DE2243572A1 - Verfahren zur gewinnung von antigenem material - Google Patents
Verfahren zur gewinnung von antigenem materialInfo
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Description
PAT E N TA N \7Ä LT E
DR. INCA1VANDERWERYr) DR. FRANZ LEDERER ;
München, den 23. August 1972 PLC 172
\ Anmelder: Pfizer Corporation, Colon, Panama
Die Erfindung "betrifft die Gewinnung von antigenem Material
und insbesondere die Gewinnung des Australia-Antigens
(auch bekannt als das der Hepatitis zugehörende Antigen) ' in·hochgereinigter Formj wie es für Verwendung zur Gewinnung
von Antisera in Tieren geeignet ist.
{ Antisera zur Verwendung in diagnostischen Vorfahren für
die' Entdeckung spezifischer Antigene, z.3. des Australia-Antigens
im Blut von Menschen und anderen Lebewesen, müssen mono-spezifisch sein, d.h. frei von anderen Antikörpern als
dem Antikörper für das. spezifische· Antigen-, 'welches ent-
; - -■ deckt werden soll. Um solche Antisera zu gewinnen ist es
: notwendig, einem Lebewesen ein sehr reines Antigen zu in- \ jizieren, welches frei von anderen Antigenen ist-. .Daher
muß ein Antigen enthaltendes Serum Von Menschen oder anderen Lebewesen einem strengen Reinigungsverfähren unterworfen
werdenν um jedes antigene Material äußer dem erforderlichen
spezifischen Antigen zu entfernen.
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; DEUTSCHE » A N K A C. HARBURG 93/20 813 »OlIMHIUi HAMBURO 117320
f TELEÖRAMMEi LEDEBERfATtNT MÖNCHEN
-Z-
Su diesem Zweck kann die Arbeitsweise des isopyknisehen
Vereinigens ("banding) angewendet v/erden, wobei ein Serummuster
mit einem flüssigen Medium zusammengebracht wird, welches einen Dichtegradienten darin besitzt, in welchem
die Dichte des verlangten spezifischen Antigens eingeschlossen ist. Das flüssige Medium wird dann einer Ultrazentrifugierung
unterworfen, um eine Gleichgewichtsverteilung der Serumbestandteile über den Dichtegradienten gemäß
ihrer individuellen Dichten zu erzielen. Aufeinanderfolgende Fraktionen des Mediums werden dann abgezogen und diejenigen,
welche das gewünschte Antigen enthalten, werden abgetrennt. Die Anwendung dieser Methode auf die Reinigung
von Australia-Antigen ist in der DT-PS 2 049 515 und US-PS
3 636 191 beschrieben·
In einer Ausführungsform dieser Methode isopyknischer Vereinigung
(banding) kann das Serummuster anfänglich mit dem unteren Ende der Dichte des flüssigen Mediums zusammengebracht
werden, d.h. an die Mediumspitze gebracht v/erden, aber mitunter führt dies zu der Erscheinung der Tröpfchensedimentation,
wobei Serumproteine enthaltende Tröpfchen durch den Dichtegradienten hindurchfailen und zum Ausbreiten
von Serumproteinen durch das flüssige Medium führen, wenn auch individuelle Antigene in engen Banden konzentriert
werden mögen. Auf diese V/eise kann das gewünschte Antigen mit anderen antigenen Stoffen erheblich verunreinigt sein*
Bei einer anderen SOrm dieser Methode kann das Serunimuster
anfänglich mit dem hohen Dichteende des flüssigen Mediums zusammengebracht v/erden, d.h. unter das Medium gebracht werden,
und Tröpfchensedimentation kann hierdurch vermieden werden. Diese Arbeitsweise wurde auf die Abtrennung von
Plasmalipoproteinen angewendet, wie von H.G.Y/ilcox und
M.Heimberg (J.Idpid Research, 1970, Band 11, Seiten 7-22)
beschrieben.
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■■■ - 3 - ....-■
Es wurde nun gefunden, daß das Australia-Antigen in hocligereinigter
Form dtu?ch die Methode isopyknischer Vereinigung
("banding) erhalten werden kann, wenn es enthaltendes Serum mit dem hohen Dichteende des flüssigen Mediums zusammengebracht
wird. ' \ ·;.'.-·.
Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren, zur Gewinnung des
Australia-Antigens in hochgereinigter Form dadurch gekennzeichnet, daß Blutserum, welches das Australia-Antigen-und
anderes antigenes Material enthält, mit dem oberen Dichte-. ende eines flüssigen Mediums, welches einen Dichtegradienten
besitzt, welcher die Dichte des Australia-Antigens einschließt, zusammengebracht wird, das flüssige Medium einer
Ultrazentrifugierung unterworfen wird, bis eine Gleichgewi chtsver teilung der Serumbestandteile über den Dichtegradienten
erzielt ist, und die Fraktion,, welche das Australia-Antigen enthält, anschließend von dem Medium abgetrennt wird.
Die das Aüstralia-Antigen enthaltende Fraktion kann dann
weiter gereinigt werden mittels Dialyse durch eine halbdurchlässige Membran, um niedrig-molekulares Material zu
entfernen, durch Konzentrierung, um ihr Volumen zu verringern,, und dann durch weitere Ultrazentrifugierung in Berührung
mit einem flüssigen Medium mit einem Dichtegradienten,
aber dieses Mal unter Verwendung der Zonenverhältnismethode, d.i. bei einem solchen Verhältnis und für eine
solche Zeit, daß Gleichgewicht nicht erreicht wird, wodurch
das Australia-Antigen und andere restliche Serumbestendtei-Ie
durch das Medium gemäß ihrer Cedimentationskoeffizienten
in dem Medium verteilt werden..
Die bei dem Verfahren benutzten flüssigen Medien können beliebige wässrige Lösungen sein, welche Dichtegradienten in
geeigneten Bereichen besitzen. Geeignete gelöste.Stoffe für
solche Lösungen sind Sucrose, Kaliumbromid, Caesiunchlorid
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und Kali.umtartrat. Für 'isopyknisches Vereinigen (bending)
ist ein Medium mit einem Dichtegradienten von 1,0 "bis mindestens
1,25 erwünscht, weil die Dichte des Australia-Antigens etv/a 1,2 ist. Y/ässrige Sucroselösungen "mit Dichten von
1f2 und darüber sind ziemlich viskos, 'was ein langsames Einstellen
des Gleichgewichts zur Folge hat. Es ist daher vorzuziehen, andere Lösungen zu verwenden, z.B. wässriges Caesiumchlorid
oder Kaliumbromid, welche mit Dichten bis zu 1,4 hergestellt werden können, ohne zu viskos zu werden·
Von diesen wurde Kaliumbromid bevorzugt, weil es weniger korrosiv als Caesiumchlorid ist. Für zonales Verhältnisvereinißen
können niedrigere Dichtebereiche benutzt werden und wässrige Sucroselösungen sind brauchbar.
Die flüssigen Medien sowohl für isopyknisches wie für zonales
Verhältnisvereinigen werden leicht hergestellt mit Dichtegradienten durch wohlbekannte Methoden, z.B. durch Beladen
des Ultrazentrifugenrotors, während er mit etwa 2000 Umdrehungen pro Minute läuft, mit einer Lösung, deren Konzentration
mit gesteuerter Geschwindigkeit erhöht wird. Das letztere kann bewerkstelligt v/erden durch Einspeisen einer
konzentrierten Lösung in ein MischgefäB, welches anfänglich eine verdünnte Lösung enthält und durch gleichzeitiges Einspeisen
der gut vermischten Lösungen in den Rotor mit der doppelten Geschwindigkeit, mit welcher die konzentrierte
Lösung in das Mischgefäß eingespeist wird. Somit ist die dem Rotor zugeführte Flüssigkeit von linear wachsender Konzentration
(und daher Dichte),· und unter den Bedingungen der Zentrifugierung tritt wenig oder keine physikalische
Vermischung in dem Rotor auf. ·
Das Serummuster, v/elches mit dem flüssigen Medium mit dem
Dichtegradienten zusammengebracht werden soll, muß naturgemäß eine Dichte bei oder gerade außerhalb derjenigen des
Mediums an dem Ende aufweisen, mit welchem es zusammenge-
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ti »II
bracht wird. Somit muß es für die isopyknische Vereinigung
(banding) gemäß der Erfindung eine Dichte "bei oder gerade
oberhalb derjenigen des oberen Dichteendes des Gradienten besitzen. Für diesen Zweck kann die-Dichte des Musters
durch Zusatz des gleichen gelösten Stoffes gesteigert werden, wie er benutzt wird, um das flüssige Medium herzustellen,
d.h. Caesiumchlorid oder Kaliumbromid. Für das zonale
Verhältnisvereinigen jedoch wird das Muster mit'dem niedri-·
gen Dichteende des Gradienten zusammengebracht und daher
ist kein Zusatz von gelöstem Stoff notwendig.
