DE1517733C - Verfahren zur Herstellung eines für die Impfung von Leguminosen-Samen geeigneten B akterienpräparates - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zui Herstellung terien ein Unterschied der Fähigkeit, trockenen und eines für die Impfung von Leguminosen-Samen ge- heißen Bedingungen zu widerstehen, vorliegt und daß eigneten Bakterienpräparates. Diese frei in der Erde Rhizobium-Bakteri'en als unterschiedliche Stämme lebenden Bakterien besitzen die Fähigkeit, die Wurzeln verschiedener Widerstandsfähigkeit auftreten,
von Pflanzen, die zu der Familie Leguminosae gehören, 5 Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung zu befallen: Dabei bilden sich an den Wurzeln der Le- eines für die Impfung von Leguminosen-Samen geguminosen Knötchen, und unter bestimmten Bedin- eigneten Bakterien-Präparates ist dadurch gekenngungen kennen diese Knötchen den Stickstoff der Luft zeichnet, daß man Rhizobium-Bakterien mit guten in eine organisch gebundene Form umwandeln. Diese Befall- und Stickstoff bindungsfähigkeiten in VerTatsache'benutzt man in der Landwirtschaft zur Bo- io bindung mit einer bestimmten Leguminosen-Art in denverbesserung. an sich bekannter Weise auf einem Kulturmedium

Weiterhin ist bekannt, daß bestimmte Rhizobium- züchtet, die so erhaltene Bakterienkultur bei einer

Stämme mit bestimmten Leguminosen eine Stickstoff Temperatur von höchstens 95° C trocknet und sodann

bindende Symbiose bilden. Beispielsweise bindet das Züchten und Trocknen der Bakterienkultur we-

Rhizobium trifoli Stickstoff mit Klee, nicht aber mit 15 nigstens noch einmal wiederholt. Zweckmäßig trock-

Erbsen und Wicken, und Rhizobium leguminosarum net man jeweils mindestens 7 Tage,

bindet Stickstoff bei Erbsen und Bohnen, nicht aber bei Günstigerweise wird das Züchten und Trocknen so

Klee. oft wiederholt,- bis mindestens 90°/₀ der Bakterien

Die deutsche Patentschrift 1 056 082 beschreibt ein beim Trocknen an Luft überleben. Das Trocknen kann Verfahren zur Herstellung eines Azotobakter-Präpa- 20 beispielsweise durch Überführen der Bakterienkultur rates durch Züchtung von Azotobakter-Kulturen in auf ein Trockenmittel, beispielsweise mit hygroskopieinem Kulturmedium und anschließende Trocknung sehen Eigenschaften, wie Kieselsäuregel, durchgeführt "der Bakterienkultur. Es zeigte sich aber in der Ver- werden. Auch können andere herkömmliche Trockengangenheit, daß ein entsprechendes Verfahren für die verfahren angewendet werden, wie beispielsweise BeGewinnung von Rhizobium-Präparaten nicht geeignet 25 lüften mit einem geeigneten, gegebenenfalls erhitzten ist, da die Trockenpräparate ihre Aktivität ganz oder Gas oder Gasgemisch oder auch Vakuumtrocknen zum größten Teil verloren haben. Daher war man bis- , oder Sprühtrocknen. Auchfkann man, wenn erwünscht, her der Auffassung, daß Phizobium-Präparate nur in Wärmestrahlung allein oder in Verbindung mit einer feuchter Form, wie in Verbindung mit feuchter Erde anderen Methode anwenden. Schließlich ist es auch oder feuchtem Torf, lagerfähig seien und in den Handel 30 möglich, Ultraviolettlichtbestrahlung anzuwenden, wokommen könnten, nicht dagegen in der Form von bei man gegen Sonneneinstrahlung resistente Bak-Trockenpräparaten. Dies aber hatte seinerseits die terienpräparate erhält.

nachteilige Folge, daß mit solchen feuchten Präparaten Im.folgenden wird die Erfindung an Hand einiger

die Leguminosen-Samen nicht vorgeimpft werden Beispiele weiter erläutert.

