Hormone), Oestriol, sowie ferner Antigene und Haptene wie zum Beispiel Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine, sowie tumorspezifische Antigene; Vitamine wie zum Beispiel Biotin, Vitamin B12, Folsäure, Vitamin E, Vitamin A und Ascorbinsäure; sowie ferner Stoffwechselprodukte oder Abbauprodukte, also Metaboliten, wie zum Beispiel 3' ,5'-Adenosin-monophos-phat und 3',5'-Guanosin-monophosphat; pharmakologische Mittel und Drogen wie zum Beispiel krampflösende Mittel (Anticonvulsatoren), Bronchien-erweiternde Mittel (Bron-chiodilatatoren), Mittel die auf das Herz und das Gefäss-System einwirken (kardiovaskulare Mittel) und Drogen, die missbraucht werden (Suchtmittel) ; sowie ferner Antikörper wie zum Beispiel Mikrosomen-Antikörper (mikrosomale Antikörper und Antikörper gegenüber Hepatitis und Allergenen; sowie spezifische Bindungsrezeptoren wie zum Beispiel Thyroxin-bindendes Globulin, Avidin, Intrinsic Factor (ein thermolabiles Micro-proteid, das in einem Teil der Magenschleimhaut gebildet wird) ; und Transcobalamin. Die erfindungsgemässen Testverfahren sind insbesondere geeignet um Haptene und deren Analogen festzustellen, die ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 1000 besitzen, und insbesondere sind sie geeignet zur Bestimmung der jodthyro-ninen Schilddrüsenhormone, Thyroxin und Liothyronin.

Das flüssige Medium, das getestet werden soll, kann eine natürlich vorkommende oder eine künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, die im Verdacht steht den Liganden zu enthalten, und üblicherweise ist es eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit die durch eine Verdünnung oder eine andere Behandlung aus einer derartigen biologischen Flüssigkeit entstanden ist. Biologische Flüssigkeiten, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren getestet werden können, sind beispielsweise Serum, Plasma, Harn, Speichel, Fruchtwasser (amniodische Flüssigkeit) und cerebrospinale Flüssigkeiten. Andere Materialien, wie zum Beispiel festes Material, beispielsweise Gewebe, können getestet werden indem man sie in eine flüssige Form überführt, beispielsweise indem man den Feststoff in einer Flüssigkeit löst, oder indem man eine Flüssigkeitsextraktion des Feststoffes vornimmt.

Markierte Konjugate

Beim erfindungsgemässen spezifischen Bindungstestverfahren enthält das markierte Konjugat als markierende Substanz Flavin-Adenin-dinucleotid, wobei dieses markierte Konjugat durch die folgende schematische Formel

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wiedergegeben werden kann.

In dieser schematischen Formel bedeutet FAD den Rest des Flavin-Adenin-dinucleotides,

R ist die verbindende Gruppe oder Bindungsgruppe und L ist die Bindungskomponente des markierten Konjugates, also entweder der Ligand oder ein Bindungsanaloges des Liganten.

Üblicherweise sind die Bindungskomponente L und der Rest des Flavin-Adenin-dinucleotides FAD mit Hilfe der verbindenden Gruppe oder Bindungsgruppe R an einer Stelle der zuerst genannten gebunden, die sich entfernt von ihrer spezifischen Bindungsstelle befindet. D.h. also, die Lage der Bindungskomponente welche an der getesteten Bindungsreaktion teilnimmt, wie zum Beispiel eine immunochemische Bindungsstelle, bei der die bindende Komponente ein Antigen oder ein Antikörper gegenüber demselben ist, soll sich entfernt von derjenigen Stelle befinden wo die verbindende Gruppe R die entsprechende Bindung oder Verknüpfung bewirkt. Ferner soll die verbindende Gruppe R auch an eine Stelle des Restes der prosthetischen Gruppe gebunden sein, die sich entfernt von deren aktiven Bindungsstelle für das Apoenzym befindet.

Test-Verfahren

Bei dem erfindungsgemässen Test-Verfahren wird der FAD-Rest als Markierungskomponente überwacht, bzw. gemessen, indem man ein Apoenzym im wesentlichen gleichzeitig mit der Bindungsreaktion oder nach dem Beginn der Bindungsreaktion zusetzt, d.h. also entweder während der Bindungsreaktion oder nachdem die Bindungsreaktion das Gleichgewicht erreicht hat, und indem man die Aktivität des Holoenzymes in der endgültigen Reaktionsmischung misst.

Dieser Test ist durch die Auswahl an Bedingungen homogen, indem nämlich die Bindung des Apoenzymes an den FAD-Rest für das FAD in der gebundenen Spezies gehemmt wird.

Die Bedingungen können jedoch auch so ausgewählt werden, dass das Apoenzym sich an die Form der gebundenen Spezies des markierten Konjugates binden kann, aber der erhaltene konjugierte Enzymkomplex zeigt keine enzy-matrsche Aktivität, und zwar deshalb weil eine Hemmung der Enzym-Substrat-Wechselwirkung auftritt. In jedem der beiden Fälle ist die Gesamtmenge an Enzymaktivität, die in dem System bestimmt wird, das Ergebnis einer ungehemmten Bindung des Apoenzymes an das frei markierte Konjugat, und dementsprechend eine direkte Funktion der Menge des Liganden aus der Probe der zur Verfügung steht, um eine Konkurrenzierung der Bindung an den bindenden Partner hervorzurufen.

Bei der homogenen Arbeitstechnik, d.h. bei der Arbeitstechnik, bei der es nicht nötig ist, eine physikalische Trennung der gebundenen Spezies und der freien Spezies vorzunehmen, verursacht die Reaktion zwischen der bindenden Komponente des markierten Konjugates und einem entsprechenden Bindungspartner eine messbare Veränderung. Diese kann entweder im positiven Sinn oder im negativen Sinn auftreten, und zwar in der Fähigkeit der FAD-Markierungskom-ponente des markierten Konjugates an der zu überprüfenden oder zu messenden Reaktion teilzunehmen, beispielsweise in der Fähigkeit des markierten Konjugates sich mit dem Apoenzym zu vereinigen.

In einem derartigen Fall kann die Verteilung der FAD-Markierungskomponente zwischen der gebundenen Spezies und der freien Spezies bestimmt werden, ohne dass man eine

Trennung der Spezien vornimmt. Die Aktivität des Holoenzymes in der Reaktionsmischung wird dann bestimmt,

indem man in mindestens einem Teil der Reaktionsmischung, die chemische Reaktion, die durch ein derartiges Holoenzym katalysiert wird, ablaufen lässt, beispielsweise indem man ein Substrat zugibt und nach irgendwelchen üblichen Verfahrensweisen die Geschwindigkeit oder die aggregierte Menge der Bildung des Produktes, oder den Verbrauch eines Reaktionsteilnehmers misst. Wenn eine qualitative Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium vorgenommen werden soll, dann vergleicht man die gemessene Quantität mit derjenigen einer Vergleichsreaktion in einem flüssigen Medium in dem der fragliche Ligand nicht vorhanden ist. Irgendein Unterschied bei diesen beiden Bestimmungen zeigt dann an, dass ein derartiger Ligand in der getesteten Flüssigkeit vorhanden ist. Bei einer quantitativen Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium muss man die gemessene Menge mit derjenigen von Vergleichsreaktionen vergleichen, die unter Verwendung von flüssigen Medien durchgeführt wurden, welche bekannte Mengen an dem Liganden enthalten, beispielsweise indem man einen Vergleich mit einer Eichkurve vornimmt.

Wenn man eine homogene Test-Technik vornimmt, dann können im allgemeinen die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion, d.h. das flüssige Medium bei dem der Verdacht herrscht, dass es den Liganden enthält, das markierte Konjugat und ein spezifischer Bindungspartner des Liganden miteinander in beliebigen Mengen, in beliebiger Art und in beliebiger Reihenfolge vereinigt werden, vorausgesetzt, dass die Aktivität der FAD-Markierungskomponente des markierten Konjugates in messbarer Weise geändert wird, wenn das flüssige Medium den fraglichen Liganden in einer Menge oder einer Konzentration enthält, die für den Zweck des Testes von Bedeutung ist. Vorzugsweise sind alle Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion in dem flüssigen Medium löslich.

Bekannte Veränderungen oder Variationen der oben kurz beschriebenen homogenen Methoden, und weitere Einzelheiten bezüglich der hier diskutierten spezifischen Techniken, einschliesslich alternativer Techniken die als die direkte Bindungstechnik bekannt sind, sind in der Literatur leicht zu finden, und es sei in diesem Zusammenhang beispielsweise auf die deutsche Offenlegungsschrift 2,618,611 verwiesen.

Verbindende Gruppe oder Bindungsgruppe

Es ist bekannt, dass viele Methoden zur Verfügung stehen, um die Bindungskomponente des markierten Konjugates, beispielsweise den Liganden, der bestimmt werden soll, oder ein Bindungsanaloges desselben oder einen Bindungspartner desselben, an das FAD zu binden. Der jeweilige chemische Charakter der verbindenden Gruppe oder Bindungsgruppe hängt von der Natur der jeweils auf der Bindungsgruppe und dem Flavin-Adenin-dinucleotid, also dem FAD, zur Verfügung stehenden Bindungsstellen ab.

Die wesentlichen Betrachtungen, die bei der Auswahl der Bindungsstellen berücksichtigt werden müssen, sind üblicherweise die folgenden:

1. Die Bewahrung der Fähigkeit der gebundenen Bindungskomponente in wirksamer Weise an dem ausgewählten Bindungstestsystem teilzunehmen, und

2. die Bewahrung der Fähigkeit des gebundenen FAD-Restes, sich mit dem Apoenzym zu vereinigen.

In beiden Fällen sind diese Betrachtungen dahingehend wichtig, dass ein nützlicher Test für den jeweiligen zu testenden Liganden entwickelt wird, und für die jeweiligen Konzentrationen oder Mengen in welchen ein derartiger

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Ligand festgestellt werden muss. Üblicherweise wird die verbindende Gruppe eine chemische Bindung umfassen, und zwar üblicherweise eine einfache Bindung, aber manchmal auch eine Doppelbindung, oder auch eine Kette, die 1-14, und vorzugsweise 1 -6 Kohlenstoffatome aufweist, und 0 bis s 5, vorzugsweise 1-3 Heteroatome besitzt, welche aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind.

Beide Komponenten, nämlich das FAD und die Bindungskomponente, bieten natürlich eine grosse Vielzahl von zur io Verfügung stehenden Funktionalitäten für die Bindung an die verbindende Gruppe oder Bindungsgruppe. Im allgemeinen sind die Funktionalitäten von denen man erwarten kann, dass sie für die verbindende Gruppe zur Verfügung stehen, Aminogruppen und zwar üblicherweise primäre 15 Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Halogenatome und zwar üblicherweise Chloratome oder Bromatome, Carbonsäuregruppen, Aldehydgruppen, Ketogruppen, Isothiocyanat-gruppen, Isocyanatgruppen und weitere derartige Gruppierungen. Dementsprechend kann die chemische Struktur der 20 verbindenden Gruppe selbst in weiten Bereichen variieren, wobei die entsprechenden Endgruppen von den Funktionalitäten abhängen, die bei dem FAD zur Verfügung stehen, und die bei der Bindungskomponente zur Verfügung stehen. Die Gesamtlänge der chemischen Struktur der verbindenden 25 Gruppe ist eine Sache der Auswahl, wobei die Grundgesichtspunkte hiefür sind, dass man den wesentlichen Charakter des FAD und der Bindungskomponente bei dem so erhaltenen Konjugat aufrecht erhalten muss. Bezüglich der Länge der verbindenden Gruppe oder Bindungsgruppe 30 bei der Herstellung eines Konjugates, das in einem homogenen Testformat eingesetzt werden soll, ist es üblicherweise wünschenswert eine möglichst kurze Gruppe auszuwählen, wobei diese Gruppe so kurz sein darf, dass sie gerade nicht dazu führt dass die erhaltene Bindungskomponente in dem Konjugat wesentlich die Aktivität des FAD des Konjugates stört oder beeinträchtigt. Wenn die Bindungskomponente ein niedriges Molekulargewicht aufweist, und beispielsweise ein Hapten eines Molekulargewichtes im Bereich zwischen 100 und 1000 ist, dann ist die verbindende Gruppe oder verknüpfende Gruppe vorzugsweise eine chemische Bindung oder eine Kette, die 1-6 Atome umfasst, wie zum Beispiel eine niedere Alkylkette, eine Carbonylgruppe, eine Alkylcarbonyl-gruppe, eine Amidogruppe, eine Alkylamidgruppe oder eine ähnliche Gruppierung. Unteranderen Umständen, beispiels- 45 weise dann wenn die bindende Komponente in dem Konjugat ein relativ hohes Molekulargewicht besitzt, wie dies bei einem Polypeptid oder einem Protein, beispielsweise einem Antikörper, der Fall ist, dann ist üblicherweise eine längere verbindende Gruppe oder verknüpfende Gruppe wünschens- so wert um zu verhindern, dass eine sterische Hinderung der sich mit dem Apoenzym verbindenden Stelle des Konjugates auftritt. In diesen Fällen wird die verbindende Gruppe oder verknüpfende Gruppe üblicherweise 1-10 Kohlenstoffatome u nd 0-5 Heteroatome aufweisen, wie dies weiter vorne 55 bereits erläutert wurde. Ketten die irgendeine wesentlich grössere Länge aufweisen führen manchmal zu Konjugaten, in welchen die Bindungskomponente die Neigung besitzt sich zurückzufalten in die Nähe der Stellen für die Verbindung mit dem Apoenzym. 60

Unter Berücksichtigung der obigen Betrachtungen sind Beispiele für verbindende Gruppen oder verknüpfende Gruppen diejenigen, die in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt sind. Spezielle Beispiele für verbindende 65 Gruppen werden in der Folge auch noch angegeben, und weitere Variationen bezüglich dieser Gruppe können leicht aus dem Stande der Technik entnommen werden.