Für das isopyknische Vereinigen gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß eine Ultrazentrifugierungsgeschwindigkeit von
4-0.000 Umdrehungen pro Minute während einer Zeit von 16
Stunden zur Erreichung des Gleichgewichts angemessen ist bei Verwendung von wässrigen CaesiumcMorid- oder Kaliumbromidlösungen
mit Dichtegradienten von 1,0 bis L,4, oder
engeren Bereichen unter Einschluß der Dichte 'von Australia-Antigen,
ζ".B. 1,1 bis 1,3, aber Verhältnisse und Zeiten sind
deutlich voneinander abhängig ebenso wie abhängig von der Zusammensetzung des Mediums. In gleicher "V/eise wurde gefunden,
daß eine Geschwindigkeit von '40.000 Umdrehungen pro Minute für eine Zeit von 5 1/2 bis 4· Stunden gute Abtrennung
des Australia-Antigens von anderen Serumbestandteilen
bei dem zonalen Verhältnisvereinigen liefert bei Verwendung einer wässrigen Sucroselösung mit einem Dichtegradienten
von 1,0 bis 1,13 (entsprechend einem Konzentrationsbereich
von 0 bis 30 % Sucrose), oder engeren Beireichen, z.B. von
1,02 bis 1,10 (entsprechend 5 bis 25 %■ Sucrose).
Die Erfindung wird noch an den folgenden Beispielen erläutert*
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Ein Titan-zonaler-Ultrazentrifugenrotor (Type B XIV)'wurde mit 400 ml einer wässrigen Caesiumchloridlosung mit
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 "bis 38 Gew.?»
"beladen, was einen annähernd linearen Dichtegradienten von
1,0 "bis 1,4 ergab. Ein 200 ml Muster von menschlichem Serum,
welches das Australia-Antigen und andere menschliche Geruiabestandteile
enthielt, zu welchem Caesiumchlorid bis zu
einer Konzentration von 50 /« zugesetzt worden war, wurde
dann auf den Rand des zonalen "Rotors unterhalb der Caesiumchloridlosung
aufgeladen und schließlich wurde eine 50 ^l
Unterlage von 54 ?£~iger wässriger Caesiumchloridlösung auf
den Rand des zonalen Rotors unterhalb des Serummusters aufgeladen,
um völlige Beladung des Musters sicherzustellen. Die Zentrifuge wurde dann mit 40,000 Umdrehungen pro LIinute
während 16 Stunden bei 20° G laufengelassen.
Nach dieser Zeit wurde der Inhalt des Hotors durch das Zentrum
des Rotors mittels 54· %-iger wässriger Caesiumchloridlösung,
die dem Rand des Rotors zugeführt vmrde, verdrängt.
Aufeinanderfolgende 8 ml Fraktionen wurden gesammelt und ihr Refraktionsindex und ihre Ultraviolett-Absorption wurden
automatisch gemessen und auf einer Tabelle aufgezeichnet. Her Refraktionsindex wurde benutzt, um die Caesiumchloridkonzentration
und Dichte jeder Fraktion zu berechnen, und der Grad ultravioletter Absorption vmrde als ein Koß
des Proteingehalts jeder Fraktion angesehen. Die Anwesenheit
von Australia-Antigen wurde entdeckt durch Gel-Diffusionsprüfung jeder Fraktion und seine Konzentration in solchen
Fraktionen, in welchen sein Vorhandensein gefunden wurde, wurde durch Komplenentfixationsprüfungen an kleinen
Vereinigungen mehrerer benachbarter Fraktionen bestimmt.
Es wurde gefunden, daß das Australia-Antigen sich konzen-
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triert fand in einer 50 ml Zone .mit einer mittleren Dichte
VGH 1822, zusammenfallend mit einer sichtbaren Spitze in
der U„V. (ultraviolett) Absorptionskurve. Die Kauptmenge
an den menschlichen Serumproteinen wurde in einer 200 ml Zone mit einer mittleren Dichte von 1,37 gefunden. Die
Zone, welche das Australia-Antigen enthielt, enthielt nur
etwa 5 ci'o der ursprünglichen Serumproteine-,· was eine 20-fache
Reinigung und ebenso eine 4-fache Konzentration des. Australia-Antigens im ursprünglichen Muster anzeigte.
Beispiel II ' '
Das Verfahren des Beispiels I wurde· wiederholt unter Verwendung einer wässrigen Kaliumbromidlösung mit einem linearen
Konzentrationsgradienten von 10 "bis 34 %, was einen annähernd
linearen Dichtegradienten von 1,076 "bis 1,31 ergab.