konnten, sondern das Impfen vom Landwirt selbst 35 Eine Zahl von Rhizobium-Stämmen aus verschie-' unmittelbar vor dem Auslegen der Saat erfolgen denen Impfgruppen ist in den unten aufgeführten mußte. Dies führte nicht nur zu einer zusätzlichen Tabellen gezeigt, wobei alle gute Befall-und Stickstoff-Arbeitsbelastung des Landwirtes, sondern oftmals auch bindungsfähigkeiten in Verbindung mit der verwenzu mangelhaften Ergebnissen, wenn nämlich der Land- deten Leguminosen-Art besaßen. Diese Stämme wurwirt nicht darauf achtete, daß die so geimpften Samen 40 den getrennt auf Kulturmedien nach Dorn gezüchtet nur bei feuchtem Wetter ausgelegt werden durften, oder (s. beispielsweise Marta Dorn: Über den Einfluß er versehentlich die geimpften Samen bis zum Auslegen phytopathogener Pilze auf die Entwicklung und Ineinige Zeit liegen ließ, so daß sie austrocknen konnten. fektionskraft von drei Rhizobium-Arten, Zentralblatt

Aus der deutschen Patentschrift 658 764 ist weiterhin für Bakteriologie, 109, S. 120, 1956). Die Stämme ein Verfahren zur Züchtung von für die Butylalkohol- 45 wurden dann unter aseptischen Bedingungen auf der Aceton-Gärung geeigneten Bakterien bekannt, indem einen Seite von semipermeablen Membranen verman nach einer Hitzebehandlung die Bakterien auf schmiert; die Membranen wurden dann mit der beNährböden mit alkalischer Reaktion ohne Erhitzen schmierten Seite nach oben auf das gleiche Kulturweiter züchtet und gegebenenfalls beide Züchtungs- medium gelegt, dem 2°/„ Agar-Agar zugesetzt war, arten mehrere Male wiederholt. Auch hier handelt es 5° um ein festes Kulturmedium zu erhalten. Nach 3- bis sich aber um andere Bakterienstämme, die im Gegen- 5tägiger Bebrütung bei 28° C wurden die Membranen satz zu Rhizobium-Bakterien zur Sporenbildung be- mit der daranhängenden Bakterienmasse unter asepfähigt sind. Eine Übertragung dieses bekannten Ver- tischen Bedingungen in halb mit trockenem Kieselfahrens auf Rhizobium-Stämme konnte nicht nahe- säuregel mit Feuchtigkeitsindikator gefüllte Präparatgelegen haben, da man entsprechend den obigen Aus- 55 röhren übergeführt, in denen man die Bakterien führungen der Auffassung war, daß Rhizobium-Bakte- 2 Tage bei 28° C trocknen ließ, worauf die Temperatur rien durch Austrocknen in ihrer Gesamtheit zerstört dann auf 70⁰C gesteigert und 7 Tage auf dieser Höhe würden. gehalten wurde. Die Membranen mit den Bakterien

Aufgabe der Erfindung war es nunmehr, ein für die wurden dann wieder auf Agar-Platten mit Doms

Impfung von Leguminosen-Samen geeignetes Bakte- 60 Kulturmedium gebracht, wobei die die Behandlung

rienpräparat in der Form eines Trockenpräparates zu überlebenden Bakterien sich vermehrten und Kolonien

erhalten, mit Hilfe dessen die Impfung der Legumino- bildeten. Diese wurden als Mutterkulturen für das zur

sen-Samen bereits beim Samenhändler erfolgen kann, Impfung von Leguminosen-Samen verwendete Ma-

was mit feuchten Präparaten nicht möglich ist, da die terial und die nachfolgenden Vergleichsversuche be-

Samen beim Händler trockengehalten werden müssen 65 nutzt. Natürlich ist es auch möglich, das "Verfahren

oder wenigstens nach der Impfung wieder austrocknen. zu wiederholen, und die Zeit sowie auch die Tem-

Dic Erfindung baut nun auf der Erkenntnis auf, peratur der Behandlung können variiert werden, je

daß innerhalb einer Population von Rhizobium-Bak- nach der speziellen Resistenz des Ausgangsmaterials

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und der erwünschten Resistenz des Bakterienpräparates.

Nun wurde ein Vergleich zwischen den Ausgangsstämmen und dem so nach der Erfindung erhaltenen Bakterienpräparat durchgeführt. Die Bakterien wurden unter aseptischen Bedingungen in der zehnfachen Menge Wasser mit einer geeigneten Menge von inertem Klebstoff, in diesem Fall Montmorillonit oder Äthyl-hydroxyäthylcellulose, suspendiert. Diese Suspensionen wurden dann auf Samen und im Laboratorium auf Glasperlen mit einem Durchmesser von 2 mm untersucht. Durch die Zugabe von Klebstoff haften die Bakterien gut an den Samen und Glasperlen an. Die Glasperlen wurden an Stelle von Samen verwendet, wenn man quantitative Messungen der Abtötungsgeschwindigkeit unter Laboratoriumsbedingungen durchführte. Die Samen wurden verwendet, wenn man die Bildung von Kriötchen und die Stickstoff-Fixierung. untersuchte.

