DE1203423B - Process for the preparation of the antibiotic ZN-6 (fusidic acid) - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Int. α.:Int. α .:

C12dC12d

DEUTSCHESGERMAN

PATENTAMTPATENT OFFICE

AUSLEGESCHRIFTEDITORIAL

Deutsche Kl.: 30h-6 German class: 30h -6

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:Number:
File number:
Registration date:
Display day:

1203 423
L42612IV a/30h
2. August 1962
21. Oktober 19651203 423
L42612IV a / 30h
2nd August 1962
October 21, 1965

Die Patentanmeldung L 40063 IVa/30h hat ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums ZN-6, welches inzwischen die Bezeichnung »Fusidinsäure« erhalten hat, zum Gegenstand, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), Stamm ATCC 14700 auf üblichem biologischem Wege züchtet und die gebildete Fusidinsäure aus dem Kulturmedium isoliert.The patent application L 40063 IVa / 30h has a process for the production of the new antibiotic ZN-6, which in the meantime has received the name "fusidic acid", is the subject of this is characterized in that Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), strain ATCC 14700 on the usual biologically grown and the fusidic acid formed isolated from the culture medium.

Im Zuge der Weiterentwicklung dieses Verfahrens wurde gefunden, daß man bei dessen Durchführung auch Mutanten des Pilzes Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), Stamm ATCC 14700 einsetzen kann.In the course of the further development of this process it was found that when it is carried out mutants of the fungus Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), strain ATCC 14700 can also be used.

Erfindungsgemäß ist daher ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums ZN-6, welches inzwischen die Bezeichnung »Fusidinsäure« erhalten hat, gemäß Patentanmeldung L 40063 IVa/30 h durch Züchtung von Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), Stamm ATCC 14700 und Isolierung der gebildeten Fusidinsäure aus dem Kulturmedium dadurch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise erhaltene, Fusidinsäure erzeugende Mutanten von Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), Stamm ATCC 14700 auf üblichem biologischem Wege züchtet.According to the invention is therefore a method for producing the antibiotic ZN-6, which has meanwhile been has received the designation "fusidic acid", according to patent application L 40063 IVa / 30 h by cultivation of Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), strain ATCC 14700 and isolation of the formed Fusidic acid from the culture medium, characterized in that one obtained in a known manner, Fusidic acid producing mutants of Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), strain ATCC 14700 breeds in the usual biological way.

Fusidinsäure ist ein Antibiotikum völlig neuartiger Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums
ZN-6 (Fusidinsäure)Fusidic acid is an antibiotic based on a completely new process for the production of the antibiotic
ZN-6 (fusidic acid)

Zusatz zur Anmeldung: L 40063IV a/30 h Auslegeschrift 1192 785Addition to registration: L 40063IV a / 30 h interpretation document 1192 785

Anmelder:Applicant:

L0vens Kemiske Fabrik Ved. A. Kongsted,L0vens Kemiske Fabrik Ved. A. Kongsted,

Ballerup (Dänemark)Ballerup (Denmark)

Vertreter:Representative:

Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls undDr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Pulse and

Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Frhr. v. Pechmann,Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Frhr. v. Bad luck man,

Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2Patent Attorneys, Munich 9, Schweigerstr. 2

Als Erfinder benannt:
Inger Kirk, KopenhagenNamed as inventor:
Inger Kirk, Copenhagen

Beanspruchte Priorität:Claimed priority:

Großbritannien vom 2. August 1961 (28109)Great Britain August 2, 1961 (28109)

Struktur, nämlich ein Cycllpentanoperhydrophenanthrenderivat der wahrscheinlichen Formel:Structure, namely a Cycllpentanoperhydrophenanthrenderivat of the likely formula:

,CH,, CH,

CH₂CH₂CH = C:CH ₂ CH ₂ CH = C:

HO C-COOH ! HHO C-COOH! H

— OCOCH₃ - OCOCH ₃

HOHO

CH₃ CH ₃

Fusidinsäure ist in Wasser schwer löslich. Sie ist eine schwache Säure, mit einem pK_a-Wert von etwa 5,3 und kann mit einer großen Anzahl anorganischer oder organischer Basen Salze bilden.Fusidic acid is sparingly soluble in water. It is a weak acid with a pK _a of about 5.3 and can form salts with a large number of inorganic or organic bases.

