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Verfahren zur Herstellung eines Poliomyelitis-Impfstoffes Die Erfindung
bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Poliomyelitis-Impfstoffes.
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Poliomyelitis ist eine Viruskrankheit, die tödlich sein oder weitreichende
Verkrüppelungsdefekte hervorrufen kann. Wegen der Natur der Krankheit liegt die
einzig gesunde Lösung für dieses Problem in einer Prophylaxis, d. h. im Vorsehen
von Mitteln, um das Auftreten der Krankheit zu verhindern. Kürzlich wurde ein Impfstoff
entwickelt, der abgetötete Poliomyelitis-Viren enthielt und aus abgetöteten, aber
antigen wirkenden Poliomyelitis-Virusarten der Typen 1, 2 und 3 zusammengesetzt
ist. Er hat eine erschöpfende klinische Überprüfung erfahren.
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Dieser Impfstoff läßt, obgleich er wirksam ist, viel zu wünschen übrig.
Er ist kostspielig herzustellen, das Verfahren seiner Herstellung schließt eine
Standardisierung oder Einstellung der Wirksamkeit aus, er ruft Nebenreaktionen und
Unannehmlichkeiten bei der Verabreichung hervor, die Antigenwirkung fällt bei der
Lagerung sehr schnell ab usw.
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Es ist Ziel der Erfindung, einen Poliomyelitis-Impfstoff zu schaffen,
der lagerbeständiger ist als die bekannten Poliomyelitis-Impfstoffe und imstande
ist, eine viel größere Antikörperentsprechung zu erzeugen als die bekannten Poliomyelitis-Impfstoffe.
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Weiter soll nach der Erfindung ein Poliomyelitis-Impfstoff geschaffen
werden, der standardisiert und in jeder beliebigen Wirksamkeit hergestellt werden
kann.
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Schließlich kann der Impfstoff mit einer Wirksamkeit, die mit denen
von bekannten Poliomyelitis-Impfstoffen vergleichbar ist, aber mit geringeren Kosten
hergestellt werden. Außerdem bewirkt das Herstellungsverfahren, daß bei der Verabreichung
des Impfstoffes weniger Nebenreaktionen hervorgerufen werden.
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Gemäß der Erfindung werden diese und weitere Ziele erkennbar und
realisiert, indem man das Poliomyelitis-Virus-Antigen aus einer abgetöteten wäßrigen
Poliomyelitis-Vaccine, die wenigstens einen Stamm von menschlichem Poliomyelitis-Antigen
enthält, an Aluminiumphosphat adsorbiert, dann das an Aluminiumphosphat adsorbierte
Poliomyelitis-Antigen von der Flüssigkeit abtrennt und die Aluminiumphosphat-Antigen-Fällung
erneut in einem wäßrigen Medium suspendiert. Durch Veränderung der Menge des für
die erneute Suspension der Aluminiumphosphat-Antigen-Fällung verwendeten Menge wäßrigen
Mediums kann man einen Poliomyelitis-Impfstoff von vorbestimmter Wirksamkeit und
vorbestimmtem Aluminiumphosphatgehalt herstellen. Der Aluminiumphosphatgehalt des
fertigen Impfstoffs kann auch geregelt werden durch Veränderung der für die anfängliche
Adsorption des Antigens verwendeten Aluminiumphosphatmenge. Das Poliomyelitis-Antigen
in den Produkten nach der Erfindung ist viel lagerbeständiger als das in den ursprünglichen
Vaccinen, aus denen die Produkte hergestellt wurden, vorhandene Antigen.
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Außerdem können die Produkte nach der Erfindung, die hinreichend flüssiges
Suspensionsmedium enthalten, um das Volumen auf das der ursprünglichen Vaccine zu
bringen, aus denen die Produkte hergestellt wurden, eine viel höhere Antigenwirksamkeit
aufweisen als die Original-Vaccine und sogar eine viel höhere Antigenwirksamkeit
als die Produkte, die durch einfache Zugabe von Aluminiumphosphat zu den ursprünglichen
Vaccinen erhalten wurden. Überraschenderweise besitzen diese speziellen Produkte
nach der Erfindung eine Antigenwirksamkeit, die fünf- bis zehnmal so groß ist wie
die der ursprünglichen Vaccine und zwei- bis dreimal so groß ist wie die der ursprünglichen
Vaccine, denen Aluminiumphosphat zugegeben war.
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Diese außerordentlich hohen Antigenwirksamkeiten der Produkte nach
der Erfindung sind wirklich überraschend und von großer technischer Bedeutung, da
man bei der Durchführung der Erfindung fünf bis zehn Immunisationen aus der gleichen
Menge Vaccine erhalten kann, wie sie zur Zeit bei der Erzeugung einer Immunisation
angewendet wird. Darüber hinaus besitzen die fünf bis zehn so erhaltenen Immunisationsmengen
die gleiche Antigenwirksamkeit wie die nach dem bekannten Verfahren hergestellten
Immunisationsmengen. Solche Produkte sind viel konzentrierter als die zur Zeit verwendeten
Impfstoffe, verursachen weniger Unannehmlichkeiten
bei der Injektion,
und die kleineren Dosen erzeugen dennoch eine Immunität, die derjenigen vergleichbar
ist, die bei Verwendung der jetzt gebräuchlichen Impfstoffe erhalten wird. Vielleicht
noch überraschender ist die hohe Antigenwirksamkeit der Produkte nach der Erfindung,
die das gleiche Volumen aufweisen wie die Original-Vaccine, im Vergleich zur Antigenwirkung
von Orignial-Vaccinen, denen Aluminiumphosphat zugesetzt war. Von solchen Produkten
wurde normalerweise erwartet, daß sie die gleiche Antigenwirksamkeit besitzen wie
die Original-Vaccine, denen Aluminiumphosphat zugefügt ist. Wie jedoch oben erwähnt
wurde, ist dies nicht der Fall, obgleich der Grund für den großen Anstieg der Antigenwirksamkeit,
der durch die Abtrennung der Aluminiumphosphat-Antigen-Fällung aus der ursprünglichen
Vaccinelösung und durch erneute Suspendierung in dem gleichen Volumen eines wäßrigen
Mediums erzielt wird, nicht bekannt ist.
