DE1203912B

DE1203912B - Verfahren zur Herstellung hochwirksamer Aluminiumoxyd-Depotimpfstoffe

Info

Publication number: DE1203912B
Application number: DEB75733A
Authority: DE
Inventors: Dr Phil Nat Alfred Grafe
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1963-04-08
Filing date: 1964-03-05
Publication date: 1965-10-28
Also published as: GB1010005A; LU45817A1; NL6403664A; ES298415A1; US3250596A; DK106195C; BE646234A; AT248027B

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

AOIk

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1203 912

Aktenzeichen: B 75733IV a/30 h

Anmeldetag: 5. März 1964

Auslegetag: 28. Oktober 1965

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung hochwirksamer Aluminiumoxyd-Depotimpfstoffe.

Es ist bekannt, daß gewisse Aluminiumoxyde — nämlich y-Aluminiumoxyde — für die Herstellung von Depotimpfstoffen verwendet werden können. Solche Depotimpfstoffe haben eine beträchtlich bessere und konstantere Wirksamkeit als Al₂O₃-freie Impfstoffe oder Aluminiumhydroxyd enthaltende Impfstoffe. Die Aluminiumoxyd-Impfstoffe erhält man z. B. durch mindestens 20 Minuten langes Schütteln feinverteilten Aluminiumoxyds mit der gewünschten Impflösung. Obwohl es bislang noch nicht geklärt ist, ob es sich hierbei um echte Adsorptionsvorgänge handelt, werden diese Aluminiumoxyd-Depotimpfstoffe als Aluminiumoxyd-Adsorbatimpf stoffe bezeichnet. Diese Impfstoffe können als Antigene Viren, Bakterien, Endotoxine, Ektotoxine oder die entsprechenden Toxoide enthalten. Das feinverteilte Aluminiumoxyd muß natürlich unschädlich für mensch-Iiches und tierisches Gewebe sein; als besonders geeignet hat sich solches y-Aluminiumoxyd erwiesen, das eine molare Oberfläche von 40 000 bis 80 000 qm hat. Die genannten Impfstoffe enthalten darüber hinaus noch Substanzen, die den Impfstoff auf den gewünschten pH-Wert puffern und ihn dauerhaft isotonisch halten, wobei Wasser als flüssiges Medium benutzt wird. Messungen nach der für die Bestimmung molarer Oberflächen üblichen BET-Methode haben gezeigt, daß y-Aluminiumoxyd mit einer molaren Oberfläche zwischen 10⁴ und 2-10⁴qm brauchbar ist. Die Komponenten der Impfstoffe werden normalerweise so bemessen, daß 1 ml der Mischung 10' bis 10⁹ Viren oder Bakterien oder die äquivalente Menge des Toxins bzw. Toxoids (das sind etwa 50 bis 500 Flockungseinheiten) und so viel Aluminiumoxyd enthält, daß es eine Oberfläche von 2 bis 20 qm besitzt. Das Schütteln wird 20 bis 40 Minuten bei Temperaturen zwischen 0 und 30⁰C, vorzugsweise unterhalb von 10⁰C, durchgeführt. Bezüglich der Herstellung der y-Aluminiumoxyde sei auf die Publikation F r i c k e et al., Berichte der deutschen ehem. Gesellschaft, 1937, S. 2318, verwiesen. In den oben beschriebenen Impfstoffen sind etwa 2,5 bis 50 mg Aluminiumoxyd pro 1 ml Impfstoff enthalten.

Depotimpfstoffe dieser Art sind beispielsweise in der österreichischen Patentschrift 216 142 beschrieben. Es wurde nun gefunden, daß Aluminiumoxyd und speziell das in der genannten österreichischen Patentschrift 216 142 beschriebene, gemäß F r i c k e et al. hergestellte y-Aluminiumoxyd keine Impfstoffe mit gleichmäßiger Stärke ergibt. Dies beruht darauf, daß Verfahren zur Herstellung hochwirksamer
Aluminiumoxyd-Depotimpfstoffe

Anmelder:

C. F. Boehringer & Soehne G. m. b. H.,

Mannheim-Waldhof

Als Erfinder benannt:
Dr. phil. nat. Alfred Grafe,
Weinheim (a. d. Bergstraße)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 8. April 1963 (271447)

die Aufnahmekapazität des zugegebenen Aluminiumoxyds für Antigene starken Schwankungen unterworfen ist, auch wenn es sich um ein Aluminiumoxyd mit ähnlicher oder sogar gleicher molarer Oberflächengröße handelt. In der folgenden Tabelle I wird die unterschiedliche Aufnahmekapazität von drei verschiedenen y-Aluminiumoxyden für Polioviren gezeigt. Alle Proben des y-Aluminiumoxyds der Tabelle I wurden gemäß der österreichischen Patentschrift 216142 und der Publikation F r i c k e durch 2stündiges Erhitzen von Aluminiumhydroxyd auf 600⁰C in einem vorgeheizten Ofen hergestellt; die molare Oberfläche betrug in jedem Fall 62 300 qm (gemessen nach der Methode von F r i c k e ).

Tabelle I

y-Aluminium- _rj	Virusgehalt des Al_aO₃-freien	adsorbierter Virus
oxyd	Überstandes	Gehalt
Probe	°/o	%
	100	_
1	64	36
2	38	62
3	30	70

509 719/359

Die Aufnahmekapazität der Aluminiumoxyde für Polioviren wurde bestimmt unter Benutzung der in der USA.-Patentschrift 3117 061 beschriebenen refraktometrischen Methode. Eine trivalente Poliovaccine wurde mit je 10 mg des betreffenden y-Aluminiumoxyds pro ml Vaccine 60 Minuten im Kühlraum (unterhalb von 10⁰C) in einer Schüttelmaschine heftig geschüttelt. Das Aluminiumoxyd wurde dann durch einstündiges Zentrifugieren bei 3000 UpM abgetrennt. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden der refraktometrischen Virusbestimmung gemäß USA.-Patentschrift 3 117 061 unterworfen, desgleichen die aluminiumoxydfreie Vaccine. Den refraktometrisch bestimmten Virusgehalt der letzteren Lösung setzt man gleich 100 und errechnet hieraus die relative Aufnahmekapazität des y-Aluminiumoxyds.

In der folgenden Tabelle II ist gezeigt, daß nach den Ergebnissen von Rattentesten gemäß G h e nd ο η et al. (Acta Virologica, 3, 1959, S. 250 bis 252) die antigene Wirksamkeit solcher Al₂O₃-Adsorbatimpfstoffe mit der unterschiedlichen Virusaufnahmekapazität der Aluminiumoxydproben korrespondiert.

Tabelle II

y-Aluminium- oxyd Probe	adsorbierter Virusgehalt %	Mindestmenge zur Auslösung der Antikörper bildung ml
1 2 3	36 62 70	0,1 0,2 0,4 0,5

Eine Reihe von Injektionspräparaten mit wechselndem Impfstoffgehalt wurde hergestellt (0,1 ml Impflösung + 0,9 ml Verdünnungsmittel, 0,2 ml Impflösung + 0,8 ml Verdünnungsmittel usw. bis 0,9 ml Impflösung + 0,1 ml Verdünnungsmittel). Für die Teste wurden jeweils die nach dem Zentrifugieren erhaltenen, aluminiumoxydfreien Überstände benutzt. Man impft Ratten von ungefähr 250 g Gewicht mit 1 ml verdünnter Impflösung intraperitoneal und vergleicht mit einer anderen Gruppe von Ratten, welche die nicht mit Aluminiumoxyd behandelte Kontrollvaccine erhielten. Jede Gruppe von Testtieren bestand aus 4 Ratten, und in jedem Fall wurde von der überstehenden Impflösung der drei y-Aluminiumoxydproben und der unbehandelten Impflösung die zur Auslösung der Antikörperbildung bezüglich des Poliovirus Typ II erforderliche Mindestmenge bestimmt. Wie aus Tabelle II hervorgeht, benötigen diejenigen Aluminiumoxydproben, die eine geringere Aufnahmekapazität für Viren haben, auch eine kleinere Menge überstehender Impflösung, um die Antikörperbildung auszulösen.