Tabelle 1

Verbindende Gruppe prosthetische Gruppe

35

-R1-

X

II

-R'-C-R2-X

II

-R'-C-X-R2-X

II

-R'-X-C-R2-X

-R'-X-C-X-R2 X X -C-R'-C--R'-X-R2--X-R1--R'-X--X-R'-X-

Bindungs-komponente

40

In den oben angegebenen verbindenden Gruppen bedeutet : X eine Iminogruppe, ein Schwefelatom oder vorzugsweise ein Sauerstoffatom, und

R1 und R2 sind unabhängig voneinander niedere Alkylenreste mit 1 -6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel ein Methylenrest, ein Äthylenrest, ein Isopropylenrest, ein Butylenrest oder ein Hexylenrest.

Apoenzym

Das Apoenzym oder der Proteinteil des Holoenzymes, bei dem jedoch das FAD fehlt, wird hergestellt indem man das konjugierte Enzym spaltet und das so freigesetzte Apoenzym-Protein isoliert. Die Spaltung des konjugierten Enzymes kann in einer Vielzahl von bekannten Arbeitsweisen vorgenommen werden, beispielsweise indem man das Enzym in eine stark saure Lösung einbringt, beispielsweise eine solche deren pH-Wert unter 2 liegt. In gleicher Weise kann die Gewinnung des Apoenzymes durch eine Vielzahl von bekannten Arbeitstechniken erfolgen, wozu eine selektive Fällung des Proteines oder eine selektive Absorption des freigesetzten FAD mit niedrigem Molekulargewicht gehört.

Veröffentlichte Methoden zur Isolierung der Apoenzyme stehen zur Verfügung, und insbesondere im Zusammenhang mit der Apoglucose-oxidase sei auf die Veröffentlichung in Biochim. Biophys. Acta. 175:365 (1969), und im Zusammenhang mit der Apoperoxidase auf die Veröffentlichungen im J. Biol. Chem. 206:109 (1953) und Arkiv. Kemi, Min. O. Geol. 148:1 (1940) hingewiesen.

Wenn die Möglichkeit auftritt, dass eine Störung in dem Test aufgrund der Anwesenheit von endogenen Flavin-Adenin-dinucleotid, also endogenen FAD, auftritt, wobei

659713

8

dieses endogene FAD in der Probe oder in irgendeinem der Reagenzien vorliegen kann, oder aufgrund der Anwesenheit von FAD als Verunreinigung in den eingesetzten Geräten, beispielsweise der Laboratoriumsausrüstung, der eingesetzten Glaswaren, oder Plastikprodukte, dann können diese störenden Mengen an FAD leicht beseitigt werden, indem man zur Verfügung stehende Inaktivierungstechniken anwendet. Beispielsweise kann eine Störung durch das Flavin-Adenin-dinucleotid, die in der Folge als FAD-Störung abgekürzt wird, beseitigt werden, indem man nacheinander eine Behandlung mit Perjodatlösungen und Äthylenglycol-Lösungen durchführt, oder indem man andere Techniken zur Inaktivierung von Flavin-Adenin-dinucleotid durchführt.

Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Homogene Bindungstests für N-2',4'-Dinitrophenyl-6-aminocaproat.

A) Herstellung des markierten Konjugates N6-(6-Amino-hexyl)-dinitrophenyl-flavin-adenin-dinucleotid.

Herstellung des Flavin-N6-aminohexyl-adenin-dinucleo-tides.

Es wurde das N6-Trifluoracetamidohexyl-adenosin-5'-monophosphat nach dem Verfahren hergestellt, das von Trayer et al. im Biochem. J. 139:609 (1974) beschrieben ist.

56 mg (0,1 mMol) an dem N6-Trifluoracetamido-hexyl-ade-nosin-5'-monophosphat wurden in etwa 10 ml Wasser gelöst, und 25 Mikroliter (abgekürzt als «jj.1») (0,1 mMol) an Tri-n-butylamin wurden zugegeben. Das Wasser wurde dann unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 10 ml an trok-kenem Dimethylformamid (abgekürzt als DYF) gelöst, und dieses wurde dann unter Vakuum entfernt. Der dabei erhaltene Rückstand wurde noch drei weitere Male aus trockenem Dimethylformamid abgedmapft. Der so erhaltene endgültige Rückstand wurde in 10 ml trockenem Dimethylformamid gelöst. 80 mg (0,5 mMol) an N,N'-Carbonyldiimidazol wurden zugegeben, und man liess 1 Vi Stunden lang reagieren. Dann wurden 15 [xl an Wasser zugegeben, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das als Rückstand erhaltene (N6-T rif luoracetamidohexyl-adenosin-5 ' -mono-phosphat-imidazolid) wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst.

47 mg (0,1 mMol) an Riboflavin-5'-monophosphat wurde in etwa 10 ml Wasser gelöst, und man setzte tropfenweise zu 20 ml Aceton zu, welches 43 p.1 (0,1 mMol) an Tri-n-octyl-amin enthielt. Dabei bildete sich ein Niederschlag ehe die Zugabe vollständig war. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer entfernt, bis sich das Riboflavin-5 monophosphat gelöst hatte. Dann wurden 5 ml Aceton und 5-10 ml an Dimethylformamid zugegeben, und die Mischung wurde bis zur Trockene abgedampft. Anschliessend wurde dann der Rückstand in 15-20 ml an trockenem Dimethylformamid aufgelöst und wieder zur Trockene abgedampft und dieser Arbeitsvorgang wurde dann noch dreimal wiederholt. Der Rückstand wurde dann in 5 ml Dimethylformamid aufgelöst, und mit der oben erwähnten Lösung von 10 ml des Imidazolides in Dimethylformamid vereinigt.

Man liess die erhaltene Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und entfernte dann das Lösungsmittel. Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser aufgenommen und auf eine Säule der Grösse 2,5 x 25 cm aufgetragen, die DEAE-Zellulose in der Bicarbonatform enthielt (das Produkt Whatman DE23, Reeve Angel, Clifton, New Jersey USA). Das Chromatogramm wurde mit einem linearen Gradienten entwickelt, der mit 2 Litern Wasser und 2 Litern an 0,3-molarem Ammoniumbicarbonat hervorgerufen wurde, und es wurden 23 ml Fraktionen aufgefangen.

Die Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (das Pro-5 dukt Silicagel 60 F254 der Firma E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) unter Verwendung einer Mischung aus 7 Volumina Äthanol +3 Volumina 1-molarem Triäthylammoniumbicarbonat als Entwicklungsmittel, die einen pH-Wert von 7,5 aufwies, zeigte dass die Fraktionen »o die mit 68-73 numeriert waren einen Hauptanteil eines Produktes mit einem Rr-Wert von 0,75 und einen geringeren Anteil des Produktes mit einem Rr-Wert von 0,36, die gelbe Verbindungen waren, enthielten. Diese Fraktionen wurden miteinander vereinigt und das optische Absorptionsspek-15 trum zeigte Maxima bei 267,373 und 450 Nanometern (nm).

Das Lösungsmittel wurde aus dem vereinigten Material entfernt und der Rückstand wurde in etwa 5 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wurde durch Zugabe von 5-normaler Natriumhydroxydlösung auf 11,0 eingestellt, und 20 man liess die Lösung 9 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen. Die Dünnschichtchromatographie zeigte, dass die Komponente mit dem Rr-Wert von 0,75 dabei verschwand, während ein neues gelbes Material mit einem Rr-Wert von 0,37 neu entstand. Der pH-Wert der Reaktionsmischung 25 wurde dann durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf 8,0 eingestellt, und das Material wurde auf eine Säule der Dimension 2,5 x 20 cm aufgetragen, die mit DEAE-Zellulose in der Bicarbonatform gefüllt war. Das Chromatogramm wurde entwickelt, indem man eine lineare Gradientenent-30 wicklung durchführte, und zwar mit 1 Liter Wasser und 1 Liter 0,2-molarem Ammoniumbicarbonat. Die aus der Säule austretenden gelben Lösungen wurden miteinander vereinigt und das Lösungsmittel entfernt. Der dabei erhaltene Rückstand wurde auf 2 g Silicagel absorbiert, und dieses Material 35 brachte man oben auf eine 50 g Säule von Silicagel auf, welches mit einer Mischung aus 9 Volumina Äthanol + 2 Volumina 1-molarem Triäthylammoniumbicarbonat (pH-Wert = 7,5) ins Gleichgewicht gebracht worden war. Diese Säule wurde eluiert unter Verwendung einer Mischung 40 aus 8 Volumina Äthanol +2 Volumina 1-molarem Triäthylammoniumbicarbonat (pH-Wert = 7,5), und die gelbe Komponente, deren Rr-Wert bei 0,37 lag, wurde aufgefangen und das Lösungsmittel entfernt. Die Ausbeute, basierend auf der Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm war etwa 10%.

45

Herstellung von N6-(6-Aminohexyl)-dinitrophenyl-flavin-adenin-dinucleotid.

Der wie oben hergestellte Rückstand, der das Flavin-N6-aminohexyl-adenin-dinucleotid enthielt, wurde gereinigt 50 indem man eine Chromatographie auf Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) vornahm. Auf eine Säule der Grösse 0,9x30 cm, die mit 25 millimolarer Natriumbicarbonatlösung eines pH-Wertes von 7,5 bei Zimmertemperatur ins Gleichgewicht gebracht worden war, 55 wurde 1 ml einer etwa 10 millimolaren Lösung des N6-FAD-Derivates in Wasser aufgebracht. Der zuerst eluierte Peak eines Materiales, das bei einer Wellenlänge von 450 nm absorbierte wurde aufgefangen, und dieses Material wurde erneut auf Sephadex G-10 chromatographiert, und wieder 6o wurde der zuerst eluierende Peak aufgefangen.

0,5 ml (0,63 LiMol) des gereinigten N6-FAD-Derivates in 25 mMol Natriumbicarbonat eines pH-Wertes von 7,5 wurden mit 2 ml an Äthanol vermischt, und es wurden 10 p.1 an 3H-Dinitrofluorbenzol in Äthanol zugegeben (6,3 uMoI, es 50 |j,Ci). Das hier verwendete tritierte Dinitrofluorbenzol wurde vom radiochemischen Zentrum in Amersham, GB, erhalten. Die Reaktionsmischung wurde kontinuierlich über Nacht in der Dunkelheit bei Zimmertemperatur geschüttelt.

9

659 713

und dann wurde sie auf eine Säule der Grösse 0,9 x 30 cm aufgetragen, die mit Sephadex G-10 gefüllt war, welches mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0, oder 0,1% Natriumazid enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Ein einzelner Peak eines Materiales, das bei 450 nm absorbierte, wurde aufgefangen, und es zeigte sich, dass dieser 8% der radioaktiven Markierung enthielt.

B) Herstellung der Apoglucose-oxidase.

Gereinigte Glucose-oxidase mit einer geringen Katalase-Aktivität wurde von der Forschungsprodukt-Abt. der Firma Miles Laboratories, Inc., Elkart, Indiana USA, erhalten, und dieses Material wurde zweimal 12 Stunden lang gegen 0,5% Gewicht :Volumen (w:v) (3 Volumina jeweils) dialysiert. Aliquote Anteile des Dialysates, die jeweils 100 mg an Glucose-oxidase enthielten, wurden lyophilisiert und bei -20°C gelagert.

