DE1543601C

DE1543601C - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

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Publication number: DE1543601C
Application number: DE19661543601
Authority: DE
Inventors: Friedrich Dr.; Steglich Wolfgang Dr.; Bjarnason Jonas; Akhtar Roshan; Khan Nur Muhammad; 8000 München Weygand
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG, vormals Meister Lucius & Brüning, 6000 Frankfurt
Priority date: 1966-06-11
Filing date: 1966-06-11
Publication date: 1973-03-22

Description

Bei der Synthese von asparagin- und glutaminhaltigen Peptiden treten Schwierigkeiten dadurch auf, daß sich Imide bilden können und die Dehydratisierung zu Nitrilen auftritt (vgl. hierzu E. Schröder und K. L ü b k e, The Peptides, Vol. I, Academic Press, New York und London, 1965, S. 110, 203 bis 204 und 191). Außerdem sind die asparagin- und glutaminhaltigen Zwischenprodukte häufig in aprotischen Lösungsmitteln schwer löslich, was die Verwendung von ungewöhnlich großen Mengen Lösungsmittel erforderlich macht.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Kondensation 'von N-Acylaminosäuren oder N-Acylpeptiden mit einer freien oder aktivierten Carboxylgruppe und Aminosäuren oder Peptiden mit einer substituierten Aminogruppe gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in den eingesetzten Aminosäure- und/oder Peptid-derivaten — CO — NH — und/oder — CONH₂-Gruppen vollständig oder teilweise durch 2,4-Dimethoxy-benzyl-Reste substituiert sind und man' gegebenenfalls anschließend die 2,4-Dimethoxy-benzyl-Reste durch Behandlung mit anorganischen' oder organischen starken Säuren, im Falle der Verwendung als ν ■:■:...,'.'.,

ΐ : , ^: ^ ■-TrCO'-i NH —-Substituienten ν ■ -.: ^;' oxybenzxl-amin oder Bis-2,4-dimethoxy-benzyl-säureamiden umsetzt. Zur Herstellung der entsprechenden Derivate des Asparagins oder Glutamins geht man von den N-Acyl-Λ-estern der Asparaginsäure und Glutaminsäure aus und setzt sie in derselben Weise mit 2,4-Dimethoxybenzyl-amin oder ■ Bis-2,4-dimethoxybenzyl-amin um. - _t _{s r}· '

2,4-pirriethoxybenzyl-amin wird beispielsweise aus 2,4-Dimethoxybenzaldehyd-oxim .durch ;katalytische

ίο Hydrierung gewonnen und Bis-2,4-dimethoxybenzylamin aus dem i^-Dimethoxybenzoesäure-^-dimethoxybenzylamid mit Lithiumaluminiumhydrid. .

Für die praktische Verwendbarkeit der 2,4-Dimethoxybenzyl-amide in der synthetischen Peptidchemie ist von Bedeutung, daß sie von Trifluoressigsäure bei 0°C innerhalb vonlO Minuten nicht abgespalten werden, ebenso nicht bei der Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak und beim Schütteln mit Pd-Kohle und Wasserstoff in Methanol bei Raumtemperatur und

ao Normaldruck. ''"..'■

Nach der Abspaltung der Acylschutzgruppen, die unter diesen Bedingungen entfernbar sind (wie der tert. - Butyloxycarbonylrest, der ρ - Methoxy - benzyloxycarbonyl-rest und der Benzyloxycarbonyl-rest), werden die durch 2,4-Dimethoxybenzyl-Reste substituierten Aminosäure-amide in üblicher Weise zu Peptidsynthesen eingesetzt. Die durch 2,4-Dimethoxybenzyl-Gruppen substituierten Amide sind im Gegensatz zu den nicht substituierten in aprotischen Lösungsmitteln gut löslich.

Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft, beispielsweise für die Synthese von Benzyloxycarbonyl-L - prolyl - L - leucyl - glycin - 2,4- dimethoxybenzylamid nach folgendem Reaktionsschema 1

35 Schema 1

Z-GIy-OH + DMB-amin
. I DCCD oder Inamin

40 Z-GIy-NH-DMB

Na/flüssiges NH₃ oder Pd/H₂

45 Z-L-Lep-OH + GIy-NH-DMB

. /·".■;■■■' '■'■..";■ I DCCD oder Inamin
Z-L-Leu -f GIy-NH-DMB

Na/flüssiges NH₃ oder Pd/H₂

Z-L-Pro-OH-f- L-Leu-Gly-NH-DMB \ ₍-

5°, i^:_f;7.r:. ''■:■%-Vv; :i 11- Ί ;DCCD oder Inamin

:>: \-J\ Z-L-Pro-iiLeu-Gly-NH-DMB

auch durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak, abspaltet. .*'■' '"''.'■'■' . ': .' Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die oben geschilderten Schwierigkeiten dadurch vermieden, daß zum Schutz der Säureamidfunktion der 2,4-_e Dimethoxybenzylrest, nachstehend in /den Formeln als »DMB« abgekürzt, verwendet wird. Er dient sowohl zur reversiblen Blockierung von primären Säureamiden —CO—NH₂ als auch von sekundären Säureamiden—CO—NH-, wie sie in Peptidbindungen Vorliegen.

