DE1177851B

DE1177851B - Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Albumin in Fluessigkeiten

Info

Publication number: DE1177851B
Application number: DEM39534A
Authority: DE
Inventors: Galen Franklin Collins
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1957-11-13
Filing date: 1958-11-07
Publication date: 1964-09-10
Also published as: GB840362A; US2986453A; FR1215027A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. Kl.: GOIn

Deutsche Kl.: 421-3/54

Nummer: 1177 851

Aktenzeichen: M 39534 IX b / 421

Anmeldetag: 7. November 1958

Auslegetag: 10. September 1964

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zur qualitativen und halbquatitativen Bestimmung von Albumin in Flüssigkeiten, insbesondere in Körperflüssigkeiten wie Harn.

Bei den bisher vorgeschlagenen Analysen zur Be-Stimmung von Albumin in Körperflüssigkeiten machte man von p_H-Indikatoren mit einer Affinität für Protein Gebrauch, infolge deren sie einen sogenannten »Proteinfehler« aufweisen, so daß die Indikatoren in proteinhaltigen Lösungen ihren charakteristischen Farbumschlag von sauer nach basisch bei einem niedrigeren p_H-Wert als demjenigen erleiden, bei welchem der Farbumschlag in Abwesenheit von Protein eintritt. Das bedeutet, daß ein Indikator mit »Proteinfehler« in einer proteinhaltigen Lösung unter ge- wissen Bedingungen seine basische Farbe zeigt, obwohl das p_H der Lösung tatsächlich weit unter demjenigen Wert liegt, bei welchem der Farbumschlag normalerweise eintritt, und das Ausmaß der Farbänderung der Lösung ist ein Anzeichen für die in Lösung befindliche Menge an Protein. Der Mechanismus, mittels dessen die Anwesenheit von Protein gewisse Farbstoffe befähigt, in Lösungen mit einem Pn-Wert unterhalb des Umschlagspunktes von sauer zu basisch ihre basische Farbe zu zeigen, ist noch nicht aufgeklärt; man weiß jedoch, daß Protein in seinem Bereich und seiner Fähigkeit zur Herbeiführung dieser Wirkung gewissen Beschränkungen unterliegt. Insbesondere kann diese auf die Gegenwart von Protein zurückzuführende Farbänderung des Indikators nur dann erfolgen, wenn der p_H-Endwert der zu untersuchenden Lösung wesentlich tiefer als etwa 1,25 pn-Einheiten unterhalb desjenigen p_H-Wertes liegt, bei welchem der normale Farbumschlag des Indikators von sauer nach basisch eintritt.

Diagnostische Mittel zur Durchführung von Albumintesten werden unter Verwendung eines Grundstoffes, wie Filterpapierstreifen, hergestellt, die als Träger für den Farbstoff und einen Puffer dienen, der dafür sorgt, daß der p_H-Wert des Trägers und des Farbstoffes, wenn der Träger mit der Harnprobe befeuchtet ist, in der Nähe, jedoch auf der sauren Seite desjenigen Punktes bleibt, bei dem der Farbstoff von seiner sauren zu seiner basischen Farbe umschlägt. Wenn solche Stoffzusammensetzungen mit der zu prüfenden Flüssigkeit angefeuchtet werden, ändern sie ihre Farbe nicht (d. h., sie zeigen weiterhin die saure Farbe des Farbstoffes), wenn die Flüssigkeit kein Protein enthält. Enthält die Flüssigkeit jedoch Protein, so schlägt der Farbstoff infolge des »Proteinfehlers« in die alkalische Farbe um.

Obwohl diese bekannten diagnostischen Mittel Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von
Albumin in Flüssigkeiten

Anmelder:

Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Kühl, Patentanwalt,

Hamburg 36, Esplanade 36a

Als Erfinder benannt:

Galen Franklin Collins, Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 13. November 1957

(696 046)

recht zufriedenstellend arbeiten und in den meisten Fällen zuverlässige Ergebnisse liefern, hat sich doch herausgestellt, daß sie in gepufferten alkalischen Lösungen fälschlich die Gegenwart von Albumin anzeigen können. Es wird angenommen, daß die Ursache für diese »falschen positiven Teste« darin zu suchen ist, daß die Alkalität des Harns oder der sonstigen zu untersuchenden Lösung so hoch ist, daß die Menge an Puffer, die man solchen Teststreifen einverleiben kann, nicht ausreicht, um das p_H auf den richtigen Wert einzustellen. Es ist bekannt, daß man einen solchen Harn mit Hilfe einer Säure auf einen p_H-Bereich einstellen kann, innerhalb dessen der in dem Prüfstreifen enthaltene Puffer in der Lage ist, das p_H auf dem erforderlichen Wert zu halten, wodurch falsche positive Ablesungen vermieden werden. Dies ist jedoch nicht praktisch, wenn die Untersuchungen in klinischem Maßstab ausgeführt werden müssen.