200 mg Rinderserum-albumin wurden in 12 ml Wasser gelöst, dessen pH-Wert mit konzentrierter Schwefelsäure auf 1,6 eingestellt war, und man vermischte mit 150 mg Aktivkohle (nämlich der Qualität RIA der Firma Schwarz-Mann, Orangeburg, New York USA) und kühlte auf 0°C. 100 mg der lyophilisierten Glucose-oxidase wurden in 3,1 ml Wasser wieder aufgelöst, und man gab 3 ml davon zu der gerührten Suspension von Albumin und Aktivkohle und rührte noch 3 Min. lang weiter. Dann filtrierte man die Suspension durch ein 0,8 Mikron Millipore Filter der Millipore Corp., Bedford, Massachusetts USA, welches einen Durchmesser von 25 mm besass und welches in einer Filtrierapparatur, nämlich dem Sweenex filter apparatus der Millipore Corp., auf einer 50 ml fassenden verfügbaren Kunststoff-Injektionsspritze montiert war. Das Filtrat wurde rasch auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert, indem man 2 ml einer 0,4 molaren Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,6 zusetzte, und anschliessend eine 5-normale Natriumhydroxidlösung. 150 mg an trok-kener Aktivkohle wurden dann zugesetzt, und man rührte 1 Stunde lang bei 0°C. Die erhaltene Suspension wurde zuerst durch ein 0,8 Millipore Filter und dann durch ein 0,22 Mikron Millipore Filter filtriert. Zu dem Filtrat setzte man Glycerin zu 25 Volumen-% pro Volumen zu, und das stabilisierte Apoglucose-oxidase-Präparat wurde bei 4°C gelagert.

C) Test-Reagenzien.

1. Markiertes Konjugat:

Nf>-(6-Aminohexyl)-DNP-FAD wurde in einem 0,05-molaren Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 bis zu einer Konzentration von 118 nM verdünnt.

2. Apoenzym:

Apoglucose-oxidase wurde mit 0,1-molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0, der 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, bis zu einer Konzentration von 958 nM FAD-Bin-dungsstellen verdünnt. Die Konzentration an FAD-Bin-dungsstellen des Apoenzympräparates wurde experimentell bestimmt, indem man die minimale Menge an FAD bestimmte die benötigt wurde um maximale Glucose-oxidase-Aktivität zu liefern, wenn man sie mit dem Apoenzym in Berührung hielt, d.h. bebrütete.

3. Antiserum:

Antiserum gegen ein Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin-Konjugat wurde von der Firma Miles-Yeda, Ltd., Rehevot, Israel erhalten, und es wurde 31-fach in 0,1-molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 verdünnt, welcher 0,1% an Rinderserum-albumin enthielt.

4. Standardlösungen:

Die Lösungen zur Standardisierung enthielten bekannte Konzentrationen an N-2',4'-Dinitrophenyl-6-aminoca-proate, und sie wurden in einem 0,05-molaren Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 hergestellt.

5. Überwachungs-Reagenzien:(Messreagenzien)

Ein Glucose-oxidase-Reagenz wurde hergestellt, indem man 45 ml eines 0,1-molaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0, der 15 mMol an Äthylendiamin-tetra-Essigsäure, 9 ml an 11,5 millimolarem 3,5-Dichlor-2-hydro-xybenzolsulfonat in Wasser, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0 unter Verwendung von Natriumhydroxid, 9 ml an 11,5 millimolarem 4-Aminoantipyrin in Wasser, enthaltend 1,25 mg/ml an Peroxidase (das Produkt der Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana USA) und 6 ml einer 1,0 molaren Glucose in wässriger gesättigter Benzoesäurelösung.

D) Testverfahren:

1. Zugabe des Apoenzymes vor dem Beginn der Bindungsreaktion.

Methode Nr. 1 :

Die folgenden Materialien wurden nacheinander in getrennte Cuvetten gegeben:

0,1 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung,

0,1 ml der Antiserumlösung,

2,0 ml des Überwachungs-Reagenz (Nachweisreagenz), und 0,1 ml der Apoenzymlösung.

Jede Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang bei 30°C belassen und die Absorption bei 520 nm bestimmt.

Methode Nr. 2:

Die folgenden Materialien wurden nacheinander in getrennte Cuvetten eingebracht:

0,1 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung,

0,1 ml der Antiserumlösung, und 0,1 ml der Apoenzymlösung.

Jede Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur bebrütet, und dann wurde 2,0 ml des Nachweisreagenzes zu jeder zugesetzt. Nach einer weiteren Bebrütung während 15 Minuten bei 30°C wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Cuvette bestimmt.

2. Zugabe des Apoenzymes nach dem Beginn der Bindungsreaktion.

Methode Nr. 3:

Die in der Folge angegebenen Materialien wurden nacheinander in getrennte Cuvetten eingebracht :

0,1 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, und 0,1 ml der Antiserumlösung.

Jede der Reaktionsmischungen wurde 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur belassen (bebrütet), und dann wurden 2,0 ml des zur Feststellung dienenden Reagenses und 0,1 ml der Apoenzymlösung zu jeder Probe gegeben. Dann wurde weitere 30 Minuten lang bei 30°C bebrütet, und die Absorption bei 520 nm wurde in jeder Cuvette gemessen.

Methode Nr. 4:

Die in der Folge angegebenen Materialien wurden nacheinander in getrennte Reaktions-Cuvetten gegeben : 0,1 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, und 0,1 ml der Antiserumlösung.

Jede Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur belassen, und dann wurden 0,1 ml der Apoenzymlösung zu jeder Reaktionsmischung zugesetzt. Nach einer weiteren Verweilzeit von 20 Minuten wurden 2 ml des Anzeigereagenses zu jeder Cuvette zugesetzt. Dann

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

659 713

10

wurde jede Reaktionsmischung 15 Minuten lang bei 30°C bebrütet, und die Absorption bei 520 nm wurde in jeder Cuvette bestimmt.

E) Resultate.

In der folgenden Tabelle 2 werden die Resultate der 4Test-verfahren bei der Bestimmung des N-2',4'-Dinitrophenyl-6-aminocaproates angegeben. Die Konzentrationen an dem N-2',4'-Dinitrophenyl-6-aminocaproat werden als Konzentrationen in den endgültigen Reaktionsmischungen eines Volumens von 2,35 ml ausgedrückt. Die Resultate für die Absorption werden als der Durchschnitt von Doppelversuchen ausgedrückt, wobei Korrekturen für die restliche Enzymaktivität und die Hintergrund-Absorption in den Reagenzien angebracht werden. Der Korrekturfaktor wird für jede Testmethode am Ende der Tabelle 2 angegeben, und er wurde festgestellt indem man experimentelle Versuche durchführte, in denen ein 0,1 molarer Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 für alle die Lösungen, und zwar markiertes Konjugat, Standard und Antiserum, ersetzt wurde.

Tabelle 2

Konzentration an Korrigierte durchschnittliche Absorption

N-2',4'-Dinitrophenyl-6-amino bei 520 nm caproat(nM)

Methode Methode Methode Methode

Nr. 1

Nr. 2

Nr. 3

Nr. 4

1021

0,274

1,089

0,205

1,399

511

0,263

0,992

0,197

1,302

255

0,235

0,898

0,187

1,136

128

0,221

0,689

0,173

0,958

64

0,194

0,545

0,155

0,737

32

0,165

0,365

0,134

0,534

16

0,141

0,276

0,133

0,353

8

0,134

0,225

0,122

0,257

4

0,122

0,193

0,104

0,229

2

0,123

0,187

0,109

0,215

0

0,107

0,171

0,101

0,199

Korrekturfaktor

0,241

0,108

0,216

0,108

Diese in der Tabelle 2 angegebenen Resultate zeigen, dass die vorliegende Erfindung eine spezifische Bindungs-Testme-thode des homogenen Typs darstellt, bei welcher das Apoenzym entweder vor oder nach dem Beginn der Bindungsreaktion eingeführt wird.

Beispiel 2

Heterogener Bindungs-Test für Thyroxine.

A) Herstellung des markierten Konjugates N6-(2-Amino-äthyl)-thyroxin-flavin-adenin-dinucleotid

Herstellung von

6-(2-Amijioäthyl)-amino-9-(2' ,3 ' -0-isopropyl-iden-ß-D-ribofuranosyl)-purin :

13,56 g (41,5 mMol) an dem 6-Chlor-9-(2',3'-0-isopropyl-iden-ß-D-Ribofuranosyl)-purin, das in der Veröffentlichung von Hampton et al. im J. Am. Chem. Soc. 83:150 (1961) beschrieben ist, wurden unter Rühren während eines Zeitraumes von 15 Minuten zu einem gekühlten Überschuss von 75 ml an 1,2-Diaminoäthan zugegeben. Man liess die erhaltene Lösung bei Zimmertemperatur während 24 Stunden stehen. Dann wurde die Lösung im Vakuum eingedampft und das erhaltene gelbe Öl mit 50 ml kalter gesättigter Natri-

umbicarbonatlösung gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum abgedampft, und der erhaltene Rückstand wurde weiter mehrmals hintereinander im Vakuum eingedampft, und zwar zuerst dreimal aus je 50 ml Wasser und dann viermal aus je 50 ml 2-Propanol, wobei man schliesslich 15 g eines gelben glasartigen Produktes erhielt. Ein Anteil von 3 g des glasartigen Produktes wurde durch eine Säule der Dimension 2,5 x 55 cm geleitet, die mit dem Kationenaustauscher Dowex 50W-X2 in seiner Ammoniumform beschickt war. Dieser Kationenaustauscher ist von den Bio-Rad Laboratories, Richmond, California USA, erhältlich.

Die Säule wurde eluiert indem man einen Linear-Gra-dienten anwandte, der unter Verwendung von 2 Liter Wasser und 2 Liter einer 0,5-molaren Ammoniumbicarbonatlösung erzeugt wurde. Die Elution wurde dann vervollständigt, indem man einen Linear-Gradienten verwendete, der aus je 2 Litern einer 0,5-molaren und einer 1-molaren Ammoniumbicarbonatlösung erzeugt wurde. Das aus der Kolonne austretende Material wurde in Fraktionen zu 15 ml aufgefangen, und die Elution wurde durch Dünschichtchromatographie auf Silicagelplatten der Firma E. Merck, Darmstadt, BRD, überprüft, wobei man als Laufmittel eine Mischung aus 9 Volumina Äthanol +1 Volumen Ammoniumhydroxid verwendete. Die entwickelten Dünnschichtplatten wurden unter dem ultravioletten Licht geprüft und dann mit Ninhydrinrea-gens (s. die Veröffentlichung von Randerath in «Thin Layer Chromatography», Academic Press (1966)) besprüht. Die Fraktionen mit den Nummern 250 bis 350, die aus der Chromatographiesäule austraten, wurden miteinander vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wobei man als Rückstand das erwünschte Purin in Form eines blassgelben, amorphen, glasartigen Produktes in einer Menge von 1,5 g erhielt.

Die Elementaranalyse dieses Produktes der Summenformel C15H22N6O4 zeigte die folgenden Werte:

berechnet : C = 51,42 ; H = 6,33 ; N = 23,99 gefunden :C = 50,92; H = 6,54; N = 23,01

Das kernmagnetische Resonanzspektrum, unter den Aufnahmebedingungen : 60 MHz, CDCb ergab :

6 1,37 (s, 3H, Isopropyliden), 1,63 (s, 3H, Isopropyliden), 5,92 (d, 1H, l'-Ribose), 7,90 (s, 1H, Purin), 8,26 (s, 1H,

Purin).

Die optische Drehung, aufgenommen in Methanol, (c = 1,0) lieferte das folgende Ergebnis :[a][,0 = -74,85°.

12 g des zurückgebliebenen Rohproduktes wurden durch Chromatographie auf einer mit Dowex 50W-X2 gefüllten Säule nach der oben beschriebenen Weise gereinigt. Die Gesamtausbeute betrug schliesslich 8 g, entsprechend 55% der Theorie.

Herstellung von a-(N-Trifluoracetyl)-amino-ß-[3,5-dijodo-4-(3',5'-dijodo-4'-hydroxyphenoxy)-phenyl]-propionsäure.

Diese Verbindung wurde nach dem Arbeitsverfahren hergestellt, das von Blank in J. Pharm. Sei. 53:1333 ( 1964) beschrieben ist. Zu einer auf 0°C gerührten Suspension von 5 g (6,4 mMol) an L-Thyroxin, das von der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri USA erhältlich ist, in 60 ml trok-kenem Essigsäureäthylester gab man 11,5 ml an Trifluores-sigsäure und 1,9 ml an Trifluoressigsäure-anhydrid zu. Nach 30 Minuten wurde die erhaltene klare Lösung dreimal mit 30 ml Wasser gewaschen, einmal mit 30 ml 5-prozentiger Natri-umbicarbonatlösung und zweimal mit 50 ml gesättigter Kochsalzlösung. Die vereinigten wässrigen Waschlösungen wurden zweimal mit 20 ml Essigsäureäthylester ausgeschüttelt. Die Essigsäureäthylesterschichten wurden miteinander vereinigt und mit 30 ml Wasser gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung im

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

659 713

Essigsäureäthylester wurde unter Vakuum abgedampft,

wobei ein weisser Feststoff als Rückstand zurückblieb.

Dieser wurde aus einer Mischung von Äthyläther und Petrol-äther umkristallisiert, wobei man 3,95 g (entsprechend einer Ausbeute von 70,5% der Theorie) eines weissen Feststoffes mit rosa Farbstich erhielt, der einen Zersetzungsschmelzpunkt von 228-230°C aufwies.

