DE2407046C3

DE2407046C3 - Verfahren und Reagentiensystem zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Katalase in Milch und anderen Flüssigkeiten, insbesondere in solchen biologischen Ursprungs

Info

Publication number: DE2407046C3
Application number: DE19742407046
Authority: DE
Inventors: Ernst Anders Carl-Gustaf Dr.phil.; Rosen Helena Mariana; Huddinge Rosen (Schweden)
Original assignee: Alfa Laval AB
Current assignee: Alfa Laval AB
Priority date: 1973-02-16
Filing date: 1974-02-14
Publication date: 1978-02-09

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Kaialase in Milch und anderen Flüssigkeiten, insbesondere in solchen biologischen Ursprungs, und ein Reagenziensystem zur Durchführung des Verfahrens.

Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Katalase sind an sich bekannt. Eines dieser Verfahren beruht auf der Fähigkeit der Katalase, die Zerlegung von Wasserstoffsuperoxyd unter Freisetzung von Sauerstoff zu katalysieren. Zur praktischen Durchführung wird die zu untersuchende Flüssigkeit mit einer verdünnten Wasserstoffsuperoxyd-Lösung in einem Fermentierungsgefäß vermischt und dann 3 Stunden lang stehengelassen, ehe das Volumen des hierbei entwickelten Sauerstoffs abgelesen wird:

2H₂O,

K),

Rasche, zuverlässige, einfache und schnelle Verfahren zur Feststellung von Katalase sind äußerst wichtig, besonders im Falle von Milch, da die Gegenwart von Katalase in Milch auf Mastitis oder Brustdrüsenentzündung hinweist, d. h. auf eine infektiöse Erkrankung am Euter des Milch erzeugenden Tieres. Da die Mastitis für die Viehwirtschaft beträchtliche Verluste bedeuten kann, ist es von großer Wichtigkeit, daß das Vorhandensein der Krankheit durch den Katalase-Nachweis bereits in frühen Stadien der Entzündung nachgewiesen werden kann bei regelmäßigen Kontrollen des Euterzustands.

Da das obenerwähnte Verfahren zum Katalase-Nachweis durch Zugabe von Wasserstoffsuperoxyd in einem

Fermentierungsgefäß zeitraubend ist, sind andere Verfahren entwickelt worden. Einige dieser Verfahren beruhen auf der Bestimmung der Koagulation oder des Viskositätsanstiegs von Milch, der alkalische oder oberflächenaktive Substanzen zugesetzt wurden. Als nachteilig wirkt sich bei diesen Verfahren aus, daß bei ihnen ebenfalls Reagenzien gebraucht werden; außerdem ist die Genauigkeit dieser Nachweisverfahren gering, es sei denn, eigens geschultes Personal wird mit den Analyse-Arbeiten betraut, besonders wenn die Mastitis noch nicht weit fortgeschritten ist.

Ein Verfahren zum kolorimetrischen Nachweis von Katalase ist in zwei Veröffentlichungen (Zeitschrift physiol. Chem, 329, 40 [1962] und Clin. Chim. Acta, 15, 159-163 [1967]) von Johann Pütter beschrieben, wobei ein System von Reagenzien verwendet wird, zu denen unter anderem Wasserstoffsuperoxyd, Peroxydase und ein Leukofarbsioff gehören. Bei diesen Verfahren wird Wasserstoffsuperoxyd der zu untersuchenden Flüssigkeit zugegeben. Die in der Flüssigkeit eventuell vorhandene Katalase zersetzt das Wasserstoffsuperoxyd, und die Reaktion wird zu bestimmten Zeiten unterbrochen und dabei jeweils die Menge des noch vorhandenen Wasserstoffsuperoxyds nachgewiesen. Man läßt dazu das Wasserstoffsuperoxyd einen Leukofarbstoff oxydieren unter Verwendung von Peroxydase als Katalysator:

LeukofarbstoiT f H,C),

Peroxydase
L > Farbstoff + H,C)