Es besteht daher das Bedürfnis nach einem einzigen diagnostischen Mittel in bequemer Streifenform, welches eine ausreichende Pufferwirkung aufweist, um die soeben beschriebenen Fehler auszuschalten, und das eine zuverlässige Anzeige für den Albumingehalt von Harnproben liefert, wenn die Proben auch noch so alkalisch sein mögen. Zweck der Erfindung ist daher die Schaffung eines diagnostischen Mittels, welches einen Indikatorfarbstoff mit einer Affinität für Protein enthält und selbst dann

409 660/336

3 4

noch eine schnelle, einfache und genaue Bestimmung anzeigen von Albumin in alkalischen Prüflösungen

des Albumins in Flüssigkeit ermöglicht, wenn der erwiesen hat und diese Verbindung daher als anioni-

p_H-Wert der Flüssigkeit 9,5 beträgt. sches oberflächenaktives Mittel bevorzugt wird, kann

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß die man für den gleichen Zweck mit zufriedenstellendem oben beschriebene falsche Anzeige von Albumin in 5 Erfolg auch andere anionische oberflächenaktive

alkalischen Flüssigkeiten durch diagnostische Mittel, Mittel verwenden, wie Natriumdecylbenzolsulfonat

die einen Puffer und einen Farbstoff mit Protein- oder Natriumlaurylsulfat.

affinität enthalten, vermieden werden kann, wenn Der in den erfindungsgemäßen Mitteln verwendete man den Mitteln eine geringe Menge eines anioni- Puffer kann etwas abgeändert werden, jedoch ist der sehen oberflächenaktiven Mittels zusetzt. Die Art, in io in der obigen Zusammensetzung (Beispiel 1) angeder das anionische oberflächenaktive Mittel dieses gebene Konzentrationsbereich des Puffers in Gegenüberraschende Ergebnis zustande bringt, ist nicht be- wart des anionischen oberflächenaktiven Mittels gekannt; es wird jedoch angenommen, daß diese Mittel wohnlich zur Einstellung des Indikatorfarbstoffes auf die Wirksamkeit des Puffers infolge ihrer starken die saure Seite des Farbumschlagpunktes von sauer Oberflächenaktivität erhöhen. Es ist zu bemerken, 15 nach basisch zufriedenstellend. Wie in Beispiel 1 andaß kationische und nichtionische oberflächenaktive gegeben, wird ein aus Natriumcitrat-Dihydrat und Mittel diese wichtige Wirkung auf den Test offenbar Citronensäure bestehender Puffer bevorzugt. Vornicht besitzen. zugsweise wendet man das Natriumeitrat und die

Das erfindungsgemäße diagnostische Mittel zur Citronensäure in solchen Mengenverhältnissen zuein-Bestimmung von Albumin in Flüssigkeiten, welches 20 ander an, daß die zum Tränken der Streifen verwenauf einem saugfähigen Träger den Äthylester von dete Lösung einen p,_rWert in dem gewünschten Be-Tetrabromphenolphthalein als Indikator und einen reich auf der sauren Seite des Farbumschlagpunktes Citrapuffer enthält, der den p_H~Wert des Indikators des Farbstoffes von sauer zu basisch besitzt. Bei Anbei Befeuchtung mit der zu untersuchenden Flüssig- wendung gleicher Gewichtsteile an Natriumcitratkeit auf der sauren Seite seines Farbumschlag- 25 Dihydrat und Citronensäure in der Zusammensetzung punktes von sauer nach basisch hält, ist dadurch ge- des Beispiels 1 in einer Menge von etwa 10 bis kennzeichnet, daß es außerdem eine geringe Menge 30 Gewichtsprozent der Imprägnierlösung erhält man eines anionischen oberflächenaktiven Mittels enthält. ein p„ von etwa 3,5. Ein Verhältnis von 1 Teil Na-

Vorzugsweise wird das diagnostische Mittel her- triumcitrat-Dihydrat zu 2,3 Teilen Citronensäure

gestellt, indem man den Farbstoff, den Puffer und das 30 liefert bei einer nach Beispiel 1 hergestellten Lösung

anionische oberflächenaktive Mittel in einem Lösungs- ein p„ von etwa 2,7. Man kann auch mit anderen

mittel oder Lösungsmittelgemisch löst, den aufsaugen- Mengenverhältnissen von Natriumeitrat zu Citronen-

den Träger (z. B. einen Filterpapierstreifen) mit der säure arbeiten, um gepufferte Lösungen von anderen

Lösung tränkt und ihn sodann trocknet. p_H-Werten herzustellen, wie es an sich bekannt ist.

