DE2243572A1 - Verfahren zur gewinnung von antigenem material - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von antigenem material

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DE2243572A1 DE2243572A DE2243572A DE2243572A1 DE 2243572 A1 DE2243572 A1 DE 2243572A1 DE 2243572 A DE2243572 A DE 2243572A DE 2243572 A DE2243572 A DE 2243572A DE 2243572 A1 DE2243572 A1 DE 2243572A1
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Description

PAT E N TA N \7Ä LT E
DR. INCA1VANDERWERYr) DR. FRANZ LEDERER ;
HAMBURG 9O · ©MÖNCHEN 80 ' WllSTORFER »TR, 33 · TEL. !04 11» 77 08 61 LUCllE-CRAHN-STR.33 » TEL. «0.11)4739 47
München, den 23. August 1972 PLC 172
\ Anmelder: Pfizer Corporation, Colon, Panama
Verfahren zur Gewinnung; von antigenem Material
Die Erfindung "betrifft die Gewinnung von antigenem Material und insbesondere die Gewinnung des Australia-Antigens (auch bekannt als das der Hepatitis zugehörende Antigen) ' in·hochgereinigter Formj wie es für Verwendung zur Gewinnung von Antisera in Tieren geeignet ist.
{ Antisera zur Verwendung in diagnostischen Vorfahren für
die' Entdeckung spezifischer Antigene, z.3. des Australia-Antigens im Blut von Menschen und anderen Lebewesen, müssen mono-spezifisch sein, d.h. frei von anderen Antikörpern als dem Antikörper für das. spezifische· Antigen-, 'welches ent- ; - -■ deckt werden soll. Um solche Antisera zu gewinnen ist es : notwendig, einem Lebewesen ein sehr reines Antigen zu in- \ jizieren, welches frei von anderen Antigenen ist-. .Daher muß ein Antigen enthaltendes Serum Von Menschen oder anderen Lebewesen einem strengen Reinigungsverfähren unterworfen werdenν um jedes antigene Material äußer dem erforderlichen spezifischen Antigen zu entfernen.
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; DEUTSCHE » A N K A C. HARBURG 93/20 813 »OlIMHIUi HAMBURO 117320
f TELEÖRAMMEi LEDEBERfATtNT MÖNCHEN
-Z-
Su diesem Zweck kann die Arbeitsweise des isopyknisehen Vereinigens ("banding) angewendet v/erden, wobei ein Serummuster mit einem flüssigen Medium zusammengebracht wird, welches einen Dichtegradienten darin besitzt, in welchem die Dichte des verlangten spezifischen Antigens eingeschlossen ist. Das flüssige Medium wird dann einer Ultrazentrifugierung unterworfen, um eine Gleichgewichtsverteilung der Serumbestandteile über den Dichtegradienten gemäß ihrer individuellen Dichten zu erzielen. Aufeinanderfolgende Fraktionen des Mediums werden dann abgezogen und diejenigen, welche das gewünschte Antigen enthalten, werden abgetrennt. Die Anwendung dieser Methode auf die Reinigung von Australia-Antigen ist in der DT-PS 2 049 515 und US-PS 3 636 191 beschrieben·
In einer Ausführungsform dieser Methode isopyknischer Vereinigung (banding) kann das Serummuster anfänglich mit dem unteren Ende der Dichte des flüssigen Mediums zusammengebracht werden, d.h. an die Mediumspitze gebracht v/erden, aber mitunter führt dies zu der Erscheinung der Tröpfchensedimentation, wobei Serumproteine enthaltende Tröpfchen durch den Dichtegradienten hindurchfailen und zum Ausbreiten von Serumproteinen durch das flüssige Medium führen, wenn auch individuelle Antigene in engen Banden konzentriert werden mögen. Auf diese V/eise kann das gewünschte Antigen mit anderen antigenen Stoffen erheblich verunreinigt sein*
Bei einer anderen SOrm dieser Methode kann das Serunimuster anfänglich mit dem hohen Dichteende des flüssigen Mediums zusammengebracht v/erden, d.h. unter das Medium gebracht werden, und Tröpfchensedimentation kann hierdurch vermieden werden. Diese Arbeitsweise wurde auf die Abtrennung von Plasmalipoproteinen angewendet, wie von H.G.Y/ilcox und M.Heimberg (J.Idpid Research, 1970, Band 11, Seiten 7-22) beschrieben.
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■■■ - 3 - ....-■
Es wurde nun gefunden, daß das Australia-Antigen in hocligereinigter Form dtu?ch die Methode isopyknischer Vereinigung ("banding) erhalten werden kann, wenn es enthaltendes Serum mit dem hohen Dichteende des flüssigen Mediums zusammengebracht wird. ' \ ·;.'.-·.
Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren, zur Gewinnung des Australia-Antigens in hochgereinigter Form dadurch gekennzeichnet, daß Blutserum, welches das Australia-Antigen-und anderes antigenes Material enthält, mit dem oberen Dichte-. ende eines flüssigen Mediums, welches einen Dichtegradienten besitzt, welcher die Dichte des Australia-Antigens einschließt, zusammengebracht wird, das flüssige Medium einer Ultrazentrifugierung unterworfen wird, bis eine Gleichgewi chtsver teilung der Serumbestandteile über den Dichtegradienten erzielt ist, und die Fraktion,, welche das Australia-Antigen enthält, anschließend von dem Medium abgetrennt wird.
Die das Aüstralia-Antigen enthaltende Fraktion kann dann weiter gereinigt werden mittels Dialyse durch eine halbdurchlässige Membran, um niedrig-molekulares Material zu entfernen, durch Konzentrierung, um ihr Volumen zu verringern,, und dann durch weitere Ultrazentrifugierung in Berührung mit einem flüssigen Medium mit einem Dichtegradienten, aber dieses Mal unter Verwendung der Zonenverhältnismethode, d.i. bei einem solchen Verhältnis und für eine solche Zeit, daß Gleichgewicht nicht erreicht wird, wodurch das Australia-Antigen und andere restliche Serumbestendtei-Ie durch das Medium gemäß ihrer Cedimentationskoeffizienten in dem Medium verteilt werden..
Die bei dem Verfahren benutzten flüssigen Medien können beliebige wässrige Lösungen sein, welche Dichtegradienten in geeigneten Bereichen besitzen. Geeignete gelöste.Stoffe für solche Lösungen sind Sucrose, Kaliumbromid, Caesiunchlorid
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und Kali.umtartrat. Für 'isopyknisches Vereinigen (bending) ist ein Medium mit einem Dichtegradienten von 1,0 "bis mindestens 1,25 erwünscht, weil die Dichte des Australia-Antigens etv/a 1,2 ist. Y/ässrige Sucroselösungen "mit Dichten von 1f2 und darüber sind ziemlich viskos, 'was ein langsames Einstellen des Gleichgewichts zur Folge hat. Es ist daher vorzuziehen, andere Lösungen zu verwenden, z.B. wässriges Caesiumchlorid oder Kaliumbromid, welche mit Dichten bis zu 1,4 hergestellt werden können, ohne zu viskos zu werden· Von diesen wurde Kaliumbromid bevorzugt, weil es weniger korrosiv als Caesiumchlorid ist. Für zonales Verhältnisvereinißen können niedrigere Dichtebereiche benutzt werden und wässrige Sucroselösungen sind brauchbar.
Die flüssigen Medien sowohl für isopyknisches wie für zonales Verhältnisvereinigen werden leicht hergestellt mit Dichtegradienten durch wohlbekannte Methoden, z.B. durch Beladen des Ultrazentrifugenrotors, während er mit etwa 2000 Umdrehungen pro Minute läuft, mit einer Lösung, deren Konzentration mit gesteuerter Geschwindigkeit erhöht wird. Das letztere kann bewerkstelligt v/erden durch Einspeisen einer konzentrierten Lösung in ein MischgefäB, welches anfänglich eine verdünnte Lösung enthält und durch gleichzeitiges Einspeisen der gut vermischten Lösungen in den Rotor mit der doppelten Geschwindigkeit, mit welcher die konzentrierte Lösung in das Mischgefäß eingespeist wird. Somit ist die dem Rotor zugeführte Flüssigkeit von linear wachsender Konzentration (und daher Dichte),· und unter den Bedingungen der Zentrifugierung tritt wenig oder keine physikalische Vermischung in dem Rotor auf. ·
Das Serummuster, v/elches mit dem flüssigen Medium mit dem Dichtegradienten zusammengebracht werden soll, muß naturgemäß eine Dichte bei oder gerade außerhalb derjenigen des Mediums an dem Ende aufweisen, mit welchem es zusammenge-
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ti »II
bracht wird. Somit muß es für die isopyknische Vereinigung (banding) gemäß der Erfindung eine Dichte "bei oder gerade oberhalb derjenigen des oberen Dichteendes des Gradienten besitzen. Für diesen Zweck kann die-Dichte des Musters durch Zusatz des gleichen gelösten Stoffes gesteigert werden, wie er benutzt wird, um das flüssige Medium herzustellen, d.h. Caesiumchlorid oder Kaliumbromid. Für das zonale Verhältnisvereinigen jedoch wird das Muster mit'dem niedri-· gen Dichteende des Gradienten zusammengebracht und daher ist kein Zusatz von gelöstem Stoff notwendig.
