DE112009000698T5

DE112009000698T5 - Verfahren und Vorrichtung zur Lokalisation einzelner Farbstoffmoleküle in der Fluoreszenzmikroskopie

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Publication number: DE112009000698T5
Application number: DE112009000698T
Authority: DE
Inventors: Paul Lemmer; Cristoph Cremer; David Orakei Baddeley; Heinz Eipel
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2008-03-19
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2011-01-13
Anticipated expiration: 2029-03-14
Also published as: DE112009005521A5; AU2009226687B2; US20090237501A1; DE112009005521B4; AU2009226687A1; WO2009115108A1; DE112009000698B4; JP2011514532A; JP5325971B2; US8212866B2; WO2009115244A1; DE212009000043U1; AU2009226687A8

Abstract

Verfahren zum Erhalten einer unterhalb einer Auflösungsgrenze liegenden, räumlichen Information einer Probe, welche mit wenigstens einer Art einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die unterhalb der Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information Lokalisierungsinformation über die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt, umfassend die Schritte:
– Erhalten von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie, wobei die Lokalisierungsbilddaten eine Serie von Bildern umfassen, erhalten durch
– Beleuchten einer interessierenden Region der Probe mit einem Beleuchtungslicht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist,
– Detektieren durch einen Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor wenigstens eines Teils des Fluoreszenzlichts, welches durch wenigstens einen Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung bei einer Beleuchtung emittiert wird, wodurch ein Bild der interessierenden Region erhalten wird;
– mehrfaches Wiederholen der Schritte eines Beleuchtens und...

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung (ein Mikroskop bzw. ein mikroskopisches System) und auf ein Verfahren zum Erhalten von unterhalb einer Auflösungsgrenze liegender, räumlicher Information von einem oder mehreren Objekt(en) bzw. Gegenstand (Gegenständen) in einem Bereich von Interesse (bzw. in einer interessierenden Region) einer beobachteten Probe.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Detektion und Lokalisierung von Fluoreszenzmolekülen, welche verwendet werden, um die gemessenen Objekte zu markieren.
Es ist bekannt, daß aufgrund des Wellencharakters des Lichts die Bilder in einer Lichtmikroskopie beugungsbegrenzt sind. Dies manifestiert sich darin, daß punktartige Gegenstände als verwaschene bzw. verschwommene (Airy-)Scheiben in dem Bildraum auf dem Sensor registriert werden. Die Funktion, welche dieses Verschmieren bzw. Verwischen beschreibt, wird als eine Punktspreizfunktion bzw. Punktbildverwaschungsfunktion bzw. Point-Spread-Funktion oder kurz PSF bezeichnet. Wenn der Zusammenhang zwischen der maximalen Auflösung eines Mikroskops und der verwendeten numerischen Apertur des Objektivs (NA) und der Wellenlänge (Lambda): d_min = Lambda/(2 × NA), wie dies durch Ernst Abbe (1873) geoffenbart wurde, berücksichtigt wird, erhält man eine beste Auflösung d_min von etwa 200 nm als die Grenze bzw. das Limit einer natürlichen Auflösung, wenn die besten Objektive und Licht in dem sichtbaren Bereich verwendet werden. Da zahlreiche Prozesse bei einem beträchtlich kleineren Maßstab stattfinden, ist die Überwindung des Abbe-Limits eine der schwierigsten, jedoch der wesentlichsten Anforderungen in der modernen Lichtmikroskopie.