Umfangreiche klinische Erprobungen zeigten, daß Fusidinsäure und gewisse ihrer Salze die an pharmazeutisch annehmbare Antibiotika gestellten Anforderungen erfüllen und wertvolle Mittel zur Behandlung von Infektionskrankheiten darstellen, wie dies beispielsweise in der Zeitschrift »The Lancet«, Bd. I, 1962, S. 928 bis 937 beschrieben ist.Extensive clinical trials have shown that fusidic acid and certain of its salts are pharmaceutically acceptable Acceptable antibiotics meet requirements and are valuable agents for treatment of infectious diseases, as shown, for example, in the journal "The Lancet", Vol. I, 1962, pp. 928-937.

Erfindungsgemäß züchtet man einen Fusidinsäure erzeugenden Mutanten des Pilzes Fusidium coccineum Fuck (K. Tubaki), Stamm ATCC 14700 unter aeroben Bedingungen in einer wäßrigen Nährlösung, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorga-According to the invention, a fusidic acid-producing mutant of the fungus Fusidium coccineum is cultivated Fuck (K. Tubaki), strain ATCC 14700 under aerobic conditions in an aqueous nutrient solution, the carbon and nitrogen sources as well as inorganic

509 718/415509 718/415

nische Salze enthält, bis diese Lösung eine wesentliche antibiotische Aktivität erreicht hat.contains niche salts until this solution has achieved substantial antibiotic activity.

Vorzugsweise werden Medien verwendet, die als Stickstoffquellen eine oder mehrere der Substanzen Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casein oder andere proteinhaltige Milchprodukte, Fleisch- und Knochenmehl enthalten.Media are preferably used which have one or more of the substances as nitrogen sources Corn steeple, soybean meal, casein or other protein-containing dairy products, meat and bone meal contain.

Die Menge an verfügbarem Stickstoff in dem Kulturmedium beträgt z. B. etwa 0,01 bis 1,5 °/o, vorzugsweise etwa 0,15 %> auf das Kulturmedium bezogen.The amount of available nitrogen in the culture medium is e.g. About 0.01 to 1.5%, preferably about 0.15%> based on the culture medium.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können insbesondere Saccharose und Glucose anwesend sein. Ferner ergänzt man vorteilhafterweise das Nährmedium durch einen Zusatz von Fetten oder Fettsäuren, die einen Teil der Kohlenstoff- und Energiequellen bilden, da diese Stoffe in Mengen von etwa 0,1 bis 5,0% des Kulturmediums die Bildung der Fusidinsäure zu fördern scheinen. Für diesen Zweck verwendet man vorzugsweise Fettsäureglyceride und die in diesen enthaltenen freien Fettsäuren oder syn- ao thetische Ester dieser Fettsäuren, insbesondere Fettsäuren mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Derivate solcher Fettsäuren.Sucrose and glucose in particular can be present as assimilable carbon sources. It is also advantageous to supplement the nutrient medium by adding fats or fatty acids, which form part of the carbon and energy sources, as these substances are in quantities of about 0.1 to 5.0% of the culture medium appears to promote the formation of fusidic acid. For this purpose fatty acid glycerides and the free fatty acids contained in them or syn- ao are preferably used thetic esters of these fatty acids, in particular fatty acids having 12 to 20 carbon atoms or derivatives such fatty acids.

Wenn die Bildung der Fusidinsäure im Fermentationsverfahren aufhört oder eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht ist, kann diese nach verschiedenen Verfahren isoliert werden.When the formation of fusidic acid in the fermentation process stops or a satisfactory one Yield is achieved, this can be isolated by various methods.