Für das isopyknische Vereinigen gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß eine Ultrazentrifugierungsgeschwindigkeit von 4-0.000 Umdrehungen pro Minute während einer Zeit von 16 Stunden zur Erreichung des Gleichgewichts angemessen ist bei Verwendung von wässrigen CaesiumcMorid- oder Kaliumbromidlösungen mit Dichtegradienten von 1,0 bis L,4, oder engeren Bereichen unter Einschluß der Dichte 'von Australia-Antigen, ζ".B. 1,1 bis 1,3, aber Verhältnisse und Zeiten sind deutlich voneinander abhängig ebenso wie abhängig von der Zusammensetzung des Mediums. In gleicher "V/eise wurde gefunden, daß eine Geschwindigkeit von '40.000 Umdrehungen pro Minute für eine Zeit von 5 1/2 bis 4· Stunden gute Abtrennung des Australia-Antigens von anderen Serumbestandteilen bei dem zonalen Verhältnisvereinigen liefert bei Verwendung einer wässrigen Sucroselösung mit einem Dichtegradienten von 1,0 bis 1,13 (entsprechend einem Konzentrationsbereich von 0 bis 30 % Sucrose), oder engeren Beireichen, z.B. von 1,02 bis 1,10 (entsprechend 5 bis 25 %■ Sucrose).
Die Erfindung wird noch an den folgenden Beispielen erläutert*
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Beispiel I
Ein Titan-zonaler-Ultrazentrifugenrotor (Type B XIV)'wurde mit 400 ml einer wässrigen Caesiumchloridlosung mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 "bis 38 Gew.?» "beladen, was einen annähernd linearen Dichtegradienten von 1,0 "bis 1,4 ergab. Ein 200 ml Muster von menschlichem Serum, welches das Australia-Antigen und andere menschliche Geruiabestandteile enthielt, zu welchem Caesiumchlorid bis zu einer Konzentration von 50 /« zugesetzt worden war, wurde dann auf den Rand des zonalen "Rotors unterhalb der Caesiumchloridlosung aufgeladen und schließlich wurde eine 50 ^l Unterlage von 54 ?£~iger wässriger Caesiumchloridlösung auf den Rand des zonalen Rotors unterhalb des Serummusters aufgeladen, um völlige Beladung des Musters sicherzustellen. Die Zentrifuge wurde dann mit 40,000 Umdrehungen pro LIinute während 16 Stunden bei 20° G laufengelassen.
Nach dieser Zeit wurde der Inhalt des Hotors durch das Zentrum des Rotors mittels 54· %-iger wässriger Caesiumchloridlösung, die dem Rand des Rotors zugeführt vmrde, verdrängt. Aufeinanderfolgende 8 ml Fraktionen wurden gesammelt und ihr Refraktionsindex und ihre Ultraviolett-Absorption wurden automatisch gemessen und auf einer Tabelle aufgezeichnet. Her Refraktionsindex wurde benutzt, um die Caesiumchloridkonzentration und Dichte jeder Fraktion zu berechnen, und der Grad ultravioletter Absorption vmrde als ein Koß des Proteingehalts jeder Fraktion angesehen. Die Anwesenheit von Australia-Antigen wurde entdeckt durch Gel-Diffusionsprüfung jeder Fraktion und seine Konzentration in solchen Fraktionen, in welchen sein Vorhandensein gefunden wurde, wurde durch Komplenentfixationsprüfungen an kleinen Vereinigungen mehrerer benachbarter Fraktionen bestimmt.
Es wurde gefunden, daß das Australia-Antigen sich konzen-
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triert fand in einer 50 ml Zone .mit einer mittleren Dichte VGH 1822, zusammenfallend mit einer sichtbaren Spitze in der U„V. (ultraviolett) Absorptionskurve. Die Kauptmenge an den menschlichen Serumproteinen wurde in einer 200 ml Zone mit einer mittleren Dichte von 1,37 gefunden. Die Zone, welche das Australia-Antigen enthielt, enthielt nur etwa 5 ci'o der ursprünglichen Serumproteine-,· was eine 20-fache Reinigung und ebenso eine 4-fache Konzentration des. Australia-Antigens im ursprünglichen Muster anzeigte.