Die Elementaranalyse dieses Produktes der Summenformel C17H10F3I4NO5 ergab die folgenden Werte :

berechnet; C = 23,39;H= 1,15;N = 1,60 gefunden: C = 23,00; H = 1,05;N = 1,65

Das kernmagnetische Resonanzspektrum, Aufnahmebedingungen: 60 MHz, DCON(CD3)2, ergab:

8 7,28 (s, 2H, aromatisch), 8,03 (s, 2H, aromatisch), 9,7 (m, Amido).

Das Infrarotspektrum, aufgenommen in KCl, zeigte die Absorption für >C = 0 bei 1700.

Die optische Drehung, aufgenommen in Dimethylsul-foxid, c = 1,0, ergab [a]" = -14,97°.

Bei einem zweiten Umkristallisieren erhielt man 0,95 g eines zweiten Niederschlages, der einen Zersetzungschmelzpunkt von 224-228°C aufwies. Die Gesamtausbeute an Produkt betrug so 87,5% der Theorie.

Herstellung von N-(2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3',5,5'-tetrajodo-thyronyl]-aminoäthyl)-2' ,3 ' -0-isopropyliden-adenosin.

Eine Lösung von 8,72 g (10,0 mMol) an a-(N-Trifluor-acetyl)-amino-ß-[3,5-dijodo-4-(3',5'-dijodo-4'-hydroxyphen-oxy)-phenyl]-propionsäure und 3,86 g (11,0 mMol) an 6-(2-Aminoäthyl)-amino-9-(2',3'-0-isopropyliden-ß-D-ribofura-nosyl)-purin in 50 ml an trockenem Dimethylacetamid wurde hergestellt, indem man eine trockene Argonatmosphäre bei einer Temperatur von -20°C anwandte. Zu dieser kalten gerührten Lösung setzte man eine Lösung von 3,04 g ( 11,0 mMol) an Diphenylphosphorylazid, das von der Firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin USA, erhältlich ist, in 10 ml an trockenem Dimethylacetamid zu, und anschliessend erfolgte dann die Zugabe von 1,6 ml (11,0 mMol) an trockenem Triäthylamin. Die Lösung wurde 22 Stunden lang bei Zimmertemperatur belassen. Dann setzte man diese Lösung tropfenweise zu 300 ml an kaltem Wasser einer Temperatur von 0°C unter Rühren zu. Dabei erhielt man einen weissen Niederschlag der abfiltriert wurde und unter Vakuum bei einer Temperatur von 56°C getrocknet wurde. Nach dem Trocknen lagen 13,0 g eines leicht crème gefärbten Feststoffes vor.

Dieser Feststoff wurde in 500 ml Aceton gelöst und die Lösung wurde durch Kochen konzentriert. Der weisse Feststoff, der aus der siedenden Acetonlösung ausfiel, wurde heiss abfiltriert. Das Filtrat wurde weiter gekocht und man erhielt noch zwei weitere Ausfällungen. Die drei ausgefällten Produkte wurden miteinander vereinigt und ergaben eine Gesamtausbeute von 8 g, entsprechend einer Ausbeute von 66,6% der Theorie, eines weissen Feststoffes, der einen Zersetzungschmelzpunkt von I98-200°C aufwies.

Die Elementaranalyse dieses Produktes der Summenformel C32H30F3I4N7O8 ergab die folgenden Werte:

berechnet: C = 31,89;H = 2,51 ;N = 8,14 gefunden: C = 31,95;H = 2,60;N = 7,86

Das kernmagnetische Resonanzspektrum, Aufnahmebedingungen: 220 MHz, (CD3)2SO, ergab:

ô 1,32 (s, 3H, Isopropyliden), 1,55 (s, 3H, Isopropyliden), 6,14 (d, 1 H, 1 '-Ribose), 7,02 (s, 2H, Thyroxin), 7,82 (s, 2H, Thyroxin), 8,25 (s, 1H, Purin), 8,36(s, 1H, Purin), 8,41 (t, 1H, J=6, Amido), 9,64(d, 1H, J = 8,Trifluoracetamid).

Die optische Drehung, aufgenommen in Pyridin, c = 1,0, war[a]o = -11,82°.

5

Herstellung von N-(2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3',5,5'-tetrajodo-thyronyl]-aminoäthyl)-2' ,3 ' -0-isopropyliden-5 ' -adenylsäure-monotriäthylaminsalz-monohydrat.

Eine Lösung aus 1,2 g (1,0 mMol) an dem N-(2-[N-(Trifluor-10 acetyl)-3,3',5,5'-tetrajodothyronyl]-aminoäthyl)-2',3'-0-iso-propyliden-adenosin in 10 ml trockenem Triäthylphosphat wurde unter einer trockenen Argonatmosphäre bei einer Temperatur von 0°C hergestellt. Zu der kalten gerührten Lösung setzte man 0,45 ml (5 mMol) an Phosphoroxychlorid ls zu. Die so erhaltene Lösung wurde 24 Stunden lang bei 0°C belassen, und dann setzte man tropfenweise unter Rühren 1 Liter Eiswasser zu. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wobei man 1,23 g eines weissen Feststoffes erhielt. Dieser Feststoff wurde in Aceton 20 gelöst, und man setzte 0,32 ml (2,2 mMol) an Triäthylamin zu. Dabei bildete sich ein Niederschlag. Die Mischung wurde dann im Vakuum abgedampft und der erhaltene Rückstand mit trockenem Aceton ausgelaugt, und dann kristallisierte man ihn aus einer Mischung von trockenem Äthanol und 25 trockenem Äther um, wobei man 390 mg eines weissen Feststoffes, entsprechend 27,8% der Theorie, erhielt, der einen Zersetzungsschmelzpunkt von 173-183°C aufwies.

Die Elementaranalyse dieses Produktes der Summenformel C38H48F3I4N8O12 P ergab die folgenden Werte:

30

berechnet: C = 32,50;H = 3,45;N = 7,98 gefunden: C = 32,24;H = 3,08;N = 7,58.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum, Aufnahmebe-35 dingungen:60 MHz, (CD3)2SO, ergab:

8 1,53 (s, 3H, Isopropyliden), 6,2 (d, 1H, l'H-Ribose), 7,1 (s, 2H, Thyroxin aromatisch), 7,87 (s, 2H, Thyroxin aromatisch), 8,27 (s, 1H, Purin), 8,52 (s, 1H, Purin).

Die optische Drehung, aufgenommen in Methanol, c = 40 1,0, war [a]o = -17,50°.

Herstellung der N-(2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3'.5,5'-tetrajodo-thyronyl]-aminoäthyl)-5 ' -adenylsäure.

200 mg (0,14 mMol) and dem N-(2-[N-(Trifluoracetyl-45 3,3 ' ,5,5 '-tetrajodothyronol]-aminoäthyl )-2' ,3 ' -0-isopropy-liden-5'-adenylsäure-monotriäthylaminsalz-monohydrat . wurden in 1 ml Wasser einer Temperatur von 0°C suspendiert, und es wurden 9 ml Trifluoressigsäure tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Nach 30 Minuten erhielt man eine so klare Lösung. Die Lösung wurde noch weitere 15 Stunden lang bei 0°C kalt gehalten, und dann im Vakuum bei einer Temperatur von 30°C abgedampft. Der erhaltene Rückstand wurde viermal im Vakuum bei 25°C aus jeweils von 20 ml Volumina wasserfreiem Äthylalkohol abgedampft, und dann ss trocknete man ihn im Vakuum bei 25°C, wobei ein weisser Feststoff zurückblieb.

Dieser Feststoff wurde 30 Minuten lang mit 10 ml an kaltem Methanol gerührt, anschliessend abfiltriert und im Vakuum bei 25°C getrocknet, wobei man 135 mg eines so weissen Feststoffes, entsprechend 76% der Theorie, erhielt, der langsam unter Zersetzung bei einer Temperatur oberhalb von 188°C schmolz.

Die Elementaranalyse dieses Produktes der Summenformel

65 C29H27F3I4N7O11 P ergab die folgenden Werte:

berechnet: C = 27,97; H = 2,19; N = 7,87 gefunden: C = 28,11 ; H = 2,31 ; N = 7,65.

659713

12

Das kernmagnetische Resonanzspektrum, Aufnahmebedingungen: 220 MHz, (CD3)2SO, ergab:

8 5,95 (d, 1 H, 1 '-Ribose), 7,04 (s, 2H, Thyroxin aromatisch), 7,84 (s, 2H, Thyroxin aromatisch), 8,25 (s, 1H, Purin), 8,36 (s, 1H, Purin), 8,43 (m, IH, Amido), 9,66 (d, 1H, Trifluor-acetamido).

Die optische Drehung, aufgenommen in Pyridin, c = 1,0, war [a]n = -2,12°.

Herstellung des Flavin-adenin-dinucleotid-Thyroxin-Konju-gates.

498 mg (0,4 mMol) and der N-(2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3',5,5'-tetrajodothyronyl]-aminoäthyl)-5'-adenylsäure wurden in 10 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, und man setzte 96 p.1 (0,4 mMol) an Tri-n-butylamin zu, und anschliessend gab man dann noch 320 mg (2,0 mMol) an 1,1 '-Carbonyldiimidazol zu. Man rührte dann 18 Stunden lang bei Zimmertemperatur in Abwesenheit von Feuchtigkeit, und setzte anschliessend 280 p,l an Wasser zu und dampfte dann das Lösungsmittel im Vakuum ab.

Dabei erhielt man als Rückstand ein Öl, das getrocknet wurde indem man es im Vakuum mehrmals aus trockenem Dimethylformamid abdampfte, und zwar viermal aus je 10 ml. Das dabei erhaltene Phosphorimidazolidat wurde wieder in 10 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und tropfenweise zu einer 0,4 millimolaren Lösung des Tri-n-octylamin-salzes des Riboflavin-5'-monophosphates in 10 ml an trok-kenem Dimethylformamid zugesetzt. Dieses Salz wurde hergestellt, indem man eine Lösung von 192 mg (0,4 mMol) des Ammoniumsalzes des Riboflavin-5'-monophosphates in 10 ml Wasser zu einer gerührten Lösung von 176 pj (0,4 mMol) an Tri-n-octylamin in 100 ml an Aceton zusetzte. Nach 30 Minuten wurde dann die erhaltene Mischung unter Vakuum abgedampft. Der dabei zurückbleibende Rückstand wurde getrocknet, indem man ihn mehrmals im Vakuum aus trok-kenem Dimethylformamid abdampfte, wobei das Salz als orange gefärbter Feststoff zurückblieb.

Die oben beschriebene Lösung, welche das Phosphorimidazolidat und das Riboflavin-5'-monophosphatsalz enthielt, wurde nach 24 Stunden in zwei gleiche Teile aufgeteilt, und einer dieser gleichen Anteile wurde im Vakuum zurTrok-kene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde auf einer Säule der Grösse 2,5 x 78 cm chromatographiert, welche 100 g an Sephadex LH-20 der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, enthielt. Diese Säule wurde vorher 18 Stunden lang vorquellen gelassen, und zwar unter Verwendung einer Mischung aus 19 Volumina Dimethylformamid und 1 Volumen 1 -molarer Triäthylammoniumbicarbonatlö-sung mit einem pH-Wert von 7,5. Bei der Säulenchromatographie verwendete man als Elutionsmittel die oben genannte Mischung aus 19 Volumenteilen und 1 Volumenteil und es wurden Fraktionen zu je 10 ml aufgefangen. Das aus der Säule austretende Material wurde überwacht, indem man eine Dünnschichtchromatographie auf silanisierten Silica-gelplatten durchführte, und zwar den Silicagel 60 silanisierten RP-2 Platten der Firma E. Merck, Darmstadt, BRD.

Die Dünnschichtplatten wurden entwickelt, indem man als Laufmittel eine Mischung aus 40 Volumina Aceton + 40 Volumina Chloroform + 25 Volumina Methanol + 1 Volumen Wasser + 1 Volumen Triäthylamin verwendete. Die aus der Chromatographiesäule austretenden Fraktionen mit den Nummern 11 bis einschliesslich 17 wurden miteinander vereinigt und im Vakuum abgedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde auf einer Säule der Grösse 2,5x75 cm chromatographiert, die 125 gSephadex LH-20 enthielt und vorher 18 Stunden lang unter Verwendung einer 0,3-molaren Ammoniumbicarbonatlösung vorgequollen worden war. Als Elutionsmittel wurde bei dieser Säulenchromatographie 0,3-molare Ammoniumbicarbonatlösung verwendet, und es wurden Fraktionen zu 10 ml aufgefangen. Das aus der Säule austretende Material wurde durch die Absorption im ultravioletten Licht bei 254 nm überprüft, s Dann wurde das Volumen der einzelnen Fraktionen auf 20 ml erhöht, und zwar beginnend mit der Fraktion der Nummer 150. Die Salzkonzentration des Elutionsmittels wurde stufenweise gesenkt, und zwar nach dem folgenden Schema:

0.15 molare Ammoniumbicarbonatlösung beginnend mit der Fraktion der Nummer 295,0,075 molare Ammoniumbicarbonatlösung, beginnend mit der Fraktion der Nummer 376, und Wasser, beginnend mit der Fraktion der Nummer 430.

