DE1467982A1 - Verfahren zur Herstellung von Fusidinsaeure und ihren Salzen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung Ton lusidinsäure und ihren Salzen Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Her- stellung der antibiotisch aktiven Verbindung fusidinsäure und ihrer Salze. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, bei welchen ein Filz, der zu Stamm Oephalosporiae gehört, unier eingeregelten Bedingungen so lange einer feraentation unterworfen wird, bis Ton ihm eine wesentliche Menge an Pusidinsäure gebildet worden ist, worauf dann die auf diese Weine erzeugte Verbindung isoliert wird.
• Heim Verfahren gemäß der Erfindung können die fusidin# säure oder ihre Salze sowohl in Form Ton verdünnten Lösungen oder Rohkonzentraten als auch in reiner kristalliner Fora

  erhalten werden, und, sofern es sich um freie Pusidia-

  säure handelt, kann diese ferner in ?oa eües ihrer

  kristallinen Solvate mit tösungsmitteln gewannen werden.

  fusidinsäure ist eine bekannte Verbindung, nämlich

  die Verbindung, die früher als Antibiotikum Z1-6 bezeich-

  net worden ist und gemäß früheren Vertiffentliohungen durch

  Züchten des Pilzen ?usidium ooooineum huoi (t. ?ubaki) in

  einem geeigneten lermentationswedium erhalten werdet kann.

  Die genannte Verbindung ist eine @,g-ungesättigte

  tarbonsäure der ]Formel 031H-4806, die wahrsoheinlioh die

  folgende Konstitution aufweist:

  Aus dieser lbsael, in der die gewellt ausgeftihrten

  Verbindungsstriche anzeigen, daß die in Prags stehende

  äonf igurati an un gewi B ist, ist ersichtlich" da.B lhxsi din-

  säure ein Cyolopentanoperhydrophenanthren-Derivat ist,

  tsidinsäure ist eine farblose, kristalline Verbin-

  dung, die in Wasser und Sex= nur schwer löslich ist, da-

  gegen in organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise

  ithenol, Aceton, Xethylisobutylketon, Aaylaoetat oder

  Ohloroforu, löslich ist. Siehst einen Schmelzpunkt von

  192 bin 1930 0 und eine spezifische Drehung von

  -9o in einer 1-%igen Lösung in Chloroform. Bei 220 in /U

  hat diese Verbindung einen molaren Bztinktionskoeffizienten

  von 8000 in Ithanol, und sie zeigt keine charakteristischen

  Absorptionsbanden oberhalb dieser Wellenlänge. Fusidinsäure

  ist ferner durch ihr Spektrum im ü8-Bereioh, wie es in

  der Zeichnung dargestellt ist, gekennseiohnet, aus der

  sich ergibt, dafi sie obs"akteristisohe Absorptionsbanden

  bei den in reziproken Zentimetern ausgedruckten ?requennen

  = 1265, 1385. 1695, 1730 und 3450 en 71 aufweist.

  Dti der ?apierohroaatographie unter Versendung der

  von Buch beschriebenen Systeme (Blochenioal Journal 50,

  1952, Seite 370) hat lhisidinsgure Itr-Verte von 0,38 und

  0,73 Im B (i)- b:w. E (5)-Systen.

  Die Saure, die einen pH-Wert von etwa 5,35 aufweist,

  kann mit anorganischen und organischen Basen eine Tiel-

  zahl von Salzen bilden, von weichen einige, wie das

  Natrium, Kalium- und Diäthanolaminsala, in Nasser löslich.

  sind, xogegenbeispielsweise das üalziumaals in Nasser nur

  schwer löslich ist.

  In der klinischen Therapie wird vorzugsweise das

  Natriumsalz benützt und bei der Behandlung von Intektions-

  krmkheiten, insbesondere den durch Staphylokoäken, Weisse-

  rie und Corynebakterien verursachten Krankheiten, gegen

  die sich fusidinsäure als sehr wirksam erwiesen hat, wie

  aus der im nachfolgenden wiedergegebenen Tabelle I ersieht- -

  lieh ist, aus der die spezitischeren antifungiellen und anti-

  bakteriellen Aktivitäten von husidinsäure zu entnehmen

  sind, oral verabreicht. In der genannten Tabelle sind in

  der ersten Spalte die jeweiligen Organismen, in der zweiten

  Spalte die verwendeten Substrate und in den verbleibenden

  Spalten die Aktivität, ausgedrückt In-den Mengen des Natrium-

  salzen von husidinsäure in mg/l, die eine 50-%ige Hemmung

  des in frage stehenden Organismus nach der in Stunden ange-

  führten Zeit hervorrufen, angeführt.

