DE1517733B - Verfahren zur Herstellung eines fur die Impfung von Leguminosen Samen geeigneten Baktenenpraparates - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zui Herstellung eines für die Impfung von Leguminosen-Samen geeigneten Bakterienpräparates. Diese frei in der Erde lebenden Bakterien besitzen die Fähigkeit, die Wurzeln von Pflanzen, die zu der Familie Leguminosae gehören, S zu befallen. Dabei bilden sich an den Wurzeln der Leguminosen Knötchen, und unter bestimmten Bedingungen kennen diese Knötchen den Stickstoff der Luft in eine organisch gebundene Form umwandeln. Diese Tatsache benutzt man in der Landwirtschaft zur Bodenverbesserung. . .

Weiterhin ist bekannt, daß bestimmte Rhizobium-Stämme mit bestimmten Leguminosen eine Stickstoff bindende Symbiose bilden. Beispielsweise bindet Rhizobium trifoli Stickstoff mit Klee, nicht aber mit Erbsen und Wicken, und Rhizobium leguminosarum bindet Stickstoff bei Erbsen und Bohnen, nicht aber bei Klee.

Die deutsche Patentschrift 1 056 082 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Azotobakter-Präparates durch Züchtung von Azotobakter-Kulturen in einem Kulturmedium und anschließende Trocknung der Bakterienkultur. Es zeigte sich aber in der Vergangenheit, daß ein entsprechendes Verfahren für die Gewinnung von Rhizobium-Präparaten nicht geeignet ist, da die Trockenpräparate ihre Aktivität ganz oder zum größten Teil verloren haben. Daher war man bisher der Auffassung, daß Phizobium-Präparate nur in feuchter Form, wie in Verbindung mit feuchter Erde oder feuchtem Torf, lagerfähig seien und in den Handel kommen könnten, nicht dagegen in der Form von Trockenpräparaten. Dies aber hatte seinerseits die. nachteilige Folge, daß mit solchen feuchten Präparaten die Leguminosen-Samen nicht vorgeimpft werden konnten, sondern das Impfen vom Landwirt selbst unmittelbar vor dem Auslegen der Saat erfolgen mußte. Dies führte nicht nur zu einer zusätzlichen Arbeitsbelastung des Landwirtes, sondern oftmals auch zu mangelhaften Ergebnissen, wenn nämlich der Landwirt nicht darauf achtete, daß die so geimpften Samen nur bei feuchtem Wetter ausgelegt werden durften, oder er versehentlich die geimpften Samen bis zum Auslegen einige Zeit liegen ließ,'so daß sie austrocknen konnten.

Aus der deutschen Patentschrift 658 764 ist weiterhin ein Verfahren zur Züchtung von für die Butylalkohol-Aceton-Gärung geeigneten Bakterien bekannt, indem man nach einer Hitzebehandlung die Bakterien auf Nährböden mit alkalischer Reaktion ohne Erhitzen weiter züchtet und gegebenenfalls beide Züchtungsarten mehrere Male wiederholt. Auch hier handelt es sich aber um andere Bakterienstämme, die im Gegensatz zu Rhizobium-Bakterien zur Sporenbildung befähigt sind. Eine Übertragung dieses bekannten Ver- _ fahrens auf Rhizobium-Stämme konnte nicht nahegelegen haben, da man entsprechend den obigen Aus-. führungen der Auffassung war, daß Rhizobium-Bakterien durch Austrocknen in ihrer Gesamtheit zerstört würden.

Aufgabe der Erfindung war es nunmehr, ein für die Impfung von Leguminosen-Samen geeignetes Bakterienpräparat in der Form eines Trockenpräparates zu erhalten, mit Hilfe dessen die Impfung der Leguminosen-Samen bereits beim Samenhändler erfolgen kann, was mit feuchten Präparaten nicht möglich ist, da die Samen beim Händler trockengehalten werden müssen oder wenigstens nach der Impfung wieder austrocknen.