Auch dieses Verfahren ist kompliziert und für den raschen, jedoch zuverlässigen Nachweis von Katalase durch nicht geschultes Personal zu zeitraubend.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren der eingangs umrissenen Art zu schaffen, mit welchem einfach, rasch, zuverlässig und exakt quantitativ und qualitativ Katalase in Milch oder anderen Flüssigkeiten bestimmt werden kann, wobei es ferner möglich sein soll, Katalase durch Farbreaktionen nachzuweisen und die Katalase-Bestimmung mit einem einfachen Hilfsmittel, das beispielsweise die Form eines Papierstreifens mit den für den Test adsorbierten Reagenzien hat, durchzuführen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Zugabe eines aus einer Substanz oder mehreren synergistischen Substanzen bestehenden ersten Reagens, das in Gegenwart einer in Milch oder anderen Flüssigkeiten vorhandenen Substanz Wasserstoffsuperoxyd freimacht, und durch Zugabe eines zweiten Reagens, das bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbreaktion ergibt, wobei die Katalase-Konzentration über den dabei entwickelten Farbton bestimmt wird.

Zweckmäßig ist das erste Reagens ein organisches oder anorganisches Peroxyd oder eine ein Peroxyd erzeugende Verbindung.

Es kann aber auch als erstes Reagens eine Verbindung verwendet werden, die Wasserstoffsuperoxyd in Gegenwart von in der Milch vorhandener Xanthin-Oxydase freimacht, also beispielsweise Xanthin oder Hypoxanthin.

Vorteilhaft handelt es sich bei dem ersten Reagens um ein oder mehrere Enzyme, es kann auch Galaktose-Oxydase sein.

Zweckmäßig besteht das erste Reagens aus den Enzymen 0-Galaktosidase und Galaktose-Oxydase, wobei es sich bei dem zweiten Reagens vorteilhaft um einen Leukofarbstoff handelt

s Das zweite Reagens umfaßt vorteilhaft zusätzlich das Enzym-Peroxydase.

Das Reagenziensystem zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt eine poröse Struktur, die mit einem Reagens, das bei Berührung mit der ίο Flüssigkeit oder einem Bestandteil derselben Wasserstoffsuperoxyd erzeugt, und einem zweiten Reagens imprägniert ist, das bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbänderung erfährt.

Vorteilhaft ist dabei das erste Reagens vom zweiten getrennt, wobei auch zwischen dem ersten und dem zweiten Reagens eine oder mehrere halbdurchlässige Membranen angebracht sein können.
Die Struktur besteht vorteilhaft aus porösem Papier. Zweckmäßig sind das erste und das zweite Reagens getrennt in Mikrokapseln eingeschlossen, die ihrerseits in der porösen Strukturdispergiert sind.

Dabei können das erste und das zweite Reagens auch getrennt in Gelschichten eingebettet sein.

Vorteilhaft sind das erste und das zweite Reagens in unlöslicher Form auf der porösen Struktur aufgebracht. Zweckmäßig ist die Zusammensetzung 0,09 — 0,11 mg/ml jJ-Galaktosidase, 0,09-0,11 mg/ml Glukose-Oxydase oder Galaktose-Oxydase, 0,9—1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19 — 0,21 mg/ml p-Tolidin.
Vorteilhaft ist 0,09-0,11 mg/ml Galaktose-Oxydase, 0,9-1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml o-Tolidin vorgesehen, oder 0,09 —0,11 mg/ml Hypoxanthin, 0,9-l,^g/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml o-Tolidin oder 0,9-1,1 mg/ml Natriumperborat oder <5 Harnstoff-Peroxyd, 0,9—1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml o-Tolidin.

Zweckmäßig ist eine Reagenzienmischung in die Struktur eingearbeitet und getrocknet worden.

Ein Verfahren, in dem nur ein trockenes Testpapier verwendet wird, läßt sich nicht durch Zugabe von Wasserstoffsuperoxyd zum Papier verwirklichen, da Wasserstoffsuperoxyd flüchtig und chemisch instabil ist.