Während Elektronenmikroskopie und andere Ultrastruktur-Abbildungsverfahren basierend auf ionisierender Strahlung den großen Vorteil einer noch nicht dagewesenen Auflösung aufweisen, bietet ”sichtbares” Licht (d. h. Licht innerhalb des Wellenbereichs von nahem Ultraviolett bis nahem Infrarot) andere Vorteile, wie beispielsweise eine Identifikation von verschiedenen Arten bzw. Typen von geeignet markierten Molekülen in einzelnen, dreidimensional intakten Zellen und selbst in lebenden Zellen. Somit ist es sehr nützlich, das Potential von Abbildungsprozeduren mit ionisierender Strahlung für die Untersuchung von biologischen Nanostrukturen mit neuartigen Zugängen zu ergänzen, um eine hohe Auflösung unter Verwendung von Mikroskopie mit sichtbarem Licht durchzuführen. Einige Beispiele von potentiellen Anwendungen davon liegen beim Untersuchen der Nanostruktur von Zellmembranen oder der Genomstruktur des Zellkerns.
Beispielsweise erlaubt Fluoreszenzenergietransfer-(FREI) Mikroskopie beispielsweise Abstandsmessungen zwischen zwei Molekülarten bis zu einem Niveau von einigen Nanometern unter Verwendung von sichtbarem Licht für eine Erregung. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie oder Fluoreszenzrückgewinnung nach einem Photobleichen (FRAP) machen die Analyse von intrazellulären Beweglichkeiten oder gekennzeichneten bzw. markierten Molekülen möglich. Für ein vollständiges Verständnis von funktionalen zellulären Prozessen ist jedoch zusätzliche strukturelle bzw. Strukturinformation notwendig. Um diese und viele andere wichtige Probleme der Zellbiologie und zellulären Biophysik zu lösen, ist eine geeignete räumliche Analyse unverzichtbar. Ein schwieriges Problem beim Erreichen dieses Ziels ist, daß eine konventionelle optische Auflösung mit Licht auf etwa 200 nm lateral und 600 nm axial beschränkt ist, wobei dies bedeutet, daß zelluläre Nanostrukturen nicht adäquat aufgelöst werden können, um eine vollständige funktionale Information zur Verfügung zu stellen.
Verschiedene, vor kurzem eingeführte laseroptische ”Nanoskopie”-Zugänge erlauben, dieses Problem zu überwinden und die räumliche Analyse weit über das ”Abbe/Rayleigh-Limit” einer optischen Auflösung zu erstrecken (wobei hier angenommen wird, in der Objektebene (x, y) etwa einer Hälfte der verwendeten Wellenlänge entsprechend den ursprünglichen Formeln und etwa einer Wellenlänge in der Richtung der optischen Achse (z) zu entsprechen). Insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie war es möglich, vor allem in den letzten zehn Jahren, beständig die erzielbare Auflösung der durch Beugung begrenzten Systeme zu erhöhen.
So wird beispielsweise in dem Konzept einer konfokalen Laserabtast-Fluoreszenz-4Pi-Mikroskopie der Gegenstand bzw. das Objekt durch Laserlicht gescannt bzw. abgetastet, welches von allen Seiten fokussiert ist (”4Pi-Geometrie”) und die erregte Fluoreszenz wird ”punktweise” detektiert. Unter Verwendung von zwei gegenüberliegenden Linsen mit hoher numerischer Apertur, um zwei einander entgegengesetzte Laserstrahlen konstruktiv in einem gemeinsamen Brennpunkt zu konzentrieren, wurde konfokale Laserscan-4Pi-Mikroskopie ein etabliertes ”Nanoskopie”-Verfahren, welches eine axiale optische Auflösung bis zu dem Bereich von 100 nm erlaubt. Dies ist eine Auflösung, welche 5–7 mal besser ist als diejenige, welche durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopieverfahren erhalten bzw. erzielt werden kann.