Vorzugsweise trennt man zunächst das Mycel von der Kulturflüssigkeit ab, z. B. durch Filtration; anschließend kann die Fusidinsäure konzentriert werden, indem man die vom Mycel befreite Lösung mit einem festen Adsorptionsmittel zusammenbringt und hierauf das Antibiotikum aus dem Adsorptionsmittel eluiert. Auch kann man die Fusidinsäure durch Zusatz eines Amins oder einer Säure zur Nährlösung in solchen Mengen, daß wesentliche Mengen der in dem Kulturmedium vorhandenen Fusidinsäure in eine in organischen Lösungsmitteln lösliche Form übergeführt werden und hierauffolgende Extraktion des Antibiotikums mit einem mit Wasser im wesentlichen nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, z. B. einem Ester, einem Keton oder einem Halogenkohlenwasserstoff als solche oder in Form eines ihrer Salze gewinnen. Hierbei erhält man eine organische Schicht, die Fusidinsäure als solche oder in Form eines Aminsalzes in verhältnismäßig hohen Konzentrationen enthält. Anschließend kann die gewünschte Verbindung nach bekannten Verfahren in einem Reinheitsgrad isoliert werden, der für die Herstellung der Verbindung in einer pharmazeutisch annehmbaren Qualität ausreichend ist.Preferably, the mycelium is first separated from the culture fluid, e.g. B. by filtration; afterward the fusidic acid can be concentrated by treating the solution freed from the mycelium with a brings together solid adsorbent and then the antibiotic is eluted from the adsorbent. Fusidic acid can also be added to the nutrient solution by adding an amine or an acid Amounts that substantial amounts of the fusidic acid present in the culture medium are converted into an organic Solvent-soluble form are converted and subsequent extraction of the antibiotic with an essentially water-immiscible organic solvent, e.g. B. a Esters, a ketone or a halogenated hydrocarbon as such or in the form of one of their salts. This gives an organic layer, the fusidic acid as such or in the form of an amine salt contains in relatively high concentrations. Then the desired connection can be made known processes can be isolated in a degree of purity that is suitable for the preparation of the compound in of pharmaceutically acceptable quality is sufficient.

Zur Gewinnung eines erfindungsgemäß verwendbaren Mutanten von Fusidium coccineum Fuck (K. T u b a k i), Stamm ATCC 14700, kann eines der bekannten Mutationsverfahren, bei welchen die Sporen des Pilzes eine Einwirkung erfahren, angewendet werden. So kann beispielsweise eine Sporensuspension mit ionisierenden oder nichtionisierenden Strahlen bestrahlt oder können die Sporen der Einwirkung von mutagenen Chemikalien, wie Diäthylsulfat oder Senfgas, unterworfen werden.To obtain a mutant of Fusidium coccineum Fuck which can be used according to the invention (K. T u b a k i), strain ATCC 14700, one of the known mutation methods in which the spores of the fungus experienced an effect, can be applied. For example, a spore suspension irradiated with ionizing or non-ionizing rays or the spores can be exposed to mutagenic chemicals such as diethyl sulfate or mustard gas.

Es wurde jedoch festgestellt, daß die Mutation des Pilzes auf sehr zweckmäßige Weise durch Bestrahlen einer Sporensuspension mit UV-Licht über einen Zeitraum, der einen Uberlebensprozentsatz vorzugsweise von etwa 0,05 bis etwa 5,0% gewährleistet, bewirkt werden kann. Die erforderliche Bestrahlungsintensität geht aus nachstehenden Versuchen hervor. Bei diesen Versuchen wurden Suspensionen von Sporen des Pilzes, mit 2 · 10⁶ Sporen/ml, die in Quarzrohren eingeschlossen waren, mit dem Licht einer Hanovia-Steri-Lampe (85% dieses Lichtes hatten eine Wellenlänge von 2537 Ä) aus einer Entfernung von 18,5 cm während der in Spalte A der nachstehenden Tabelle angeführten Zeiträume bestrahlt; die Zahlen in Spalte B der Tabelle geben den Prozentsatz überlebender Sporen an:It has been found, however, that the mutation of the fungus can be brought about in a very convenient manner by irradiating a spore suspension with UV light for a period of time which ensures a survival percentage, preferably from about 0.05 to about 5.0%. The required irradiation intensity can be found in the experiments below. In these experiments suspensions of spores of the fungus, with 2 x 10 ⁶ spores / ml, which were enclosed in quartz tubes, with the light of a Hanovia Steri lamp (85% of this light had a wavelength of 2537 Å) from a distance of 18.5 cm irradiated for the periods listed in column A of the table below; the numbers in column B of the table indicate the percentage of surviving spores:

AA. ]] Versuch IIExperiment II ZeitTime BB. 36,736.7 in Sekundenin seconds % überlebende Sporen% surviving spores 4,34.3 1515th Versuch IAttempt I. 1,21.2 3030th 2727 0,30.3 4545 5,85.8 0,040.04 6060 1,01.0 7575 0,30.3 0,060.06

Die bestrahlten Sporen wurden hierauf auf Agarplatten gebracht und die aus einzelnen Sporen entstandenen Kolonien untersucht, in dem man diese in Schüttelkolben züchtete und sowohl ihre Fähigkeit zur Bildung von Fusidinsäure bestimmte, als auch ihren Bedarf an besonderen Nährstoffen ermittelte. Die Agarplatten hatten folgende Zusammensetzung:
Substrat 25 A:The irradiated spores were then placed on agar plates and the colonies formed from individual spores were examined by cultivating them in shake flasks and determining both their ability to form fusidic acid and their need for special nutrients. The agar plates had the following composition:
Substrate 25 A:

Glycerin 7,5 g/lGlycerin 7.5 g / l

Maisquellwasser 2,5 g/lCorn steep water 2.5 g / l

MgSO₄-7H₈O 0,05 g/lMgSO ₄ -7H ₈ O 0.05 g / l

KH₂PO₄ 0,06 g/lKH ₂ PO ₄ 0.06 g / l

Perton 5,0 g/lPerton 5.0 g / l

NaCl 4,0 g/lNaCl 4.0 g / l

FeSO₄ - 7H₂O 0,005 g/lFeSO ₄ - 7H ₂ O 0.005 g / l

CuSO₄-5H₂O 0,004 g/lCuSO ₄ -5H ₂ O 0.004 g / l

Glucose 10,0 g/lGlucose 10.0 g / l

Caseinhydrolysat 1,5 g/lCasein hydrolyzate 1.5 g / l

Agar 30,0 g/lAgar 30.0 g / l

Vitaminlösung*) 10 mlVitamin solution *) 10 ml

Der pH-Wert der Agarplatte war 7,0.The pH of the agar plate was 7.0.

*) Die Zusammensetzung der zugesetzten Vitaminlösung war wie folgt:*) The composition of the added vitamin solution was as follows:

Thiamin 100 mg/1Thiamine 100 mg / l

Riboflavin 50 mg/1Riboflavin 50 mg / 1

Pyridoxin ■ HCl 61 mg/1Pyridoxine ■ HCl 61 mg / 1

Calciumsalz der Pantothensäure 220 mg/1Calcium salt of pantothenic acid 220 mg / 1

p-Aminobenzoesäure 50 mg/1p-aminobenzoic acid 50 mg / l

Nikotinsäureamid 200 mg/1Nicotinic acid amide 200 mg / 1

Cholin · HCl 129 mg/1Choline · HCl 129 mg / 1

Inosit 400 mg/1Inositol 400 mg / 1

Nach diesem Verfahren wurden drei Mutanten, die von besonderem Interesse sind, isoliert. Einer dieser Mutanten, im folgenden als Leo-U42 bezeichnet, wurde aus einer 45 Sekunden bestrahlten Sporensuspension und zwei Mutanten, im folgenden als Leo-U 79 bzw. Fc-U 404 bezeichnet, aus einer 60 Sekunden bestrahlten Sporensuspension isoliert.Following this procedure, three mutants of particular interest were isolated. One of these Mutants, hereinafter referred to as Leo-U42, were produced from a 45-second irradiated spore suspension and two mutants, hereinafter referred to as Leo-U 79 and Fc-U 404, respectively, from one 60 seconds irradiated spore suspension isolated.

Die Wachstumsgeschwindigkeit, die Färbung der Kolonien, die Sporenbildungsgeschwindigkeit und Morphologie des Mutanten Leo-U 42 waren im Vergleich zum Mutterstamm unverändert, hingegen benötigte er für sein Wachstum die Anwesenheit von Methionin oder Cystein in dem Kulturmedium, zum Unterschied von Mutterstamm.The rate of growth, the color of the colonies, the rate of sporulation and The morphology of the mutant Leo-U 42 was unchanged compared to the parent strain, but required he for its growth the presence of methionine or cysteine in the culture medium, for Difference from maternal line.