In einem primären Säureamid sind von den beiden Η-Atomen eines oder beide durch 2,4-Dimethoxybenzyl-Reste ersetzbar. Man stellt solche Verbindungen her, indem man N-Acylaminosäuren mit 2,4-Dimeth-(Z = Benzyloxycarbonyl-; DCCD = Dicylohexylcarbodiimid;,; Inamin = Methyl-äthinyl-diäthylamin).

Die Bis - 2,4 - dimethoxybenzyl - amid - Derivate des Glutamins und Asparagins zeigen eine hervorragende Löslichkeit in aprotischen Lösungsmitteln; außerdem wird Imidbildung und Dehydratisierung verhindert. Hierin liegt ein besonderer Vorteil gegenüber den bisherigen Methoden zur Synthese von glutamin- bzw. asparaginhaltigen Peptiden. Das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise für die Synthese von ρ - Methoxy - benzyloxycarbonyl - l - glutamyl - (γ - bis-DMB-amid)-L-valinmethylester, kann wie folgt durchgeführt werden:

ρ - Methoxy - benzyloxycarbonyl - L - glutaminsäurea-benzylester wird mit Bis-2,4-dimethoxybenzyl-amin

3 4

und Dicyclohexylcarbodiimid oder Methyl-äthinyl- daß die in der Peptidbindung durch den 2,4-Dimeth-

diäthylamin zum ρ,-Methoxy - benzyloxy - carbonyl- oxybenzyl-Rest substituierten Derivate eine viel größere

L- glutaminsäure - α - benzylester - γ - bis - 2,4 - dimeth- Löslichkeit in aprotischen Lösungsmitteln besitzen als

oxybenzylamid umgesetzt. Nach Verseifung des Ben_: die nicht substituierten. Da durch die Blockierung die

zylesters wird mit L-Valin-;methylester mittels Dicyclo- 5 Ausbildung von Wasserstoffbrücken unmöglich wird,

hexylcarbodiimid oder Methyl-äthinyl-diäthylamin der . sind Aggregationen herabgesetzt, was für den Aufbau

p-Methoxy - benzyloxy - carbonyl - l - glutamyl- von Sequenzpolymeren und die Gewinnung von

(γ - bis -DMB r amid) -. L -valin - methylester her- cyclischen Peptiden (Ausbleiben von Verdopplungs-

gestellt. ■■;■ > ' . " < reaktionen) günstig ist. Hierbei ist es nicht notwendig,

In derartigen Derivaten des Glutamins oder Aspara- io alle Peptidbindungen durch DMB-Reste zu blockieren. ;

gins, mit geschützter Amidgruppe istes möglich, die Peptide, deren Peptidbindungen durch den N-2,4-Di-

Estergruppe zu .verseifen . und die Peptidkette. am methoxybenzyl-Rest substituiert sind, werden aus den

Carboxylende zu verlängern oder die Aminoschutz- entsprechenden. N-2,4-dimethoxybenzyl-substituierten

gruppe zu entfernen und die Peptidkette am Amino- , Aminosäuren nach üblichen Kondensationsmethoden '

ende zu verlängern. Bei der Abspaltung von p-Meth- 15 erhalten.DieN-2,4-Dimethoxybenzylaminosäurenwer-;

oxybenzyloxycarbonyl- oder tert. - Butyloxycarbonyl- den aus 2,4-Dimethoxybenzaldehyd und Aminosäuren

Resten mit Trifluoressigsäure unter Zusatz von Anisol durch Reduktion mit Natriumborhydrid oder kataly-

wird gleichzeitig auch ein DMB-Rest entfernt, was tische Reduktion erhalten. Die N-(2,4-Dimethoxy-

aber für die weiteren'Peptidsynthesen belanglos ist. benzyl)-amihosäuren können wie α-Aminosäuren mit

Der 2,4-Dimethoxybenzyl-Rest dient auch zur re- 20 alkoholischer Salzsäure verestert werden, wobei der

versiblen Blockierung von sekundären Säureamid- 2,4-Dimethoxybenzyl-Rest nicht abgespalten wird,

funktionen — CO — NH-, wie sie in Peptidbindun- Das Verfahren verläuft beispielsweise für die Syn-

gen vorliegen. Hierdurch werden Nebenreaktionen these von ρ - Methoxy - benzyloxycarbonyl - glycyl-

bei Peptidsynthesen, wie die Acylierung der Peptid- [(DMB) - glycyl]₃ - (2,4 - dimethoxybenzyl) - glycin-

bindung, vermieden. Von besonderer Bedeutung ist, 25 methylester gemäß nachfolgendem Reaktionsschema 2:

■ , Schema 2

pMZ-Gly-OH + N-(DMB)^GIy-OCH₃ ^T

' 1 DCCD oder Inamin .