  Tabelle I

  Organimus Substrat Zeit Aktivität

  Staph ,loaooous aureus, ge ®m

  Peniolllin emptindlioh Bouillon 24 0,06j

  Btaphylooooous aureus reni-

  oillinase bildender Biete Bouillon 24 0,050

  xeisserla gonorrhoeae Blut-

  asoites-

  agar 24 0,32

  Beisseria seniaitides Blut-

  asoltes-

  agar 24 0,32

  Streptooooaus pyogenes Bouillon mit

  5 X aerum 24 392

  Streptooooous taeoalis Bouillon r3.t

  5 % 8l rum 24 5v0

  Pseudomonas aerugiaosa,

  Uibrio ooma,

  Banheriohla ooli,

  Elebsiella pneuaonise,

  ßerratia maroesoens und

  Proteus Ytlgar3e Bouillon 24 # 30,0

  Salmonella typhiauriuua Bouillon 24 > 100,0

  Oandida albioans Saborauds 24 100,0

  Trioophyton mentagrophytes Saborauds 72. 100,0

  lapergillus niger Saborauds 72 100,0

  Baoillus subtills Bouillon 24 1,6

  Hyoobaoterium tuberaulosis

  imrehuae Duboe. 14.4 0,79

  olostridium tetani Thloglykolat-

  Xedlum 48 0,02

  Ooryaebaoterium pyogenes ileiseh-

  wasser mit

  10 % Serum 24 0905

  Na wurde nun überraschenderweise festgestellt, daB

  Pilze der Gattung CephalosporiuN die zur ?aailie der

  Muoedhaoeae (Koniliaoiae) der Ordnung Hyphoa?oetales

  (Moniliales) gehören, oder durch Bestrahlen der Filze

  mit UV-Lioht, Röntgenstrahlen, Elektronen von hoher Ce-

  sohxindigteit oder durch chemische Mutagens n, wenn die

  Filze submers unter Belüftung in einen geeigneten Kultur-

  medium gezüchtet werden, erhaltene Mutanten imstande sind,

  eine antibiotisch aktive Verbindung zu erzeugen, die bei

  einem Vergleich mit Pueidinsäure Eigenschaften aufweist,

  die zeigen, da£ die zur Diskussion stehende Verbindung

  mit der genannten Säure identisch ist.

  Beispielsweise bilden im folgenden angefflhrte Ni.äro-

  organismen, die alle zur Gattung ßephalosporitua gehören,

  wenn sie 3 bis 7 Tage in den mit römischen Ziffern bezeich-

  neten Nährsubstraten fermentiert werden, Pusidinsäures

  Tabelle II

  Pils Ort der Substrat

  Herkunft

  Cephaloeporium lamellaeoola P.B.Smith CBS I und II

  Cephalosporium lefroyi Horne CBS I

  Cephalosporium malorum Kidd CBS III

  Cephalosporium reoifei Leao et Lobo CBS I

  Csphalosporium solerotigenum M et ?.

  Xoreau CBS IM

  Pils Ort der Substrat

  Herkunft

  Oephalosporium stühneri Sahaidt et Y

  Bense OBS

  Oephalosporim niveo-lanosum@Benedek CB8

  Die in der Tabelle verwendete Bezeichnung "0B8" be-

  sieht sich auf das Centralbureau voor Sohimmeloultures,

  Baarn, Holland, von wo die genannten Kulturen unter den

  angeführten lasen erhalten werden können.

