DE1265453B - Zum Nachweis von Blut bestimmtes diagnostisches Mittel - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

GOIn

Deutsche Kl.: 421-3/54

Nummer: 1265 453

Aktenzeichen: M 52734IX b/421

Anmeldetag: 3. Mai 1962

Auslegetag: 4. April 1968

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Blut in Körperflüssigkeiten. Es sind bereits derartige Mittel in trockener, fester Form bekannt, welche ein organisches Peroxyd, einen auf Blut in Gegenwart organischer Peroxyde durch Oxydation unter Farbänderung ansprechenden Indikator und einen Puffer enthalten.

Das Mittel gemäß der Erfindung besteht demgegenüber aus einem mit den genannten Stoffen getränkten saugfähigen Träger in Streifen- oder Stäbchenform und enthält als organisches Peroxyd Cumolhydroperoxyd, Diisopropylbenzolhydroperoxyd, p-Menthanhydroperoxyd oder 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxyd, welches mit Hilfe eines durch ein Dialdehydpolysaccharid fixierten kolloidalen Stoffes eingekapselt ist, sowie einen Puffer, der den pH-Wert der zu untersuchenden Probe im Bereich von 4 bis 7 hält.

Der kolloidale Stoff ist vorzugsweise Gelatine und das Dialdehydpolysaccharid Dialdehydstärke, während als Indikator am besten o-Tolidin verwendet wird.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der katalytischen Wirkung der im Blut vorhandenen prosthetischen Gruppen. Diese katalytisch wirksamen Substanzen, die im Hämoglobin identifiziert sind, gehören zu der allgemeinen Klasse von Hämoproteinen, konjugierten Proteinen, von denen alle die gleichen prosthetischen Gruppen Eisenprotoporphyrin oder Hämin besitzen. Diese prosthetische Gruppe besitzt die Fähigkeit, die Übertragung von Sauerstoff aus einer Sauerstoff quelle zu einem Akzeptor, der seinerseits oxydiert wird, zu katalysieren. Wenn der Akzeptor ein Farbstoffvorläufer ist, der farblos ist, bis er oxydiert wird, und in seiner oxydierten Form farbig ist, dann wird das Vorhandensein der katalytischen Aktivität durch Färbung angezeigt.

Die erfindungsgemäß angewandten Hydroperoxyde besitzen, wenn sie mit den anderen bei der Zubereitung der diagnostischen Zusammensetzung erforderlichen Materialien vermischt sind, geringere Stabilität als erwünscht. Erfindungsgemäß wird daher ein neues Einkapselungsmaterial für die organischen Hydroperoxyde aus Proteinen oder Polysacchariden, wie beispielsweise Gelatine, Algin, Carraghenin, Casein, Albumin oder anderen Materialien dieser Art verwendet. Die Proteine oder Polysaccharide werden durch die Behandlung mit einem Dialdehydpolysaccharid gehärtet.

Das organische Hydroperoxyd wird vorteilhaft mit einem Emulgator, wie beispielsweise Gummiarabikumschleim (acacia mucilage), oder Polyvinylalkohol, Gummiarabikum - Carboxyvinylpolymere vermischt. Auch ein oberflächenaktives Mittel, wie Dioctylna-Zum Nachweis von Blut bestimmtes
diagnostisches Mittel

Anmelder:

Miles Laboratories, Inc.,

Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. K. Th. Hegel, Patentanwalt,

2000 Hamburg 50, Große Bergstr. 223

Als Erfinder benannt:
Ernest C. Adams jun.,
Norman R. Novak, Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 4. Mai 1961 (107 646) - -

triumsulfosuccinat, kann verwendet werden. Die erhaltene Emulsion wird mit Hilfe eines Puffers, beispielsweise eines Gemisches von Natriumeitrat und Zitronensäure, gepuffert. Es kann auch ein Tartrat, Phosphat, Phthalat, Acetat oder ein anderer Puffer verwendet werden. Der bevorzugte Bereich der Wasserstoffionenkonzentration, auf die die Zusammensetzung abgepuffert wird, beträgt von etwa pH 4 bis pH 7. Vorzugsweise wird der Puffer zuerst mit dem sogenannten Umkapselungsmaterial, beispielsweise Gelatine, vor Zugabe zu der Hydroperoxydemulsion vermischt. Dann wird eine wäßrige Dispersion des Dialdehydpolysaccharids als Fixiermittel zugegeben.

Gründliches Vermischen ist bei jeder Zugabe von außerordentlicher Bedeutung. Die Zusammensetzung wird dann auf Papierstreifen oder runde Papierblätter aufgebracht. Die Streifen oder Blätter werden getrocknet. Dann wird ein Indikator, wie beispielsweise o-Tolidin, etwa durch Eintauchen aufgebracht.