PMz-GIy-N-(DMB)-GIy-OCH₃

I NaOH; Citronensäure ·

pMZ-Gly-N-(DMB)-GIy-OH + N-(DMB)-GIy-OCH₃

■ ■ .. .j DCCD oder Inamin ■ ' / ■.-:;-:- . ,'. , .

pMz-Gly-N-(DMB)-Gly-N-(DMB)-Gly-OCH₃ : '''V

. ... .. I NaOH; Citronensäure .

^V. PMz-GIy-N-(DMB)-GIy-N-(DMB)-GIy-OH^-N-(DMB)-GIy-OCH₃

^;'.-■-: ''-.-';,.. M- ·;'■'■' ■ j ; DCCD oder Inamin · ' - '

■';■:,'"I-^; _;. " CpMZ-GIy-[N-(DMB)-GIy]₂-N-(DMB)-GIy-OCH₃ , . .

·.■■''--■'■ ■'■.■:■■· :i--<-\.':f. ■■■':'> ~'':·:-:?~<'.^:ϊ ^i:i ' 'NaOH; Citronensäure ._:■ ■■:;;.·■'■■'^;- ■.'

.'■'■ ■ ' ' VV; ^;:; Ψ PMz-GIy-[N-(DMB)-GIy]₂-N-(DMB)-GIy-OH + N-(DMB)-GIy-OCH₃ ' ^;Λι ' j DCCD oder Inamin ^;

PMz-GIy-[N-(DMB)-GIy]₃-(DMB)-GIy-OCH₃

\ (pMz = p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-;DCCD = Dicyclohexylcarbodiimid; Inamin = Methyl-äthinyl-diäthylamin). - . .

Die 2,4-Dimethoxybenzyl-Reste werden von der se- sich aus Benzyloxycarbonyl-glycyl-N-(2,4-dimethoxy-, kundären Säureamidgruppierung (Peptidbindung) bei- benzyl)-glycin chromatographiseh einheitliches Benzylspielsweise durch mehrstündige Einwirkung yon Tn-'':.' oxycarbonyl - glycyl - glycin, ρ - Methoxy - benzyloxyfluoressigsäure bei 20⁰C unter Zusatz von Anisol, um . carbonylglycyl - N - (2,4 - dimethoxybenzyl) - glycin die Dimethoxybenzylkationen abzufangen, abgespal- 55 liefert mit Ameisensäure'l5 Minuten lang zum Sieden ten. Man kann auch kürzere Zeit bei erhöhten Tempe- erhitzt in der Hauptsache Glycyl-glycin neben wenig raturen arbeiten. So liefert Benzyloxycarbonyl-glycyl- ■ Glycyl-(2,4-dimethoxybenzyl)-gtycin. -ί; ^^:S -' N-(DMB)-glycih bei 20stündiger Einwirkung von Tri- 'Die Abspaltung der 2,4-Dimethoxybenzyl-Gruppe fiuoressigsäure bei 20⁰C sowie bei lstündigemKocheh ν von der Peptidbindung kann auch mit Natrium in Glycylglycin. ρ - Methoxy-benzyloxy - carbonyl - gly- 60 flüssigem Ammoniak ausgeführt werden. Benzyloxycyl-N-(DMB)-glycin ergibt bei der Einwirkung von i carbonyl - glycyl - N - (2,4 - dimethoxybenzyl) - glycin Trifluoressigsäure bei O⁰C während 10 Minuten nur ■ ergibt z. B. bei der Reduktion bei der Siedetemperatur Glycyl-N-(DMB)-glycin, aber bei der 12stündigen Ein- des flüssigen Ammoniak mit Natrium Glycyl-glycin wirkung von Trifluoressigsäure bei 20° C oder bei in 91°/_oiger Ausbeute. 30minutigem Kochen entsteht Glycyl-glycin. 65 Von der primären Säureamidgruppe wird der

Der DMB-Rest kann auch mit Hilfe von Ameisen- 2,4-Dimethoxybenzyl-Rest bei der Reduktion mit säure durch Erhitzen abgespalten werden. Beim 20 Mi- Natrium und flüssigem Ammoniak nicht entfernt. Bennuten langen Kochen (unter Zusatz von Anisol) bildet zyloxycarbonyl - glycin - (2,4 - dimethoxybenzyl) - amid