Allgemein können zufriedenstellende diagnostische 35 Der erfindungsgemäße Indikator, nämlich Tetra-Mittel zur Bestimmung von Albumin hergestellt bromphenolphthaleinäthylester, weist einen Farbwerden, indem man geeignete absorbierende Streifen Umschlagspunkt von sauer nach basisch in einem vormit einer Lösung sättigt, die etwa 0,0025 bis teilhaften p,_rBereich von etwa 3,5 bis 4,0 auf.
0,l°/oTetrabromphenolphthaleinäthylester als Indi- Die im Beispiel 1 angegebenen Konzentrationskator, etwa 10 bis 30% Puffer und etwa 0,0025 bis 40 bereiche der Bestandteile definieren praktisch an-0,05 °/o an dem anionischen oberflächenaktiven wendbare Konzentrationen zur Herstellung diagno-Mittel enthält und zum Rest aus einem flüchtigen stischer Mittel, die den Albumingehalt der zu unterLösungsmittel für die Bestandteile besteht, worauf suchenden Flüssigkeiten zuverlässig anzeigen. Die die gesättigten Streifen getrocknet werden. Wie sich Mengenverhältnisse einiger der Bestandteile können aus den angegebenen Mengenverhältnissen ergibt, ist 45 jedoch etwas abgeändert werden, ohne daß die Andas anionische oberflächenaktive Mittel in der erfin- wendbarkeit des Mittels dadurch beeinträchtigt wird, dungsgemäßen Stoffzusammensetzung in Mengen von So kann man weniger Farbstoff verwenden als die im etwa 0,008 bis 0,5 °/o, bezogen auf die Gesamt- Beispiel 1 angegebene geringste Menge; in diesem gewichtsmenge an Feststoffen in der zur Tränkung Falle wird jedoch die Farbe der Stoffzusammenverwendeten Lösung, enthalten. Die allgemeine Zu- 50 setzung entsprechend schwach. Arbeitet man mit sammensetzung der erfindungsgemäßen Imprägnie- größeren Farbstoffmengen, als dem im Beispiel 1 anrungslösung im Rahmen der obigen Definition ist die gegebenen Höchstwert entspricht, so vermindert sich folgende: die Empfindlichkeit des Tests. Arbeitet man mit größeren Mengen an anionischem oberflächenaktivem

Beispiel 1 ₅₅ Mittel, als im Beispiel 1 angegeben ist, so vermindert

Äthylester von Tetrabromphenol- ^sj^ch ebenfalls die Empfindlichkeit des Tests. Verwen-

phthalein 0,0005 bis 0,020 g Jf ¹^³¹¹, genn^re Mengen an oberflächenaktivem

^. , -_T . Mittel, als der im Beispiel 1 angegebenen Mindest-

Dioctylestervon Natrium- _nnnncu. _nm menge entspricht, dann arbeitet das diagnostische

sulfosuccinat 0,0005 bis 0,01 g _{6o Mittd hinsichtlich der Anzei}g_e »falscher positiver

Citratpuffer (Natriumeitrat- Ergebnisse« ebenso unzuverlässig, wie wenn es kein

Dihydrat und Citronensäure) .. 2 bis 6 g oberflächenaktives Mittel enthielte. Daher liegt für

Lösungsmittel die im Beispiel 1 angegebenen Bestandteile der

(Alkohol und Wasser) aufgefüllt auf Mengenanteil an anionischem oberflächenaktivem

etwa 20 ecm 65 Mittel vorzugsweise zwischen etwa 0,025 und 0,05 %, bezogen auf die Gesamtgewichtsmenge der nicht-

Obwohl der Dioctylester von Natriumsulfosuccinat flüchtigen Bestandteile ausschließlich des aufsaugen-

sich als recht wirksam zur Beseitigung von Fehl- den Trägers.

Claims

5 6

Besondere Ausführungsformen der Erfindung sind Umschlag des Farbstoffes in die alkalische Farbe,

in den folgenden Beispielen angegeben: wodurch sich die Anwesenheit von Albumin deutlich

zu erkennen gibt. Der Gehalt des erfindungsgemäßen

Beispiel 2 diagnostischen Mittels an anionischem oberflächen-

Äthylester von Tetrabromphenolphthalein 2,0 mg 5 aktivem Mittel verhindert falsche positive Anzeigen

Dioctylester von Natriumsulfosuccinat ... 6,0mg von Albumin in Flüssigkeiten mit einem p_H-Wert bis

Citratnuffer ' ^u g^ewani"I^eistet "ie Zuverlässigkeit des Tests.