Die Erfindung baut nun auf der Erkenntnis auf, daß innerhalb einer Population von Rhizobium-Bakterien ein Unterschied der Fähigkeit, trockenen und heißen Bedingungen zu widerstehen, vorliegt und daß Rhizobium-Bakterien als unterschiedliche Stämme verschiedener Widerstandsfähigkeit auftreten.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines für die Impfung von Leguminosen-Samen geeigneten Bakterien-Präparates ist dadurch gekennzeichnet, daß man Rhizobium-Bakterien mit guten Befall- und Stickstoffbindungsfähigkeiten in Verbindung mit einer bestimmten Leguminosen-Art in an sich bekannter Weise auf einem Kulturmedium züchtet, die so erhaltene Bakterienkultur bei einer Temperatur von höchstens 95° C trocknet und sodann das Züchten und Trocknen der Bakterienkultur wenigstens noch einmal wiederholt. Zweckmäßig trocknet man jeweils mindestens 7 Tage.

Günstigerweise wird das Züchten und Trocknen so oft wiederholt, bis mindestens 90°/„ der Bakterien beim Trocknen an Luft überleben. Das Trocknen kann beispielsweise durch Überführen der Bakterienkultur auf ein Trockenmittel, beispielsweise mit hygroskopischen Eigenschaften, wie Kieselsäuregel, durchgeführt werden. Auch können andere herkömmliche Trockenverfahren angewendet werden, wie beispielsweise Belüften mit einem geeigneten, gegebenenfalls erhitzten Gas oder Gasgemisch oder auch Vakuumtrocknen oder Sprühtrocknen. Auch kann man, wenn erwünscht, Wärmestrahlung allein oder in Verbindung mit einer anderen Methode anv enden. Schließlich ist es auch möglich, Ultraviolettlichttestrahlung anzuwenden, wobei man gegen Sonneneinstrahlung resistente Bakterienpräparate erhält.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand einiger Beispiele weiter erläutert.

Eine Zahl von Rhizobium-Stämmen aus verschiedenen Impfgruppen ist in den unten aufgeführten Tabellen gezeigt, wobei alle gute Befall- und Stickstoffbindungsfähigkeiten in Verbindung mit der verwendeten Leguminosen-Art besaßen. Diese Stämme wurden getrennt auf Kulturmedien nach Dorn gezüchtet (s. beispielsweise Marta Dorn: Über den Einfluß phytopathogener Pilze auf die Entwicklung und Infektionskraft von drei Rhizobium-Arten, Zentralblatt für Bakteriologie, 109, S. 120, 1956). Die Stämme wurden dann unter aseptischen Bedingungen auf der einen Seite von semipermeablen Membranen verschmiert; die Membranen wurden dann mit der beschmierten Seite nach oben auf das gleiche Kulturmedium gelegt, dem 2°/₀ Agar-Agar zugesetzt war, um ein festes Kulturmedium zu erhalten. Nach 3- bis 5tägiger Bebrütung bei 28° C wurden die Membranen mit der daranhängenden Bakterienmasse unter aseptischen Bedingungen in halb mit trockenem Kieselsäuregel mit Feuchtigkeitsindikator gefüllte Präparatröhren übergeführt,'-in denen man die Bakterien 2 Tage bei 28° C trocknen ließ, worauf die Temperatur dann auf 70° C gesteigert und 7 Tage auf dieser Höhe gehalten wurde. Die Membranen mit den Bakterien wurden dann wieder auf Agar-Platten mit Doms Kulturmedium gebracht, wobei die die Behandlung überlebenden Bakterien sich vermehrten und Kolonien bildeten. Diese wurden als Mutterkulturen für das zur Impfung von Leguminosen-Samen verwendete Material und die nachfolgenden Vergleichsversuche benutzt. Natürlich ist es auch möglich, das Verfahren zu wiederholen, und die Zeit sowie auch die Temperatur der Behandlung können variiert werden, je nach der speziellen Resistenz des Ausgangsmaterials

und der erwünschten Resistenz des Bakterienpräparates.

Nun wurde ein Vergleich zwischen den Ausgangsstämmen und dem so nach der Erfindung erhaltenen Bakterienpräparat durchgeführt. Die Bakterien wurden unter aseptischen Bedingungen in der zehnfachen Menge Wasser mit einer geeigneten Menge von inertem Klebstoff, in diesem Fall Montmorillonit oder Äthyl-hydroxyäthylcellulose, suspendiert. Diese Suspensionen wurden dann auf Samen und im Laboratorium auf Glasperlen mit einem Durchmesser von 2 mm untersucht. Durch die Zugabe von Klebstoff haften die Bakterien gut an den Samen und Glasperlen an. Die Glasperlen wurden an Stelle von Samen verwendet, wenn man quantitative Messungen der Abtötungsgeschwindigkeit unter Laboratoriumsbedingungen durchführte. Die Samen wurden verwendet, wenn man die Bildung von Knötchen und die Stickstoff-Fixierung untersuchte.