Insgesamt wurden 480 Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen der Nummern 200 bis einschliesslich 235 wurden miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei das markierte Konjugat als gelb-orange gefärbter Rückstand zurückblieb. Eine alkalische wässrige Lösung dieses Rückstandes zeigte im ultravioletten Spektrum Absorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen : 266 nm, 350 nm, 373 nm und 450 nm.

Die Ausbeute wurde nach der Absorption bei 450 nm abgeschätzt und sie betrug etwa 5% der Theorie.

Ein Phosphordiesterase-Präparat, das von der Firma Wor-2s thington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey USA, erhältlich ist, und das aus dem Gift der Schlange Crotalus Adamanteus isoliert wurde, hydrolysierte das oben genannte Produkt zu Riboflavin-5'-monophosphat, und der mit Thyroxin substituierten 5'-Adenylsäure, in welcher die Trifluor-30 acetyl-Schutzgruppe entfernt worden war.

Eine weitere Beschreibung der Herstellung von markierten Konjugaten dieses Typs kann in der mit gleichem Datum eingereichten USA-Patentschrift Nr. 4171 432, mit dem Titel «Flavin-adenin-dinucleotid-jodthyronin-Konju-35 gate» gefunden werden.

B) Herstellung der Apoglucose-oxidase

Das Apoenzym, das nach dem Verfahren gemäss Beispiel

1, Abschnitt B) hergestellt wurde, wurde zu diesem Zweck 40 verwendet.

C) Test-Reagenzien

1. Markiertes Konj ugat :

N6-(2-Aminoäthyl)-thyroxin-FAD (FAD bedeutet Flavin-

45 adenin-dinucleotid) wurde in 0,1 molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7 bis zu einer Konzentration von 1 uMol verdünnt.

2. Apoenzym:

50 Apoglucose-oxidase wurde mit 0,1 molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7 bis zu einer Konzentration von 0,6 (iMol an FAD-Bindungsstellen verdünnt.

(Die FAD-Bindungsstellen sind gemäss Beispiel 1, Teil C) unter 2.) definiert.)

55 3. Unlöslich gemachter Antikörper:

Ein gewaschener feuchter Kuchen aus Sepharose 4B Gel der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, wurde mit Hilfe von Cyanogenbromid aktiviert, und zwar nach dem Verfahren das von March et al. in Anal. Biochem. 60 60:119 (1974) beschrieben ist. Dieses aktivierte Material wurde zu einer Lösung von 85 mg eines Antikörpers in 20 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0 gegeben, und man rührte langsam 36 Std. lang bei 4°C. Der verwendete Antikörper wurde aus einem Antiserum gegen 65 einThyroxin-Rinderserum-albumin-Konjugat isoliert. Sobald die Kupplungsreaktion vollständig war wurde ein Milliliter an 1-molarem Alanin zugesetzt und man schüttelte während weiteren 4 Stunden um unumgesetzte Stellen zu

15

13

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blockieren. Der erhaltene, an Sepharose gebundene Antikörper wurde auf einem Sintertrichter mit jeweils 400 ml jeder der folgenden Lösungen gewaschen : 50 millimolare Natriumacetatlösung, 500 millimolare Natriumchloridlösung eines pH-Wertes von 5,50 millimolarer Phosphatpuffer, 500 millimolare Natriumchloridlösung eines pH-Wertes von 7, und 800 ml eines 100 millimolaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 7.

Der feuchte Filterkuchen wurde dann in 100 mMol Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7 suspendiert, der 0,01 g Natriumazid enthielt, und man erhielt dabei 22 ml einer etwa 50-prozentigen Suspension.

4. Standard:

Eine 1,15 millimolare Vorratslösung an Thyroxin in 5 millimolarem Natriumhydroxid wurde unter Verwendung eines 0,1-molaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 7 auf 2 limolar verdünnt.

5. Nachweisreagenz:

Es wurde ein Glucose-oxidase-Testreagenz hergestellt, welches die folgende Mischung pro 130 jxl enthielt:

25 |i.l einer Lösung von 1,2 mg/ml Peroxidase der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri USA in 0,1-molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7, 5 |il einer 10 millimolaren Lösung von 4-Aminoantipyrin in Wasser,

20 |xl einer 25 millimolaren Lösung von 3,5-Dichlor-2-hydro-xybenzolsulfonat in 0,1-molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,

30 jj.1 eines 16,5-prozentigen Rinderserum-albumines in einem 0,1 -molaren Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7, und

50 (il einer 1-molaren Glucoselösung in wässriger gesättigter Benzoesäurelösung.

D) Testverfahren.

Die Bindungsreaktionsmischungen wurden hergestellt, indem man 150 ^,1 der unlöslich gemachten Antikörper-Suspension mit 80 jxl der markierten Konjugatlösung und unterschiedlichen Mengen der standardisierten Thyroxinlö-sung vermischte, sodass man unterschiedliche Konzentrationen an Thyroxin in den Reaktionsmischungen erhielt. Ferner wurde eine ausreichende Menge an 0,1-molarer Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7 zugesetzt, damit die Mischungen jeweils schliesslich ein Gesamtvolumen von 500 jj.1 erreichten.

Die Reaktionsmischungen wurden unter Schütteln 2 Stunden lang bei 25°C belassen. Dann wurde jede Reaktionsmischung einer Vakuumfiltration durch eine mit einem Glaswollpfropfen versehene trockene Pasteur-Pipette unterworfen, wobei die Pipette vorher mit Perjodatlösungen und Äthylenglycol-Lösungen behandelt worden war um irgendeine mögliche Verunreinigung mit FAD (Abkürzung für Flavin-adenin-dinucleotid) zu beseitigen.

Zu Anteilen von je 300 p.1 jedes Filtrâtes gab man 130 p.1 des Nachweisreagenzes und 50 [xl der Apoenzymlösung zu. Nach 1 Stunde wurde die Absorption jeder der Reaktionsmischungen bei 520 nm bestimmt.

E) Ergebnisse.

In der folgenden Tabelle 3 werden die Ergebnisse des Testverfahrens bezüglich der Bestimmung von Thyroxin gezeigt. Die Ergebnisse der Absorption die angegeben sind, sind der Durchschnittswert aus zwei Parallelversuchen, die bezüglich einer restlichen Enzymaktivität in der Apoenzymlösung (Absorption von 0,522), und bezüglich endogenem FAD in der Antikörper-Suspension (Absorption 0,142) korrigiert sind.

Tabelle 3

Volumen an zugesetztem

Korrigierte durchschnittliche

Thyroxin-Standard

Absorption bei 520 nm in ul

0

0,223

25

0,221

75

0,281

250

0,286

Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung ein nützliches spezifisches Bindungstestverfahren des heterogenen Typs gewährleistet.

Beispiel 3

Homogene Bindungstests für Thyroxin.

A) Herstellung des markierten Konjugates N6-(6-Amino-hexyl)-thyroxin-flavin-adenin-dinucleotid.

Herstellung von 6-(6-Aminohexyl)amino-9-(2',3'-0-isopropyl-iden-ß-D-ribofuranosyl)-purin.

16,0 g (50 mMol) an dem 6-Chior-9-(2',3'-0-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-purin (s. die Veröffentlichung von Hampton et al. in J. Am. Chem. Soc. 83:1501 (1961) wurden unter Rühren zu einer geschmolzenen, eine Temperatur von 70°C aufweisenden Probe an 58 g (500 mMol) frisch destilliertem 1,6-Diamonohexan gegeben. Die erhaltene Mischung wurde unter Argon bei einer Temperatur von 40°C während 18 Stunden gerührt. Der Überschuss des Diamines wurde durch Destillation bei einem Druck von 0,91 mm Hg und einer Temperatur von 60°C entfernt. Man erhielt dabei einen blassgelben Rückstand und dieser wurde auf 150 g Silicagel 60 der Firma E. Merck, Darmstadt BRD, aufgetragen. Dieses Material wurde oben in eine Chromatographiesäule eingebracht, welche aus einer Anschlämmung von 2 kg Silicagel 60 in einer Mischung aus 9 Volumina absolutem Äthylalkohol und 1 Volumen 1-moIarerTriäthylammoniumbicarbonatlö-sung eines pH-Wertes von 7,5 hergestellt worden war. Diese Chromatographiesäule wurde eluiert, indem man die oben genannte Lösungsmittelmischung mit einem Volumenverhältnis von 9:1 als Elutionsmittel verwendete, und es wurden 900 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen.

Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie überprüft, indem man Platten aus Silicagel 60 verwendete und als Laufmittel eine Mischung aus 7 Volumina absolutem Äthanol und 3 Volumina einer 1-molaren Triäthylam-moniumbicarbonatlösung eines pH-Wertes von 7,5 verwendete.

Die Fraktionen mit den Nummern 391 bis einschliesslich 900, die aus der Chromatographiesäule austraten, wurden miteinander vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei 15,0 g eines glasigen Rückstandes verblieben, was einer Ausbeute von 74% der Theorie entspricht. 1 g Probe dieses glasigen Rückstandes wurde in einem kleinen Volumen an Methanol aufgelöst, und dieses Material wurde dann am Kopf einer Säule aufgetragen, welche 80 g Sephadex LH-20 der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, welches mit Methanol vorgequollen war, enthielt. Die Säule wurde mit Methanol eluiert. Insgesamt wurden 90 Fraktionen zu je 8 ml aufgefangen. Die eluierten Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel 60 überprüft, wobei man als Laufmittel eine Mischung aus 7 Volumina absolutem Äthylalkohol und 3 Volumina einer 1-molaren Triäthylammoniumbicarbonatlösung eines pH-Weïtes von 7.5 verwendete. Die Fraktionen mit den

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30

35

40

45

50

55

60

65

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Nummern 19 bis einschliesslich 27 aus dieser Chromatographiesäule wurden miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man 910 mg eines weissen glasartigen Rückstandes erhielt, was einer Wiedergewinnung des Produktes von 91% der Theorie entsprach.

Die Elementaranalyse dieses Materiales der Summenformel C19H30N6O4 ergab die folgenden Werte :

berechnet: C = 56,14; H = 7,44; N = 20,68 gefunden: C = 53,91 ; H = 7,33; N = 19,18.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum, Aufnahmebedingungen: 60 MHz, CDCh, lieferte die folgenden Werte:

S 1,40 (s, 3H, Isopropyliden), 1,63 (s, 3H, Isopropyliden), 5,98 (d, 1H, l'-Ribose), 7,92 (s, 1H, Purin), 8,36 (s, 1H,

Purin).

Die optische Drehung, aufgenommen in Methanol, c = 1,0, betrug [aß = -50,11°.

Herstellung von N-(6-[N-Trifluoracetyl)-3,3',5,5'-tetrajodo-thyronyl]-aminohexyl)-2',3'-0-isopropyliden-adenosin.

Eine Lösung von 4,36 g (5,0 mMol) an der a-(N-Trifluor-acetyl)-amino-ß-[3,5-dijodo-4-(3',5'-dijodo-4'-hydroxyphe-noxy)-phenyl-propionsäure, die in der gleichen Weise hergestellt wurde, wie dies in dem Teil A) des obigen Beispieles 2 erläutert wurde, sowie von 2,24 g (5,5 mMol) an dem 6-(6-Aminohexyl)amino-9-(2',3'-0-isopropyliden-ß-D-ribofura-nosyl)-purin in 100 ml trockenem Dimethylformamid wurde unter einer trockenen Argonatmosphäre bei einer Temperatur von -20°C hergestellt. Zu dieser kalten gerührten Lösung setzte man eine Lösung von 1,52 g (5,5 mMol) an Diphenylphosphorylazid, erhältlich von der Firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin USA, in 50 ml trok-kenem Dimethylformamid zu und gab dann anschliessend noch 0,8 ml (5,5 mMol) an trockenem Triäthylamin zu. Diese Lösung wurde bei Zimmertemperatur 22 Stunden lang belassen. Dann setzte man die Lösung tropfenweise zu 600 ml kaltem Wasser einer Temperatur von 0°C unter Rühren zu. Der dabei erhaltene weisse Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum bei 60°C getrocknet, wobei man 4,90 g, entsprechend 78% der Theorie, an einem weissen Feststoff erhielt. Eine Probe dieses Feststoffes wurde aus einer Mischung von Aceton und Wasser umkristallisiert, wobei man einen weissen Feststoff erhielt, der einen Zersetzungsschmelzpunkt von 205-207°C aufwies.

Die Elementaranalyse dieses Produktes der Summenformel ergab die folgenden Werte :

C36H38F3I4N7O8:

berechnet: C = 34,28; H = 3,04; N = 7,77 gefunden: C = 34,22;H = 2,99;N = 7,41.

Im Massenspektrum (20 ma) fand man : m/e : 1262 [MH+ ], 1164 [M+ minus COCF3].

Die optische Drehung, aufgenommen in Pyridin, c = 1,0, war [aß5 = -21,89°.