  Die angegebenen Nährsubstrate sind die folgenden:

  I 8aborauds-Xedivua:

  Pepton 10 g

  ßluoose 20 g

  Dest. Wasser 1 1

  pR vor des Einbringen in den

  Autoklaven s"6,0

  II 8teleT's#äediumt

  alzoe rin 795 g

  Xaisquellwasser 50 % 2,5 g

  Xagaesiumsulfat 50 mg

  Kaliumphosphat, prim. 60 mg

  latrimaohlorid 4 g

  Perrosulfat 5 mg

  Cuprisulfat 1' mg

  Glucose 10 g

  Leitungswasser 1 1

  °--pH vor dem Einbringen in den

  Autoklaven - 7,0

  III Xedium der folgenden Zusammensetzungs

  Glucose 60 g

  Asparagin 4.5 g

  Ammonsultat 15,84 g

  Kaliumphosphat, prim. 14,28 g

  Kaliumphosphat, sek. 33,36 g

  Hagnesiumphosphat 6 g

  Cuprisulfat 38,4 mg

  gerrosulfat 6,6 mg

  Hangansulfat 53,4 =g

  Zinksulfat 9 mg

  Hefeextrakt 30 g

  Halsquellwasser 50 120 ml

  Kreide 30 , g

  Deut. Wasser 6 1

  Zur Gewinnung eines Mutanten von der Art, die für

  das Yerfahren gemäß der Erfindung brauchbar ist, kann

  eine der bekannten Mutationsmethoden angewandt werden,

  bei der die Sporen des Pilzes eine äinwirkung erfahren.

  So kann beispielsweise eine Sporensuspension mit

  ionisierenden oder nichtionisierenden StraMsh bestrahlt

  werden oder die Sporen können der Einwirkung von mutagenen

  tktemikalien, wie Diätiylsulfat oder Senfgas, unterworfen

  werden.

  zu wurde jedoch festgestellt, das die Mutation

  des Pilzes auf sehr zweckmäßige Weise durch Bestrahlen

  einer Sporensuspension mit UV-?doht über einen Zeitraum,

  der°einen Überlebungsprozentsatz in des Bereich von 0,005

  bis 2,0 % gewährleistet, bewirkt werden kann.

  Hei einem Versuch, '5e1 welchem eine Sporansuspension

  von Cepheloeporium lamellaeoola 7.E. Smith-f.E. Smith mit

  UV-Licht bestrahlt wurde, wurde ein besonders geeigneter

  Mutant erhalten.

  Hei diesem Versuch Wurde das unten in Tabelle III

  angettlhrte Verhältnis zwischen Übedebungspro$entsatz und

  Einwirkungszeit testgestellt.

  Tabelle III

  Einwirkungszeit in Sekunden $berlebungsprozentsatz

  10 50

  20 493

  30 09035

  40 0,006

  50 0,002

  Nach der Einwirkung wurden die Sporen der bestrahlten

  8uspensionea auf igarplatten aulaebraoht,und eine geeignete

  .Anzahl der gezüchteten goloalen wurde isoliert und näher

  untersucht, um ihre Naohatunsbedingungen und ihre Yähig-

  keit zur Erzeugung ton Pusidinsäure zu ermitteln.

  Bei dieser Verfahrenexeise wurde der oben erwhnte

  besonders geeignete Mutant aus der Sporensuspension Iso-

  liert, die 30 Sekunden lang bestrahlt worden war. Dieser

  Mutant erhielt die Bezeichnung 01-u 499, unter der er

  beim Commonwealth Myoologioal Institute in Surrey, Ȋg-

  lan d, geführt wird.

  Hinsichtlich der

  der Bporen-

  bildung und der hrbe ähnelt der Mutamt 01-u 499 des ur-

  sprünglichen Stamm, erfordert jedoch i= Gegensatz zu die-

  sem Stamm die Anwesenheit ton "x-äminobuttersture oder

  Isoleuotit in dem Substrat.

  Bei der Wohtung in einem der oben angeführten Sub-

  drnte erwies sich der Ifttant CQ-u 499 als Imstande, drei

  bis tiermal so viel 7üsidinsgure zu produzieren als der

  3rbitterstamm.

  Nr die technische Herstellung ton fnsidinsäure :eig-

  ten sich insbesondere der ?1la Dephalosporium lasellaeoola

  ?.8.8atith-f.B.BÜth und Mutanten davon als geeignet, doch

  ist die Erfindung keineswegs auf die alleinige Verwendung

  dieser Organismen beschränkt.