Das Wasserstoffsuperoxyd muß vielmehr in der zu prüfenden Flüssigkeit oder im Tesipapier erzeugt werden, indem dem Papier eine Substanz zugefügt wird, die mit einer in der Flüssigkeit vorhandenen Substanz reagiert und dabei Wasserstoffsuperoxyd freisetzt.

Substanzen, die diese Forderungen erfüllen, sind beispielsweise organische oder anorganische Peroxyde oder eine ein Peroxyd erzeugende Verbindung.

Auch ist es möglich, eine Enzym-Reaktion zur Erzeugung des Wasserstoffsuperoxyds zu verwenden. Diese Lösung ist besonders günstig im Falle von Milch oder anderen biologischen Flüssigkeiten. Xanthin und Hypoxanthin zusammen mit dem in der Milch vorhandenen Enzym Xanthin-Oxydase ergeben Wasserstoffsuperoxyd.

Am zweckmäßigsten ist es aber, die Milch oder andere biologische Flüssigkeiten mit einem Enzym oder do synergistischen Enzymen zu vermischen, die Wasserstoffsuperoxyd in Gegenwart eines in der Flüssigkeit vorhandenen Zuckers freimachen. Eine derartige Erzeugung von Wasserstoffsuperoxyd läßt sich erreichen mit der in Milch vorhandenen Laktose in (15 Verbindung mit dem Enzym Galaktose-Oxydase.

Galaktose-Oxydase reagiert jedoch spezifisch mit freier Galaktose und reagiert nur langsam mit Laktose. Es ist deshalb vorteilhaft, das Enzym /?-Galaktosidase

zuzugeben, das Laktose in Galaktose und Glukose aufspaltet Zusammen mit der ß-Galaktosidase kann statt der Galaktose-Oxydase (oder in Verbindung mit derselben) das Enzym Glukose-Oxydase verwendet werden, das spezifisch mit der in de> Spaltreaktion erhaltenen Glukose reagiert
Ein zum Nachweis von Katalase in Milch geeignetes System umfaßt die in den folgenden Formeln angegebenen Reaktionen, wobei ein Leukofarbstoff in Gegenwart von Peroxydase katalytisch durch das Wasserstoffsuperoxyd oxydiert wird, das in der zu untersuchenden Flüssigkeit erzeugt wird.

Die Oxydation wird durch die eventuelle vorhandene Katalase gehemmt:

Laktose

/f-Galaktosidasc

H, O,

Glukose

Glukose-Oxydase

Peroxydase . , , , _rr - ► -ι- Leukofarbsloff

Katalase

♦ + Leukofarbstoff — Verfärbung
keine Verfärbung

Ein Papierstreifen, der die oben beschriebenen Reagenzien adsorbiert enthält, ist geeignet, da das Papier nur in die zu untersuchende Flüssigkeit zur Bestimmung von Katalase eingetaucht Morden muß. Ein anderes geeignetes Material kann eine spezifische Struktur haben, so beispielsweise Gelstruktur mit zugesetzten Reagenzien. Auch dieses Material kann in der Form eines Gelstreifens hergestellt werden, wie sie für pH-Bestimmungen seit längerer Zeit verwendet werden.

Es schien jedoch unwahrscheinlich, daß Katalase und Peroxydase um das vorhandene Wasserstoffsuperoxyd konkurrieren würden. Gemäß einer Demonstration von W. E. K η ox (Biochem. Biophys. Acta, 14, 117 [1954]), wonach sämtliches Wasserstoffsuperoxyd, das in einem Glukose, Glukose-Oxydase, Katalase, Peroxydase und einer oxydierbaren Verbindung, d. h. einem Wasserstoff-Donator enthaltendem System erzeugt wird. während der durch Peroxydase katalysierten Reaktion verbraucht wurde, ohne dabei von Katalase beeinflußt zu werden, war man allgemein zu der Ansicht gekommen, daß enzymatisch erzeugtes Wasserstoffsuperoxyd in allgemeinen unabhängig von einer eventuell anwesenden Katalase mit Peroxydase reagiert. Für diese Ansicht sprach ferner, daß, obwohl Katalase einen höheren Umsatz auf der Trägersubstanz bewirkt als andere Enzyme, sie trotzdem eine geringe Affinität zum Träger hat, während Peroxydase eine hohe Affinität zum Träger hat. Außerdem wurde festgestellt, daß Katalase mit hohem Wirkungsgrad enzymatisch erzeugtes, in geringen Mengen vorhandenes Wasserstoffsuperoxyd ausnutzt.