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Die Produkte nach der Erfindung verursachen wenige oder keine Nebenreaktionen
bei der Injektion. Der Gesamteiweißstickstoffgehalt der Produkte ist sehr niedrig
und beträgt gewöhnlich etwa 0,0002 bis 0,001 mg je ccm in den Produkten, die das
gleiche Volumen wie die Ausgangsvaccine besitzen. Die wäßrige Phase der Produkte
nach der Erfindung enthält praktisch keine Eiweißstoffe.
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Die als Ausgangsstoffe für die Herstellung von Produkten nach der
Erfindung verwendeten abgetöteten wäßrigen Poliomyelitis-Vaccinen können einen beliebigen
Stamm oder alle verschiedenen Stämme des menschlichen Poliomyelitis-Virus enthalten.
Die bevorzugten Vaccinen sind diejenigen, die ein Gemisch der Typen 1, 2 und 3 von
Poliomyelitis-Antigen enthalten.
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Solche Vaccinen können auf verschiedene Weise hergestellt sein; z.
B. kann ein zerkleinertes Gewebe aus Äffennieren mit Trypsin behandelt werden, um
Fremdgewebe zu entfernen. Man kann dann die restlichen Zellen sich vermehren lassen,
das Medium mit Poliomyelitis-Virus impfen, das geimpfte Gemisch entwickeln, die
Flüssigkeit sammeln und den lebenden Virus durch Behandlung mit Formaldehyd, Ultraviolettstrahlung
oder anderen geeigneten Mitteln inaktiv machen. Falls gewünscht, können die Vaccinen,
die unter Fortlassung der Trypsin Behandlungsstufe hergestellt wurden, ebenfalls
verwendet werden, aber in diesem Falle kann der Eiweißgehalt der Vaccine übermäßig
hoch sein und sollte vor der Verwendung bestimmt werden. Bei der Herstellung von
Mischvaccinen, d. h. von Vaccinen, die mehr als eine Poliomyelitis-Virusart enthalten,
ist es zweckmäßig, die aufgefangenen Flüssigkeiten, die die verschiedenen Arten
enthalten, nach der Inaktivierung zu sammeln oder zu vermischen, obgleich dies auch
früher geschehen kann.
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Bei Verwendung von mit Formaldehyd inaktivierten Vaccinen ist es
vorzuziehen, Vaccinen zu verwenden, denen kein Natriumbisulfit zugesetzt wurde,
um den Formaldehydgehalt herabzusetzen. Das Aluminiumphosphat oder sonstige Ausgangsmaterial,
das bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendet wird, wird in
Gelform angewandt. Geeignete Aluminiumphosphatgele können leicht hergestellt werden,
indem man eine wäßrige Lösung, die eine äquivalente Menge wasserlösliches Phosphat,
z. B. Trinatriumphosphat, enthält, zu einer wäßrigen Lösung mit einer bekannten
Menge Aluminiumchlorid zufügt. Das anfallende Gel wird gewaschen, um anorganische
Salze zu entfernen, das Gel wird wieder in Wasser suspendiert, und der pn-Wert wird
auf etwa 5,5 bis 6,5 eingestellt. Die Gelsuspension kann durch Erhitzen im Autoklav
sterilisiert werden, und dann kann der Aluminiumphosphatgehalt je ccm bestimmt werden,
indem man eine kleine Probe trocknet.
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Die standardisierte Gelsuspension wird dann gelagert, bis man sie
gebrauchen will. Unmittelbar vor der Verwendung wird eine abgemessene Menge Gelsuspension
zentrifugiert, um die Flüssigkeit zu entfernen, und das zurückbleibende Aluminiumphosphatgel
wird bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendet.
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Bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung wird eine bekannte
Menge Aluminiumphosphatgel in einer abgemessenen Menge einer abgetöteten wäßrigen
Poliomyelitis-Vaccine, die wenigstens einen Stamm, vorzugsweise drei Stämme von
menschlichem Poliomyelitis-Antigen enthält, suspendiert. Die Suspension kann bei
beliebiger Temperatur unterhalb etwa 40° hergestellt werden; aber sie wird vorzugsweise
bei einer Temperatur zwischen 0 und 10° erzeugt. Die anfallende Suspension wird
in Bewegung gehalten, d. h. gerührt oder geschüttelt, um eine vollständige Adsorption
des Antigens, d. h. eine Adsorption von 900/, oder mehr des Antigens, sicherzustellen.
Bei Raumtemperatur (22 bis 25°) ist die Adsorption des Antigens nach etwa 1 Stunde
vollständig, während bei niedrigeren Temperaturen die Adsorption etwas langsamer
verläuft. Da eine Ausdehnung der Adsorptionszeit auf mehrere Stunden und sogar mehrere
Tage bei niedrigen Temperaturen (0 bis 10°) anscheinend keinen schädlichen Einfluß
auf die Antigenwirksamkeit hat, ist es vorzuziehen, hinreichend Zeit anzuwenden,
um eine vollständige Adsorption des Antigens sicherzustellen.