  Heim Verfahren gemäß der ärtindnng wird eine l«idin-

  säure erzeugende ßpezies der Gattung Cephalosporium unter

  aeroben Bedingungen in einem uäßrigen itährrediux, das

  Kohlehydrate, Stickstoffquellen und geeignete Mengen der

  anorgaaisehen Salate und anderen Stoffe, die für die Braäh-

  rung des Pilzes erforderlich sind, enthält, gezüchtet und

  die forsentatiom wird solange fortgesetzt, bis die betref-

  fende Usung eine wesentliche sntibiotisahe Aktivität aut-

  »int, »rau! dann die auf diese Welse gebildete Pasidin-

  säure pwmnwe, konzentriert und in reiner Törn isoliert

  oder mit Eilte an sich bekannter Umsetzungen in eines ihrer

  Salze übergeführt wird.

  Die Bildungsgeschwindigkeit von pusidinsäure wird

  während den Verlaufes der

  durch routinemäßige

  äestimzvmg der Aktivität der Kulturfiltrate ermittelt,

  lttr welchen Zweck die Agarplatten-Nothode angewandt »d

  dabei beispielsweise Staphylooooous aureus als Testorganis-

  mus verendet werden kann.

  Die optimale Ausbeute an Pusidinsäure wird in eines

  Zeitraum Ton 80 bin 130 Stunden bei einer Temperatur

  zwischen 20 und 300C und vorzugsweise von 24 bim 2800 er-

  halten.

  Die angeihrten Tenperaturbereiohe stellen jedoch

  keine d renzwerte dar, da die t;3r den Erhalt gUnstiger

  =rgelminse erforderliche Zelt in einen gewissen Au»ag

  von der Bauwehe den Permentationagefäges und der Art

  den verwendeten Rührwerkes bzx. der Schütteleinrichtung

  abhängt.

  für die Herstellung von fusidiasäure haben sich zwar

  mehrere bekannte Kulturmedien als brauchbar erriesen, doch

  werden solche Medien bevorzugt verwendet, die als Stick-

  stoffquelle einen oder mehrere Stoffe aus der Gruppe Mai s-

  quellwasser, Lojabohnenmehl, Casein oder andere Nilahprodukte

  und Pieisch- und Knochenmehl enthalten.

  Die Menge an verfügbarem Stickstoff in den Kultur-

  medium kann vorteilhaft in den Bereich von 0,01 % bis

  1,5 % liegen und beträgt vorzugsweise etwa 0,15 % den

  Kulturmediums.

  11s vorzugsweise zu verwendende Kohlehydrate können

  Saooharose und Glucose genannt werden.. ferner ist es vor-

  teilhaft, das Nähmedium durch einen Zusatz von Fetten oder

  Pettsäuren zu ergänzen, um mit diesen einen Teil der Kohle-

  hydratquelle und r` ergiequelle zu bilden, da diese Stoffe

  e:.ne fördernde W.rkun; hinsichtlich der Bildung vom 7u3idin-

  säure suezuUban scheinen, wenn sie in Mengen ten etwa 0,1

  bis 5,0 % den Kulturmediums verwendet werden.

  Pür den angeführten Zweck können sowohl die Pettsäure-

  glyeeride, als auch die darin enthaltenen freien Fettsäuren

  oder synthetische Ester dieser letteäuren beim Verfahren

  gemäß der Erfindung verwendet worden. Insbesondere haben

  sieh.äettsäuren mit 12 bis 20 Kohlenetoffatcriten in der

  KohlenetoffLette oder J)erivate von solchen PEttsiuren als

  fördernd t"irkende Stoffe als brauchbar Erwiesen.