Bisher war es unmöglich, die Aufnahmekapazität eines speziellen Aluminiumoxyds für Antigene vorherzubestimmen, außer durch die Bestimmung der effektiven Aufnahmekapazität mittels Tierversuchen, die aber relativ umständlich und zeitraubend sind. Die hierdurch entstehenden Probleme für die Impfstoffproduktion werden erschwert durch die Tatsache, daß die Aluminiumoxyde weitgehend in ihrer Antigenaufnahmekapazität variieren, auch wenn immer Material derselben Herkunft benutzt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung hochwirksamer Aluminiumoxyd-Depotimpfstoffe, die eine gleichmäßige und exakt vorherzubestimmende Stärke aufweisen, ohne daß hierzu Tierversuche benötigt werden. Es wurde

ίο nämlich gefunden, daß man unter Verwendung einer ionenfreien wäßrigen Eiweißlösung eine verläßliche Aussage über dieAufnahmekapazität eines Aluminiumoxyds für Viren erhalten kann. Wenn man eine solche wäßrige Eiweißlösung mit einem gegebenen Aluminiumoxyd zusammenbringt, so steht die Eiweißaufnahmekapazität des Oxyds in direkter Relation zur Aufnahmekapazität des Aluminiumoxyds für Viren des nicht lipoiden Typs, z. B. Polio. Mit anderen Worten, wenn das Aluminiumoxyd eine niedrige Eiweißaufnahmekapazität zeigt, hat es auch eine relativ niedrige Aufnahmekapazität für Viren des nicht lipoiden Types usw. Nach unseren Befunden besitzt ein Aluminiumoxyd, welches eine mindestens 30%ige, vorzugsweise 50%ige Eiweißaufnahmekapazität hat, eine ausreichende Aufnahmekapazität für derartige Viren.

Ferner wurde gefunden, daß wäßrige Kephalinlösungen eine zuverlässige Aussage über die Aufnahmekapazität von Aluminiumoxyden für lipoide Virustypen, wie Myxo- und Masernviren, erlauben. Auch in diesem Falle besteht eine direkte Relation zwischen der Kephalinauf nahmekapazität eines Aluminiumoxyds und seiner Aufnahmekapazität für derartige Viren. Nach unseren Befunden besitzt ein Aluminiumoxyd, welches eine mindestens 10%ige Kephalinaufnahmekapazität hat, eine ausreichende Aufnahmekapazität für lipoide Viren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung hochwirksamer Aluminiumoxyd-Depotimpfstoffe ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst bestimmt, welche Mengen Eiweiß und/oder Kephalin ein gegebenes Aluminiumoxyd aus deren ionenfreien wäßrigen Lösungen zu adsorbieren vermag, und dann solche Aluminiumoxydpräparate auswählt, die eine Eiweißaufnahmekapazität von mindestens 30% bzw. eine Kephalinauf nahmekapazität von mindestens 10% aufweisen, worauf man diese Aluminiumoxydpräparate in üblicher Weise in Depotimpfstoffe überführt.

Im folgenden ist die Durchführung des Eiweiß- bzw. Kephalintestes näher erläutert.

Beispiel 1

Eine 5volumprozentige Lösung von Kälberserum in demineralisiertem Wasser wird hergestellt; der Eiweißgehalt der Lösung beträgt 0,2624 Gewichtsprozent. Von dieser Grundlösung entnimmt man Proben und vermischt sie mit 10 mg des zu prüfenden Aluminiumoxyds (s. Tabelle I und II) pro Milliliter Serumlösung. Die mit Aluminiumoxyd versetzten Proben werden im Kühlraum 60 Minuten heftig automatisch geschüttelt. Das Aluminiumoxyd wird dann 60 Minuten bei 3000 UpM abzentrifugiert und der Eiweißgehalt des