In vielen Abbildungs- bzw. bildgebenden Anwendungen ist die gewünschte strukturelle Information die Größe von Nanostrukturen, welche voneinander um einen Abstand größer als das Abbe-Limit getrennt sind. Zur Lösung dieses Problems wurde Weitfeldlichtmikroskopie mit räumlich modulierter Beleuchtung (SMI, Spatially Modulated Illumination) als eine der vielen Möglichkeiten für ein Verwenden von strukturierter Beleuchtung entwickelt, um eine räumliche Analyse zu verbessern. SMI Mikroskopie basiert auf der Erzeugung eines Felds einer stehenden Welle von Laserlicht, welches auf verschiedene Arten realisiert werden kann, wie beispielsweise durch ein Fokussieren von kohärentem Licht in die rückwärtigen Brennpunktebenen von zwei einander gegenüberliegenden Objektivlinsen mit hoher numerischer Apertur. Das fluoreszenzmäßig markierte Objekt wird zwischen den zwei Linsen angeordnet und axial in kleinen Schritten (beispielsweise 20 nm oder 40 nm) durch das Feld der stehenden Welle bewegt. Bei jedem Schritt wird die emittierte Fluoreszenz durch eine hochempfindliche CCD-Kamera registriert. Dieses Verfahren erlaubt Messungen eines axialen Durchmessers von individuellen fluoreszierenden Objekten einer Größe unterhalb einer Wellenlänge bis zu einigen zehn Nanometern, und auch die Bestimmung von axialen Abständen zwischen ”punktartigen” fluoreszierenden Objekten (bei lateralen bzw. seitlichen Abständen größer als das Abbe-Limit) bis in den Bereich von einigen zehn Nanometern und mit einer Präzision in dem Bereich von 1 nm. Verschiedene biophysikalische Anwendungsbeispiele zeigen die Nützlichkeit bzw.
Verwendbarkeit von SMI-Mikroskopie für die Untersuchung der Größe von Transkriptionsfabriken und von individuellen Genbereichen bzw. -regionen an.
Die Verwendung eines strukturierten Beleuchtens und einer strukturierten Detektion erhöht die Auflösung von Weitfeld- und konfokalen Methoden um etwa einen Faktor zwei lateral und bis zu einem Faktor von sechs entlang der optischen Achse (axial). Die Verfahren für ein Verbessern der lateralen Auflösung sind oft einfach in bestehende Mikroskope zu integrieren oder neu zu implementieren. Im Gegensatz dazu verwenden die Verfahren für eine maximale Verbesserung der axialen Auflösung überwiegend technisch höchst komplexe optische Pfade bzw. Wege. Für die Analyse von lebenden Systemen sind die lateralen Verfahren, welche oftmals als Weitfeldverfahren angewandt werden, ausreichend schnell. Die überwiegend konfokalen Methoden bzw. Verfahren für eine Verbesserung der axialen Auflösung sind Scan- bzw. Abtasttechniken und sind derart entweder zu langsam oder erfüllen nicht die hohen optischen Anforderungen als derartige Messungen.
Mikroskopie mit stimulierter Emissionsverarmung (Stimulated Emmision Depletion, STED) ist ein Verfahren mit fokussiertem Strahl, in welchem die Größe der erregten Region stark durch eine stimulierte Emissionsverarmung bzw. -depletion reduziert wird. Gegenwärtig erlaubt diese Technik eine optische laterale ((x, y)) Auflösung in dem Bereich von 15–20 nm unter Verwendung von sichtbarem Licht. in Fällen, wo das Blick- bzw. Gesichtsfeld ausreichend klein (in dem Bereich von einigen Nanometern) gemacht werden kann, wurde eine in vivo STED-Mikroskopie innerhalb von einigen zehn Rahmen/Sekunde berichtet.
STED-Mikroskopie kann als ein spezieller Fall von RESOLFT (Mikroskopie mit reversiblem sättigbarem optischem Fluoreszenzübergang) erachtet werden, wo im Prinzip eine optische Auflösung in dem Bereich von einigen Nanometern unter Verwendung von sichtbarem Licht möglich sein sollte.