Herstellung von N-(6-[N-Trifluoracetyl)-3,3',5,5'-tetrajodo-thyronyl]-aminohexyl)-2' ,3 ' -0-isopropyliden-5 ' -adenylsäure-monotriäthylamin-monohydrat.

Eine Lösung von 1,89 g (1,5 mMol) an dem N-(6-[N-(Tri-fluoracetyl)-3,3',5,5'-tetrajodothyronyl]-aminohexyl)-2',3'-0-isopropyliden-adenosin in 15 ml an trockenem Triäthylphos-phat wurde unter einer Atmosphäre von trockenem Argon bei -10°C hergestellt. Zu der kalten gerührten Lösung setzte man dann 0,68 ml (7,5 mMol) an Phosphoroxichlorid zu. Die so erhaltene Lösung wurde 18 Stunden lang bei -15°C belassen, und dann tropfenweise und unter Rühren zu0l,51

Eiswasser zugesetzt. Dabei bildete sich ein Niederschlag, der abfiltriert und im Vakuum getrocknet wurde, wobei man 1,91 g, entsprechend 87% der Theorie, an einem weissen Feststoff erhielt. Dieser Feststoff wurde in 10 ml Methanol gelöst 5 und es wurden 0,38 ml (2,6 mMol) an Triäthylamin zugesetzt. Diese Lösung wurde im Vakuum abgedampft und der dabei erhaltene Rückstand aus einer Mischung aus Methanol und Äthyläther umkristallisiert, wobei man 720 mg, entsprechend 33% der Theorie, an einem weissen Feststoff erhielt, 10 der einen Zersetzungsschmelzpunkt von 151-154°C aufwies.

Die Elementaranalyse dieser Verbindung der Summenformel C42H56F3I4N8O12 P ergab die folgenden Werte:

berechnet: C = 34,54;H = 3,86;N = 7,67 15 gefunden: C = 35,24;H = 3,88;N = 7,75.

Im Massenspektrum (20 ma) fand man: m/e: 1342 [MH+], 1244 [M+minus COCFs],

Die optische Drehung, aufgenommen in Methanol, c = 20 1,0, war [aß = -17,20°C.

Herstellung der N-(6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3',5,5'-tetrajodo-thyronyl]-aminohexyl)-5'-adenylsäure.

600 mg (0,41 mMol) an dem N-(6-[N-(Trifluoracetyl)-25 3,3 ' ,5,5 ' -tetrajodothyronyl]aminohexyl)-2' ,3 ' -0-isopropy-liden-5'-adenylsäure-monotriäthylamin-monohydrat wurden in 0,6 ml Wasser einer Temperatur von 0°C suspendiert, und man setzte tropfenweise 6 ml an Trifluoressigsäure unter Rühren zu. Nach 50 Minuten erhielt man eine klare Lösung. 30 Diese Lösung wurde bei einer Temperatur von 0°C während weiteren 15 Stunden belassen, und dann unter Vakuum bei einer Temperatur von 30°C eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde im Vakuum 5-mal mit je 20 ml wasserfreiem Äthylalkohol abgedampft, und dann rieb man den 35 Rückstand mit 30 ml Wasser an und wusch ihn mit einem kleinen Volumen an Methanol. Man erhielt dabei 430 mg an einem weissen Feststoff, und dieser wurde aus Methanol umkristallisiert, wobei man 290 mg, entsprechend 54,6% der Theorie, an einem weissen Feststoff erhielt, der einen Zerset-40 zungsschmelzpunkt von 180- 183°C aufwies.

Die Elementaranalyse dieses Produktes der Summenformel C33H33F3I4N7011 P ergab die folgenden Werte :

45 berechnet: C = 30,46;H = 2,71 ;N = 7,54 gefunden: C = 30,77;H = 2,55;N = 7,29.

Im Massenspektrum (20 ma) fand man m/e: 1302 [MH+], 1204 [M+ minus COCF3].

50

Herstellung des Flavin-adenin-dinucleotid-Thyroxin-Konju-gates

130,13 mg (0,1 mMol) an der N-(6-[N-(Trifluor-acetyl)-3,3 ' ,5,5' -tetrajodothyronyl]aminohexyl)-5 ' -adenylsäure 55 wurden in eine Argonatmosphäre eingebracht. Zu dieser Probe gab man eine Lösung von 14 ul (0,1 mMol) an Triäthylamin in 1 ml an trockenem Dimethylformamid. Nachfolgend wurde dann eine Lösung von 16,2 mg (0,1 mMol) an l,l'-Carbonyldiimidazol in 1 ml an trockenem Dimethylfor-60 mamid zugesetzt. Nach 24 Stunden wurde ein zweites Äquivalent, nämlich nochmals 16,2 mg(0,l mMol) an l,l'-Carbo-nyldiimidazol in 1 ml trockenem Dimethylformamid zugesetzt. Man liess die Reaktion insgesamt während 48 Stunden bei Zimmertemperatur unter Ausschluss von Feuchtigkeit 65 ablaufen. Eine Probe von 47,3 mg (0,1 mMol) an dem Ammoniumsalz des Riboflavin-5'-monophosphates wurde in das entsprechende Tri-n-octylaminsalz umgewandelt, und zwar in derjenigen Weise wie dies im Teil A) von Beispiel 2

15

659 713

beschrieben ist. Dieses Salz wurde in 3 ml an trockenem Dimethylformamid aufgelöst und zu der oben genannten Lösung zugesetzt, die das Phosphorimidazolidat des Adenyl-säure-Zwischenproduktes enthielt.

Man liess die erhaltene Lösung in der Dunkelheit bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang unter Ausschluss von Feuchtigkeit stehen. Dann wurde das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft und der verbleibende Rückstand auf einer Säule der Grösse 2,5 x 78 cm chromatographiert. Die Säule war mit 100 g an Sephadex LH-20 der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, gefüllt, welches vorher 18 Stunden lang in einer Mischung aus 19 Volumina Dimethylformamid und einem Volumen 1-molarem Triäthylammoniumbicarbonat mit einem pH-Wert von 7,5 vorquellen gelassen wurde. Anschliessend wurde dann die Säule mit der oben genannten Mischung aus 19 Volumina +1 Volumen eluiert, und es wurden Fraktionen zu je 5 ml aufgefangen. Das bei der Elution aus der Säule austretende Material wurde durch Dünnschichtchromatographie überprüft, und zwar unter Verwendung von silanisierten Silicagelplatten, nämlich die Silicagel 60 silanisierten RP-2 TLC Platten der Firma Merck, Darmstadt BRD. Die Dünnschichtplatten wurden entwickelt, indem man als Laufmittel eine Mischung aus 40 Volumina Aceton +40 Volumina Chloroform +25 Volumina Methanol +1 Volumen Wasser +1 Volumen Triäthylamin verwendete.

Die Fraktionen mit den Nummern 24 bis 38, die aus der Chromatographiesäule austraten, wurden miteinander vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde auf einer Säule der Grösse 2,5 x 85 cm chromatographiert. Diese Säule enthielt 125 g an Sephadex LH-20, das vorher 18 Stunden lang mit einer 0,1-molaren Ammoniumbicarbonatlösung vorquellen gelassen wurde. Diese Säule wurde unter Einhaltung eines linearen Gradienten eluiert, und zwar unter Verwendung von 2 Litern einer 0,1-molaren Ammoniumbicarbonatlösung und 2 Litern Wasser, und es wurden Fraktionen von je 23 ml aufgefangen. Das austretende Material wurde anhand seiner Ultraviolett-Absorption bei 254 nm kontrolliert. Die Fraktionen mit den Nummern 170 bis einschliesslich 182 wurden miteinander vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde auf einer Säule der Grösse 2,5 x 55 cm chromatographiert, wobei diese Säule mit 80 g Sephadex LH-20 gefüllt war, welches vorher in einer 0,05-molaren Ammoniumbicarbonatlösung vorquellen gelassen wurde. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten eluiert, und zwar unter Verwendung von 2 Litern einer 0,05-molaren Ammoniumbicarbonatlösung und 2 Litern einer 0,02-molaren Ammoniumbicarbonatlösung. Das aus der Säule austretende Material wurde durch Ultraviolett-Absorption bei 254 nm kontrolliert. Die Elution wurde unter Verwendung von 2 Litern an einer 0,2-molaren Ammoniumbicarbonatlösung fortgesetzt, indem man Fraktionen zu je 23 ml auffing. Insgesamt wurden 257 Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen der Nummern 70 bis einschliesslich 110 wurden miteinander vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei das markierte Konjugat als gelborange gefärbter Rückstand verblieb.

Eine alkalische wässrige Lösung dieses Rückstandes zeigte ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei den folgenden Wellenlängen : 270 nm, 345 nm und 450 nm. Die Ausbeute wurde nach der Absorption bei 450 nm abgeschätzt, und sie betrug etwa 5% der Theorie.

Ein Phosphordiesterase-Präparat der Firma Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey USA, welches aus dem Gift der Schlange Crotalus Adamanteus isoliert worden war, hydrolysierte dieses oben beschriebene Produkt zu Ribo-flavin-5'-monophosphat und zu einer mit Thyroxin substituierten 5'-Adenylsäure, in welcher dieTrifluoracetylschutz-gruppe entfernt worden war.

Bezüglich einer weiteren Beschreibung der Herstellung von markierten Konjugaten dieses Typs sei auf die USA-Patentschrift Nr. 4171 432, der Firma Miles Laboratories hingewiesen.

s

B) Herstellung von Apoglucose-oxidase.

Glucose-oxidase wurde in derjenigen Weise dialysiert und lyophilisiert, wie dies im Teil B) des vorangegangenen Bei-io Spiels 1 beschrieben ist. Ein Anteil von 80 mg der lyophilisierten Glucose-oxidase wurde in 20 ml einer 30 volumenprozentigen Glycerinlösung bei 4°C aufgelöst, und der pH-Wert dieser Lösung wurde durch die Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure der Formel H2SO4 auf 1,4 eingestellt. Diese 15 Lösung wurde bei 4°C während 2 Stunden bebrütet, und dann liess man sie durch eine Säule laufen, die mit Sephadex G-50 der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, gefüllt war, welches bei 4°C mit einer 30 volumenprozentigen Lösung von Glycerin, deren pH-Wert mit 20 konzentrierter Schwefelsäure auf 1,4 eingestellt worden war, ins Gleichgewicht gebracht wurde. Der eluierte Proteinpeak wurde aufgefangen (27 ml Eluat, welches 74 Gew.% des auf die Säule aufgebrachten Materiales enthielt), und 200 mg an Rinderserum-albumin wurde in dem gesammelten Eluat auf-25 gelöst. 600 mg Aktivkohle, und zwar die Qualität RIA der Firma Schwarz-Mann, Orangeburg, New York USA, wurden dann zugegeben und die Mischung wurde neutralisiert,

indem man 4,0 ml an 0,4-molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 8,0 und eine ausreichende Menge an 2-nor-30 maier Natriumhydroxidlösung zusetzte, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen.

Diese Mischung wurde 60 Minuten lang bei 4°C gerührt und dann nacheinander durch Millipore Filter der Porenweite 0,8 (i und der Porenweite 0,22 filtriert. Diese Milli-35 pore Filter sind von der Millipore Corp., Bedford, Massachusetts USA, erhältlich. Es wurde eine Lösung von 10 Gew.% Natriumazid pro Volumen zugegeben, bis eine endgültige Konzentration dieses Materiales in der Mischung von 0,1% erreicht war.

1. Markiertes Konjugat: N6-(6-Aminohexyl)-thyroxin-FAD (die Abkürzung FAD

45 bedeutet Flavin-adenin-dinucleotid) wurde in einem 0,1-molaren Phosphatpuffer, welcher 0,1 Gew.% pro Volumen an Rinderserum-albumin enthielt, und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, bis zu einer Konzentration von 400 nM verdünnt.

2. Apoenzym:

Apoglucose-oxidase wurde in einem 0,1-molaren Phosphatpuffer, welcher 0,1 Gew.% pro Volumen an Rinderserum-albumin enthielt, und einen pH-Wert von 7,0 besass, bis zu einer Konzentration von 4,0 mikronormalen FAD-Bindungs-stellen verdünnt.

In der Folge wird «mikronormal» auch mit «|j.N» abgekürzt, und bezüglich der FAD-Bindungsstellen sei auf den Teil C), Punkt 2 des vorangegangenen Beispiels I verwiesen.

3. Antiserum

7,5 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurden mit einer Geschwindikgeit von 0,1 ml pro Minute bei Zimmertemperatur in 15 ml Kaninchen-antithyroxinantiserum eingepumpt, welches auf einem Eisbad gerührt wurde. Dann liess man die so erhaltene Suspension 2 Std. lang bei 4°C ohne Rühren stehen. Der dabei gebildete Niederschlag wurde durch Abzentrifugieren gewonnen, und in 3 ml einer eiskalten 50 millimolaren Boratpufferlösung eines

40

C) Test-Reagenzien.