Erfindungsgemäß wurde überraschend festgestellt, daß das oben beschriebene System und Reaktion (3) in der erhofften Weise wirksam sind. Die Abweichungen dieser Ergebnisse von den von K η ο χ und anderen Forschern erhaltenen lassen sich mindestens teilweise der Tatsache zuschreiben, daß letztere gewisse, natürlich vorkommende Wasserstoff-Donatoren verwendeten, während erfindungsgemäß auf synthetische Farbstoffe zurückgegriffen worden ist. Die enzymatische Erzeugung von Wasserstoffsuperoxyd in situ ergibt eine verhältnismäßig konstante Konzentration des Wasserstoffsuperoxyds, was eine Vorbedingung für den konkurierenden Abbau des Wasserstoffsuperoxyds durch Peroxydase und Katalase bei des Feststellung der Katalase-Konzentration ist.

Es wurde eine große Anzahl von Tests durchgeführt, in denen Katalase in der oben beschriebenen Weise bestimmt wurde. Die Gemische der hierbei verwendeten Reagenzien und die flüssigen, für die Tests verwendeten Muslcr wirkten in der in Gleichung (3) angegebenen Weise zusammen und ergaben bei Abwesenheit von Katalase dunkelblaue oder grünliche Farbtöne. Bei hohen Katalase-Konzentrationen entwikkelten sich blaßgelbe Farbtöne. Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist umgekehrt proportional der Peroxydase-Konzentration der Reagenzien-Mischung. Es ist erfindungsgemäß gelungen, die Empfindlichkeit bei ihren Tests mit Milch so einzustellen, daß im Falle einer von einer völlig gesunden Kuh stammenden Milch die Farbreaktion eine dunkelblaue Farbe ergab, während bei Kühen mit Mastitis-Erkrankungen zunehmender Stärke die Farbtöne von einem mittleren Blau über ein leichtes Blaugrün bis Blaßgelb reichten.

Im folgenden werden Beispiele von Reagenzien-Mischungen mit den vorher erwähnten Verbindungen angegeben, sowie Verfahren, bei denen diese Mischungen zur Feststellung der Katalase-Konzentrationen in Milch verwendet werden. Dazu wird ein Tropfen Milch

is mit einem Tropfen der Reagenzien-Lösung vermischt, die eine der folgenden Zusammensetzungen hat:

40

60

('S

Möglichkeit 1:	0,1 mg/ml 0,1 mg/ml l^g/ml 0,2 mg/ml
/?-Galaktosidase Glukose-Oxydase oder Galaktose-Oxydase Peroxydase o-Tolodin
Möglichkeit 2:	0,1 mg/ml 1,0 ng/ml 0,2 mg/ml
Galaktose-Oxydase Peroxydase o-Tolidin
Möglichkeit 3.	0,1 mg/ml l^g/ml 0p?. mg/ml
Hypoxanthin Peroxydase o-Tolidin
Möglichkeit 4:

Natrium-Perborat oder

Harnstoffperoxyd 1,0 mg/ml

Peroxydase 1,0 μg/ml

o-Tolidin 0,2 mg/ml

Statt der oben angegebenen Vermischung von Milch und Reagenzien-Lösung kann auch ein Streifen eines Filterpapiers verwendet werden, das in eine der oben angeführten, möglichen L ösungen eingetaucht und dann getrocknet wurde. Wenn das Filterpapier dann in die Milch zum Nachweis der in ihr enthaltenen Katalase eingetaucht wird, absorbiert das Papier eine Milchmenge, die der im Papier vorhandenen Reagenzienmenge entspricht

Die verwendete Peroxydase kann normale, handelsübliche Reinheit haben (beispielsweise RZ = 0,6). Besondere Reinheitsforderungen in bezug auf eine niedrige Katalase-Konzentration müssen aber an die Glukose-Oxydase und Galaktosidase gestellt werden. Um Stabilität der Reagenzien zu gewährleisten, sollten die Verbindungen in einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH-Wert um pH 7 aufgelöst werden.