RESOLFT-Verfahren bieten durch eine Ausnutzung von nicht-linearen Effekten theoretisch eine willkürlich hohe Auflösung hinab bis zu einem Molekülmaßstab. Der Erfolg dieser Verfahren ist jedoch durch die physikalischen Eigenschaften der verwendeten Farbstoffe bzw. Marker oder Label bzw. Markierungen und die optischen Eigenschaften der beobachteten Probe bzw. der Träger- bzw. Objektträgervorbereitung beschränkt. Eine Rekonstruktion eines dreidimensionalen Objekts mußte bisher auf ziemlich komplizierte Verfahren unter Verwendung von strukturierter Beleuchtung zurückgreifen. Mit den gegenwärtig verwendeten Farbstoffen war es möglich, eine laterale und axiale Verbesserung der Auflösung zu erzielen, wobei jedoch derartige Verfahren bis jetzt nicht für ein Abbilden von aktiven Prozessen geeignet waren.
Basierend auf der Erfahrung, daß ”punktartige” fluoreszierende Objekte durch Lichtmikroskopie mit einer Präzision von mehr als einer Größenordnung besser als die durch Beugung begrenzte Auflösung von konventioneller Weitfeldfluoreszenzlichtmikroskopie lokalisiert werden können, wurde die spektrale Präzisionsabstandsmikroskopie (Spectral Precision Distance Microscopy, SPDM) vor etwa einem Jahrzehnt entwickelt.
SPDM ist ein Weitfeldlichtmikroskopieverfahren basierend auf:

a) einem Markieren von benachbarten ”punktartigen” Objekten bzw. Gegenständen mit unterschiedlichen spektralen Signaturen (abgekürzt auch Farben genannt); und
b) einer spektral selektiven Registrierung, um die emittierten Photonen entsprechend ihrer spektralen Signatur ”auszusortieren”; und

c) einem Hochpräzisions-Positionsüberwachen.
Ursprünglich wurden die ”unterschiedlichen spektralen Signaturen” durch unterschiedliche Erregungs/Emissions-Spektren realisiert, wobei jedoch erdacht bzw. entwickelt wurde, auch andere ”Photonsortier”-Moden, wie beispielsweise Fluoreszenzlebenszeiten, Photolumineszenz und stochastische Markierschemata aufzunehmen, um eine photophysikalische Unterscheidung zu erlauben. In Kombination mit Fluoreszenzlebenszeitmessungen wurde die Anwendung des SPDM Konzepts auf eine Nanometerauflösung von einzelnen Molekülen experimentell bestätigt. Insbesondere wurde unter Verwendung von fluoreszierenden Markierungen von unterschiedlichen photostabilen spektralen Signaturen und Verfahren, welche eine in situ Kalibrierung von chromatischen Verschiebungen involvieren bzw. bedingen, eine Auflösung einer lateralen (2D) Position und eines Abstands unterhalb 30 nm, und eine dreidimensionale (3D) Auflösung unterhalb 50 nm in fixierten Zellkernen nach einem spezifischen FISH Markieren von kleinen DNA Targets unter Verwendung eines standardmäßigen konfokalen Laserscanmikroskops erzielt. Somit wurde SPDM erfolgreich angewandt, um die supramolekulare Architektur von Genombereichen bzw. -regionen von intakten 3D konservierten Zellkernen durch Positions- und Abstandsmessungen beträchtlich unterhalb der konventionellen, durch Beugung begrenzten optischen Auflösung von Weitfeldfluoreszenzmikroskopen mit hoher numerischer Apertur zu analysieren. Das SPDM Konzept (auch genannt ”Colokalisierung”) erwies sich als nützlich bzw. verwendbar auch in einer Vielzahl von anderen Anwendungen, beinhaltend einzelne Moleküle.