  Die Ut.-inuuna d@z, PucicansL.ure aus der Kultumedium

  kann auf verschiedene Arten erfolgen. ?orteilhafterweiee

  besteht der erste Schritt zur ßek3xrnung dieses Stoffee in

  einer Abtrennung des Hycele von dar Kulturflüssigkeit,

  beispielsweise durch giltration. Als nächster Schritt

  kann sich eire Adearption &n einem festen ldaorptionmittel,

  wie Aktivkohle oder einem Ionenaustausoherharz, mit einer

  nachfolgenden Blution aua drum Adaorptionomittel ansohlieAkem,

  wodurch eine Iconsentriertere und gereinigte Lösung von

  Fusidinogure erhalten werden kann. Der nächste Schritt

  kann aber such eine Bztraktion mit einen geeigneten IOmmgs-

  mittel, vorzugsweise einem mit 'Wasser nicht mIeohbaren 70-

  sungsmi.ttel, wie Nethylieobutylk.3ton, 9myiacetat, Butylaaetat

  oder dergl., bei einem geeigneten pH-Wert sein, worauf dann

  das reinere Produkt aus diesem 1äsuaZsmittel durch Bin-

  daApfen der organischen Phase auf ein kleines Voluften und

  Ausfällen des antibiotischen Stoffes entweder durch AbkOh-

  len oder durch Zusatz einer Torbindung, Welche die LösUoh-

  keit des antiblotiseh wirksamen Stoffes vermindert, isoliert

  werden .kann.

  Inabesoadere in Zusamunhang mit der mtIetzt ange-

  führten AusfUhruagsiesn käan Benzol erwähnt werden, das

  ein leicht kristallisierbares Solvat von. htsidinsäure

  bilden kann.

  Aua dem organischen Lösungsmittel kann tsidinsäure

  auch ohne Konzentration dieses Lösungsmittels isoliert

  werden, roll die sanrm äigenachaften ran hnsidiasäure

  die Xrohiührung einer ansehließenden Extraktion der erga-

  nisehen Phase mit einer sltlrigen alkalischen Lösung oder

  mit einer wUrigen Ouspenslon einer alkalischen Verbindung

  ermöglichen, wodurch konzentrierte oUrige Lösungen von

  Salzen der 1Pusidinsäure erhalten werden können. Durch

  Ansäuern von solchen: Lösungen kann die Säure ausgefällt

  Werden oder es kann, wenn dien gewUnsaht wird, das Balz

  der Pasidinsäure aus der alkalleohen Lösung isoliert werden.

  In Bezug auf die Reinigung v an Yusidinsäure ist ihre

  ?ähigreit, mit bestimmten Lösungsmitteln Bolrate zu bilden,

  ein viohtiges Msrlmal. Be wird beispielsweise bei einer

  Mutigen Austübruagsfori des Verfahrens gemäß der Irtin-

  dung die rohe Säure dadurch gereinigt, daß sie !n einer

  kleinen Menge von heißen Nethaaol gelöst wird, wobei beim

  Abkühlen Ihr Methmolsoivat in Oberrauchend reiner lern

  auskristallisiert, so daß nur diesen eirunde diese Vorgsacigs-

  weise besonders dazu geeijpet ist, äusidinsäurv 3.n einer

  pharras«tisoh annehmbaren Qualität zu gewinnen. Das ge-

  nannte äethaaolsolvat hat einen Schmelzpunkt ton 179 bis

  179.5o0.

  Wenn Salze der fsidinsäurs erhalten werden sollen,

  dann kfnea diese durch eine einfache Zeutralieation der

  Säure oder eines ihrer Solvate gewonnen werden, indes die

  in !rase stehende Base in Gegenwart eines geeigneten Baak-

  tioansdedluus sngentst wird, das die Umsetzung erleichtert

  und ans welchen das Salz ausfallen kann oder gegebenenfalls

  durch Zusatz einer geeigneten äozpoonemte, die die Iösiioh-

  keit des geutinsohten Salzes herabsetzt, ausgefällt werden

  kann, oder das Salz kann durch Uadanpfen der Reaktions-

  nisehmtg isoliert werden.

  Bach einer anderen tusfMhraageforn kann ein bereits

  vorliegendes Salz von Pusidinsäure mit der in Betracht kos-

  tenden Uze megesetst werden oder das gewUnsohte Salz von

  fasidinsgure kann durch eine doppelte ünsetzung eines ihrer

  in vorhl.nein hergestellten Salze mit einen anderen Salz,

  welches das gewUnsehte Metallion oder die genlinsohte Hase

  enthält, hergestellt werden.