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Bei der Herstellung der Aluminiumphosphat-Antigen-Suspensionen ist
die Aluminiumphosphatmenge nicht besonders kritisch. Natürlich muß hinreichend Aluminiumphosphatgel
angewendet werden, um eine vollständige Adsorption des Antigens sicherzustellen,
und, soweit es möglich war, es zu bestimmen, ist eine Mindestmenge von 0,5 mg je
ccm der fertigen Suspension hierzu erforderlich.
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Die obere Grenze der Aluminiumphosphatkonzentration kann in weitem
Maße geändert werden. Natürlich ist es vorzuziehen, keine so große Menge zu verwenden,
daß das Endprodukt eine unzweckmäßige Menge Aluminiumphosphat enthält. In der Praxis
wurde die optimale Menge Aluminiumphosphat für die Adsorption des Antigens aus der
Vaccine im Bereich von 0,5 bis 25 mg je ccm Vaccine-Suspension ermittelt mit einem
bevorzugten Bereich von 1 bis 10 mg je ccm.
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Nachdem die Adsorption des Antigens am Aluminiumphosphatgel vollständig
ist, wird die Aluminiumphosphat-Antigen-Fällung von der Suspension abgetrennt. Dies
erfolgt vorzugsweise durch Zentrifugieren, obgleich natürlich auch andere Mittel,
wie Filtration, angewandt werden können. Die isolierte Aluminiumphosphat-Antigen-Fällung
wird vorzugsweise gewaschen, bevor sie für die Herstellungder Endprodukte verwendet
wird.
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Das Waschen erfolgt durch erneute Suspendierung'der Fällung in einem
wäßrigen Medium, vorzugsweise demjenigen, das für das Endprodukt verwendet werden
soll.
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Das für die Waschzwecke verwendete Volumen des wäßrigen Mediums ist
nicht kritisch, aber es ist zweckmäßig, zwischen etwa 1/2 und 2 Volumen der ursprünglichen
Vaccine anzuwenden. Als wäßrige Media für die Waschstufe und bzw. oder die Endprodukte
kann man Wasser oder eine physiologische Salzlösung, z. B. eine physiologische Kochsalzlösung
oder Hanksche Lösung, verwenden. Die physiologischen Salzlösungen sind die bevorzugten
wäßrigen Medien. Nachdem die Aluminiumphosphat-Antigen-Fällung gründlich durchgemischt
wurde, wird sie vom für das Waschen verwendeten wäßrigen Medium abgetrennt und in
einer vorbestimmten Menge des wäßrigen Mediums erneut suspendiert, um den endgültigen
fertigen Impfstoff zu erhalten. Bei der Waschstufe und der Endsuspendierungsstufe
soll die Temperatur des wäßrigen Mediums unter etwa 30°, vorzugsweise
zwischen
0 und 10°, gehalten werden. Die Menge des wäßrigen Mediums, die bei der Herstellung
des Endproduktes verwendet wird, hängt von der gewünschten Wirksamkeit und dem gewünschten
Aluminiumphosphatgehalt ab. Sie unterliegt natürlich einer Veränderung innerhalb
weiter Grenzen. Jedoch soll das Volumen des wäßrigen Mediums nicht so groß sein,
daß mehr als 3 ccm des Produktes erforderlich sind, um die für eine Immunisierung
notwendige Antikörperbildung hervorzurufen.
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Mit anderen Worten, je 3 ccm Produkt sollen mindestens hinreichend
Antigen enthalten, um eine Immunität hervorzurufen. Als praktisches Maß gibt es
keine Mindestmenge des Suspensionsmittels, außer daß das Material flüssig genug
sein muß, um injiziert werden zu können.
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Allgemein gesprochen, sind die bevorzugten Produkte nach der Erfindung
diejenigen, die zwischen 0,2 und 8 mg Aluminiumphosphat je ccm enthalten. Um die
Menge Suspensionsmittel für die Verwendung zu bestimmen, um eine Masse mit einem
gegebenen Aluminiumphosphatgehalt zu erzeugen, bedarf es nur einer einfachen Rechnung.
Wenn z. B. 4 mg Aluminiumphosphat je ccm für die Fällung des Antigens aus der ursprünglichen
Vaccine verwendet wurden und ein Endprodukt mit einem Aluminiumphosphatgehalt von
4 mg je ccm erwünscht ist, verwendet man hinreichend wäßriges Suspensionsmittel,
um ein Endvolumen zu erreichen, das dem der als Ausgangsmaterial verwendeten Vaccine
entspricht.
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Solch ein Produkt enthält 4 mg Aluminiumphosphat je ccm und besitzt
eine Antigenwirksamkeit, die fünf- bis zehnmal so groß ist als die der ursprünglichen
Vaccine.
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In ähnlicher Weise verwendet man, wenn man ein Endprodukt mit 2 mg
Aluminiumphosphat je ccm herstellen soll, eine hinreichende Menge wäßriges Suspensionsmittel,
um ein Endvolumen zu erhalten, das zweimal so groß ist wie das der Ursprungsvaccine
usw.