Während der ersten Anwendungen der ”SPDM” auf eine Beleuchtung bzw. Erhellung von biologischen Nanostrukturen wurden die Objekte mit Fluorochrom-Molekülen markiert, welche unterschiedliche Emissionswellenlängen aufwiesen, und die Signale wurden synchron erhalten bzw. aufgenommen. Fluoreszenz-Emissionsspektren von auswählbaren Molekülen mit typischerweise einer Bandbreite von 50 nm sind relativ breit. Derart sind in einer Fluoreszenzmikroskopie die detektierbaren Wellenlängen auf einen kompletten Bereich von etwa 600 nm beschränkt und nur einige wenige ”Farben” (in dem Sinn einer Abänderung in den Emissionsspektren) können zur selben Zeit innerhalb desselben Objekts verwendet werden.
Seit den ursprünglichen Berichten wurde eine Anzahl von konzeptmäßig in Verbindung stehenden Weitfeldfluoreszenzverfahren vorgeschlagen, beispielsweise BLINKING (wobei dies bedeutet, daß eine Lichtquelle Licht in Pulsen mit einer gegebenen Frequenz, ähnlich einem Leuchtturm emittiert); FPALM (Fluoreszenzphotoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie, fluorescence photoactivation localization microscopy), PALM (photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie, photoactivated localization microscopy), PALMIRR (PALM mit unabhängig laufendem Erhalt, PALM with independently running acquisition); STORM (stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie, stochastic optical reconstruction microscopy).
Als eine allgemeine Bezeichnung können alle diese Zugänge als Verfahren von ”spektral zugewiesener Lokalisierungsmikroskopie” (SALM, Spectrally Assigned Localization Microscopy) erachtet werden, wo die Lokalisierung eines Objekts einer charakteristischen spektralen Signatur zugewiesen wird. Das zugrundeliegende Prinzip dieser ”SPDM/SALM” Zugänge ist die ”optische Isolation” (in einer Domäne von Raum und/oder Zeit) und somit eine unabhängige Lokalisierung von einzelnen bzw. individuellen ”punktartigen” Objekten aufgrund von auf irgendeinem Photon basierenden Merkmalen des emittierten Lichts. Dies bedeutet, daß in einem gegebenen, durch Beugung beschränkten Beobachtungsvolumen, welches beispielsweise durch (x, y, z) volle Breite bei halbem Maximum (FWHM, Full-Width-at-Half-Maxima) der Punktspreizfunktion (PSF) des verwendeten Mikroskopsystems definiert ist, zu einem gegebenen Zeitintervall und für eine gegebene spektrale Registration nur ein derartiges Objekt (beispielsweise ein einzelnes Molekül) oder unter gewissen Bedingungen nur einige wenige Objekte registriert ist bzw. sind bzw. werden.
Durch ein Abbilden von fluoreszierenden Stößen bzw. Bursts von einzelnen Molekülen nach einer Lichtaktivierung könnte die Position der Moleküle mit einer Präzision viel höher als die volle Breite bei halbem Maximum bzw. halber Höhe der Punktspreizfunktion bestimmt werden. Mit anderen Worten basieren diese Mikroskopiezugänge auf der Registration einer Vielzahl (beispielsweise einigen tausend) von Bildern derselben Probe bzw. derselben interessierenden Region, so daß die optische Auflösung durch ein ”Scannen” der vierten Koordinate des Raum-Zeit-Kontinuums verbessert wird.