Der Mutant Leo-U 79 zeigte im Vergleich zum Mutterstamm eine verringerte Sporenbildungs- undCompared to the parent strain, the mutant Leo-U 79 showed reduced spore formation and

Wachstumsgeschwindigkeit und eine Änderung der Färbung seiner Kolonien von weiß nach rosa; auch zeigten seine Kolonien auf Agarplatten der obengenannten Zusammensetzung eine außerordentlich stark gekräuselte Oberfläche.The rate of growth and a change in the color of its colonies from white to pink; even its colonies showed an extraordinary one on agar plates of the above composition strongly ruffled surface.

Der als Fc-U 404 bezeichnete Mutant unterschied sich vom Mutterstamm durch seine mäßig geringere Wachstumsgeschwindigkeit, ergab jedoch wesentlich höhere Ausbeuten an Fusidinsäure.The mutant designated as Fc-U 404 differed from the parent strain in that it was moderately smaller Growth rate, but gave much higher yields of fusidic acid.

Von diesen Mutanten sind insbesondere der Stamm-Leo-U 42, welcher den Zusatz von Aminosäuren benötigt, und der Stamm Fc-U 404 für industrielle Fermentationsverfahren von Interesse.Of these mutants, in particular, the strain Leo-U 42, which requires the addition of amino acids, and the strain Fc-U 404 for industrial Fermentation processes of interest.

Die Erfindung ist jedoch keineswegs auf eine Verwendung der obenerwähnten Mutanten beschränkt, da auch eine große Anzahl anderer Fusidinsäure bildender Mutanten erhalten werden konnte. Diese zur Herstellung von Fusidinsäure verwendbaren Mutanten können vom Mutterstamm durch ihre Wachstumsgeschwindigkeit in flüssigen Kulturmedien, durch die Menge an gebildeten Sporen und durch die Form und Farbe ihrer Kolonien auf Agarplatten unterschieden werden und benötigen gegebenenfalls für ein optimales Wachstum den Zusatz besonderer Nährstoffe. Bei ihrer mikroskopischen Prüfung sind keine Unterschiede gegenüber dem Mutterstamm erkennbar.However, the invention is in no way restricted to a use of the mutants mentioned above, since a large number of other fusidic acid producing mutants could also be obtained. This for Production of fusidic acid usable mutants can be derived from the parent strain by their growth rate in liquid culture media, by the Amount of spores formed and differentiated by the shape and color of their colonies on agar plates and may need the addition of special nutrients for optimal growth. at microscopic examination reveals no differences compared to the parent strain.

Der Mutterstamm wurde von K. T u b a k i vom Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland, bezogen und im »Mycological Journal of Nagao Institute«, September 1954, Nr. 4, beschrieben.The dam line was obtained from K. T u b a k i from Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland and in the "Mycological Journal of Nagao Institute", September 1954, No. 4, described.

Das Mycel ist hyalin und hat einen Durchmesser von etwa 1 bis etwa 1,6 μ, die Konidien sind spindelförmig, und aus den Konidienträgern entstehen hyaline einzelne Zellen, die eine lange Kette bilden, von der das äußerste Glied im reifen Zustand abgestoßen wird.The mycelium is hyaline and has a diameter of about 1 to 1.6 μ, the conidia are spindle-shaped, and the conidia carriers develop into individual hyaline cells that form a long chain from which the outermost link is repelled when mature.

Die Größen der Konidien der Mutanten betragen etwa 4,6 bis 6,8 · 1,4 bis 2,0 μ, ähnlich, wie bei dem Mutterstamm.The sizes of the conidia of the mutants are about 4.6 to 6.8 x 1.4 to 2.0 µ, similar to that Mother line.

Nachstehend werden die Größen der aus den obenerwähnten Mutanten isolierten Konidien aufgeführt:The sizes of the conidia isolated from the mutants mentioned above are given below:

Fc-U 404Fc-U 404

6,4-1,6 μ
6,4 · 2,0 μ6.4-1.6 µ
6.4 x 2.0 µ

6.7 -2,0 μ6.7 -2.0 μ

4.8 · 1,6 μ4.8 x 1.6 µ

Leo-U 42Leo-U 42

6,4 · 1,6 μ
4,8 · 1,8 μ6.4 x 1.6 µ
4.8 x 1.8 µ

Leo-U 79Leo-U 79

4,8-1,4 μ
4,8 · 1,6 μ
5,6-1,6 μ
6,4 -1,6 μ4.8-1.4 µ
4.8 x 1.6 µ
5.6-1.6 µ
6.4-1.6 µ

Die verwendbaren Mutanten können ferner, ebenso wie der Mutterstamm, Lactose nicht assimilieren und benötigen Biotin, entwickeln sich daher nicht auf Czapek-Agarplatten.The mutants which can be used, like the parent strain, can furthermore not assimilate lactose and require biotin and therefore do not develop on Czapek agar plates.