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Um sicherzustellen, daß die Produkte nach der Erfindung frei von
einer Vergiftung durch Bakterien, Schimmelpilzen und Pilzen bleiben, ist es vorzuziehen,
den Produkten ein Schutzmittel einzuverleiben. Die hierfür bevorzugte Substanz ist
BenzethoniuInchlorid, das angewendet werden kann in einer Konzentration von 1:10000
bis 1: 50000. Es können auch andere Schutzstoffe, die keine nachteilige Einwirkung
auf die Antigenwirksamkeit der Produkte haben, verwendet werden.
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Falls gewünscht, können die Produkte nach der Erfindung vereinigt
werden mit anderen Bakterien- oder Virusvaccinen, die damit verträglich sind. Zum
Beispiel können sie mit Tetanus-, Diphtherie- oder Pertussis-Vaccinen kombiniert
werden, die durch Adsorption der vorgenannten Antigene an Aluminiumphosphat, Abtrennung
des Aluminiumphosphat-Antigen-Niederschlages und erneute Suspension in einem wäßrigen
Medium erhalten wurden. Diese Kombinationsprodukte sind imstande, eine Immunisierung
gegen Poliomyelitis, Tetanus, Diphtherie und Pertussis hervorzurufen. In solchen
Kombinationsprodukten muß man sicherstellen, daß der verwendete Schutzstoff nicht
die Antigenwirksamkeit des Poliomyelitis-Antigens zerstört.
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Da Benzethoniumchlorid keinen ungünstigen Einfluß auf das Poliomyelitis-Antigen
besitzt, ist es der Schutzstoff der Wahl für solche Produkte.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert: Beispiel
1 a) Vaccineherstellung. Zellen für die Entwicklung von Poliomyelitis-Virus werden
nach dem Verfahren von Dulbecco, Journal of Experimental Medicine, 99 (1954), S.
167 hergestellt. In kurzem besteht dieses Verfahren darin, daß man zunächst eine
Suspension der
Epithelzellen von Affennieren herstellt (vgl. Dulbecco, Proc. Nat.
Acad. Sci., 38, [1952] S. 747), indem man zerkleinertes Nierengewebe aus gesunden
Cynomalgus- oder Rhesusaffen mit Trypsin behandelt, um fremde Stoffe zu entfernen
und die einzelnen Zellen freizulegen. Diese Zellen läßt man sich auf einer geeigneten
Glasfläche in irgendeinem Gewebekulturmedium vermehren. Die so erhaltene Schicht
von entwickelten Nierenzellen wird dann mit einer Stammkultur der Type 1 (Mahoney-Stamm)
von Poliomyelitis-Virus beimpft, und das Gemisch wird bei 36 bis 37O entwickelt,
bis die Zerstörung der Zellen vollständig ist und große Mengen von neuem Virus frei
geworden sind. Die den Virus enthaltende Flüssigkeit wird aufgefangen und durch
eine ultrafeine Glasfrittenkerze geleitet. Das Filtrat, das den lebenden Poliomyelitis-Virus
Type 1 enthält, wird auf den Virusgehalt, seine Bakteriensterilität und Stammreinheit
untersucht.
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Ein Filtrat, das lebenden Poliomyelitis-Virus der Type 2 (MIEF-1-Stamm)
enthält, wird nach dem oben beschriebenen Verfahren für die Herstellung des Filtrats
mit Poliomyelitis Type 1 hergestellt. Ein Filtrat mit lebenden Poliomyelitis-Viren
Type3 (Saukett-Stamm) wird nach dem gleichen Verfahren hergestellt.
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Die lebenden Virusarten, die in den getrennten Filtraten enthalten
sind, werden durch Zugabe von Formaldehyd und Entwicklung der anfallenden getrennten
Gemische inaktiviert, entsprechend dem einzelnen dargelegten Verfahren in der Abänderung
2 der Mindesterfordernisse für Poliomyelitis-Vaccine, die am 20. Mai 1954 vom US-Departement
of Health Education and Welfare herausgegeben wurde. Es wird kein Natriumbisulfit
zugegeben, um überschüssigen Formaldehyd zu neutralisieren. Etwa die gleichen Mengen
der so erhaltenen Vaccinen der Typen 1, 2 und 3 werden zusammengegeben, und die
anfallende Mischvaccine wird für die Herstellung der Produkte nach der Erfindung
verwendet.
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Ein Teil der Mischvaccine wird in unveränderter Form zurückgehalten,
um als Kontrollprobe zu dienen. b) Herstellung der Aluminiumphosphat-Suspension.
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1485 ccm 100/,ige Lösung von Aluminiumchlorid-Hexahydrat in destilliertem
Wasser werden zu 7500 ccm destilliertem Wasser bei 37° gegeben. Nach gründlichem
Mischen werden 1485 ccm 15,750/,ige Lösung von analysenreinem Trinatriumphosphat
in destilliertem Wasser langsam zur Aluminiumchloridlösung unter ständigem Rühren
zugegeben. Das Gemisch wird auf 12 850 ccm mit destilliertem Wasser bei 37° verdünnt,
das Gemisch wird 5 Minuten gerührt, und der pIs-Wert wird mit 10 n-Natronlauge auf
6,4 bis 6,6 eingestellt. Man läßt die Suspension bei Raumtemperatur (20 bis 25°)
5 bis 7 Tage stehen. Nach dieser Zeit hat sich die Fällung auf ein Volumen von etwa
6250 ccm abgesetzt. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und verworfen.
Die restliche Suspension wird sterilisiert, indem man sie 2 Stunden im Autoklav
bei etwa 15 bis 18 lbsjpsi Dampfdruck erhitzt und dann abkühlen läßt.