Ein 145 ml Serumiauster mit einem Gehalt von .34 % Kaliumbromid
wurde in diesem 'Fall verwendet und eine 50 ml Unterlage
von 40 %-igem Kaliumbromid wurde unter das »Serummuster
geladen, · ".·-.-
Nachdem die Zentrifuge mit 40.000 Umdrehungen pro Iiinute
während 16 Stunden bei 25° G (um Kristallisation des Kaliumbromids
zu vermeiden) gelaufen war, wurde der Inhrlt des Botorsrmit wässriger 40 ?£-iger wässriger Kaliumbromidlösung
verdrängt und in gleicher V/eise wie in Beispiel 1 analysiert. Das Australia-Antigen fand sich konzentriert "in einer 50 ml
Zone mit einer mittleren Dichte von 1,21 und enthielt auch hier nur 5 % der. ursprünglichen Serumproteine.
Beispiel III ·
Das Verfahren des Beispiels II wurde wiederholt mit der Ab- ■
änderung, daß die Zentrifuge 18 Stunden anstatt 16 Stunden betrieben wurde. Dichte und Proteingehalt aufeinanderfolgender
Fraktionen und die Konzentration von Australia-Antigen
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in kleinen Vereinigungen benachbarter Fraktionen werden in ·
Fig. I der Zeichnungen wiedergegeben. Die Dickte ist angegeben
in g/c.c. und zeigt einen annähernd linearen Gradienten von 1,13 bei Fraktion 3 bis 1,275 "bei Fraktion 53, welche
die ursprünglichen 4-00 ml Kaliumbromidgradient darstellt.
Anschließende Fraktionen über 53 hinaus zeigen die Auswirkung eines Vermischens mit den Serunmuster und der Unterlage.
Ein großer Teil des Proteingehalts ist, wie ersichtlich, in der Uusterzone zurückgeblieben mit einem zweiten Gipfel in
den Fraktionen 18 bis 23 (Dichte 1,1 bis 1,19) und einer
Abflachung an diesem Gijfel bei Fraktionen 27 bis 30 (Dichte
1,20 bis 1,21). .
Australia-Antigen wurde entdeckt in den Fraktionen 12 bis
50, und Fig. I zeigt, daß der größere Teil des Australia-Antigens in den Fraktionen 24 bis 38 (Dichte 1,19 bis 1,23)
konzentriert wurde mit einer Spitzenkonzentration zugehörig zu der Abflachung bei Fraktionen 27 bis 30 (mittlere Dichte
1,205).
Die Produkte mehrerer Versuche gemäß jedem der Beispiele, d.i. die zusammengegebenen Fraktionen aus den 50 rol Zonen
an konzentriertem Australia-Antigen aus den Beispielen I oder II, oder die 120 ml zusaramengegebener Fraktionen 24
bis 33 des Beispiels III, wurden kombiniert und dialysiert
gegenüber phospliat-gepufferter Sole, bis sie im wesentlichen
frei von anorganischen Salzen waren. Die Lösung wurde dann weiter dialysiort gegenüber einer 50 %-igen wässrigen Lösung
von "Carbowax" 20LI, um ;7asser und kleine Ionen abzuziehen,
wodurch die Lösung auf etwa 1/6 des ursprünglichen Volumens der vereinigten Fraktionen konzentriert wurde.