Die Empfindlichkeit des einphasigen Reagenziensystems reicht aus, um eine bestehende Entzündung am ι ο Euter, die als akute Mastitis bekannt ist, währe·id ihrer Entwicklung nachzuweisen. Das einphasige System erwies sich außerdem als hinreichend empfindlich, um einen visuellen Nachweis in den frühen Stadien des Entzündungsprozesses (subklinische Mastitis) zu ermöglichen, was von besonderem diagnostischem Wert ist. Diese Stadien können photometrisch mit dem einphasigen Nachweissystem festgestellt werden.

Die Empfindlichkeit des Analyseverfahrens kann auf gewünschte Werte angehoben werden durch Weiterentwicklung des Systems zu einem mehrphasigen System, wobei die Wasserstoffsuperoxyd und den Farbstoff ergebenden Reagenzien voneinander durch einen Zwischenraum getrennt sind, durch den das erzeugte Wasserstoffsuperoxyd diffundieren kann und in den die Milch eingebracht wird. Beim Übergang von der Wasserstoffsuperoxyd erzeugenden Phase des Systems durch den Zwischenraum in die Farbstoff erzeugende Phase des Systems hat das Wasserstoffsuperoxyd genügend Zeit zur vollständigen oder teilweisen Zerlegung, falls Katalese in der in den Zwischenraum eingedrungenen oder in ihn eingebrachten Milch enthalten ist

Durch die Anbringung eines durch die zu untersuchende Flüssigkeit führenden Diffusionswegs für das 3s Wasserstoffsuperoxyd, d. h. eines Durchgangs vom Wasserstoffsuperoxyd erzeugenden Enzym zum Farbstoff erzeugenden System, das hauptsächlich ein katalysierendes Enzym enthält, lassen sich jetzt sogar äußerst geringe Katalase-Mengen nachweisen und damit Mastitis in einer frühen Entwicklungsstufe feststellen.

Die folgenden Beispiele beziehen sich auf praktische Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

B e i s ρ i e I 1

Verwendet wurde eine Prüfzelle aus zwei Kammern, von denen die eine ständig mit einer halbdurchlässigen Membran verschlossen war und 1 — 10 U Galaktose-Oxydase, berechnet auf Laktose als Trägermittel, enthält Eine geringe Menge (0,5 — 1 ml) der auf Katalase zu untersuchenden Flüssigkeit wird in die offene Kammer der Prüfzelle eingegeben. Ein Peroxydase und einen Leukofarbstoff der in Beispiel 2 unten beschriebenen Art enthaltendes Prüfpapier ist in der Flüssigkeit so angeordnet, daß der der halbdurchlässigen Membran nächstgelegene Teil des Papiers in einem festen Abstand von einigen Milimetern von der Membran bleibt Verschiedene Empfindlichkeiten in bezug auf Katalase lassen sich erzielen, je nach der Menge der Galaktose-Oxydase, der Probenmenge und des obenerwähnten fest eingestellten Abstands. Mit dieser Anordnung sind halbquantitative Bestimmungen von Katalase in Konzentrationen von etwa 2 — 20 U/ml möglich, wozu die Entwicklung der Verfärbung des zur Prüfung verwendeten Papiers verfolgt wird. Die Verfärbung ist maximal nach einigen Minuten, wenn keine Katalase vorliegt, erreicht jedoch ein immer schwächeres Verfärbungsmaximum bei zunehmenden Katalase-Konzentrationen.