10

liefert Glycin - (2,4 - dimethoxybenzyl) - amid. Trifluoressigsäure spaltet dagegen bei mehrstündiger Einwirkung bei 20° C oder in der Siedehitze den 2,4-Dimethoxybenzyl-rest ab. .Dasselbe wird mit siedender Ameisensäure erreicht. So liefert Benzyloxy-carbonylglycin-amid mit Trifluoressigsäure (24 Stunden) bei 20°C oder mit siedender Ameisensäure (10 Minuten) Benzyloxycarbonyl-glycin; beim Erhitzen mit Trifluor-, essigsaure (45 Minuten) entsteht Glycin-amid. Das Benzyloxycarbonyl -L - asparaginsäure - β r (bis-2,4 dimethoxybenzyl)-amid liefert beim Erhitzen mit Trifluoressigsäure(45 Minuten) optisch reines L-Asparagin.

Bei der Abspaltung von 2,4-Dimethoxybenzyl-Resten bestehen starke Differenzierungen gegenüber den verschiedenen . Amino- und Carböxylschutzgruppen, so daß durch 2,4-Dimethoxybenzyl-Reste substituierte Peptide sowohl am Amino-. wie .am Carboxylende verlängert werden können.

Da die Abspaltung des DMB-Restes vqn der Säureamidfunktion durch Säuren auf der Resonanzstabilisierung des intermediär gebildeten Dimethoxy-benzylkations beruht, können auch andere, durch mehrere elektronenliefernde Reste substituierte Benzylreste, z. B. der 2,4,6-Trimethoxybenzylrest, an Stelle des Dimethoxy-benzylrestes verwendet werden.

Die Verfahrensprodukte haben nach Abspaltung der Schutzgruppen entweder selbst biologische Wirkung, oder sie können für weitere Synthesen als Zwischenprodukte verwendet werden.

Beispiell

Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-a-benzylester-/?-(bis-2,4-dimethoxy-benzyl)-amid

2,48 g Benzyloxycarbonyl - l - asparaginsäurea-benzylester und 2,0 g Bis-(2,vuimethoxy-benzyl)-amin werden in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst. Unter Rühren läßt man die Lösung von 0,78 g Methyl-äthinyl-diäthylamin in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran binnen 30 Minuten eintropfen. ;

Sodann wird das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, der Rückstand in Essigester gelöst, die Essigesterlösung je zweimal mit 5%iger Citronensäurelösung, ges. Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther digeriert. Ausbeute 3,92 g (94%)..Der Ester wird anschließend verseift (Beispiel 2). .

-.⁰^-ViV. ■'.'/ -:^j :.' .;.'■ ■: ■ ^: B e i s ρ i e 1 2 , ■ ' ■". · .

ir;; Benzyl oxycarbonyl-L-asparaginsäure-/S-(bis-• ν : 2,4-dimethoxy-benzyl)-amid

3,92 g des nach Beispiel 1 gewonnenen Benzylesters werden mit 10Ö ml Dioxan/ln-NaOH (1:1 Volumen) 2 Stunden bei 20° C gerührt. Sodann wird das Dioxan weitgehend im Vakuum abdestilliert, die wäßrige Lösung mit Äther ausgeschüttelt, durch Evakuieren von Resten Äther befreit und mit Citronensäure angesäuert. , Ausbeute 3,0 g (84%), Schmp. 70 bis 73° C, [<x]_s% = +10,4° (c = 2 in Methanol). ' .... dampft, der Rückstand in Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wird mit Äther und Chloroform ausgeschüttelt, worauf die wäßrige Lösung mit einem schwach basischen Ionenaustauscher neutralisiert wird, z. B. mit Amberlite IR 45. Beim Eindampfen im Vakuum kristallisiert das L-Asparagin aus. Es wird aus Wasser/Äthanol umkristallixiert. Ausbeute ' 86 %, Schmp. und Mischschmelzpunkt 220 bis 222°C. ^;

Beispiel 3
L-Asparagin

0,5 g der nach Beispiel 2 erhaltenen Verbindung werden 45 Minuten in 10 ml Trifluoressigsäure unter Rückfluß erhitzt. Sodann wird im Vakuum einge-Bei spi el 4

p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäurea-benzylester-/S-(bis-2,4-dimethoxy-benzyl)-amid

6,25 g ρ - Methoxy - benzyloxycarbonyl -L- asparaginsäure-a-benzylester und 4,90 g Bis-2,4-dimethoxybenzylamin werden in 50 ml Tetrahydrofuran mit 1,89 g Methyl-äthinyl-diäthylamin in 50 ml Tetrahydrofuran - analog Beispiel 1 umgesetzt. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 1. Ausbeute 9,1 g (85 %), nicht kristallisiert. Der Ester wird anschließend verseift (Beispiel 5). ■■'■■■

B e i s ρ i e 1 5

p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäurejS-(bis-2,4-dimethoxy-benzyl)-amid '

0,85 g des nach Beispiel 4 hergestellten Benzylesters werden in 40 ml Dioxan/ln-NaOH (1:1 Volumen) 5 Stunden bei 20°C gerührt. Die Aufarbeitung wird analog Beispiel 2 vorgenommen. Ausbeute. 0,71 g (97%), Schmp. 62 bis 65°C(unscharf). [«]$ = + 31,3° (c = 5 in Benzol).