Die Moleküle und Proteine, welche für PALM und verwandte Techniken verwendet werden, sind fluoreszierende Markierungen bzw. Labels, welche chemisch in einer derartigen Weise (beispielsweise durch ein Hinzufügen von geeigneten Seitengruppen) modifiziert sind bzw. werden, daß sich die meisten der fluoreszierenden Moleküle ursprünglich in einem inaktiven Zustand für die Fluoreszenzerregung bei einer gegebenen Wellenlänge λ_exc befinden. Dieser Zustand (auch eine ”dunkle” spektrale Signatur genannt) kann auf eine fluoreszierende (auch eine ”helle” spektrale Signatur) beispielsweise durch eine Beleuchtung mit Licht einer definierten Wellenlänge λ_phot (beispielsweise in dem nahen Ultraviolett) geändert werden, welche verschieden von derjenigen einer Fluoreszenzerregung ist. Wenn die Aktivierung der fluoreszierenden Marker bzw. Markierungen oder mit anderen Worten der Übergang von einer ”dunklen” spektralen Signatur zu einer ”hellen” spektralen Signatur stochastisch unter Verwendung von geringen Intensitäten durchgeführt wird, werden nur einige wenige Moleküle innerhalb eines Erhalt- bzw. Aufnahmezeitintervalls bzw. einem Erhalt- bzw. Aufnahmezeitrahmen des Detektors aktiviert und es kann somit eine optische Isolation ihrer Signale erzielt bzw. erhalten werden. Aufgrund einer nachfolgenden Beleuchtung mit λ_exc wird das fluoreszierende Signal, welches durch diese optisch isolierten Moleküle (”helle” spektrale Signatur) emittiert wird, dann registriert, bis sie irreversibel gebleicht sind (d. h. bis zu einem irreversiblen Übergang zu einer ”dunklen” spektralen Signatur). Aus diesen fluoreszierenden Signalen kann die Position der einzelnen Moleküle mit hoher Präzision bestimmt werden. Unter guten optischen Bedingungen ist eine Lokalisierungsgenauigkeit in dem Bereich von einigen Nanometern möglich. Eine Wiederholung dieser Prozedur (beispielsweise durch eine Registrierung von etwa 10.000 einzelner Bildrahmen) erlaubt, die Positionen der einzelnen Moleküle zu erhalten, selbst wenn ihre gegenseitigen Abstände weit unterhalb des Abbe/Rayleigh-Limits sind bzw. liegen. Der Photoaktivierungsprozeß bei λ_phot und die Verwendung einer zweiten Laserlinie (λ_exc) können vermieden werden, wenn eine Auto-Aktivierung der Moleküle durch einen Ausleselaser (λ_exc) verwendet wird.
Die Methoden der spektral zugeordneten Lokalisierungsmikroskopie (SALM, Spectrally Assigned Localization Microscopy)/spektralen Präzisionsabstandsmikroskopie (Spectral-Precision-Distance Microscopy (kurz nachfolgend Lokalisierungsmikroskopie genannt) ( DE 10052823.6 , DE 59705009.0-08 , DE 29701663.3 , US 09/331,6444 , DE 19830596.6 , JP 2000502406 , US 09462435 , PCT/EP 02/11343 , WO 2006/127692 A2 , US 20080032414 A1 ) erlauben im Prinzip eine laterale Auflösung in dem Bereich von einstelligen Nanometern. Diese Lokalisierungsmikroskopie wird insbesondere durch die relativ geringen Anforderungen betreffend die erforderlichen optischen und mechanischen Komponenten gekennzeichnet. Auch ist die Einstellung der Vorrichtung sehr benutzerfreundlich. Die Lokalisierungsmikroskopie verwendet für ein Überwinden des Abbe-Limits die Tatsache, daß ein einzelnes fluoreszierendes Objekt nahezu willkürlich präzise lokalisiert werden kann. Wie oben beschrieben, ist die Vorbedingung, daß die durch Beugung begrenzte Scheibe entsprechend dem Fluoreszenzobjekt räumlich isoliert verfügbar ist, d. h. nicht mit anderen Signalen überlappt oder überlagert ist. Die laterale Position des emittierenden Moleküls wird allgemein von dem Zentrum der durch Beugung bzw. Diffraktion begrenzten Fluoreszenzscheibe bestimmt. Die Präzision, mit welcher eine derartige Bestimmung durchgeführt werden kann, hängt von der Anzahl der detektierten Photonen und von dem zugehörigen Signal-Rausch-Verhältnis ab. Obwohl die verwendeten Sensoren typischerweise zweidimensionale Sensor-Arrays bzw. -Felder sind, ist es auch möglich, eine Lokalisierung entlang der dritten Raumrichtung durchzuführen. Eine derartige