Beispiel II ' '
Das Verfahren des Beispiels I wurde· wiederholt unter Verwendung einer wässrigen Kaliumbromidlösung mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 10 "bis 34 %, was einen annähernd linearen Dichtegradienten von 1,076 "bis 1,31 ergab. Ein 145 ml Serumiauster mit einem Gehalt von .34 % Kaliumbromid wurde in diesem 'Fall verwendet und eine 50 ml Unterlage von 40 %-igem Kaliumbromid wurde unter das »Serummuster geladen, · ".·-.-
Nachdem die Zentrifuge mit 40.000 Umdrehungen pro Iiinute während 16 Stunden bei 25° G (um Kristallisation des Kaliumbromids zu vermeiden) gelaufen war, wurde der Inhrlt des Botorsrmit wässriger 40 ?£-iger wässriger Kaliumbromidlösung verdrängt und in gleicher V/eise wie in Beispiel 1 analysiert. Das Australia-Antigen fand sich konzentriert "in einer 50 ml Zone mit einer mittleren Dichte von 1,21 und enthielt auch hier nur 5 % der. ursprünglichen Serumproteine.
Beispiel III ·
Das Verfahren des Beispiels II wurde wiederholt mit der Ab- ■ änderung, daß die Zentrifuge 18 Stunden anstatt 16 Stunden betrieben wurde. Dichte und Proteingehalt aufeinanderfolgender Fraktionen und die Konzentration von Australia-Antigen
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in kleinen Vereinigungen benachbarter Fraktionen werden in · Fig. I der Zeichnungen wiedergegeben. Die Dickte ist angegeben in g/c.c. und zeigt einen annähernd linearen Gradienten von 1,13 bei Fraktion 3 bis 1,275 "bei Fraktion 53, welche die ursprünglichen 4-00 ml Kaliumbromidgradient darstellt. Anschließende Fraktionen über 53 hinaus zeigen die Auswirkung eines Vermischens mit den Serunmuster und der Unterlage. Ein großer Teil des Proteingehalts ist, wie ersichtlich, in der Uusterzone zurückgeblieben mit einem zweiten Gipfel in den Fraktionen 18 bis 23 (Dichte 1,1 bis 1,19) und einer Abflachung an diesem Gijfel bei Fraktionen 27 bis 30 (Dichte 1,20 bis 1,21). .
Australia-Antigen wurde entdeckt in den Fraktionen 12 bis 50, und Fig. I zeigt, daß der größere Teil des Australia-Antigens in den Fraktionen 24 bis 38 (Dichte 1,19 bis 1,23) konzentriert wurde mit einer Spitzenkonzentration zugehörig zu der Abflachung bei Fraktionen 27 bis 30 (mittlere Dichte 1,205).
Die Produkte mehrerer Versuche gemäß jedem der Beispiele, d.i. die zusammengegebenen Fraktionen aus den 50 rol Zonen an konzentriertem Australia-Antigen aus den Beispielen I oder II, oder die 120 ml zusaramengegebener Fraktionen 24 bis 33 des Beispiels III, wurden kombiniert und dialysiert gegenüber phospliat-gepufferter Sole, bis sie im wesentlichen frei von anorganischen Salzen waren. Die Lösung wurde dann weiter dialysiort gegenüber einer 50 %-igen wässrigen Lösung von "Carbowax" 20LI, um ;7asser und kleine Ionen abzuziehen, wodurch die Lösung auf etwa 1/6 des ursprünglichen Volumens der vereinigten Fraktionen konzentriert wurde.