Die oben gezeigten Versuche auf Glasperlen ergaben die folgenden Ergebnisse:

Zur Untersuchung des ,Selektionseffektes des Verfahrens nach der Erfindung wurde die Zeit der Abtötung von 99 °/₀ verschiedener in der unten aufgeführten Tabelle angegebener Rhizobium-Stämme für den unbehandelten Ausgangsstamm und für einen bei 7O⁰C während 7 Tagen selektierten Stamm bestimmt. Suspensionen der einzelnen Bakterienkulturen wurden auf Glasperlen mit 2 mm Durchmesser unter aseptischen Bedingungen übergeführt, dann ließ man sie trocknen und bei 28° C und einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 70°/₀ stehen. Verschiedene Suspensionen von unterschiedlicher Verdünnung wurden von jedem untersuchten Stamm hergestellt, da die Ausgangskulturen viel zu konzentriert waren. Die Ausgangskultur wurde auf das Zehnfache verdünnt, wobei Verdünnungen von 10^s, 10^β, ΙΟ⁷ und ΙΟ⁸ schätzungsweise eine Menge von 10000, 1000, 100 und 10 Zellen pro Milliliter ergaben. Jede Verdünnung war also zehnmal stärker als die vorangehende Verdünnung. Jeweils von dem unbehandelten Stamm und dem nach der Erfindung erhaltenen Bakterienpräparat wurden vier Suspensionen hergestellt, d. h. zusammen acht Suspensionen je untersuchten Rhizobium-Stamms. Jede Suspension wurde in einer Menge von 2,0 ml über 70 g (= etwa 3500 Stück) Glasperlen in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt, der während der Versuchszeit von mehr als 2 Monaten bei 28° C und einer Feuchtigkeit von 50 bis 70% stehengelassen wurde. Unmittelbar am Anfang und in Intervallen von 7 bis 10 Tagen wurden Proben von etwa 100 Glasperlen von jedem Präparat abgezogen. Die Zahl lebender Zellen in jeder Probe wurde durch Lebendauszählung bestimmt (s. beispielsweise R. A. Stanier, M. D oud or of f und E. A. Adelberg, General Microbiology, MacMillan & Co., London, 1958).

Die Glasperlen einer Probe wurden jeweils mit 5 ml Wasser unter aseptischen Bedingungen ¹I₂ Stunde geschüttelt, wobei sich die Zellen von den Glasperlen lösten und in die Wasserphase gingen. Bestimmte Mengen dieser 5 ml wurden dann auf der Oberfläche von Agar-Kulturplatten verteilt, und man ließ die einzelnen Zellen zu sichtbaren Kolonien auf den Platten wachsen. Aus der Zahl der Kolonien auf den Platten, der Zahl der Glasperlen der Probe und der pro Platte verwendeten Menge der 5-ml-Wasserphase wurde die Zahl der lebenden ,Bakterien pro Glasperle der
rechnet:

Probe nach der folgenden Formel be-

n =

M a-b

worin η die Zahl der lebenden Bakterien pro Glasperle der Probe, M die Zahl der Kolonien pro Platte, α die Zahl der Glasperlen der Probe und b die auf der Platte verteilte Menge der 5-ml-Wasserphase bedeutet. Die Versuchsbedingungen wurden so gewählt, daß M zwischen 10 und 200, ä in der Größenordnung von 100 und b 0,1, 0,01, 0,001 oder 0,0001 ist. Durch Bestimmung von η unmittelbar nach der Behandlung der Glasperlen mit den Bakteriensuspensionen erhielt man auf diese Weise einen Ausgangswert /z₀ zum ' Zeitpunkt 0 für die verschiedenen Stämme. Wiederholte Bestimmungen von η ,wurden dann in Intervallen von 7 bis 10 Tagen durchgeführt. Da die Bakterien nach und nach auf den Glasperlen absterben,.

hatte man zu erwarten, daß nach einer bestimmten Zeit η = 0,01 · n₀ wird. Dies bedeutet, daß nur 1 °/₀ der zum Zeitpunkt 0 lebenden Zellen noch am Leben war oder daß die Bakterien zu 99°/₀ abgetötet wurden. Je länger es dauert, daß dieser Abtötungsgrad erreicht "wird, desto resistenter ist das Bakterienpräparat. Die folgende Tabelle I, in der die Zeiten in Tagen zur 99°/_oigen Abtötung für verschiedene Stämme angegeben sind, zeigt, daß die nach der Erfindung hergestellten Bakterienpräparate viel resistenter und besser als die Ausgangsstämme sind, mit Ausnahme des Luzerne-Stammes, der schon bei Beginn eine große Resistenz besitzt.