Die oben gezeigten Versuche auf Glasperlen ergaben die folgenden Ergebnisse:

Zur Untersuchung des Selektionseffektes des Verfahrens nach der Erfindung wurde die Zeit der Abtötung von 99°/₀ verschiedener in der unten aufgeführten Tabelle angegebener Rhizobium-Stämme für den unbehandelten Ausgangsstamm und für einen bei 70⁰C während 7 Tagen selektierten Stamm bestimmt. Suspensionen der einzelnen Bakterienkulturen wurden auf Glasperlen mit 2 mm Durchmesser unter aseptischen Bedingungen übergeführt, dann ließ man sie trocknen und bei 28°C und einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 70°/₀ stehen. Verschiedene Suspensionen von unterschiedlicher Verdünnung wurden von jedem untersuchten Stamm hergestellt, da die Ausgangskulturen viel zu konzentriert waren. Die Ausgangskultur wurde auf das Zehnfache verdünnt, wobei Verdünnungen von 10⁵, 10⁶, 10⁷ und 10⁸ schätzungsweise eine Menge von 10000, 1000, 100 und 10 Zellen pro Milliliter ergaben. Jede Verdünnung war also zehnmal stärker als die vorangehende Verdünnung. Jeweils von dem unbehandelten Stamm und dem nach der Erfindung erhaltenen Bakterienpräparat wurden vier Suspensionen hergestellt, d. h. zusammen acht Suspensionen je untersuchten Rhizobium-Stamms. Jede Suspension wurde in einer Menge von 2,0 ml über 70 g (= etwa 3500 Stück) Glasperlen in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt, der während der Versuchszeit von mehr als 2 Monaten bei 28°C und einer Feuchtigkeit von 50 bis 70°/₀ stehengelassen wurde. Unmittelbar am Anfang und in Intervallen von 7 bis 10 Tagen wurden Proben von etwa 100 Glasperlen von jedem Präparat abgezogen. Die Zahl lebender Zellen in jeder Probe wurde durch Lebendauszählung bestimmt (s. beispielsweise R. A. St a η ie r, M. Doudoroff und E. A. Adelberg, General Microbiology, MacMillan & Co., London, 1958).

Die Glasperlen einer Probe wurden jeweils mit 5 ml Wasser unter aseptischen Bedingungen ¹Z₂ Stunde geschüttelt, wobei sich die Zellen von den Glasperlen lösten und in die Wasserphase gingen. Bestimmte Mengen dieser 5 ml wurden dann auf der Oberfläche von Agar-Kulturplatten verteilt, und man ließ die einzelnen Zellen zu sichtbaren Kolonien auf den Platten wachsen. Aus der Zahl der Kolonien auf den Platten, der Zahl der Glasperlen der Probe und der pro Platte verwendeten Menge der 5-ml-Wasserphase wurde die Zahl der lebenden Bakterien pro Glasperle der
rechnet:

Probe nach der folgenden Formel .be?

η =

M a-b

worin η die Zahl der lebenden Bakterien pro Glasperle der Probe, M die Zahl der Kolonien pro Platte, α die Zahl der Glasperlen der Probe und b die auf der Platte verteilte Menge der 5-ml-Wasserphase bedeutet. Die Versuchsbedingungen wurden so gewählt, daß M zwischen 10 und 200, α in der Größenordnung von 100 und b 0,1, 0,01, 0,001 oder 0,0001 ist. Durch Bestimmung von η unmittelbar nach der Behandlung der Glasperlen mit den Bakteriensuspensionen erhielt man auf diese Weise einen Ausgangswert n₀ zum Zeitpunkt 0 für die verschiedenen Stämme. Wiederholte Bestimmungen von η wurden dann in Intervallen von 7 bis 10 Tagen durchgeführt. Da die Bakterien nach und nach auf den Glasperlen absterben, hatte man zu erwarten, daß nach einer bestimmten Zeit η — 0,01 · K₀ wird. Dies bedeutet, daß nur 1 °/o der zum Zeitpunkt 0 lebende'n Zellen noch am Leben war oder daß die Bakterien zu 99 °/o abgetötet wurden.