Beispiel6

Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-^-(bis-2,4-dimethoxy-. benzylJ-amid-L-leucin-methylester

0,60 g Benzyloxycarbonyl. - l - asparaginsäure-/?-(2,4-dimethoxybenzyl)-amid (von Beispiel 2), 0,195 g L-Leucin-methylesterhydrochlorid und 0,120 g Triäthylamin werden in 5ml Methylenchlorid gelöst.. ■Innerhalb 45 Minuten fügt man 0,13 g Methyläthinyl-diäthylamin in 2 ml Methylenchlorid zu/Nach weiteren 2 Stunden wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen, die •Essigesterlösung mit verdünnter Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther digeriert. Er wird der Verseifung unterworfen (Beispiel 7).

B ei spiel 7

Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-/?-(bis-2,4-dimethoxy-benzyl)-amid-L-leucin

0,25 g des nach Beispiel 6 gewonnenen Benzylesters werden mit Natriumhydroxyd in wäßrigem Dioxari analog Beispiel 2 verseift und aufgearbeitet. Ausbeute 0,21 g (87 .%),[«]& = +1,5° (c = 2 in Methanol). V

■;' ■ ■'· ■ ^;-'"v B eis.ρie 18 '.'■'';;■ ''yi~Y^'^:f'

p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäureix-benzylester-y-bis-(2,4-dimethoxy-benzyl)-amid

1,40 g p-Methoxy - benzyloxycarbonyl - L - glutaminsäure-a-benzylester und 1,11 g Bis-2,4-dimethoxy-benzylamin werden in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und im Verlaufe von 30 Minuten

mit der Lösung von 0,43 g Methyl-äthinyl-diäthylamin . Beispiel 12

in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran tropfenweise ver- _ . " , . , \ , . ~ . ,. ,

setzt. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 1. Nach Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-glycin-l^.dimethoxy-

Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther 1,75g '' τ ^ benzylamid .

(72%), Schmp. 98 bis 99°, [<x]& = —13,8°C (c = 5 in 5 = 2,65 g Benzyloxycarbonyl-L-leucin und 2,24 g GIy-Benzol). cin-2,4-dimethoxy-benzylamid werden in 50 ml Tetra-

_n . . . hydrofuran gelöst und bei 20°G langsam mit der

Beispiel y Lösung von 1,22 g Methyl-äthinyl-diäthylamin in

p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure- " " 30 ml Tetrahydrofuran versetzt. 30 Minuten nach be- «-bis-(2,4-dimethoxy-benzyl)-amid ¹⁰ «ⁿ.^d^^ter Zugabe ™^{rd im} Vakuum eingedampft, der

Ruckstand in Essigester aufgenommen, die Essigester-

0,50 g des nach Beispiel 8 hergestellten Benzylesters -lösung mit 0,5n-HCl, gesättigter Natriumhydrogenwerden in 40 ml Dioxan/ln-NaOH (1:1 Volumen) ge- ; carbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumlöst und 8 Stunden bei 20 C gerührt. Die Aufarbeitung sulfat getrocknet und eingedampft. Die Verbindung erfolgt analog Beispiel 2. Ausbeute 0,41g (94%), 15 kristallisiert aus Essigester/Petroläther. Ausbeute 4,1 g Schmp. 66 bis 68⁰C,[a]/« = —8,2° (c = 5 in Meth- ; (87%), Schmp. 120 bis 126°C, nach nochmaligem anol). ."■- -y.'l·.""'. Umkristallisieren'aus Essigester/Petroläther Schmp.

^; Beispiel 10 ^; '■■'■ ,130 bis 131°C, [«]& = +9,8° (c = 1 in Methanol).