Das Dialdehydpolysaccharid kann durch die bekannte Oxydation von Polysacchariden mit Perjodsäure hergestellt werden.

Als Rohstoffe können Mais-, Weizen-, Tapioka- oder Kartoffelstärke, Cellulosen, Dextrane, Alginen, Inulin usw. verwendet werden. Vorzugsweise sollen fünfzig bis hundert der ursprünglichen Anhydroglucosegruppen in Dialdehydgruppen übergeführt sein.

Bei der vorliegenden Erfindung wird das Dialdehydpolysaccharid in Form einer wäßrigen Dispersion von etwa 0,25 bis etwa 1,5 % verwendet.

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Als Indikatoren können außer o-Tolidin auch o-Toluidin, p-Toluidin, o-Phenylendiamin, N,N'-Dimethyl-p-phenylendiamin, Ν,Ν'-Diäthyl-p-phenylendiamin, Benzidin, p-Anisidin, Dianisidin, o-Krisol, m-Kresol, p-Kresol, «-Naphthol, /^-Naphthol, Catechin, Brenzcatechin, Guajacol und Pyrogallol benutzt werden.

Die folgende Tabelle veranschaulicht einige brauchbare Zusammensetzungen:

Emulgator (40 bis 60% Gew./

Vol.) 50 bis 100 ml

Organisches Hydroperoxyd ... 2,5 bis 10 ml Oberflächenaktives Mittel für die

Hydroperoxydemulsion 0 bis 2 ml

Puffer I 25 bis 50 ml

Einkapselungsmaterial 0,7 bis 3,5 g

Dialdehydpolysaccharid

(1% Gew./Vol.) 0,4 bis 3 ml

Oberflächenaktives Mittel für

andere Bestandteile

(5% Gew./Vol.) 3,75 bis 12 ml

Puffer II (3fache Konzentration

von Puffer I) 25 bis 75 ml

Die Herstellung geschieht etwa wie folgt:

Beispiel 1

In einen Mörser wurden 100 ml Gummiarabikumschleim (hergestellt durch Zugabe von 200 g Gummiarabikum zu 500 ml siedendem Wasser) und anschließend 2 ml Dioctylnatriumsulfosuccinat (5% Gew./Vol.) eingebracht. Dann wurden 5 ml Cumolhydroperoxyd zugegeben, und das Gemisch wurde 5 Minuten unter Bildung einer ersten Emulsion verrieben. Als nächstes wurde eine Citratpufferlösung durch Erhitzen von 1500 ml Wasser zum Sieden und Zugabe zu einem Gemisch von 163 g Natriumeitrat und 37 g Citronensäure hergestellt. Der Citratpuffer wurde dann mit 0,7 g Gelatine vermischt, und 50 ml des Puffer-Gelatine-Gemisches wurden zu der ersten Emulsion zugegeben und mit dieser gut vermischt. Als nächstes wurde 1 ml einer l%igen Dispersion von Dialdehydstärke unter gründlichem Vermischen zugesetzt. Anschließend wurde eine 5%ige Lösung von Natriumlaurylsulfat zu dem Gemisch in einer Menge von 12 ml zugesetzt. Die erhaltene Zusammensetzung wurde dann mit Hilfe eines handbetriebenen Homogenisators homogenisiert, und 50 ml einer, wie oben beschrieben, unter Verwendung von 500 ml Wasser, 163 g Natriumeitrat und 37 g Citronensäure hergestellten Pufferlösung wurde unter gutem Vermischen zugesetzt. Die Endemulsion wurde dann auf Papierstreifen durch Eintauchen derselben aufgebracht, und die imprägnierten Papierstreifen wurden in einem Ofen bei 75 bis 80° C 24 Stunden lang getrocknet. Schließlich wurden 320 mg o-Tolidin in 16 ml Chloroform gelöst und auf die getrockneten Papierstreifen durch Eintauchen derselben aufgebracht. Das überschüssige Chloroform wurde von den Streifen durch mildes einigen erfindungsgemäß unter Verwendung eines Dialdehydpolysaccharids als Fixierungsmittel hergestellten Stäbchen durchgeführt. Die so hergestellten Stäbchen wurden unter verschiedenen Bedingungen bezüglich Temperatur und relativer Feuchtigkeit in jedem Falle 7 Tage lang geprüft. Die Vergleichsergebnisse dieser Prüfungen sind in nachfolgender Tabelle gezeigt, in der A sich auf die Stäbchen, in denen kein Fixierungsmittel verwendet wurde, B auf diejenigen, in denen Formaldehyd als Fixierungsmittel verwendet wurde, und C auf diejenigen, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, d. h. auf diejenigen, in denen ein Dialdehydpolysaccharid als Fixierungsmittel verwendet wurde, beziehen.