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Der pn-Wert der sterilisierten Suspension beträgt etwa 5,5 bis 5,7.
Eine kleine Probe der Suspension von bekanntem Volumen wird abgezogen und zur Trockene
eingedampft. Der Rückstand wird gewogen und die Konzentration am Aluminiumphosphat
je ccm errechnet. Bei der speziellen beschriebenen Herstellungsweise betrug der
Aluminiumphosphatgehalt je ccm Suspension 12mg. c) Herstellung der Vaccine. 100
ccm der oben in b) hergestellten Aluminiumsulfatsuspension wurden 10 bis 15 Minuten
bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird
verworfen. Das zurückbleibende Aluminiumphosphatgel wird in einer
ausreichenden
Menge einer Poliomyelitis-Mischvaccine hergestellt wie unter a), wieder suspendiert,
so daß eine Suspension mit einem Volumen von 300 ccm erhalten wurde. Diese Suspension
wird bei etwa 20° 30 bis 60 Minuten in Bewegung gehalten, um eine vollständige Absorption
des Antigens sicherzustellen. Dieses Produkt enthält 4 mg Aluminiumphosphat je ccm.
200 ccm Suspension werden zurückbehalten, um als Kontrollprobe zu dienen.
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Die restlichen 100 ccm Aluminiumsphophat-Vaccinesuspension werden
10 Minuten bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit
wird durch Dekantieren entfernt und durch ein gleiches Volumen Hankscher Salzlösung
ersetzt (vgl. Proc. Soc.
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Exp. Biol. Med., 71 [1949], S.328). Das Gemisch wird geschüttelt,
bis eine gleichmäßige Suspension erzielt ist, und dann wird die Suspension 10 Minuten
bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird
durch Dekantieren entfernt, und ein gleiches Volumen frischer Hankscher Salzlösung
wird zum restlichen Gel gegeben. Das Gemisch wird geschüttelt, bis eine gleichmäßige
Suspension erzielt ist. Das so erhaltene Produkt enthält 4 mg Aluminiumphosphat
je ccm, auf dem die Typen 1, 2 und 3 des Poliomyelitis-Virus-Antigens absorbiert
sind. Die flüssige Phase dieser Suspension enthält praktisch kein Eiweiß. Dieses
Produkt ist für die Verwendung als Immunisierungsmittel geeignet.
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Um die Stabilität und die Wirksamkeit des Produktes nach der Erfindung
mit denen der ursprünglichen Poliomyelitis-Mischvaccine und auch mit der ursprünglichen
Vaccine zu vergleichen, der 4 mg Aluminiumphosphat je ccm einverleibt waren, wurden
die drei Proben 5 Tage auf 37° erwärmt. Dies entspricht etwa einer Lagerung von
5 Monaten bei einer Temperatur von 4°.
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Am Ende der Erhitzungszeit wurde die WirLsamkeit aller Proben durch
das Serumneutralisationsverfahren bestimmt, das von Salk, Younger und Ward, American
Journal of Hygiene, Bd. 60 [1954], S. 214 beschrieben ist, und die Ergebnisse wurden
wiedergegeben im Maß von geometrischen Mitteltitern. Die Tabelle 1 faßt die Wirkungsdaten
der drei Zubereitungen des Versuches zusammen.
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Kurz gesagt, umfaßt die Prüfmethode das Beimpfen von Rhesusaffen
mit drei l-ccm-Dosen der Testvaccine in wöchentlichen Intervallen, Ausblutenlassen
der Tiere eine Woche nach Ende der Behandlungszeit, Herstellung eines Serums aus
dem aufgefangenen Blut und Bestimmung der Zahl der Antikörper in dem Serum. Diese
Bestimmung wurde durchgeführt, indem man serienweise das Serum mit Salzlösung verdünnt
und die verdünnten so erhaltenen Teilmengen mit einer Standardlösung vermischt,
die eine bekannte Anzahl von infektiösen Einheiten der gegebenen Art Poliomyelitis-Virus
enthält.
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Wenn man z. B. auf Wirksamkeit der Type 1 analysiert, verwendet man
eine Standardlösung, die eine bekannte Anzahl von infektiösen Einheiten von Poliomyelitis-Virus
der Type 1 enthält. Für die Analyse auf eine Wirksamkeit der Type 2 oder 3 verwendet
man eine Standardlösung von infektiösem Virus der Type 2 oder Type 3.
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Der Endpunkt der Titration ist die Verdünnung, bei der das Serum hinreichend
Antikörper enthält, um eine genaue Neutralisation zu ergeben, d. h. eine bekannte
Anzahl von infektiösen Einheiten des Virus der Standardlösung zu binden und nichtinfektiös
zu machen. Eine Anzahl von Affen wird bei der Analyse der Wirksamkeit für jede Type
von Poliomyelitis-Virus verwendet. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in eine für
einen Vergleich und eine statistische Auswertung geeignete Form gebracht, indem
man den Logarithmus2 der Endpunktverdünnung für das Serum jedes Affen nimmt, diese
Zahlenwerte mittelt und dann das Analoge des so erhaltenen Mittels verwendet. Dieser
Analogwert wird der geometrische Mitteltiter der Vaccinen genannt und ist natürlich
für jede in der Vaccine vorhandenen Virusart verschieden. Da der geometrische Mitteltiterwert
von der Wirksamkeit der standardisierten Lösung des infektiösen Poliomyelitis-Virus,
die beim Versuch verwendet wird, abhängig ist, ist es notwendig, die Zahl der infektiösen
Einheiten des in der Standardlösung vorhandenen Poliomyelitis-Virus genau zu spezifizieren,
um die richtige Kennzeichnung des geometrischen Mitteltiters wiederzugeben. Das
Verfahren der Berechnung des geometrischen Mitteltiters ist im einzelnen in der
oben zitierten Abänderung2 der Mindestanforderungen für Poliomyelitis-Impfstoffe
dargelegt.