Überstandes refraktometrisch gemessen, wobei die Brechungsindizes ein direktes Maß für die Konzentration sind. Für diese Bestimmung hat sich das Zeiss-Immersionsrefraktometer als besonders geeignet

erwiesen. Die Brechungsindizes werden bei konstanter Temperatur zwischen 22,5 und 24,5°C gemessen. Die Virussuspension und die anderen zu messenden Flüssigkeiten werden 1 Stunde lang auf diese Temperatur gebracht, ehe die Messung durchgeführt wird. Zunächst muß das Refraktometer auf einen konstanten Wert für destilliertes Wasser justiert werden (in den vorliegenden Beispielen war dieser Refraktometerwert 13,80). Zwischen den Messungen sollte jeweils eine Wartezeit von 2 Minuten eingehalten werden, um ein Temperaturgleichgewicht zu erreichen. Vorteilhaft überprüft man auch den Brechungsindex des destillierten Wassers etwa nach jeder dritten Messung. Um die gewünschte Genauigkeit zu erreichen, wird jede Messung mehrmals wiederholt (z. B. zehnmal) und das arithmetische Mittel berechnet.

Die obengenannte 5%ige Kälberserumlösung ergibt nach dieser Methode einen Refraktometerwert von 15,55 ± 0,05, was einem Brechungsindex von 1,33342 (22,8°C) entspricht. Diesen Refraktometerwert der Grundlösung setzt man gleich 100, so daß die im folgenden angegebenen Eiweißkonzentrationen relative Werte darstellen.

Die folgende Tabelle III gibt die Virusaufnahme verschiedener Al₂O₃-Proben im Vergleich zu ihrer Eiweißaufnahme wieder.

wobei besonders darauf hinzuweisen ist, daß alle Präparate in gleicher Weise hergestellt wurden, nur mit dem Unterschied, daß die als Ausgangsprodukte verwendeten Aluminiumhydroxydgele aus verschiedenen Ansätzen stammen.

Tabelle IV Tabelle III

y-Aluminium-	Eiweißaufnahme	Poliovirus
oxyd		aufnahme
Probe	%	%
1	17	36
2	43	62
3	51	70
4	8	20
5	35	55
6	40	56
7	10	19
8	58	78
9	28	45
10	47	60
11	22	41
12	41	56
13	53	69

30

35

40

45

50

Die Virusaufnahme wird ebenfalls refraktometrisch gemessen, und zwar in analoger Weise, wie es im Beispiel 1 erläutert und in der USA.-Patentschrift 3 117 061 näher beschrieben ist.

Wie aus der Tabelle III ersichtlich wird, steht die Aufnahmekapazität für Poliovirus und Eiweiß in einem direkten Verhältnis zueinander. Mit dieser in-vitro-Methode kann man also Aluminiumoxyde mit hoher und höchster Eiweißaufnahme heraussuchen, wodurch die Herstellung von Depotimpfstoffen entsprechend hoher Wirksamkeit ermöglicht wird.

Die folgende Tabelle IV zeigt eine Reihe von y-Aluminiumoxyden, die alle nach der Methode von F r i c k e bzw. nach der österreichischen Patentschrift 216 142 hergestellt sind. Die Tabelle soll die große Variationsbreite der Eiweißaufnahme (und somit der entsprechenden Virusaufnahme) zeigen,

y-Aluminium-	Eiweiß	y-Aluminium-	Eiweiß
oxxd	aufnahme	oxyd	aufnahme
Probe	%	Probe	%
100	34	58/21	45
104	22	58/22	47
105	33	58/23	35
106	35	58/24	35
n/57	27	58/25	32
58/1	17	58/26	32
58/2	26	58/27	32
58/3	36	58/28	32
58/4	43	58/29	22
58/5	26	58/30	38
58/6	29	58/31	10
58/7	31	58/32	35
58/8	37	58/33	30
58/9	28	58/34	38
58/10	37	62/12	34
58/11	43	62/13	31
58/12	36	62/14	30
58/13	40	62/15	33
58/14	36	62/16	44
58/15	51	62/17	43
58/16	44	62/18	42
58/17	37	62/19	36
58/18	47	62/20	36
58/19	48	62/21	39
58/20	46	62/22	40
62/23	37	A/4	28,0
62/24	47	A/5	14,5
62/25	40	A/6	24,0
62/26	40	A/7	22,0
62/27	35	A/8	11,5
62/28	47	A/9	19,0
62/29	37	A/10	27,0
62/30	32	A/11	17,0
62/31	31	A/12	27,0
		A/13	14,0
402/49	31	A/14	21,0
402/52	37	A/15	25,5
402/53	26	A/16	22,5
402/54	41	A/17	21,0
402/55	36	A/18	27,5
402/60	45	A/19	21,5
402/61	43	A/20	21,5
402/62	46	A/21	25,5
402/63	54	A/22	24,5
402/64	42	A/23	27,5
402/65	48	A/24	26,0
402/66	58	A/25	28,0
402/67	42	A/26	29,5
402/68	45	A/27	28,5
402/69	41	A/28	34,5
402/70	46	A/29	27,5
		A/30	30,0
A/l	21,5	A/31	30,0
A/2	25,5	A/33	18,0
A/3	19,5