Tabelle I

Bedingungen	Relative	Ergebnisse
	Feuchtigkeit
Temperatur	70%	alle verfärbt, kein Unter
40°C		schied
	50%	C am wenigsten verfärbt
40° C		und beste Sensitivität,
		B am schlechtesten
	35%	C und A waren wenig ver
40° C		färbt und sensitiver als B
		alle etwas verfärbt, C am
70° C		empfindlich sten
	—	C am meisten sensitiv
60°C	-—	C bestes, B schlechtestes
50° C	—	C bestes, B schlechtestes
40° C	—	C bestes, B schlechtestes
Raum
temperatur

Beispiel 2

In einen 1000-ml-Becher wurden 500 ml Gummiarabikumschleim, der durch Zugabe von 500 ml siedendem Wasser zu 200 g Gummiarabikum hergestellt war, und 25 ml Cumolhydroperoxyd eingebracht. Diese Bestandteile wurden in einem mit einem Propellerrührer versehenen Mischer 5 Minuten bei einer Rheostateinstellung auf 70 bis 80 gemischt. In einem anderen Becher wurden 1500 ml siedendes Wasser zu einem Gemisch von 163 g Natriumeitrat und 37 g Citronensäure zugesetzt. Nach Abkühlen wurden 3,5 g Gelatine in dem Citratpuffer gelöst, und das Gemisch wurde in den den Gummiarabikumschleim und das Cumolhydroperoxyd enthaltenden Becher eingebracht. Als nächstes wurden 5 ml einer l%ig^en (Gew./Vol.) Dispersion von Dialdehydstärke zugegeben. Man ließ die Dialdehydstärke sich mit den anderen Bestandteilen vermischen, gab dann 50 ml Natriumlaurylsulfat zu und setzte das Vermischen 5 Minuten lang bei einer Rheostateinstellung von 60 fort. Die so erhaltene Emulsion wurde durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator 5 Minuten lang bei einem Druck von 140 atü

Erwärmen verdampft. Diese Streifen wurden dann an 60 geführt. Zu dem homogenisierten Gemisch wurden

verschiedenen Urinproben geprüft und zeigten positive Reaktionen bei Proben, die 1 Teil Blut in 30 000 Teilen Urin enthielten.

Um die erhöhte Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Diagnosestäbchen zu zeigen, wurde ein Vergleichsversuch zwischen Stäbchen, in denen kein Fixierungsmittel verwendet wurde, einigen, in denen Formaldehyd als Fixierungsmittel verwendet wurde, und 250 ml Citratpuffer, der zuvor durch Zugabe von 500 ml siedendem Wasser zu einem Gemisch von 163 g Natriumeitrat und 37 g Citronensäure hergestellt war, zugegeben, und das Vermischen wurde fortgesetzt. Die Emulsion wurde dann auf Papierstreifen durch Eintauchen derselben aufgebracht, und die imprägnierten Streifen wurden 16 Stunden in einen Ofen bei 71° C gegeben. Schließlich wurden die Streifen in eine Chloro-

formlösung von o-Tolidin, die durch Auflösen von 1,28 g o-Tolidin in 64 ml Chloroform hergestellt war, eingetaucht, und das überschüssige Chloroform wurde unter Verwendung eines Ofens verdampft. Diese Streifen wurden dann in verschiedenen Urinproben getestet und zeigten sich bei 1 Teil Blut in 25 000 Teilen Urin empfindlich.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Zum Nachweis von Blut bestimmtes diagnostisches Mittel in trockener, fester Form, welches ein organisches Peroxyd, einen auf Blut in Gegenwart des organischen Peroxydes durch Oxydation unter Farbänderung ansprechenden Indikator und einen Puffer enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem mit den genannten Stoffen getränkten saugfähigen Träger in Streifen- oder Stäbchenform besteht und als organisches Peroxyd mit Hilfe eines durch ein Dialdehydpolysaccharid fixierten kolloidalen Stoffes eingekapseltes Cumol- ao hydroperoxyd, Diisopropylbenzolhydroperoxyd, p-Menthanhydroperoxyd oder 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxyd sowie als Puffer einen solchen enthält, der den pH-Wert der zu untersuchenden Probe im Bereich von 4 bis 7 hält.

2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der kolloidale Stoff Gelatine ist.

3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Dialdehydpolysaccharid Dialdehydstärke ist.

4. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Peroxyd Cumolhydroperoxyd ist.

5. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator o-Tolidin ist.

In Betracht gezogene Druckschriften:
USA.-Patentschrift Nr. 2 799 660.

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