Die konzentrierte, das Australia-Antigen enthaltende Lösung wurde dann einer v/eiteren Reinigung durch zonale Verhultniszentrifugierung in Sucroselösung mit einem Dichtegradienten
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unterworfen, wofür das folgende Beispiel typisch ist: 400 ml einer wässrigen Sucroselösung mit einen Dichtegra- dionten von 1,02 Ms .1,-13 (5 "bis 30' % Sucrose) vhirden in einen B XIV zonalen Rotor in der '.veise eingespeist, wie in Beispiel I "beschrieben, wobei die höchste Dichte am Rand des Rotors war. Eine wässrige 45 %-ige Sucroselösung (Dichte 1,20) wurde in den Rand des Rotors eingespeist, um den Dichtegradienten zu dem Zentrum des Rotors hin zu verdrängen, bis das leichte Ende des Dichtegradienten als Ausfluß nus der Lütte des Rotors erschien, und dann y/urden 22 ml konzentrierter Lösung, enthaltend Australia-Antigen aus den kombinierten Fraktionen 24 bis 38 des Beispiels III stammend, in die Lütte des Rotors eingespeist, gefolgt von 100 ml von phosphat-gepufferter. wässriger Salzlösung als Überlage. Die Zentrifuge wurde dann mit 40.000 Umdrehungen pro Minute während 3 1/2 Stunden bei 20° G. laufengelassen, für welche Zeit berechnet war, daß das Australia-Antigen sich zu der Zone etwa halbwegs längs des Dichtegradienten bewegt haben würde. Der Inhalt des Rotors wurde dann von der I1Iitte des Rotors durch Einspeisen 45 ?>-iger Sucroselösung in den Rand des Rotors verdrängt und 8 ml Fraktionen wurden gesammelt und analysiert, wie in Beispiel I beschrieben;
Die Ergebnisse des zonalen Vernältniszentrifugierens in' dem Sucrosegradienten werden in Pig. II der Zeichnungen wiedergegeben, worin Dichte und}Proteingehalt von einzelnen Fraktionen und die Australia-Antigenkonzentration von Vereinigungen benachbarter Fraktionen so wie bei Fig. I gezeigt sind. Die Ergebnisse zeigen, daß das A.ustralia-Antigen in den Fraktionen 34 bis 51 konzentriert ist, entsprechend einer Dichtezone von 1,06 bis 1,10, während die Hauptmenge des übrigen ProteingeheIts in einer Zone nahe dem unteren linde des Dichtegradienten verblieben ist. Die Dichtekurve zeigt einen im wesentlichen lineraren Gradienten von 1,03 in FrrJc-
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tion 20 bis 1,10 in Fraktion 52, nit etwas Vermischen nit der überlnce an dem unteren Ende und mit der 45 Gucroselösung rn dera oberen 2nde des Gradienten.
Ein F.uster der kombinierten Fraktionen 3^ bis 51 wurde durch. Dialyse gegenüber phosphp.t-gepuff erter Salzlösung, um Gucrose zu entfernen und dann gegenüber 50 />-igein v/assrigem "Garbov/ax" 2OM wie oben v/ieder konzentriert. V;enn dieses Material durch Gel-Diffusion gegen Kaninchen-anti-hunan-Serum geprüft wurde, v;ar eine Verunreinigung mit Humanserunprotein unentdeckbar bei einer Konzentration entsprechend einer Verdünnung 1/10.000 an Gesantserum.
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Claims (6)

  1. Patentansprü ehe
    Verfaliren zur Gewinnung eines hochgereinigten Australia-Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß Australia-Antigen und anderes antigenes Material enthaltendes Blutserum mit dem oberen Dichteende eines flüssigen Mediums, welches einen Di elite gradient en besitzt, welcher die Dichte von Australia-Antigen einschließt, zusammengebracht wird, das flüssige Iuediun einer Ultrazentrifugierung unterworfen wird, bis eine Gleichgewi clitsverteilung der Serumbestandteile einschließlich des Australia-Antigens über den Dichtegradienten erzielt .ist, und schließlich die das Australia-Antigen enthaltende Fraktion von dem Rest des Mediums abgetrennt wird.
  2. 2. Verfaliren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine wässrige Lösung mit einem Dichtegradienten innerhalb des Bereichs von 1,0 bis mindestens 1,25 ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Dichtegradient von 1,0 bis 1,4 beträgto
  4. 4-« Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der'Dichtegradient zwischen 1,1 und 1,3 liegt.^
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kedium eine wässrige Lösung von Caesiumchiorid oder Kaliumbromid"ist.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrazentrifugierung mit etwa 40.000 Umdrehungen pro .Llinute während mindestens
    16 Stunden durchgeführt wird* · ,
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    7« Vorfahren nach einen der vorhergehenden Ansprüche, dadurch Gekennzeichnet, daß die abgetrennte, das Australia-Antigen enthaltende Lösung durch Dialyse gereinigt und konzentriert wird und dann einer weiteren Ultrazentrifugierung in Berührung mit einem flüssigen Lledium mit einem Dichtegradienten in einem Verhältnis und während einer solchen Zeit unterworfen wird, daß Gleichgewicht nicht erzielt wird, daß jedoch das Australia-Antigen und andere restliche Serumbestandteile durch das üediura verteilt werden, und dann .die das Australia-Antigen enthaltende Fraktion von dem übrigen Lledium abgetrennt vriLrd,
    8· Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium* worin die weitere Ultrezentrifugierung durchgeführt wird, eine wässrige Sucroselösung ist.
    9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Ultrazentrifugierung in einer wässrigen Sucroeelösung mit einem Dichtegradienten im Bereich von 1,0 hie 1,13 während einer Zeit von 3 1/2 bis 4 Stunden durchgeführt wird.
    'JiHUU 1/11 :?7
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