τ, ι u ι ι · ι λ j· λ ι. ι . , ω B e i S ρ Ι β 1 13

Benzyloxycarbonyl-glycin^^-dimethoxy-benzyl-amid

„ _, „ , , , >, . j-- ,,_η. L-Leucyl-glycin^^dimethoxy-benzylamid

, 8,76 g Benzyloxycarbonyl-glycm und 7,5 g 2,4-Di-

methoxybenzylamin werden in 150 ml Tetrahydro- 6,53 g der nach Beispiel 12 erhaltenen Verbindung

furan und 25 ml Dimethylforamid gelöst, wobei das werden analog Beispiel 11, b) mit Natrium in flüssigem

Salz ausfällt. Nun werden unter starkem Rühren as Ammoniak reduziert. Man erhält zunächst 4,9 g

innerhalb !Stunde 5,5g Methyl-äthinyl-diäthylamin öliges Rohprodukt, das mit 0,5ml methanolischer in 50 ml Tetrahydrofuran zugetropft. Dabei entsteht^λ Salzsäure durch Zusatz von Äther in das kristallisierte

eine klare Lösung. Nun wird im Vakuum eingedampft Hydrochlorid überführt wird. Ausbeute 4,62 g (89 %),

und mit Wasser und wenig Essigsäure versetzt. Dabei Schmp. 155 bis 162° C (Zersetzung),

kristallisiert die Verbindung aus. Sie wird mit viel 30

Wasser und Petroläther gewaschen. Ausbeute 8,72g Beispiel 14 . '-.-.■.■

(58%), Schmp 112 bis 114° C, nach Umkristallisieren Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-i-leucyl-glycin-

aus Essigester/Petroläther Schmp. 115°C. 2,4-dimeihoxy-benzylamid

. ...Beispiel 11 35 2,8 g des nach Beispiel 13 erhaltenen Hydrochloride

Glycin-2,4-dimethoxy-benzyl-amid ™?^en _t ™ φ ml Tetrahydrofuran suspendiert und mit

a) Durch katalytisch Hydrierung r- , ;r ^⁰⁵ ml Tnathylarmn 15 Mmutenbei 20⁰C gerührt.

■ :-.;.■:. Dann fugt man 1,85 g Benzyloxycarbonyl-L-prolin

0,5 g der nach Beispiel lO erhaltenen Verbindung carbodiimid hinzu. Nach Rühren über Nacht wird der werden in 30 ml absolutem Methanol und 1 ml 40 ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abgesaugt, worauf 0,5normaler methanolischer Salzsäure in Gegenwart .analog Beispiel 12 aufgearbeitet wird. Nach Kristallivon 20 mg Pd-Kohle Katalysator hydriert, bis kein ' sation aus Toluol/Petroläther 2,74 g (63%), Schmp. Kohleridioxyd mehr entwickelt wird. Der Katalysator 80 bis 86° C. Der Schmelzpunkt steigt beim Umkristalliwird abnitriert, das Filtrat eingedampft, der Rück- sieren aus Essigester/Petroläther auf 95 bis 96° C, stand zwischen Essigester und Natriumhydrogen- 45 [«]/« = —48,7° (c = 1 in Methanol). ■ ' , carbonatlösung verteilt, die Essigesterlösung mit

Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Ausbeute Beispiel 15

an öligem Glycin^^-dimethoxy-benzylämid 90%, _{w iL} , ^λ , ■ ■ , , . " , _XT ,- · ,.

Schmp? des HydrochloridsSIS?" bis 188°C,dümi: - P^ethoxy-benzyloxycarbonyl-glycy-N-(2,4-di- - schichtehromatiraphisch teinheitlich ί (Kieselgel G, 50 methoxy-benzyO-glycin-methylester , ._r

n-Butaiiol—Essigsäure—Wasser [4:1: i Volumen], R_f 2,39 g p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-glycin und

0,45). , '2,39 g N-(2,4-Dimethoxy-benzyl)-glycin-methyl-

b) Durch Reduktion mit Natrium in flüssigem «£ ^?ⁿ j^{n 3}P.^¹ Tetrahydrofuran gelöst. Inner-

Ammoniak Minuten laßt man die Losung von 1,3 g Me-

55 thyl-äthinyl-diäthylamin in 20 ml Tetrahydrofuran

4 g der nach Beispiel 10 erhaltenen Verbindung zutropfen. Die übliche Aufarbeitung ,(Eindampfen, werden in etwa 100 ml flüssigem Ammoniak gelöst, ΐ Lösen in Essigester, Waschen der Essigesterlösung mit Nun wird unter Kühlung mit _: Trockeneis/Aceton :. '^: 5%iger Citronensäure, gesättigter Natriumhydrogen-Natriüm in kleinen Stücken unter Schütteln zugegeben, carbonatlösung und Wasser, Trocknen mit Natrium- > bis eine bleibende Blaufärbung auftritt.' 5 Minuten 60 sulfat und Eindampfen) liefert die Verbindung als öl. danach wird der Natriumüberschuß durch Zugabe von Es wird der Verseifung unterworfen (Beispiel 16). ^ Methanol beseitigt, worauf das Ammoniak abgedampft " " . '.'.'■'-"' ■

wird. Der Rückstand wird zwischen Essigester und 'Beispiel 16

wenig Wasser verteilt. Die Essigesterlösung wird mit p-Mcthoxy-bcnzyloxycarbonyl-glycyl-N-(2,4-di- .

Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Es hinter- 65 mcthoxv-benzvh-elvcin

bleiben 2,29 g (91%) an öligem Glycin-^-dimethoxy- mclftoxy benzyl) glycin

benzylamid, identisch mit der nach a) hergestellten Das nach dem voranstehenden Beispiel erhaltene

Verbindung. Produkt wird in 20 ml Aceton gelöst, worauf 11 ml

9 10

In-NaOH zugegeben werden. Man rührt zunächst r · · ι iq

2 Stunden bei 2O⁰C und dann 1 Stunde bei 40⁰C. Hier- , Beispiel i*.

bei fällt das Natriumsalz aus. Es wird abgesaugt, in p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-glycyl-[N-(2,4-di-

Wasser suspendiert und mit einem Überschuß an methoxy - benzyl) - glycyl]₂ - N - (2,4 - dimethoxy-Citronensäure gerührt. Mit Essigester wird das Di- 5 benzvD-glvcin

peptid-derivat ausgeschüttelt. Ausbeute 3,5g (79%), . - .

Schmelzpunkt nach zweimaligem Umkristallisieren aus 0,653 g der nach Beispiel 18 erhaltenen Verbindung

Essigester/Petroläther 102 bis 103⁰C. ..·. " , und 0,263 g N-(2,4-Dimethoxy-benzyl)-glycin-methyl-.

; ■ ·:.;■■.- .'■. , ^: : ' .'·'. - ester werden in 50 ml Tetrahydrofuran/Dimethylform-

' :ir - _v ■ ,^Beis,P^{ieI 17}' .· ίο amid (4:1 Volumen) mit 0,12 g Methyl-äthinyl-di-

··._■ ^:·:.'^ : '^ Glycyl-glycin \ äthylamin in 10 ml Tetrahydrofuran tropfenweise ver-

' Vn ι ' u ,vtt/j· Vu -setzt- Nach 1 Stunde wird analog Beispiel 15 auf-

a) aus Benzyloxycarbonyl-N-(2,4-dimethoxy- gearbeitet. Der ölig erhaltene Ester wird^ur Versei-

. benzylj-glycin : ' fung in 20 ml Dioxan/Aceton (1:1 Volumen) gelöst

Diese Verbindung, die analog der p-Methoxy-ben- 15 und mit 5 ml In-NaOH versetzt. Die übliche Auf-

zyloxycarbonyl-Verbindung (Beispiel 15 und 16) dar- arbeitung liefert 0,75 g (86%), Schmp. 110 bis 114°C

gestellt wird, liefert beim 20stündigen Stehen in Tri-' (aus Essigester). * '

fluoressigsäure unter Zusatz von Anisol Glycyl-glycin. r · 1 on

Die Lösung wird im Vakuum eingedampft, der Rück- Beispiel 20 \

stand wird zwischen Wasser und Äther verteilt, die «, p._Methoxy-benzyloxycarbonyl-gIycyl-[N-2,4-diwaßnge Phase wird mit einem schwach basischen methoxy-benzyl)-glycyl]₃-N-(2,4-dimethoxy-

Ionenaustauscher neutralisiert und eingedampft. Das benzvlVelvcin ^x

erhaltene Glycyl-glycin ist dünnschichtchromatogra-

phisch mit einer authentischen Probe von Glycyl- 0,43 g der nach Beispiel 19 gewonnenen Verbindung

glycin identisch. 35 und 0,144 g N-(2,4-Dimethoxy-benzyl)-glycin-methyl-

Dasselbe Ergebnis wird erreicht, wenn die Ausgangs- ester werden in 20 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Diverbindung mit Trifluoressigsäure unter Zusatz von methylformamid gelöst und mit 0,066 g Methyl-Anisol 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt wird. äthinyl-diäthylamin in 8 ml Tetrahydrofuran tropfen-

Wird Benzyloxycarbonyl-N-(2,4-dimethoxy-benzyl)- weise versetzt. Nach 1 Stunde wird wie bei Beispiel 15

glycin in 99%iger Ameisensäure 20 Minuten unter 30 aufgearbeitet. Die Verseifung des^: Esters erfolgt in

Rückfluß erhitzt, so resultiert nach der üblichen Auf- 10 ml Aceton und 5 ml Dioxan mit 4 ml In-NaOH

arbeitung in 79%iger Ausbeute Benzyloxycarbonyl-· (6 Stunden bei 20⁰C). Die nach der üblichen Auf-

glycyl-glycin, identisch mit einer authentischen Probe, arbeitung erhaltene Verbindung enthält noch wenig

,. ,, ', , , , , _VT ,_ . .. unveränderten Ester, der durch Filtration über Alu-

b)au_Sp-Methoxy-benzyIoxycarbonyl-N-(2₎4Kh- ^„^ο^ (Aktivität III, neutral),' Lösungsmittel

methoxy-benzyO-glycm Essigester/Petroläther (1:1, Volumen) abgetrennt wird.