Die konzentrierte, das Australia-Antigen enthaltende Lösung
wurde dann einer v/eiteren Reinigung durch zonale Verhultniszentrifugierung
in Sucroselösung mit einem Dichtegradienten
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unterworfen, wofür das folgende Beispiel typisch ist:
400 ml einer wässrigen Sucroselösung mit einen Dichtegra- dionten
von 1,02 Ms .1,-13 (5 "bis 30' % Sucrose) vhirden in
einen B XIV zonalen Rotor in der '.veise eingespeist, wie in
Beispiel I "beschrieben, wobei die höchste Dichte am Rand
des Rotors war. Eine wässrige 45 %-ige Sucroselösung (Dichte 1,20) wurde in den Rand des Rotors eingespeist, um den
Dichtegradienten zu dem Zentrum des Rotors hin zu verdrängen, bis das leichte Ende des Dichtegradienten als Ausfluß
nus der Lütte des Rotors erschien, und dann y/urden 22 ml
konzentrierter Lösung, enthaltend Australia-Antigen aus
den kombinierten Fraktionen 24 bis 38 des Beispiels III
stammend, in die Lütte des Rotors eingespeist, gefolgt von
100 ml von phosphat-gepufferter. wässriger Salzlösung als
Überlage. Die Zentrifuge wurde dann mit 40.000 Umdrehungen
pro Minute während 3 1/2 Stunden bei 20° G. laufengelassen,
für welche Zeit berechnet war, daß das Australia-Antigen sich zu der Zone etwa halbwegs längs des Dichtegradienten
bewegt haben würde. Der Inhalt des Rotors wurde dann von der I1Iitte des Rotors durch Einspeisen 45 ?>-iger Sucroselösung
in den Rand des Rotors verdrängt und 8 ml Fraktionen wurden gesammelt und analysiert, wie in Beispiel I beschrieben;
Die Ergebnisse des zonalen Vernältniszentrifugierens in' dem
Sucrosegradienten werden in Pig. II der Zeichnungen wiedergegeben,
worin Dichte und}Proteingehalt von einzelnen Fraktionen
und die Australia-Antigenkonzentration von Vereinigungen
benachbarter Fraktionen so wie bei Fig. I gezeigt sind. Die Ergebnisse zeigen, daß das A.ustralia-Antigen in
den Fraktionen 34 bis 51 konzentriert ist, entsprechend einer
Dichtezone von 1,06 bis 1,10, während die Hauptmenge des
übrigen ProteingeheIts in einer Zone nahe dem unteren linde
des Dichtegradienten verblieben ist. Die Dichtekurve zeigt einen im wesentlichen lineraren Gradienten von 1,03 in FrrJc-
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tion 20 bis 1,10 in Fraktion 52, nit etwas Vermischen nit
der überlnce an dem unteren Ende und mit der 45
Gucroselösung rn dera oberen 2nde des Gradienten.
Ein F.uster der kombinierten Fraktionen 3^ bis 51 wurde durch.
Dialyse gegenüber phosphp.t-gepuff erter Salzlösung, um Gucrose
zu entfernen und dann gegenüber 50 />-igein v/assrigem
"Garbov/ax" 2OM wie oben v/ieder konzentriert. V;enn dieses
Material durch Gel-Diffusion gegen Kaninchen-anti-hunan-Serum
geprüft wurde, v;ar eine Verunreinigung mit Humanserunprotein
unentdeckbar bei einer Konzentration entsprechend einer Verdünnung 1/10.000 an Gesantserum.
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Claims (6)
- Patentansprü eheVerfaliren zur Gewinnung eines hochgereinigten Australia-Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß Australia-Antigen und anderes antigenes Material enthaltendes Blutserum mit dem oberen Dichteende eines flüssigen Mediums, welches einen Di elite gradient en besitzt, welcher die Dichte von Australia-Antigen einschließt, zusammengebracht wird, das flüssige Iuediun einer Ultrazentrifugierung unterworfen wird, bis eine Gleichgewi clitsverteilung der Serumbestandteile einschließlich des Australia-Antigens über den Dichtegradienten erzielt .ist, und schließlich die das Australia-Antigen enthaltende Fraktion von dem Rest des Mediums abgetrennt wird.
- 2. Verfaliren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine wässrige Lösung mit einem Dichtegradienten innerhalb des Bereichs von 1,0 bis mindestens 1,25 ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Dichtegradient von 1,0 bis 1,4 beträgto
- 4-« Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der'Dichtegradient zwischen 1,1 und 1,3 liegt.^
- 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kedium eine wässrige Lösung von Caesiumchiorid oder Kaliumbromid"ist.
- 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrazentrifugierung mit etwa 40.000 Umdrehungen pro .Llinute während mindestens16 Stunden durchgeführt wird* · ,30981.171 1377« Vorfahren nach einen der vorhergehenden Ansprüche, dadurch Gekennzeichnet, daß die abgetrennte, das Australia-Antigen enthaltende Lösung durch Dialyse gereinigt und konzentriert wird und dann einer weiteren Ultrazentrifugierung in Berührung mit einem flüssigen Lledium mit einem Dichtegradienten in einem Verhältnis und während einer solchen Zeit unterworfen wird, daß Gleichgewicht nicht erzielt wird, daß jedoch das Australia-Antigen und andere restliche Serumbestandteile durch das üediura verteilt werden, und dann .die das Australia-Antigen enthaltende Fraktion von dem übrigen Lledium abgetrennt vriLrd,8· Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium* worin die weitere Ultrezentrifugierung durchgeführt wird, eine wässrige Sucroselösung ist.9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Ultrazentrifugierung in einer wässrigen Sucroeelösung mit einem Dichtegradienten im Bereich von 1,0 hie 1,13 während einer Zeit von 3 1/2 bis 4 Stunden durchgeführt wird.'JiHUU 1/11 :?7Leerseite
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