55

60

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16

pH-Wertes von 8,6 gelöst, und man dialysierte über Nacht gegen 1 Liter einer 50 millimolaren Boratpufferlösung eines pH-Wertes von 8,6. Die Immunoglobulinlösung wurde dann auf das ursprüngliche Volumen des Antiserums gebracht, indem man eine entsprechende Menge einer 50 millimolaren Boratpufferlösung eines pH-Wertes von 8,6 zugab. Die so erhaltene Immunoglobulinlösung wurde weiter unter Verwendung einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung verdünnt, welche 0,1 Gew.% pro Volumen an Rinderserum-albumin enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies. Dieses verdünnte Material wurde in den nachfolgenden Testverfahren in den angegebenen Mengen verwendet.

4. Standard:

Thyroxin-Natriumsalz, erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri USA, wurde als Vorratslösung einer Konzentration von 1 mg pro ml verwendet und man titrierte in eine Lösung in destilliertem Wasser mit 2-normaler Natriumhydroxidlösung bis ein endgültiger pH-Wert von 10,2 erreicht war. Die Standarde wurden hergestellt, indem man diese Vorratslösung mit einem 0,1-molaren Phosphatpuffer, welcher 0,1 Gew.% pro Volumen an Rinderserum-albumin enthielt und einen pH-Wert von 7,0 besass, verdünnte.

5. Nachweisreagenz:

Ein Glucose-oxidase-Testreagens wurde hergestellt, indem man 11 Teile eines 0,15-molaren Phosphatpuffers, welcher eine pH-Wert von 7,0 besass, und 1,8 Gew.% pro Volumen an Rinderserum-albumin, sowie 2 Teile einer 2,0 millimolaren 4-Aminoantipyrinlösung, welche 0,6 mg pro ml an Peroxi-dase enthielt, 2 Teile einer 20 millimolaren Lösung von 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat in 0,1-molarem Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0, und 2 Teile einer 1,0-molaren Glucose in wässriger gesättigter Benzoesäurelösung miteinander vermischte.

D) Testverfahren.

1. Zugabe aller Reagenzien ohne Durchführung einer Arbeitsstufe der Vorbebrütung.

Die folgenden Materialien wurden nacheinander in getrennte Reaktions-Cuvetten eingefüllt:

0,05 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung,

0,1 ml einer 1:4 Verdünnung der Antiserumlösung in Phosphatpuffer,

1,7 ml des Nachweisreagenses, und 0,1 ml der Apoenzymlösung.

Jede dieser Reaktionsmischungen wurde 30 Minuten lang bei 20°C bebrütet, und dann wurde die Absorption bei 520 nm bestimmt.

2. Vorbebrütung mit dem Antiserum.

Die folgenden Materialien wurden nacheinander in getrennte Reaktions-Cuvetten eingebracht:

0,05 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, und

0,1 ml einer 1:16 Verdünnung der Antiserumlösung in dem

Phosphatpuffer.

Die Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang bei 20°C belassen, und dann wurden 1,7 ml des Nachweisreagenses und 0,1 ml der Apoenzymlösung in jede Cuvette nacheinander eingebracht. Nachdem eine weitere Bebrütung während 30 Minuten bei 20°C stattgefunden hatte, wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Cuvette bestimmt.

3. Vorbebrütung mit dem Apoenzym.

Die in der Folge angegebenen Materialien wurden nacheinander in getrennte Cuvetten eingefüllt:

0,05 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählte Standardlösung, und 0,1 ml der Apoenzymlösung.

Jede der Reaktionsmischungen wurde 20 Minuten lang bei 20°C bebrütet, und dann wurden 0,1 ml einer 1:2 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer und 1,7 ml des Nachweisreagenses jeder Cuvette nacheinander zugesetzt. Nachdem man weitere 30 Minuten lang bei 20°C bebrütet hatte, wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Cuvette bestimmt.

4. Nacheinander folgende Vorbebrütung, und zwar zuerst mit dem Antiserum und dann mit dem Apoenzym.

Die in der Folge angegebenen Materialien wurden nacheinander in getrennte Reaktions-Cuvetten eingefüllt:

0,05 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, und 0,1 ml einer 1:32 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer.

Die Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang bei 20°C bebrütet und dann wurden 0,1 ml der Apoenzymlösung in jede Cuvette eingebracht. Dann wurde weitere 20 Minuten lang bei 20°C bebrütet, und anschliessend wurden 1,7 ml des Nachweisreagenzes zu jeder Cuvette zugesetzt, und es wurde wieder 30 Minuten lang bei 20°C bebrütet und dann wurde die Absorption bei 520 nm gemessen.

5. Nacheinander folgende Vorbebrütung, und zwar zuerst mit dem Apoenzym und dann mit dem Antiserum.

Die in der Folge angegebenen Materialien wurden nacheinander in getrennte Cuvetten eingefüllt:

0,05 ml der markierten Konjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, und 0,1 ml der Apoenzymlösung.

Jede dieser Reaktionsmischungen wurde 20 Minuten bei 20°C bebrütet, und dann setzte man 0,1 ml einer 1:32 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer zu jeder Cuvette zu. Nachdem man während weiteren 20 Minuten bei 20°C bebrütet hatte, wurden 1,7 ml des Nachweisreagenzes zu jeder Cuvette zugesetzt, und nachdem man weitere 30 Minuten lang bei 20°C bebrütet hatte, wurde die Absorption bei 520 nm bestimmt.

6. Vorbebrütung sowohl mit dem Antiserum als auch mit dem Apoenzym.

Die folgenden Materialien wurden nacheinander in getrennte Reaktions-Cuvetten gegeben:

0,05 ml der markierten Kunjugatlösung,

0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung,

0,1 ml der Apoenzymlösung, und

0,1 ml einer 1:32 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer.

Jede Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang bei 20°C bebrütet, und dann wurden zu jeder Mischung 1,7 ml des Nachweisreagenzes zugesetzt. Nachdem man weitere 30 Minuten lang bei 20°C bebrütet hatte, wurde in jeder Cuvette die Absorption bei 520 nm bestimmt.

E) Ergebnisse.

Die Tests wurden jeweils in Parallelversuchen durchgeführt, wobei geeignete Leerversuche ebenfalls durchgeführt wurden. Es zeigte sich, dass bei den Testverfahren 1-3 die Konzentration an Thyroxin in der Standardlösung direkt s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17

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proportional der Glucoseaktivität war, während bei den Testverfahren 4-6 die Thyroxinkonzentration verkehrt proportional der Enzymaktivität war. Bei den Testverfahren 1 bis 3 war in Abwesenheit von Thyroxin die Aktivierung des Enzymes behindert, während bei den Testverfahren 4 bis 6 bei Thyroxin-Abwesenheit die Aktivierung verstärkt war. Es zeigte sich ferner, dass die Testverfahren 4-6 etwas empfindlicher gegenüber Thyroxin sind als die anderen Testverfahren. Der Grund oder die Gründe warum die Enzymaktivierung in unterschiedlicher Weise gehemmt oder erhöht war, je nach der Reaktionsfolge die angewandt wurde, ist nicht vollständig klar. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass das erfindungsgemässe Verfahren eine homogene spezifische Bindungs-Testmethode zur Bestimmung von Thyroxin unter Verwendung einer grossen Vielzahl an Reaktionsfolgen zur Verfügung stellt.

Beispiel 4

Homogene Bindungstests für Theophylline.

A) Herstellung des markierten Konjugates Theophylline-FAD.

Die im Titel benützte Abkürzung «FAD» bedeutet Flavin-adenin-dinucleotid.

Zu einer Lösung von 2,4 (iMol an Flavin-N6-amino-hexyl-adenin-dinucleotid, das in derjenigen Weise hergestellt wurde, die im Teil A) des Beispieles! beschrieben ist, in 200 |j.l an Dimethylsulfoxid, und die unter einer Argongasatmosphäre gehalten wurde, setzte man 0,9 mg (3,62 jiMol) an l,3-Dimethyl-l,6,7,8-tetrahydropyridol[l,2-e]-purin-2,4,9(3H)-trion zu. Dieses zuletztgenannte Material wurde nach dem von Cook et al. in Res. Comm. in Chem. Pathol. and Pharm. 13:497 (1976) beschriebenen Verfahren hergestellt. 4 Std. nach der Zugabe dieses Triones setzte man weitere 1,8 mg (7,3 uMol) an dem gleichen Trion zu. Dann rührte man über Nacht und dampfte anschliessend das Lösungsmittel unter Vakuum (0,1 mm Hg) ab und chromato-graphierte den Rückstand. Der Rückstand wurde auf einer Säule von 2,5x90 cm chromatographiert, die mit LH-20 Sephadex der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, gefüllt war, und als Elutionsmittel benützte man einen 0,3-molarenTriäthylammonium-bicarbonat-puffer eines pH-Wertes von 7,8.

Das rohe Produkt wurde eluiert, nachdem 210 ml Eluat die Säule verlassen hatten, und es war in den 36 ml, also bis insgesamt 246 ml die Säule verlassen hatten, enthalten. Dieses rohe Material wurde gesammelt und auf eine Silicagelplatte der Grösse 20x20 cm und der Dicke von 1000 (t, aufgetragen, und man verwendete als Laufmittel eine Mischung aus 8 Teilen Äthanol und 2 Teilen 1-molarem Triäthylammonium-bicarbonatpuffer, der einen pH-Wert von 7,8 besass. Die Bande, welche das gewünschte Produkt enthielt und einen Rr-Wert von 0,77 besass, wurde von der Platte abgeschabt und mit einem 1-molaren Triäthylammoniumbicarbonatpuffer eines pH-Wertes von 7,8 extrahiert, und man filtrierte und konzentrierte das Filtrat.

Bei einer endgültigen Reinigung durch erneutes Chromatographieren auf LH-20 Sephadex unter Verwendung des 0,3-molaren Puffers als Elutionsmittel erhielt man 1,26 |j.Mol des markierten Konjugates. Die Menge wurde durch die Bestimmung der Absorption bei 450 nm bestimmt, und die Ausbeute war 53% der Theorie.

B) Antikörper-Bindungsreaktionen.

Es wurden in Kaninchen Antikörper gegen das Immunogen 8-(3-Carboxypropyl)-l,3-dimethylxanthine-BSA nach demjenigen Verfahren erzeugt, das von Cook et al. in Res.

Comm. in Chem. Pathol. Pharm. 13:497 (1976) beschrieben ist.

Die Antikörper-Bindungsreaktionen wurden bei Zimmertemperatur in 0,1-molarem Natriumphosphatpuffer eines 5 pH-Wertes von 7,0 durchgeführt, und die Bestimmungen der Glucose-oxidase-Aktivität wurden in dem gleichen Puffer bei 20°C durchgeführt.

Die Reagenzien, die in dem Test verwendet wurden, werden in der Folge mit den Buchstaben A, B, C, D und E io abgekürzt, und die Bedeutung dieser Abkürzungen ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt :

Reagenz Zusammensetzung

A 0,1-molarer Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0)

B 565 nM Theophyllin-FAD-markiertes Konjugat oder 160 nm N6-(6-Aminohexyl)-FAD (das 20 FAD-Derivat)

C Antiserum gegen Theophyllin ( 10-fach verdünnt im Reagenz A)

D Apoglucose-oxidase (50 nM FAD-Bindungsstellen

25 pro ml)

E Nachweisreagenz:

200 (ig Peroxidase pro ml,

0,71 mMol 4-Aminoantipyrin, 30 7,1 mMol 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat,

353 mMol Glucose, und 35 mg BSA pro ml

35

Die Reagenzien A, B, und C wurden miteinander in getrennten Reaktions-Cuvetten vereinigt, und zwar in den Mengen die in der folgenden Tabelle 4 angegeben sind.

100 (il des Reagens D und 283 [il des Reagenz E wurden 40 dann rasch nacheinander in jede der Reaktionsmischungen eingebracht, und dann bebrütete man 30 Minuten lang bei 20°C. Anschliessend wurde die Absorption in jeder Cuvette bei 520 nm bestimmt. Die dabei erhaltenen Resultate sind in der Tabelle 4 zusammengestellt, wobei die angegebenen 45 Werte Durchschnittswerte aus jeweils Parallel versuchen sind.

Tabelle 4

Reaktions- Reagenz A Reagenz B in ul Reagenz C Absorption zahl in ul inul bei 520 nm

(Puffer) FADDerisat markiertes (Antiserum)

Konjugat

1

617

-

_

-

0,046

2

517

100

-

-

0,584

3

507

100

-

10

0,644

4

477

100

-

40

0,631

5

357

100

-

160

0,629

6

497

_

20

_

0,690

7

587

-

20

10

0,314

8

577

-

20

20

0,216

9

532

-

20

40

0,224

10

517

-

20

80

0,22

11

437

-

20

160

0,21

659 713

18

Die Ergebnisse der Reaktionen 2 bis 5 zeigen, dass das Antiserum die Aktivität des FAD-Derivates (d.h. des nicht an Theophyllin gekuppelten Materiales) nicht beeinflusste. Die Reaktionen 6 bis 11 zeigen, dass steigende Mengen an Theo-phyllin-antiserum zu einer verminderten Aktivität des markierten Konjugates bezüglich seiner Fähigkeit sich mit dem Apoenzym zu verbinden führte.