Natriumcitrat-Dihydrat 2,5 g , Weiterhin ermöglicht das anionische oberflächen-

Citronensäure 2 5 tr aktive Mittel die Verwendung von Stoffzusammen-

£ ,,.,,, _1A' ίο Setzungen, die als solche einen höheren p_H-Wert be-

AtnyjaiKonoi ία ecm _{sitzeiij aJs es bisher möglich warj ohne daß dadurch}

^Wasser aufgefüllt auf 20 ecm _{fa]sche poskive} Ergebnisse erzielt werden, wie man

Beispiel 3 ^s^^e normalerweise bei solchen höheren p_H-Werten

.. erhalten würde. Streifen, die aus Lösungen von

Athylester von Tetrabromphenolphthalein 2,0 mg ₁₅ höheren p_H-Werten hergestellt sind, sind beständiger

Dioctylester von Natriumsulfosuccinat ... 2,0 mg _unci daher vorteilhafter. So liefern z. B. Streifen, die

Citratpuffer: aus Lösungen mit einem p_H-Wert von 2,7 hergestellt

Natriumcitrat-Dihydrat 1,5 g sind, nach 2 Tage langer Einwirkung einer relativen

Citronensäure 3,5 g Feuchtigkeit von 100 % bei 82° C keine zufrieden-

Äthylalkohol 10 ecm 20 stellenden Ergebnisse mehr, während Streifen, die

Wasser aufgefüllt auf 20 ecm aus Lösungen mit einem p_H-Wert von 3,5 hergestellt

sind, auch noch nach 6tägiger Einwirkung der gleichen

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen diagno- Bedingungen gute Testergebnisse liefern,
stischen Mittel werden das anionische oberflächenaktive Mittel und der Puffer in einem Teil des 25 Patentansprüche:
Wassers gelöst. Der Farbstoff wird in dem Alkohol

gelöst, und die Lösung wird zu der Lösung des Puf- 1. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von fers und des oberflächenaktiven Mittels hinzugefügt, Albumin in Flüssigkeiten, welches auf einem worauf man mit Wasser auf das gewünschte End- saugfähigen Träger den Äthylester von Tetravolumen auffüllt. Filterpapierstreifen werden in diese 30 bromphenolphthalein als Indikator und einen Lösung eingetaucht und getrocknet. Vorzugsweise Citratpuffer enthält, der den p_H-Wert des Indikaverwendet man ein Filterpapier von mittlerer Stärke tors bei Befeuchtung mit der zu untersuchenden (etwa 0,635 mm). Nach dem Trocknen sind die ge- Flüssigkeit auf der sauren Seite des Farbtränkten Streifen gebrauchsfertig. Umschlagspunktes von sauer nach basisch hält,

Bei der Verwendung wird ein erfindungsgemäß ge- 35 dadurch gekennzeichnet, daß es außertränkter Streifen in die zu untersuchende Flüssig- dem eine, geringe Menge eines anionischen oberkeitsprobe getaucht und schnell herausgenommen, flächenaktiven Mittels enthält,
um die Auslaugung des Puffers und des anionischen 2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, daoberflächenaktiven Mittels zu verhindern. Da in allen durch gekennzeichnet, daß das anionische ober-Fällen der Farbstoff in der trockenen Stoffzusammen- 40 flächenaktive Mittel der Dioctylester von Nasetzung seine saure Farbe aufweist und die Wirkung triumsulfosuccinat, Natriumdecylbenzolsulfonat des Puffers (vermutlich verstärkt durch das anioni- oder Natriumlaurylsulfat ist.
sehe oberflächenaktive Mittel) den p_H-Wert der Stoff- 3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 zusammensetzung auch nach der Befeuchtung mit und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als ander zu untersuchenden Probe auf der sauren Seite des 45 ionisches oberflächenaktives Mittel den Dioctyl-Farbumschlagspunktes von sauer nach basisch hält, ester von Natriumsulfosuccinat in Mengen von verursacht eine negative Probe keine Farbänderung etwa 0,008 bis 0,5%, bezogen auf die Gesamtdes Farbstoffs. Eine albuminhaltige Flüssigkeitsprobe gewichtsmenge der angegebenen Bestandteile, entverursacht jedoch infolge des »Proteinfehlers« einen hält.

409 660/336 9.64 © Bundesdruckerei Berlin