Die Verbindung (Beispiel 16) liefert bei der 12stün- . Die gesuchte Verbindung wird mit Methanol eluiert.

digen Behandlung mit Trifluoressigsäure unter Zusatz Ausbeute 0,20 g (77%), Schmp. 114 bis 118⁰C. von Anisol in guter Ausbeute Glycyl-glycin. Es sind

noch Spuren Glycyl-N-(2,4-dimethbxy-benzyl)-glycin 40 : ; Beispiel 21

dünnschichtchromatographisch nachweisbar. 30 Mi- , .-.·_ , ,. , . :, ';,- .'',.-' .. '

nuten langes Kochen mit Trifluoressigsäure liefert , Benzyloxycarbonyl-g ycyl-N-(2,4-dimethoxy-

reines Glycyl-glycin in sehr guter Ausbeute. Die Ab- -^ ^: -

spaltung beider Schutzgruppen erfolgt auch durch 0,69 g Benzyloxycarbonyl-glycin, 1,0 g N-(2,4-Di-

20 Minuten langes Kochen mit 99%iger Ameisensäure 45 methoxy - benzyl) ? l.- leucin - methylester - hydrochlounter Rückfluß. , ~ rid und 0,3 g Triethylamin werden in 10 ml Methylen-,

_ _R . "■' i- V₁O chlorid nach Zusatz von 0,65 g Dicyclohexylcarbo-

- ^eisP^ie diimid über Nacht gerührt. Die Aufarbeitung analog

p-Methoxy-ben_Zyloxycarbonyl-glycyl-N-(2,4-di- , Beispiel 15' liefert 1,30 g (89 %), Benzyloxycarbonyl-

methoxy - benzyl) - glycyl - N - (2,4 - dimethoxy - ben- ⁵° ^yI - N - (2,4 - dimethoxy - benzyl) -1 - leucin - me-, 2vD elvcin - ' ^; thylester. Zur Verseifung wird er in 20 ml Dioxan/

^v ; ' :^v: > : yj&y ln-NaOH(l:l Volumen) 12 Stunden bei 20⁰C stehen-

2,45 g ρ - Methoxy - benzyloxycarbonyl - glycyl- gelassen. Die übliche Aufarbeitung liefert 0,7 g (41 %). N-(2,4-dimethoxy-benzyI)-glycin und 1,3 g N-(2,4-Di- ■ -, _Λ ,■

methoxy-benzylj-glycin-methylester werden in 30ml 55 ' " Beispiel 22..■'._■.

Tetrahydrofuran gelöst und mit 1,2g Dicyclohexyl- Glycyl-L-leucin ^ ■

carbodiimid in 20 ml Tetrahydrofuran tropfenweise ν , i -. · ,1 -

binnen 30 Minuten versetzt. Am nächsten Tag wird Die nach Beispiel 21 erhaltene Verbindung wird in '

der Dicyclohexylhamstoff abgesaugt, das Tetrahydro- 5 ml Trifluoressigsäure 45 Minuten lang zum Sieden

furan verdampft und der Rückstand analog Beispiel 15 60 erhitzt. Nach dem Abdampfen der Trifluoressigsäure aufgearbeitet. Sodann wird die Estergruppe verseift, wird mit Wasser digeriert und mit Äther ausgeschüttelt., indem man den erhaltenen Rückstand in 40 ml Die wäßrige Phase wird mit einem schwach basischen Aceton/Dioxan (1:1 Volumen) löst und mit 10 ml Ionenaustauscher neutralisiert und eingedampft. Man In-NaOH über Nacht rührt. Die übliche Aufarbeitung erhält Glycyl-L-leucin in 83%iger Ausbeute, [<x]g„

liefert 2,53 g (77%), Schmp. 130 bis 131°C. Schmelz- 6₅ = —37,2° (c = 2 in H₂O) in Übereinstimmung mit der punktdesDicyclohexylammoniumsalzesl37bisl38°C. Literatur.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Kondensation von N-Acyl-aminosäuren oder N-Acylpeptiden mit einer freien oder aktivierten Carboxylgruppe und Aminosäuren oder Peptiden mit einer substituierten Aminogruppe, dadurch gekennzeichnet, daß in den eingesetzten Aminosäure- und/oder Peptid-derivaten -

, — CO -4 NH- und/oder — CONH₂-Gruppen

vollständig oder teilweise durch 2,4-Dimethoxybenzylreste substituiert sind und man gegebenenfalls anschließend die 2,4-Dimethoxy-benzylreste durch Behandlung mit anorganischen oder organischen starken Säuren, im Falle der Verwendung als — CO — NH -—Substituenten auch durch Behandlung mit Natrium in" flüssigem Ammoniak abspaltet.