_Je länger es dauert, daß dieser Abtötungsgrad erreicht wird, desto resistenter ist das Bakterienpräparat. Die folgende Tabelle I, in der die Zeiten in Tagen zur 99^O/_Oigen Abtötung, für verschiedene Stämme angegeben sind, zeigt, daß die nach der Erfindung hergestellten Bakterienpräparate viel resistenter und besser als die Ausgangsstämme sind, mit Ausnahme des Luzerne-Stammes, der schon bei Beginn eine große Resistenz besitzt.

. Tabelle I	35	- -	Rh. japonicum,	Ausgangs- stsmm	Bakterien präparat nach
4° Sojastamm		der Erfindung
Rh. m^Iiloti, Luzerne	8	55
Rh. trifoli, Kleestamm
Rh. leguminosarum,	65	65
Erbsen-Wicken-Stamm	20	65
45 Rh. phaseoli, Bohnen	8	55
stamm
Rh. lupini, Lupinenstamm	8	46
7	22

Vergleichende Kulturversuche auf Samen wurden in der folgenden Weise durchgeführt:

Stämme von drei Rhizobiumarten, Rhizobium trifoli, Rhizobium meliloti und Rhizobium leguminosarum, wurden als unbehandelte Ausgangsstämme als Rt, Rm und Rl sowie nach 7tägiger Selektierung nach der Erfindung bei 7O⁰C als Rt 7, Rm 7 und Rl 7 untersucht. Samen wurden zur Zeit 0 mit einer verdünnten Suspension der Ausgangsstämme und Bakterienpräparate nach der Erfindung geimpft, und von den getrockneten Samen wurde eine bestimmte Zahl verwendet, um verschieden lange vom Zeitpunkt 0 an zu wachsen. In jedem Fall wurden Proben zur Abschätzung der Bakterienzahl pro Samen entnommen. Die Zahl der gewachsenen Pflanzen, die Knötchen zeigten, wurde aufgezeichnet. In Tabelle II sind die Ergebnisse von sechs solchen Experimenten aufgezeichnet. In der letzten Spalte eines jeden Experimentes ist die Zahl lebender Bakterien pro Samen in bestimmten Zeitabständen nach der Impfung wieder-

gegeben. Die entsprechenden rechten Spalten geben die Zahl der Pflanzen von zehn Pflanzen wieder, die eine Knötchenbildung zeigten.

Das Ergebnis in der Tabelle zeigt, daß es mit erfindungsgemäß erhaltenen Bakterienpräparaten möglich ist, Knötchenbildung nach einer beachtlich längeren Zeit zwischen Impfung und Aussäen zu erhalten als mit dem entsprechenden unbehandelten Ausgangsstamm.

Tabelle II

(Fortsetzung Tabelle II)

Tage

nach

der

Impfung

Zahl der
Bakterien
pro Samen

Pflanzen

mit

Rnötchen
pro zehn
Pflanzen

Zahl der Bakterien pro Samen

Pflanzen

mit

Knötchen pro zehn Pflanzen

Samen von Trif olium pratense, Klee I Rt 1 Rt 7

Samen von Medicago sativa, Luzerne I Rm I Rm7

1	8-10*	9	2-105	10
10	0	0	l-10s	10
20	—	0	8-10*	9
30			7-10*	10
40			6-10*	9
90			—	8

1	5 · 104	10	7-10*	10
10	2-102	6	9-103	10
20	0	0	2-103	10
30	—	0	7-102	10
40			3-102	8
90			—	7

Tage

nach

Impfung

Zahl der
Bakterien
pro Samen

Pflanzen

mit

Knötchen
pro zehn
Pflanzen

Zahl der
Bakterien
pro Samen

Pflanzen

mit

Knötchen
pro zehn
Pflanzen

Samen von Pisum sativum, Erbse
I Rl I R17

1	2-106	10	5-10*	9
10	4-10*	2	2-10*	10
20	5-103	0	2-10*	10
30		0	1-10*	8
40			8-103	7
90			—	5

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines'für die Impfung von Leguminosen-Samen geeigneten Bakterienpräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man Rhizobium-Bakterien mit guten Befall- und Stickstoffbindungsfähigkeiten in Verbindung mit einer bestimmten Leguminosen-Art in an sich bekannter Weise auf einem Kulturmedium züchtet, die so erhaltene Bakterienkultur bei einer Temperatur von höchstens 95° C trocknet und sodann das Züchten und Trocknen der Bakterienkultur wenigstens noch einmal wiederholt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils mindestens 7 Tage trocknet.