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Tabelle 1
| Zahl der neutralisierten Geometrischer |
| Untersuchte Probe') Virusart wendeten Mitteltiter |
| wendeten probe) Virusart avendeten Affen3) infektiösem Virus2) |
| Ausgangsmisch-Vaccine 1 6 32 128 |
| 2 6 45 256 |
| 3 6 320 8 |
| Ausgangsmisch-Vaccine plus 4 mg 1 6 32 660 |
| Aluminiumphosphat je ccm 2 6 45 540 |
| 3 6 320 64 |
| Antigen absorbiert an Aluminium- 1 6 32 1320 |
| phosphat und suspendiert in 2 6 45 1740 |
| Hankscher Lösung (AlPO4 konz. 3 6 320 51 |
| 4 mg/ccm) |
1) Alle Proben 5 Tage auf 370 erhitzt und während der Beimpfung bei 40 gelagert.
Affen ausgeblutet eine Woche nach der letzten Impfung.
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2) Wirksamkeit der bei den Versuchen verwendeten Standardlösung.
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3) Die Titer vor der Vaccine-Behandlung aller Affen waren unter 1
: 4, d. h., das Affenblut enthielt keine vorgebildeten Poliomyelitis-Antikörper.
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Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich ist, entwickelte das
Produkt nach der Erfindung eine etwa zehnmal so starke Antikörperwirksamkeit gegenüber
dem Poliomyelitis-Virus Type 1 als die Vaccine, aus der es
hergestellt war, und eine
zweimal so große Antikörperwirksamkeit als eine aus der Ursprungsvaccine und Aluminiumphosphat
hergestellte. Hinsichtlich der Poliomyelitis-Type 2 erzeugte das Verfahrensprodukt
nach der
Erfindung eine etwa siebenmalgrößereAntikörperwirkung,
als sie die Vaccine, aus der es hergestellt war, hervorbrachte, und mehr als eine
dreimal so große Antikörperwirkung, als sie durch die ursprünglichen Vaccine erzeugt
wurde, wenn diese Aluminiumphosphat enthielt.
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Gegenüber dem Poliomyelitis-Virus Type 3 erzeugte das Verfahrensprodukt
nach der Erfindung eine Antikörperwirkung, die mindestens sechsmal so groß war,
als die aus der Poliomyelitis-Vaccine, aus der es hergestellt war, erzeugte. In
der Tat war die Antikörperwirkung der ursprünglichen Vaccine gegenüber Poliomyelitis-Virus
Type 3 so niedrig, daß, statistisch gesprochen, das An-
sprechen unbedeutend war.
Das Ansprechen von Poliomyelitis-Virus der Type 3 für das Produkt nach der Erfindung
und der ursprünglichen Vaccine einschließlich Aluminiumphosphat war, statistisch
gesprochen, etwa gleich.
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Aus den obigen Ergebnissen ist es ersichtlich, daß die Wirksamkeit
des Produktes nach der Erfindung weit besser ist, nicht nur gegenüber der Ursprungsvaccine,
aus der es hergestellt war, sondern auch gegenüber der Ursprungsvaccine, wenn dieser
Aluminiumphosphat zugesetzt war.
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Die Beständigkeit des Produktes nach der Erfindung wird durch die
in der Tabelle 2 wiedergegebenen Versuche gezeigt.
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Tabelle 2
| Zahl der ver- Zahl der neutralisierten GeometrIscher |
| Untersuchte Probe t Virusart wendeten Affen') I r Einheiten
von zu Geometrischer |
| ilifektiösem Virus2) |
| Ausgangsmisch-Vaccine nicht er- 1 6 32 810 |
| hitzt 2 6 45 166 |
| 3 6 320 51 |
| Ausgangsmisch-Vaccine 5 Tage 1 6 32 128 |
| auf 37° erhitzt 2 6 45 256 |
| 3 6 320 8 |
| Antigen absorbiert an Aluminium- 1 6 32 320 |
| phosphat und suspendiert in 2 6 45 1740 |
| Hankscher Lösung (AlPO4 konz. 3 6 320 51 |
| 4 mg/ccm) 5 Tage auf 37° erhitzt |
1) Titer aller verwendeten Affen vor der Vaccine-Behandlung war unter I: 4, d. h.,
das Affenblut enthielt keine vorgebildeten Poliomyelitis-Antikörper.
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2) Wirksamkeit von bei den Versuchen verwendeter Standardlösung.
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Aus der vorstehenden Tabelle ist zu erkennen, daß die ursprüngliche
Mischvaccine, aus der das Produkt nach der Erfindung hergestellt wurde, etwa 85
°lo seiner Wirksamkeit gegenüber Poliomyelitis-Virus-Antigenen der Typen 1 und 3
während der Entwicklungszeit verloren hatte, die etwa einer fünfmonatigen Lagerung
bei 4° äquivalent war. Auf der anderen Seite wies das Produkt nach der Erfindung
am Ende der Entwicklungszeit die 6- bis 10fach Wirksamkeit der entwickelten ursprünglichen
Vaccine auf und das 6- bis 10fach der Wirksamkeit der nicht erhitzten Ausgangsvaccine.