Manche dieser Mutanten bilden Fusidinsäure mit höherer Ausbeute als der Mutterstamm.Some of these mutants produce fusidic acid in higher yields than the parent strain.

Die Mutanten Leo-U 42, Leo-U 79 und Fc-U 404 werden im »Commonwealth Mycological Institute« in Großbritannien unter den genannten Bezeichnungen aufbewahrt und können von dort zum Zwecke einer Identifizierung erhalten werden.The mutants Leo-U 42, Leo-U 79 and Fc-U 404 are in the "Commonwealth Mycological Institute" in Great Britain kept under the names mentioned and can be used from there for the purpose of a Identification can be obtained.

Die Erfindung wird an Hand nachstehender Beispiele näher erläutert:The invention is explained in more detail using the following examples:

Beispiel 1example 1

Sporen von 14 Tage alten, in einem Kolben auf dem Substrat 25 A entwickelten Kolonien von Leo-U 42 wurden als Impfmaterial für einen Schüttelkolben von 500 ml Inhalt, der 50 ml eines sterilen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, verwendet:Spores from 14-day-old colonies of Leo-U 42 developed in a flask on substrate 25 A were used as inoculum for a shake flask with a capacity of 500 ml containing 50 ml of a sterile culture medium the following composition was used:

Glycerin 7,5 g/lGlycerin 7.5 g / l

Maisquellwasser 2,5 g/lCorn steep water 2.5 g / l

Fleisch- und Knochenmehl 15,0 g/lMeat and bone meal 15.0 g / l

Glucose 20,0 g/lGlucose 20.0 g / l

MgSO₄-7H₂O 0,05 g/lMgSO ₄ -7H ₂ O 0.05 g / l

NaCl 4,0 g/lNaCl 4.0 g / l

pH = 7,0pH = 7.0

Der Schüttelkolben wurde auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 72 Stunden bei 26 ⁰C bebrütet, um ein vegetatives Wachstum zu erzielen.The shake flask was incubated on a reciprocating shaker for 72 hours at 26 ^° C. in order to achieve vegetative growth.

Ein Teil dieser Kultur wurde als Impfmaterial für 125 ml eines sterilen Kulturmediums der nachstehenden Zusammensetzung verwendet, das sich in einem Kolben von 1000 ml Inhalt befand:A portion of this culture was used as an inoculum for 125 ml of a sterile culture medium of the following Composition used, which was in a flask of 1000 ml content:

Maisquellwasser 20,0 g/lCorn steep water 20.0 g / l

KH₂PO₄ 10,0 g/lKH ₂ PO ₄ 10.0 g / l

MgSO₄-7H₂O 0,5 g/lMgSO ₄ -7H ₂ O 0.5 g / l

Saccharose 50,0 g/lSucrose 50.0 g / l

pH-Wert des Mediums = 6,7pH of the medium = 6.7

Nach dem Impfen wurde das Kulturmedium 120 Stunden bei 25 ⁰C auf einem rotierenden Schütteltisch bebrütet. Anschließend wurde in dem Kulturfiltrat im Agarschalentest gegen Staphylococcus aureus als Testsubstanz eine Fusidinsäurekonzentration von 116 mg/1 gefunden. Die Identität der erhaltenen Verbindung mit Fusidinsäure wurde auf chemischem Wege nachgewiesen.After the inoculation, the culture medium was ^{incubated for 120 hours at 25 °} C. on a rotating shaking table. A fusidic acid concentration of 116 mg / l was then found in the culture filtrate in the agar dish test against Staphylococcus aureus as the test substance. The identity of the compound obtained with fusidic acid was demonstrated chemically.