Beispiel 2

Das Wasserstoffsuperoxyd erzeugende System ist nur an einer Seite einer porösen Struktur wirksam, an deren anderer Seite das die Verfärbung erzeugende System anliegt. Die poröse Struktur bildet damit den Trennraum zwischen den beiden Systemen und kann die zu analysierende Flüssigkeit absorbieren. Gleichzeitig stellt der poröse Zwischenraum den Diffusionsweg für das Wasserstoffsuperoxyd dar. Der Zwischenraum kann durch eine halbdurchlässige Membran verstärkt werden, die die beiden Systeme voneinander getrennt hält. Die poröse Struktur kann aus einer oder mehreren Schichten eines porösen Papiers bestehen.

Die beiden Reagenzien-Mischungen können in Gelschichten fixiert verwendet werden. Die folgenden beiden Lösungen werden bei 40⁰C vorzugsweise in 20 — 40% Gelatine oder einer anderen, ein Gel bildenden Substanz zubereitet:

Lösung 1:

Peroxydase (EC. 1.11.1.7, RZ 0,6) 0,5 mg/ml o-Tolidin 0,5 mg/ml.

Puffersalz, beispielsweise ein Phosphat, das einen fast neutralen pH-Wert ergibt.

Lösung 2:

Galaktose-Oxydase (EC 1.1.3.9, etwa 20 U/mg, mit Laktose als Trägersubstanz, Nicht-Katalase) 0,5 - 5 mg/ml.

Puffersalz wie oben.

Beispiel 3

Statt die beiden Enzym-Systeme an den beiden Seiten einer porösen Zwischenschicht in getrennten Gelschichten wirksam werden zu lassen, können auch zwei poröse Schichten, beispielsweise aus Papier, verwendet werden, nachdem jeweils ein System an jeder Schicht adsorbiert wurde. Diese Schichten können dann zu beiden Seiten oder an verschiedenen Abschnitten einer dritten porösen Schicht, die ebenfalls aus Papier bestehen kann, angebracht werden. Die beiden mit den Reagenzien versehenen Schichten werden zweckmäßigerweise von der Zwischenschicht halbdurchlässige Membranen abgetrennt.

Beispiel 4

Statt in Gelschichten können die Reagenzien des Beispiels 2 in sogenannten, an sich bekannten Mikrokapseln mit Hilfe eines vorbeschriebenen Verfahrens eingekapselt werden, (s. beispielsweise T. M. S. Chang, F. C. Macintosh, und F. G. Mason, »Semi-Permeable Aqueous Microcapsules«, Cand. J. Physiol. Pharmacol, 44,115 [1966]).

Zwei Lösungen ähnlich denen des Beispiels 2 werden zubereitet und dann getrennt in Mikrokapseln eingeschlossen. Diese werden in die verschiedenen Schichten zu beiden Seiten einer porösen Diffusionsschicht eingebracht oder mit einem inerten Diffusionsmittel (z. B. Zellulose-Fasern) vermischt Die Mischung wird dann zu einer porösen Struktur umgeformt

Beispiel 5

Die halbdurchlässigen Membranen des Beispiels 3 wurden weggelassen, falls die verwendeten Enzyme zu

beiden Seiten oder an verschiedenen Stellen der porösen Struktur so unlöslich angebracht wurden, daß sie nicht in direktem Kontakt miteinander waren. Ein zur Anbringung von Enzymen an Papier geeignetes Verfahren kann verwendet werden, wie z. B. beschrieben in der Veröffentlichung von R. O. S t a s i w, A. B. Patel und H. D. Brown, »Utilization of Bound Lactase in Clinical Chemistry», Biotechnol. Bioeng., 14, 629(1972).