Tabelle I	35	Rh. japonicum,	Ausgangs stamm	Bakterien- präparat nach der Erfindung
4° Sojastamm	. 8	55 '-
Rh. meliloti, Luzerne
Rh. trtfoli, Kleestamm	65	65
Rh. leguminosarum,	20	65
Erbsen-Wicken-Stamm	8	55
45 Rh. phaseoli, Bohnen
stamm	8	46
Rh. lupini, Lupinenstamm
7	22

Vergleichende Kulturversuche auf Samen wurden in der folgenden Weise durchgeführt:

Stämme von drei Rhizobiumarten, Rhizobium trifoli, Rhizobium meliloti und Rhizobium leguminosarum, wurden als unbehandelte Ausgangsstämme als Rt, Rm und Rl sowie nach 7tägiger Selektierung nach der Erfindung bei 70⁰C als Rt 7, Rm 7 und Rl 7 untersucht. Samen wurden zur Zeit 0 mit einer ver-

. dünnten Suspension der Ausgangsstämme und Bakr terienpräparate nach der Erfindung geimpft, und von den getrockneten Samen wurde eine bestimmte Zahl verwendet, um verschieden lange vom Zeitpunkt 0 an zu wachsen. In jedem Fall wurden Proben zur Abschätzung der Bakterienzahl pro Samen entnommen. Die Zahl der gewachsenen Pflanzen, die Knötchen zeigten, wurde aufgezeichnet. In Tabelle II sind die Ergebnisse von sechs solchen Experimenten aufgezeichnet. In der letzten Spalte eines jeden Experimentes ist die Zahl lebender Bakterien pro Samen in bestimmten Zeitabständen nach der Impfung wieder-

gegeben. Die entsprechenden rechten Spalten geben die Zahl der Pflanzen von zehn Pflanzen wieder, die eine Knötchenbildung zeigten.

• Das Ergebnis in der Tabelle zeigt, daß es mit^werfindungsgcmäß erhaltenen Bakterienpräparaten .nröglich ist, Knötchenbildung nach einer beachtlich'längeren''^:^: Zeit zwischen Impfung und Aussäen zu erhalten" als mit dem entsprechenden- unbehandelten Ausgangsstamm. ■ ■

Tabelle II

(Fortsetzung Tabelle II)

	Zahl der	Pflanzen	Zahl der	Pflanzen
lage	Bakterien	mit	Bakterien	mit
	pro Samen	Knötchen	pro Samen	Knötchen
ΐ" YVT		pro zehn		pro zehn
■*,.■*■&■■*&	Pflanzen	Pflanzen

Tage

nach

Impfung

Zahl der Bakterien pro Samen

Pflanzen

mit

Knötchen pro zehn Pflanzen

Zahl der Bakterien pro Samen

Pflanzen

mit

Knötchen pro zehn Pflanzen

Samen von Trifolium pratense, Klee I Rt I Rt

1	8-104	9	2-10s	10
10	0	0	1 -106	10
20	■—	0	8-10«	9
30.			7-104	10
,40"			6-104	9
90			—	8

Samen von Medicago sativa, Luzerne I Rm I Rm7

1	5-104	10	7-104	10
10	2-102	6	9-103	10
20	0	0	2-103	10
30	—	0	7-102	10
40			3-102	8
90			—	7

35 Samen von Pisum sativum, Erbse
I RI I Rl 7

1	2-106	10	5-104	9
10	4-104	2	2-104	10
20	5-103	0	2-104	10
30		0	1 -10«	8
40			8-103	7
90			— ■	5

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines für die Impfung von Leguminosen-Samen geeigneten Bakterienpräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man Rhizobium-Bakterien mit guten Befall- und Stickstoffbindungsfähigkeiten in Verbindung mit einer bestimmten Leguminosen-Art in an sich bekannter Weise auf einem Kulturmedium züchtet, die so erhaltene Bakterienkultur bei einer Temperatur von höchstens 95° C trocknet und sodann das Züchten und Trocknen der Bakterienkultur wenigstens noch einmal wiederholt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils mindestens 7 Tage trocknet.