  Umfangreiche klinische Vershohe, die kürzlich ausge-

  inhrt xuxden, haben geseilgt , daa fusidineäure und gewisse

  Salze von ihr den Anforderungen, die an pharmazeutisch

  amaebnbare Antibiotika gestellt werden, entsprechen md-

  und diese Verbindungen Wertvoile Stoffe für die Behand-

  lung Ton Infektionskrankheiten darstellen, wie dies bei-

  spielsweise in der Zeitschrift "The Lancet", Band I, 1962,

  Selten 928 bis 937, beschrieben ist.

  Die Erfindung wird nun ein Hand der folgenden Beispiele,

  aus Welchen 31nsilaeiten der verschiedenen lusftlärimgsforaen

  entnommen werden können, näher erläutert t

  Beispiel 1

  Herstellung von Pasidinsäure.

  3 Liter einen Zulturmediuns der folgenden Zusamrn-

  setsung,ausgedrüokt in glls

  Glycerin 7o,5

  Glucose 10,0

  Sojabohnenmehl 3,0

  Maisquellwasser 2,5

  1(a01, 0

  KH904 0,6

  he »4.%0 09005

  xgs04.71120 0,5

  0u80,4#5%0 o,004,

  das vor des Sterilisieren auf einen pH-Vert von 6,8 einge-

  stellt Worden War, wurden in einem feraenter bei einer

  Temperatur von 120 °Q wEhrend eines Zeitraumes Ton einer

  halben Stunde sterilisiert und dann nach dem Abkühlen

  mit Sporen den Stammes Oephalosporium lamellaeoola

  p.$.Smith-?.B.ßti.th (erhalten vom Centraalbureau voor

  Sohimmeleultures, Baarn, Holland, und zur Gattung Oepha-

  losporium, gehörig) von einer Agarplatte angeimpft. Hierauf

  wurde die Kultur unter aereben Bedingungen bei einer Tem-

  per#f von 27°C 4o Stunden lang in einer hin- und herge-

  henden Sohütteleinriohtung bebrütet. Das auf diese weise

  erhaltene Keimmaterial wurde in ein ßefäB mit einen Inhalt

  von 700 1 übergeführt, das ein Kultumedlum von der gleichen

  Zusammensetzung Erie der germenter von der übliohen teohni-

  echen Größe enthielt, und bei einer Temperatur von 26°0

  48 Stunden lang bebrütet, um die Entwicklung den vegetati-

  ven Wachstums den Pilzes vor dem änimpfen den Rauptfermen-

  ters au bewirken.

  Anschließend wurden 16,000 1 eines Kulturmediuns d er

  folgenden Zusammensetzung in gfls

  Saooharose 60,0

  Halsquellwasser 50 % 20,0

  gH2P4 10,0

  Ngs04.7%11 0959

  das vor dem Sterilisieren auf einem pH-Yert von 6,8 ge-

  bracht worden war, in dem Hauptfermenter bei 1200C eine

  halbe Stunde lang sterilisiert und nach dem Abktihlen mit

  den oben ervähnten Impfgut angeiupft. Unter Bewegen »d

  und Durchleiten von ruft durch eine Verteiltmgsvorrioh-

  ttmg in einen geeigneten Ausmaß (in, einen Verhältnis von

  095 1 Luft pro 1 Plüseigkeit pro Minute) wurde das Xyeel

  gebildet, und die Permentation wurde bei einer Temperatur

  von 2600 während eines Zeitraumes ton 100 .Stunden fortge-

  setzt.

  Während des Verlaufes der Fermentation wurde die Akti-

  vität von Proben des Kulturfiltrates nach der Agarsohalen-

  Methode unter Verwendung ton StaphJZooocaus aureus als

  Testorganismus bestimmt. Wenn der Proseß beendet war, ent-

  sprach die erhaltene Aktivität einer Konzentration der

  Pusidinsäure in dem Kulturmedium v= 80/U&/ml.