Beispiel 2 Tabelle VI

Eine demineralisierte wäßrige Lösung, d. h. eine ionenfreie Lösung, von 0,4 Gewichtsprozent Kephalin, wird bereitet. Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode wird hierfür ein Refraktometerwert von 15,48 ± 0,05 bestimmt; dies entspricht einem Brechungsindex von 1,3339 (22,8° C). Proben dieser Lösung werden wie im Beispiel 1 beschrieben mit Aluminiumoxyd versetzt, wobei 10 mg Aluminiumoxyd pro Milliliter Lösung verwendet werden. Das Aluminiumoxyd enthaltende Produkt wird dann 1 Stunde im Kühlraum automatisch geschüttelt und anschließend das Aluminiumoxyd durch lstündiges Zentrifugieren bei 3000 UpM abgetrennt. Anschließend unterwirft man die oxydfreie Flüssigkeit einer refraktometrischen Messung bei 22,5 bis 24,5° C mit dem Immersionsrefraktometer. Die erhaltenen Werte werden mit den analog gewonnenen Weiten der Grundlösung verglichen, wobei man den Refraktometerwert der letzteren gleich 100 setzt.

In der folgenden Tabelle V sind einige y-Aluminiumoxydproben zusammengestellt, die nach F r i c k e bzw. nach der österreichischen Patentschrift 216 142 hergestellt wurden und alle die gleiche molare Oberfläche haben. Wie aus der Tabelle V ersichtlich wird, entsprechen sich die Kephalinaufnahmekapazität jeder Probe und deren Aufnahmekapazität für Viren des lipoiden Typs. Im vorliegenden Fall handelt es sich um den Erreger der atypischen Gefiügelpest, das sogenannte »Newcastle disease«-Virus; andere lipoide Virustypen geben ähnliche Ergebnisse.

Tabelle V

y-Aluminium-	Kephalin-	»Newcastle«-
oxyd	aufnahme	Virusaufnahme
Probe	°/o	%
A8	3	12
A9	7	19
A 24	8	23
A 25	10,5	24
A 29	12,5	30
A 33	10	25
402/66	18	42'
A17	16	40
A6	4	11
A7	1,5	10
A 23	9	23
A 27	16	39

y-Aluminium-	Eiweiß	Kephalin-
oxyd	aufnahme	aufnahme
Probe	%	%
A/8	11,5	3,0
A/13	14,0	2,5
A/5	14,5	2,0
A/11	17,0	5,0
A/33	18,0	10,0
A/9	19,0	7,0
A/3	19,5	14,0
A/14	21,0	2,0
A/17	21,0	16,5
A/l	21,5	12,0
A/19	21,5	1,5
A/20	21,5	1,5
A/7	22,0	1,5
A/16	22,5	7,0
A/6	24,0	4,0
A/22	24,5	9,5
A/21	24,5	8,5
A/2	25,5	12,5
A/15	25,5	6,5
A/24	26,0	8,0
A/12	27,0	2,5
A/10	27,0	2,5
A/29	27,5	12,5
A/18	27,5	1,5
A/23	27,5	9,0
A/25	28,0	10,5
A/4	28,0	9,5
A/27	28,5	16,0
A/26	29,5	5,0
A/31	30,0	9,0
A/30	30,0	11,0
A/28	34,5	14,5
402/66	58,0	18,0

Die Werte der Kephalinaufnahme und der »Newcastle«-Virusaufnähme der Tabelle V werden in analoger Weise refraktometrisch bestimmt, wie es im Beispiel 1 bei der Eiweißaufnahme und Poliovirusaufnahme beschrieben ist.