Beispiel 2Example 2

Ein gläsernes Fermentationsgefäß mit einem Arbeitsvolumen von 51 wurde mit einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung beschickt:A glass fermentation vessel with a working volume of 51 was filled with a nutrient medium from the following composition:

Maisquellwasser 40,0 gCorn steep water 40.0 g

Saccharose 55,0 gSucrose 55.0 g

KH₂PO₄ 5,0 gKH ₂ PO ₄ 5.0 g

MgSO₄-7H₂O 0,5 gMgSO ₄ -7H ₂ O 0.5 g

Leitungswasser ad 1000 mlTap water to 1000 ml

Nach dem Sterilisieren wurde der pH-Wert auf 7,2 eingestellt und das Medium mit 5 Volumprozent einer 48 Stunden alten vegetativen Kultur von Fc-U 404, gezüchtet in einem flüssigen Medium der gleichen Zusammensetzung wie Substrat 25 A, das noch mit 1,5% des unter dem Handelsnamen »Staley's Special Nutrient« bekannten Nährmediums ergänzt worden war, geimpft.After sterilization, the pH was adjusted to 7.2 and the medium with 5 percent by volume 48 hour old vegetative culture of Fc-U 404 grown in a liquid medium of the same Composition like Substrate 25 A, which still contains 1.5% of the under the trade name »Staley's Special Nutrient «well-known nutrient medium had been supplemented, inoculated.

Die Fermentation wurde bei 25 ⁰C unter Rühren mit 470 UpM und Belüften mit 0|2 Volumina steriler Luft je Volumen Kulturflüssigkeit je Minute durchgeführt. Zur Verhinderung des Schäumens wurde erforderlichenfalls Specköl in Mengen von jeweils 0,25 ml zugesetzt. Die Gesamtmenge des während der Fermentation zugesetzten Specköls betrug 40 ml.The fermentation was carried out at 25 ^° C. with stirring at 470 rpm and aeration with 0.2 volumes of sterile air per volume of culture liquid per minute. To prevent foaming, lard oil was added, if necessary, in amounts of 0.25 ml each. The total amount of lard oil added during fermentation was 40 ml.

Nach 40, 64, 88 und 112 Stunden wurden Proben entnommen und in diesen die Menge der entstandenen Fusidinsäure bestimmt. So fand man 10, 85, 185 bzw. 335 mg Fusidinsäure je Liter Kulturmedium. Der zuletzt genannte Wert wurde durch die Gewinnung der Fusidinsäure in reiner Form bestätigt.After 40, 64, 88 and 112 hours, samples were taken and in these the amount of the resulting Fusidic acid determined. 10, 85, 185 and 335 mg of fusidic acid were found per liter of culture medium. Of the The last-mentioned value was confirmed by the recovery of fusidic acid in its pure form.

Bei der Durchführung einer Fermentation mit dem Mutterstamm unter den gleichen Bedingungen fand man nach 112 Stunden in der Kulturflüssigkeit nur 240 mg/1 Fusidinsäure.When carrying out a fermentation with the mother strain took place under the same conditions one after 112 hours in the culture liquid only 240 mg / 1 fusidic acid.

Claims (1)

9 109 10 Patentanspruch: dung L 40063 IVa/30 h,"dadurch gekenn-Claim: dung L 40063 IVa / 30 h, "characterized by this Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum zei chn et, daß man in bekannter Weise erhal-Process for the production of antibiotic zei chn et that one obtains in a known manner ZN-6 (Fusidinsäure) durch Züchtung von Fusi- tene, Fusidinsäure erzeugende Mutanten von Fusi-ZN-6 (fusidic acid) by breeding fusidic acid, fusidic acid producing mutants of fusidic dium coccineum Fuck (K. T u b a k i), Stamm dium coccineum Fuck (K. T u b a k i), Stammdium coccineum Fuck (K. T u b a k i), strain dium coccineum Fuck (K. T u b a k i), strain ATCC14700 und Isolierung der gebildeten Fusidin- 5 ATCC 14700 auf üblichem biologischem WegeATCC14700 and isolation of the fusidin-5 ATCC 14700 formed by the usual biological route säure aus dem Kulturmedium gemäß Patentanmel- züchtet.acid from the culture medium according to patent application. 509 718/415 10.65 © Bundesdruckerei Berlin509 718/415 10.65 © Bundesdruckerei Berlin