C) Konkurrenzierde Bindungstests.

Diese Reaktionen wurden so ausgeführt, wie dies im oben beschriebenen Teil b) angegeben ist, mit Ausnahme dessen, dass bestimmte Mengen, also bestimmte Niveaus an Theophyllin mit den Reagenzien A und B vereinigt wurden, ehe 5 zu dieser Mischung dann das Reagenz C zugesetzt wurde, und ferner bestand auch der Unterschied darin, dass für das Reagenz C eine 100-fache Verdünnung an Antiserum verwendet wurde. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Reaktionszahl Reagenz A in ,ul Reagenz B in ul Theophyllin Reagenz C in |xl Absorption bei 520 nm

(Puffer) (markiertes Konjugat) (Antiserum)

Zugegebenes Volumen Konzentration in in jii jiMoI

1

617

-

-

-

- -

0,047

2

597

20

-

-

-

0,932

3

497

20

-

-

100

0,364

4

397

20

100

10

100

0,703

5

447

20

50

10

100

0,649

6

397

20

100

1,0

100

0,507

7

447

20

50

1,0

100

0,481

8

397

20

100

0,1

100

0,418

9

447

20

50

0,1

100

0,377

Die in der Tabelle 5 angegebenen Reaktionen 1 bis 3 waren Vergleichsversuche, die zeigten, dass ein Antikörper gegen Theophyllin die Fähigkeit des markierten Konjugates sich mit dem Apoenzym zu verbinden vermindert. Die Reaktionen 4 bis 9 zeigen, dass die FAD-Aktivität proportional mit dem Theophyllin-niveau in der Reaktionsmischung ansteigt.

4 Liter eines 0,01-molaren Natriumphosphatpuffers eines 30 pH-Wertes von 7,0 während 48 Stunden.

Dann wurde Natriumazid zugesetzt, bis 0,1 Gew.% pro Volumen erreicht waren. Das Reaktionsmaterial wurde durch ein Millipore Filter einer Porengrösse von 0,22 u filtriert und gelagert.

Beispiel 5

Homogener Bindungstest für menschliches IgG

A) Herstellung des markierten Konjugates IgG-FAD.

Zu 4,24 mg an Flavin-N6-aminohexyl-adenin-dinucleotid, das so hergestellt wurde, wie dies im Teil A) des vorangegangenen Beispiels 1 beschrieben ist, setzte man 2,5 mg an Dimethyladipimidat-dihydrochlorid, das von der Firma Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois USA, erhältlich ist, in 1 ml Wasser und 5 jxl an Triäthylamin zu. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann wurden 40 mg an menschlichem Immunglobulin (IgG) in 1 ml einer 0,1-molaren Natriumpyrophos-phatpufferlösung eines pH-Wertes von 8,5 anschliessend zugesetzt. Das Immunglobulin wird in der Folge mit «IgG» abgekürzt. Dann rührte man 3 Stunden lang bei Zimmertemperatur und brachte die Reaktionsmischung auf eine Säule der Grösse 2,5 x 50 cm auf, die mit G-25 Sephadex der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, gefüllt war. Die Säule war mit 0,1-molarem Natriumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 ins Gleichgewicht gebracht worden, und man eluierte mit dem gleichen Puffer.

Die Fraktionen des zuerst eluierenden Peaks, der eine Absorption bei 450 nm zeigte, wurden gesammelt, und sie wurden nacheinander gegen die folgenden Lösungen dialy-siert:

4 Liter eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0 während 16 Stunden,

4 Liter eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0, der 1 Mol Natriumchlorid enthielt, während 24 Stunden, sowie

B) Antikörper-Bindungsreaktionen. Die verwendeten Reagenzien waren die folgenden:

40

Reagenz

Zusammensetzung

A

0,1-molarer Natriumphosphatpuffer, pH 7,0

B

10 mMol 4-Aminoantipyrin

C

1,0 Mol Glucose

D

25 mMol 3,5-Dichlor-4-hydroxybenzol-sulfonat

im Reagenz A

E

1,2 mg/ml Meerrettich-peroxidase im Reagenz A

F

30 Gew.% pro Volumen Rinderserum-albumin

(von der Forschungsprodukt-Abt. der Firma

Miles Laboratories, Ind., Elkhart, IN USA)

G

IgG-FAD-markiertes Konjugat, gelagert in der

obigen Lösung

H

Apoglucose-oxidase

I

Kaninchen-antiserum gegen menschliches IgG

(erhältlich von Behring Diagnostics, Somerville,

New Jersey, USA)

J

Standarde von menschlichem IgG im Reagenz A

mit vorher bestimmten Gehalten.

19

659 713

Die Reagenzmischungen wurden wie folgt hergestellt:

Mischung Nr. 1:

180 (il Reagenz A,

20 (il Reagenz B,

100 (il Reagenz D, und 5 (il Reagenz G (5,4 (ìM)

Mischung Nr. 2:

0,3 ml Gesamtvolumen der verschiedenen Anteile, die dasjenige Volumen an Reagenz I enthalten, das in der folgenden Tabelle 6 angegeben ist, wobei der Rest des Volumens aus dem Reagenz A besteht.

Tabelle 7

Mengen an menschlichem IgG die zugesetzt wurden in ug o

4 8

12 16 24

Absorption hei 520 nm

0,579 0,653 0,751 0,844 0,986 1,06

Mischung Nr. 3:

80 (il Reagenz D,

50 (il Reagenz E,

33 (il Reagenz F,

137 ul Reagenz A, und

1,6 ul Reagenz H (4,2 (iN FAD-Bindungsstellen)

Zu 300 (il der Mischung Nr. 1 setzte man 300 (il der Mischung Nr. 2 und 300 (il an Reagenz A in getrennten Reak-tions-Cuvetten zu. Nach mindestens 10 Minuten dauernder Bebrütung bei Zimmertemperatur gab man 300 (il der Mischung Nr. 3 zu jeder Cuvette zu. Nach einer weiteren Bebrütung während 30 Minuten bei 20°C wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Cuvette bestimmt.

Die dabei erzielten Ergebnisse waren die folgenden:

Tabelle 6

Volumen an Antiserum das zugesetzt wird um die Mischung Nr. 2 herzustellen

Absorption bei 520 nm

0

0,859

2

0,750

4

0,602

6

0,494

8

0,443

10

0,415

12

0,408

14

0,392

16

0,375

Diese Ergebnisse zeigen, dass mit ansteigendem Spiegel an Antikörper die Aktivität der Glucose-oxidase die durch das FAD-Markierungsmittel, welches an das IgG konjugiert ist, hervorgerufen wird, abnimmt.

C) Konkurrenzierende Bindungstests.

Diese Reaktionen wurden durchgeführt indem man die in dem obigen Teil B) beschriebenen Reagenzien verwendet. Die angegebenen Konzentration an dem menschlichen IgG in den 300 (il Volumina des Reagenses A wurden mit der Mischung Nr. 1 in getrennten Reaktions-Cuvetten vermischt. Dann wurde eine Mischung aus 12 jil des Reagenzes I und 288 (il des Reagenzes A zu jeder Reaktion zugesetzt. Nach 10 Minuten wurden 300 (il der Mischung Nr. 3 beigegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei 20°C während 30 Minuten bebrütet. Am Ende dieser Zeit wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Cuvette bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse waren die folgenden:

's Man sieht aus der vorangehenden Beschreibung und den Beispielen, dass das erfindungsgemässe spezifische Bindungstestverfahren zur Bestimmung von Liganden hohen Molekulargewichtes, nämlich von menschlichem IgG, in einem flüssigen Medium geeignet ist.

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Reagenz-Zusammensetzungen

Für einen Fachmann auf dem fraglichen Arbeitsgebiet ist es aus der vorangegangenen Beschreibung und den Beispielen ersichtlich, dass Reagenz-Zusammensetzungen, die 25 zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens angewandt werden, eine grosse Anzahl an verschiedenen Formen annehmen können. Insbesondere können derartige Reagenzzusammensetzungen in fester Form oder in flüssiger Form vorliegen.

30 Beispielsweise kann eine Testzusammensetzung zur Bestimmung eines Liganden nach den erfindungsgemässen Verfahren die folgenden Komponenten enthalten:

a) ein markiertes Konjugat, welches Flavin-Adenindinu-cleotid, also FAD, gekuppelt an den Liganden oder ein Bin-

35 dungsanaloges desselben enthält.

b) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden und c) Apoglukose-oxydase.

Eine derartige Testzusammensetzung kann auch Reagen-.zien zur Messung der Aktivität der Glukoseoxydase ent-halten.

Natürlich können auch übliche Verdünnungsmittel, Puffermittel, Stabilisatoren und ähnliches, ebenfalls in derartigen Testzusammensetzungen enthalten sein.

Die Reagenz-Zusammensetzungen können auch in Form 45 einer Testausrüstung vorliegen, d.h. eine verpackte Kombination von Behältern darstellen, welche die nötigen Reagenzelemente enthalten. Zur Illustration sei eine Testzusammensetzung beschrieben, die zur Bestimmung eines Liganden nach dem erfindungsgemässen Verfahren geeignet ist. Diese Testzusammensetzung umfasst einen oder mehrere Behälter, welche die folgenden Komponenten enthalten:

a) ein markiertes Konjugat, welches Flavin-Adenindinu-cleotid, also FAD, gekuppelt an den Liganden oder ein Bindungsanaloges desselben enthält,

ss b) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden und c) Apoglukose-oxydase.

Eine derartige Testausrüstung kann auch in einem oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen Behälter Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität der Glukose-oxydase 60 enthalten.

So kann eine derartige Testausrüstung, die zur Durchführung des erfindungsgemässen spezifischen Bindungstestverfahrens geeignet ist, mindestens zwei getrennte Behälter aufweisen, von denen der eine das markierte Konjugat und gege-65 benenfalls noch Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität der Glukose-oxydase enthält und der andere Behälter den Bindungspartner und das Apoenzym enthält. Selbstverständlich können derartige Testvorrichtungen auch andere

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Reagenzien enthalten, wie dies auf diesem Fachgebiet üblich ist, welche vom wirtschaftlichen Standpunkt oder vom Standpunkt der Verwendung her nützlich sein können, und als Beispiele hiefür seien Puffer, Verdünnungsmittel, Bleichsubstanzen oder Standardisierungsmittel und ähnliches genannt.

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B

Claims (8)

1. 659 713

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Spezifisches Bindungstestverfahren zur Bestimmung einer Substanz, die als Ligand bezeichnet wird und die von einem Bindungspartner für diese Substanz spezifisch gebunden wird, in einem flüssigen Medium, wobei das flüssige Medium

   (a) mit einem markierten Konjugat zusammengebracht wird, das eine markierende Substanz, gekuppelt an den Liganden oder ein Bindungsanaloges desselben enthält und

   (b) mit einem spezifischen Bindungspartner des Liganden zusammengebracht wird und wobei diese markierende Substanz in der erhaltenen Reaktionsmischung bestimmt wird und in Beziehung zu dem Liganden in dem flüssigen Medium gebracht wird,

   dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz Flavin-Adenin-dinucleotid ist und dass diese in der Reaktionsmischung bestimmt wird, indem man Apoglucose-oxi-dase der Reaktionsmischung zusetzt und die erhaltene Glu-cose-oxidase-Aktivität misst, die in der Reaktionsmischung durch die Rekombination des als markierende Substanz dienenden Flavin-Adenin-dinucleotides und der Apoglucose-oxidase gebildet wurde.
2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucose-oxidase-aktivität durch ein kolori-metrisches Arbeitsverfahren gemessen wird.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ein Antigen oder ein Hapten ist und dass der bindende Partner ein Antikörper dafür ist.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ein Hapten ist, das ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 1000 aufweist.
5. 5. Reagenzzusammensetzung zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1, welche die folgenden Bestandteile enthält:

   (a) ein markiertes Konjugat, welches eine markierende Substanz, gekuppelt an den Liganden, oder ein Bindungsanaloges desselben enthält,

   (b) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden,

   dadurch gekennzeichnet, dass die markierende Substanz

   Flavin-Adenin-dinucleotid ist und dass die Reagenzzusammensetzung zusätzlich noch Apoglucose-oxidase enthält, die in der Lage ist, sich mit dem als markierender Substanz dienenden Flavin-Adenin-dinucleotid zu verbinden, wobei sich aktive Glucose-oxidase bildet.
6. 6. Reagenzzusammensetzung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem Glucose und eine kolorimetrische Indikatorzusammensetzung zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid enthält.
7. 7. Reagenzzusammensetzung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ein Antigen oder ein Hapten ist und dass der Bindungspartner ein Antikörper dafür ist.
8. 8. Reagenzzusammensetzung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ein Hapten ist, das ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 1000 aufweist.