In der folgenden Tabelle VI sind eine Reihe von y-Aluminiumoxydproben zusammengestellt, die in gleicher Weise wie oben angegeben hergestellt wurden und gleiche molare Oberflächengröße hatten, wobei die Tabelle in jedem Falle die entsprechende refraktometrisch bestimmte Eiweißaufnahmekapazität der Kephalinaufnahmekapazität gegenüberstellt.

35 Der Kephalintest, der oben am Beispiel des »Newcastle«-Virus beschrieben ist, kann mit vergleichbaren Ergebnissen auch bezüglich anderer Viren des Lipoidtyps, z. B. Influenza-, Masern- oder Mumpsvirus durchgeführt werden. Dasselbe gilt für den Eiweißtest, der nicht nur auf Polioviren sondern auch auf die Viren des Typs Coxsackie, Maul- und Klauenseuche oder auf andere Viren nicht lipoider Art angewendet werden kann. Es liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, solche geeigneten Aluminiumoxydpräparate mit Hilfe des Eiweiß- bzw. Kephalintests auszuwählen, die entweder bevorzugt für nicht lipoide oder für lipoide Virustypen oder aber für beide Typen gleichzeitig gut geeignet sind. Wie aus der obigen Tabelle VI ersichtlich ist, entspricht das Ausmaß der Eiweißaufnahmekapazität eines gegebenen Aluminiumoxyds nicht notwendigerweise dem Ausmaß der Kephalinaufnahmekapazität desselben Aluminiumoxyds; nur die Präparate A 30, A 28 und 402/66 haben gleichzeitig eine so gute Eiweiß- und Kephalinaufnähme, daß sie ein geeignetes Aluminiumoxyd für einen guten Depotimpfstoff mit sowohl lipoiden als auch nicht lipoiden Viren darstellen.

Obwohl die Konzentration der für den Eiweiß- und Kephalintest benötigten Lösungen keine ausschlaggebene Bedeutung haben, sollten doch die nach dem Zentrifugieren verbleibenden Lösungen leicht refraktometrisch analysierbar sein. Wenn es gewünscht wird, sowohl die Eiweiß- als auch die Kephalinaufnahme

eines gegebenen Aluminiumoxydpräparates zu bestimmen, so müssen die Konzentrationen so gewählt werden, daß die refraktometrisch erhaltenen Werte um nicht mehr als 7 ± 2 Meßeinheiten differieren, damit die gemessenen Werte ungefähr vergleichbar sind. Das wird z. B. erreicht, wenn man die obenerwähnte 5volumprozentige Kälberserumlösung (d. h. 0,2624 Gewichtsprozent Eiweißlösung) und 0,4 gewichtsprozentige Kephalinlösung verwendet. Zweckmäßig kommen etwa 3 bis 20 mg (vorzugsweise 6 bis 12 mg) Aluminiumoxyd pro Milliliter wäßrigen Mediums sowie 0,15 bis 0,75 Gewichtsprozent (vorzugsweise 0,25 bis 0,50 Gewichtsprozent) Eiweiß und 0,2 bis 1 Gewichtsprozent (vorzugsweise 0,4 bis 0,6 Gewichtsprozent) Kephalin zur Anwendung.

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Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung hochwirksamer Aluminiumoxyd-Depotimpfstoffe mit Viren des nicht lipoiden und/oder des lipoiden Typs, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst bestimmt, welche Mengen Eiweiß und/oder Kephalin ein gegebenes Aluminiumoxyd aus deren ionenfreien wäßrigen Lösungen zu adsorbieren vermag, und dann solche Aluminiumoxydpräparate auswählt, die eine Eiweißaufnahmekapazität von mindestens 30 % bzw. eine Kephalinaufnahmekapazität von mindestens 10% aufweisen, worauf man diese Aluminiumoxydpräparate in üblicher Weise in Depotimpfstoffe überführt.

509 719/359 10.65 © Bundesdruckerei Berlin