  Nach den Abfiltrieren des MToels wurde die geläuterte

  Nährlösung auf einen pH-Wert qcm 6,0 eingestellt und in

  einem Podbielniak-Eztraktor mit Methylisobutylketon extra-

  hiert. Dieser Extrakt, der 1,1 kg Pusidinsäure enthält,

  wurde ansohlielien*it Natronlauge eines pH-#ertes von 11,5

  extrahiert. Unmittelbar nach der Extraktion wurde die fri-

  ge ]Phase auf einen pH-Wert ton 9,3 gebracht und in einen

  vakuuneindampfer auf ein Volumen t= 150 1 mit einem Gehalt

  von 0"9 kg Pasidinsäure eingedampft.

  Dann wurde Benzel zugesetzt und der pH-Wert der xä9-

  rigen nass mit Hilfe vaoa@ Salzsäure unter »Ohr« auf 0, 5

  eingestellt: dabei wurde ein Niedessehlag gebildet, der

  ans dem 1bn:elsolvat von Pusidinsäure bestand, Nachdem

  nach weitere 4 Stunden gertthrt worden war, wurde der

  Niederschlag abfiitriert, mit Wässer und Bensol gewaschen

  und hierauf getrocknet.

  Das lehprodurt wurde in Nethylenohlorid gelöst und

  filtriert zmd die JZmmg wurde in Vakuum zur trockene ein-

  gedampft. Der täiotstead wurde in heißes Miethanoi gelöst

  und beim lbklxälen auf 000 kristallisierte ein Nethanol-

  aolvat aas, das abfiltriert, mit eiskaltes Methanol ge-

  xasehen und dann getrocknet wurde, wodurch ein farbloses

  1Vthanelsolvat ton Pusidinsäure erhalten wurde.

  Hein 2roclmen dieses ßolvats 3.a Vakuum bei einem

  Druck renn 0,01 ms RS und einer feaperatur von 10000 bis zur

  Oewiehtstenstanz wurde das von Lösungsmittel freie Produkt

  mit einem 1g. von 191 bie 192°0 erhalten, das im üR-Spek-

  trum starke Hunden bei 12b5, 1385, 1695. 1730 und 3$50 ei 1

  (13r) zeigte.

  Herstell»g de: Nrtri#msalsee von rusidinet?ure

  In einem PPeraentatiansgefio aus rostfreie= Stahl, das

  einem Inhalt vom 1,5 a3 hatte und mit einex Mrer ansge-

  atattet war, wurden 1,00 a3 eines Kulturmediums der fol-

  genden Zuseamnsetztmg hergestellt t

  Glucose 20"0 kg

  1Pleleeh- und Knochenmehl 20,0 kg

  Maisquellwasser, 50 %

  Trocken$ubstanz 2,5 kg

  Specköl @ 20,10 kg

  Naal 490 kg

  xgso$ 0,05 kg

  Leitungswasser ad 1000 3riter

  Das Kulturmedium hatte einen pH-Vert Ton 6,1, der mit

  Hilfe Ton verdünnter Natronlauge auf 6,5 erhöht wurde; dann

  wurde das Medium durch Erhitzen sterilisiert. Nach den Ab-

  kühlen wurde es mit 3 1 einer Kultur fron Cephalosporium

  lamellaecola F.$.Mith-F.B.Salth, die 48 Stunden lang in

  einer Schüttelflasche bei einer Temperatur vau 2700 gezüch-

  tet worden war, angelmpft. Der Inhalt des Permentatiensge-

  fäBes wurde gerührt und bei 27°t? 96 Stunden lang mit 0,6 m3

  Luft/Stunde belüftet. Während dieses Zeitraumes wurde ein

  pH-idert von 7,0 aufrechterhalten. Nach der Permentations-

  periode wurde festgestellt, daß die antibiotische Aktivi-

  tät des Kulturmediums, bestimmt nach der üblichen Agar-

  sohalen-Hethode mit Staph'locooeus sureus, einem Gehalt

  von 150 mg Pusidinsäure pro Liter entsprach, wenn als Ver--

  gleiohsbasis die Aktivität des reinen Stoffes, nach der

  gleichen Methode bestimmt, verwendet wurde.

  Das Nyoel wurde von dea Kulturmedium durch Filtrieren

  abgetrennt, wobei die Menge an Filtrat 700 1 betrug.