Somit war das Produkt nach der Erfindung nach der Entwicklung nicht nur weit besser
gegenüber der entwickelten Ursprungsvaccine, aus der es hergestellt war, sondern
auch weit besser hinsichtlich der Wirksamkeit der Ursprungsvaccine, die keinerlei
beschleunigter Bewegungsbehandlung unterworfen war.
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Falls gewünscht, kann das obige Produkt der Erfindung mit einem gleichen
Volumen kalter Hankscher Lösung verdünnt werden, um eine Vaccine mit der halben
Wirksamkeit des Ursprungsproduktes zu erhalten, die 2 mg Aluminiumphosphat je ccm
enthält. In gleicher Weise erhält man durch Zugabe von 3 Volumen kalter Hankscher
Lösung zum Produkt nach der Erfindung eine Vaccine mit einem Viertel der Wirksamkeit
des nicht verdünnten Produktes und mit 1 mg Aluminiumphosphat je ccm. So können
durch geeignete Verdünnungen des Produktes nach der Erfindung Impfstoffe mit einer
vorbestimmten Wirksamkeit hergestellt werden.
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In gleicher Weise können wenn Produkte mit höherer Wirksamkeit als
das oben beschriebene Produkt gewünscht werden, diese hergestellt werden durch einfaches
Vermindern des Volumens kalter Hankscher Lösung, das bei der Herstellung der endlichen
Suspension des Aluminiumphosphat -Antigen -Niederschlages verwendet
wurde. Wenn z.
B. ein Produkt mit der doppelten Wirksamkeit und mit 8 mg Aluminiumphosphat je ccm
erwünscht ist, verwendet man einfach nur so viel Hanksche Lösung bei der Herstellung
der Endsuspension des Aluminiumphosphat-Antigen-Niederschlages, um das Volumen auf
50 ccm an Stelle von 100 ccm zu bringen.
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Beispiel 2 Etwa 2700 ccm Poliomyelitis-Vaccine mit Typen 1, 2 und
3 wurden, wie im Beispiel 1, a), beschrieben, auf Antigen verarbeitet. Eine Teilmenge
von 100 ccm Vaccine wurde abgezogen, und es wurden 0,25 ccm 1 °/Oige Lösung Benzethoniumchlorid
langsam unter Rühren zur kalten Vaccine zugegeben. Das erhaltene Produkt, das Benzethoniumchlorid
in einer Konzentration von 1: 40 000 enthält, wird für die Verwendung als Kontrollprobe
aufgehoben.
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800 ccm Aluminiumphosphatsuspension (12 mglccm), hergestellt nach
Beispiel 1, b), werden 10 bis 15 Minuten bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird durch Dekantieren entfernt und verworfen. Es wird
hinreichend kalte Poliomyelitis-Vaccine unter Rühren zum restlichen Aluminiumphosphatgel
zugesetzt, um das Volumen auf 2600 ccm zu bringen. Die anfallende Suspension wird
60 Stunden bei 4" geschüttelt, um eine vollständige Adsorption des Antigens sicherzustellen.
Eine Teilmenge von 100 ccm so erhaltene Suspensoin wird abgezogen, und es werden
0,25 ccm 1 obige Lösung Benzethoniumchlorid langsam unter Rühren zur kalten Vaccinesuspension
zugegeben. Das entstehende Produkt, das 4 mg Aluminiumphosphat je ccm und Benzethoniumchlorid
in einer Konzentration von 1: 40 000 enthält, wird für die Verwendung als Kontrollprobe
aufgehoben.
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Die restlichen 2500 ccm Aluminiumphosphat-Vaccinesuspension werden
in zwei gleiche Teile unterteilt. Ein Teil mit 1250 ccm wird 10 Minuten bei 1500
Umdrehungen je Minute zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen
und verworfen. Der Rückstand wird in einer hinreichenden Menge kalter Hankscher
Salzlösung wieder suspendiert, um das Volumen auf 1250 ccm zu bringen. Nach gründlichem
Durchmischen wird die Suspension 15 Minuten bei 1500 Umdrehungen zentrifugiert,
und die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Der Rückstand wird
wieder in einer hinreichenden Menge kalter Hankscher Lösung suspendiert, um das
Volumen auf etwa 1250 ccm zu bringen, und dann werden 3,12 ccm 1 °/OigeBenzethoniumchloridlösung
langsam unter Rühren zugefügt. Die entstehende Lösung wird mit kalter Hankscher
Salzlösung auf ein Volumen von 1250 ccm verdünnt, wobei man die gewünschte Vaccine
erhält.
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Dieses Produkt enthält 4 mg Aluminiumphosphat je ccm und Benzethoniumchlorid
in einer Konzentration von 1: 40000. Die wäßrige Phase des Produktes ist praktisch
eiweißfrei. Das Produkt ist viel stabiler und besitzt eine größere Wirksamkeit als
die Vaccine, aus der es hergestellt wurde. Es ist für die Verwendung bei der Impfung
von Menschen gegen Poliomyelitis geeignet. Die restlichen 1250 ccm Aluminiumphosphat
- Vaccinesuspensionen werden 10 Minuten bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert,
und die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Der Rückstand wird
wieder in einer hinreichenden Menge kalter gepufferter physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert, um das Volumen auf 1250 ccm zu bringen. Nach gründlichem Durchmischen
wird die Suspension 10 Minuten bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert, und
die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Der Rückstand wird wieder
in einer hinreichenden Menge kalter gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (Phosphatpuffer,
pE-Wert 7,2) suspendiert, um das Volumen auf 1000 ccm zu bringen, und dann werden
3,12 ccm 1°/Oige Benzethoniumlösung langsam unter wirksamem Rühren zugefügt. Die
entstehende Suspension wird auf ein Volumen von 1250 ccm mit kalter gepufferter
physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wobei man die gewünschte Vaccine erhält.