Wenn es in den Beispielen heißt, daß die verschiedenen Enzym-Systeme in geeigneter Weise an verschiedenen Stellen einer porösen Struktur angebracht werden sollen, so darf das nicht dahin verstanden werden, daß die Systeme beispielsweise an jedem Ende eines Papierstreifens anzubringen sind, sondern vielmehr müssen sie an den verschiedenen Bestandteilen der porösen Struktur oder an Teilen für den Aufbau einer solchen Struktur angebracht werden. Beispiel 4 bezieht sich auf letzteren Fall. Die die Reagenzien enthaltenden Mikrokapseln sind hierbei Bestandteile der Struktur, die entsteht, wenn die Mikrokapseln mit einem geeigneten Verfahren mit einem inerten Diffusionsmedium vermischt werden, worauf die Mischung sich zu einer porösen Struktur umwandelt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Katalase in Milch und anderen Flüssigkeiten, insbesondere in solchen biologischen Ursprungs, gekennzeichnet durch Zugabe eines aus einer Substanz oder mehreren synergistischen Substanzen bestehenden ersten Reagens, das in Gegenwart einer in Milch oder anderen Flüssigkeiten vorhandenen Substanz Wasserstoffsuperoxyd freimacht und durch Zugabe eines zweiten Reagens, das bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbreaktion ergibt, wobei die Katalase-Konzentration über den dabei entwickelten Farbton bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Reagens ein organisches oder anorganisches Peroxyd oder eine ein Peroxyd erzeugende Verbindung ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als erstes Reagens eine Verbindung verwendet wird, die Wasserstoffsuperoxyd in Gegenwart von in der Milch vorhandener Xanthin-Oxydase freimacht, also beispielsweise Xanthin oder Hypoxanthin.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ersten Reagens um ein oder mehrere Enzyme handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- ^o zeichnet, daß das ers'.e Reagens Galaktose-Oxydase ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Reagens aus den Enzymen /J-Galaktosidase und Glukose-Oxydase besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Reagens aus den Enzymen jS-Galak'osidase und Galaktose-Oxydase besteht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zweiten Reagens um einen Leukofarbstoff handelt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Reagens zusätzlich das Enzym Peroxydase umfaßt.

10. Reagenziensystem zur Durchführung des 4s Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch eine poröse Struktur, die mit einem ersten Reagens, das bei Berührung mit der Flüssigkeit oder einem Bestandteil derselben Wasserstoffsuperoxyd erzeugt, und einem zweiten so Reagens, das bei Oxydation durch Wasserstoffsuperoxyd eine Farbänderung erfährt, imprägniert ist.

11. Reagenziensystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Reagens vom zweiten getrennt ist.

12. Reagenziensystem nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch eine oder mehrere, zwischen dem ersten und dem zweiten Reagens angebrachte, halbdurchlässige Membranen.

13. Reagenziensystem nach einem der Ansprüche (10 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktur aus porösem Papier besteht.

14. Reagenziensystem nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das ersle und das zweite Reagens getrennt in Mikrokapseln f,s eingeschlossen sind, die ihrerseits in der porösen Struktur dispergiert sind.

15. Reagenziensystem nach einem der Ansprüche

10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zwei ie Reagens getrennt in Gelschichten eingebettet sind.

16. Reagenziensystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite Reagens in unlöslicher Form auf der porösen Struktur aufgebracht sind.

17. Reagenzien-Mischung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zusammensetzung 0,09-0,11 mg/ml /?-Galakiosidase, 0,09-0,11 mg/ml Glukose-Oxydase oder Galaktose-Oxydase, 0,9—1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml p-Tolidin.

18. Reagenzien-Mischung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 0,09-0,11 mg/ml Galaktose-Oxydase, 0,9-1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19 —0,21 mg/ml o-Tolidin.

19. Reagenzien-Mischung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 0,09-0,11 mg/ml Hypoxanthin, 0,9-1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19 — 0,21 mg/m) o-Tolidin.

20. Reagenzien-Mischung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 0,9—1,1 mg/ml Natriumperborat oder Harnstoff-Peroxyd, 0,9-1,1 μg/ml Peroxydase und 0,19-0,21 mg/ml o-Tolidin.

21. Reagenziensystem nach einem der Ansprüche 10—16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reagenzien-Mischung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20 in die Struktur eingearbeitet und getrocknet worden ist.