  Der pH-Wert des giltrate$ Wurde durch Zusatz von

  25 Eiger Schwefelsäure auf 6,0 eingestellt und dann

  wurde das liltrat mit 2°0 1 Butylaoetat in einem Pod-

  bielniak-Bztraktor im Gegenetroa extrahiert. Die dabei

  erhaltene Butylaoetatphase wurde mit einem Anteil von

  77 1 Wasser, dem 10 %i ge Natronlauge bis zum Erreichen

  eines pH-Wertes von 11,0 zugesetzt Wurde, extrahiert ,

  und dann wurde die wäßrige Phase von der Butylaeetat-

  phase getrennt. Der pH-Wert der wäßrigen Phase wurde

  durch Zusatz von 25 $iger Schwefel säure auf 9,3 einge-

  stellt, und die Lösung Wurde in einem Vakuumeindampfer

  auf ein Volumen von 5 1 eingeengt. Durch Zusatz von 0,5 1

  Benzol und Einstellung des pE-Wertes der wUBrigen Phase

  auf 3,0 mit Hilfe von Salzsäure unter Rohren wurde ein

  Niederschlag gebildet, der aus dem Benzolsolvat fron 7'uei-

  dinsäure bestand. Nach 5-stündi gem Rühren wurde dieser

  Niederschlag abfiltriert, mit Wasser und Benzol gewaschen

  und getrocknet. Durch ümkristallisieren aus Benzol wurden

  72 g des Stoffes mit einem Pp, ton 187 bis 189o0 erhalten.

  20 g des auf diese Weise geronnenen Benzolsolvats

  wurden in 800 s1 Nanser suspendiert und zu der Suspension

  wurde 0,5 n#Natrenlauge bis zum Erreichen einen pH-Wertes

  von 9,0 zugesetzte Die Lösung wurde filtriert und das

  Piltrat mit 2000 ml n-Butanol versetzt, worauf der Wasser-

  gehalt der Lösung durch azeotrope Destillation im Vakuum

  entfernt Wurde. Aue dem Rückstand wurde das gewünschte

  Natriuasala durch Zurats von äther ausgefällt. In wurde

  abfiltriert, mit Xther gewaschen und hierauf getrocknet.

  Durch Uakristallisieren aus äthanol/loeton wurden 14,4 g

  des reinen, kristallinen latriussalses erhalten.

Claims (1)

1. P a t e n t a n, a D r ti c -h e 1. Verfahren zur Herstellung von antibiotisch aktiver Fusidinsäure oder ihren Balzen, dadurch g e ä e n n - s e i o h a e t , Saß eine Speoies der Gattung gepha- losporiua, die 7bsidinsäure bildet, unter aeroben Be- dingungen In einem fragen Nährmedium bebrütet wird, das eine tohleustoffquelle, wie Kohlehydrate und Lipoide, Stickstoffquellen md geeignete Xeagen der anorganischen Balze und anderen Stoffe, die für die Braährung des Pilzes erforderlich sind, entbält, und die Penentation so lange durohgefUhrt wird, bis die genannte Lösung eine wesentliche aatibiotisehe Aktivität aufweist, und denn die auf diese Weise gebildete Pnaädinsäure geronnen, konzentriert und in reiner form isoliert oder mit Hilfe von an sich bekann- ten Unsetsungea in eines ihrer Salze übergeführt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n - s e i o h n e t , Sao ein ?eil der in des Nährmedium ent- haltenen Stickstoffquelle aus fetten oder Fettsäuren be- steht. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e ken n - s e i o h n e t , Sao die Stickstoffquelle einen oder meh- rere Stoffe aus der Gruppe Maisquellwasser, So jabomenmehl, Casein oder andere Nilohprodukte und ]Fleisch- und Knochen- sohl enthält Sand die ?ernemtation subsers bei einer Tempe- ratur :wischen etwa 20 und 3000 und .während eines Zeit- range s von etwa 2 bis 7 f aipn durchgeführt wird, Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e i e n n - s e i o h n e t , da£ das Nährmedium eine assiailierbare Stiohstoffquelle in einer Menge entsprechend 0"01 bis 195 % Stickstoff enthält.