Die wäßrige Phase des Produktes ist praktisch frei von Eiweißstoffen. Das Produkt
ist viel beständiger und besitzt eine weit höhere Wirksamkeit als die Vaccine, aus
der es hergestellt ist. Es ist geeignet für die Verwendung bei der Impfung von Menschen
gegen Poliomyelitis.
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Dieses Produkt enthält 4 mg Aluminiumphosphat je ccm und Benzethoniumchlorid
in einer Konzentration von 1:40000.
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Beispiel 3 Etwa 900 bis 1000 ccm Poliomyelitis-Vaccine mit Antigenen
der Typen 1, 2 und 3 werden, wie im Beispiel 1, a) beschrieben, hergestellt. Eine
Teilmenge von 100 ccm Vaccine wird abgezogen, und 1 ccm 1°/Oige Benzethoniumlösung
wird langsam unter Rühren zur kalten Vaccine zugefügt. Das entstehende Produkt,
das Benzethoniumchlorid in einer Konzentration von 1:10000 enthält, wird für die
Verwendung als Kontrollprobe aufgehoben. Eine andere Probe von 100 ccm wird abgezogen
und in ähnlicher Weise mit 0,5 ccm 1 obiger Benzethoniumlösung behandelt. Diese
zweite Kontrollprobe enthält Benzethoniumchlorid in einer Konzentration von 1 :
20 000. Eine dritte Kontrollprobe wird hergestellt aus einem dritten Teil von 100
ccm der Vaccine durch Zugabe von 0,25 ccm 1 °/Oiger Benzethoniumchloridlösung.
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Diese Kontrollprobe enthält Benzethoniumchlorid in einer Konzentration
von 1: 40000.
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200 ccm Aluminiumphosphatsuspension, 12 mg je ccm, hergestellt nach
Beispiel 1, b), werden 10 bis 15 Minuten bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird abgezogen und verworfen. Es wird eine hinreichende
Menge kalter Poliomyelitis-Vaccine unter Rühren zugegeben, um den Rückstand auf
ein Volumen von 600 ccm zu bringen. Die anfallende Suspension wird 60 Stunden bei
4" geschüttelt, um eine vollständige Adsorption des Antigens sicherzustellen. Eine
Probe von 100 ccm Suspension wird abgezogen, und es wird 1 ccm 1 Ol,ige Benzethoniumchloridlösung
zur kalten Vaccineprobe langsam und unter Rühren zugefügt. Das anfallende Produkt,
das B enzethoniumchlorid in einer Konzentration von 1:10000 und 4 mg Aluminiumphosphat
je ccm enthält, wird für die Verwendung als Kontrollprobe aufbewahrt.
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Zwei weitere Kontrollproben werden aus 100 ccm Teilmengen der Vaccinesuspension
durch Zugabe von 0,5 bzw. 0,25 ccm Benzethoniumchloridlösung hergestellt.
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Diese beiden weiteren Kontrollproben enthalten je 4 mg Aluminiumphosphat
je ccm, und eine enthält Benzethonium in einer Konzentration von 1: 20 000, während
die andere diese Verbindung in einer Konzentration von 1: 000 enthält.
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Die restlichen 300 ccm der Aluminiumphosphat-Vaccinesuspension werden
10 Minuten bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit
wird so vollständig wie möglich abgezogen und verworfen.
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Es wird kalte, mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung unter Rühren
zum Rückstand gegeben, bis das Volumen der Suspension 300 ccm beträgt. Nach gründlichem
Mischen wird die Suspension 10 Minuten bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert,
und die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Kalte, mit Phosphat
gepufferte Kochsalzlösung wird unter Rühren zum Rückstand gegeben, bis das Volumen
der Suspension 300 ccm erreicht. Die Suspension wird in drei Teilmengen von je 100
ccm unterteilt. Es wird zu einem kalten 100-ccm-Anteil der Vaccinesuspension 1 ccm
1 0/0ige Benzethoniumchloridlösung langsam unter Rühren zugegeben, um eine Vaccine
zu erhalten, die 4 mg Aluminiumphosphat je ccm und Benzethoniumchlorid in einer
Konzentration von 1:10 000 enthält. In ähnlicher Weise werden die beiden anderen
Teilmengen der Vaccinesuspension von je 100 ccm mit 0,5 bzw. 0,25 ccm 10/obiger
Benzethoniumchloridlösung behandelt. Die beiden so erzeugten Vaccine enthalten je
4 mg Aluminiumphosphat je ccm, aber einer enthält Benzethoniumchlorid in einer Konzentration
von 1: 20 000, während die andere diese Verbindung in einer Konzentration von 1:
40 000 enthält. Die drei nach dem Obigen hergestellten Vaccine sind stabiler und
besitzen eine weit höhere Wirksamkeit als die Vaccine, aus dem sie hergestellt wurden,
oder die Kontrollproben der Vaccine, die eine entsprechende Menge Benzethoniumchlorid
enthalten.