Lokalisierung erfordert jedoch entweder sehr exakte dreidimensionale Modellfunktionen der Punktspreizfunktion (PSF) in Kombination mit einer großen Anzahl der detektierten Photonen (> 1000) oder eine zusätzliche Kenntnis betreffend die Position des betrachteten Moleküls in dem Objektraum. Ein Erhalten derartiger Resultate ist sehr schwierig unter Verwendung von lediglich Methoden der reinen Lokalisierungsmikroskopie, wie sie beispielsweise in WO 2006/127692 A2 geoffenbart ist. Es ist auch ein Verfahren bekannt, welches einen Astigmatismus ausnützt, um empirisch eine dreidimensionale Punktspreizfunktion zu erzeugen, welche in einen axialen und lateralen Abschnitt bzw. Teil getrennt ist, und diese Funktion an die gesammelten Daten anzupassen bzw. zu fitten. Die durchschnittliche Präzision bzw. Genauigkeit, mit welcher die Lokalisierung durchgeführt werden kann, beträgt etwa 55 nm (23 nm Standardabweichung). Dieser Wert repräsentiert eine Art einer natürlichen Grenze für diese Verfahren aufgrund der typischen Anzahl von detektierten Photonen und der Tatsache, daß die Linsen-PSF ein größeres Verwischen oder Verschmieren in einer axialen Richtung zeigt. Die reine Lokalisierungsmikroskopie mit ihren einzelnen oder mehrfachen zyklischen Einzelpunkt-Rekonstruktionsverfahren ist schlecht geeignet für die Beobachtung von aktiven Prozessen, wie beispielsweise in vivo Messungen von lebenden Zellen. Dementsprechend ist es immer notwendig, einen Kompromiß zwischen einer ausreichenden Anzahl von detektierten Photonen und einer realisierbaren Punktdichte in einem möglichst kleinen Zeitfenster zu finden. Auch setzt die mechanische Stabilität des Mikroskops bei sehr langen Detektionszeiten eine weitere Begrenzung für die Lokalisierungspräzision.
Es ist ein Ziel bzw. Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit welchen die Grenze bzw. das Limit der Lokalisierungspräzision bzw. -genauigkeit der bisher etablierten Lokalisierungsmikroskopie überwunden werden kann, während gleichzeitig der Lokalisierungsprozeß beschleunigt und optimiert wird.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erhalten einer unterhalb einer Auflösungsgrenze liegenden, räumlichen Information einer Probe zur Verfügung gestellt, welche mit wenigstens einer Art einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die, unterhalb der Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information Lokalisierungsinformation über die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt, umfassend die Schritte:

– Erhalten bzw. Erfassen von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie, wobei die Lokalisierungsbilddaten eine Serie von Bildern umfassen, erhalten durch
– Beleuchten einer interessierenden Region der Probe mit einem Beleuchtungslicht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist,
– Detektieren durch einen Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor wenigstens eines Teils des Fluoreszenzlichts (fluoreszierenden Lichts), welches durch wenigstens einen Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung bei einer Beleuchtung emittiert wird, wodurch ein Bild der interessierenden Region (bzw. des Bereichs von Interesse) erhalten wird;
– mehrfaches Wiederholen der Schritte eines Beleuchtens und Detektierens des emittierten Fluoreszenzlichts, wodurch die Serie von Bildern erhalten wird, wobei jedes Bild bei einem unterschiedlichen Zeitschritt aufgenommen wird;
– Bearbeiten der erhaltenen Lokalisierungsbilddaten, um dadurch die Lokalisierungsinformation betreffend die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung zu erhalten, wobei der Schritt eines Ver- bzw. Bearbeitens ein Bestimmen in jedem der detektierten Bilder der Serie der Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilungen von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen der einen oder mehreren fluoreszierenden Markierung(en) in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt.

Insbesondere wird gemäß einem Aspekt bei einer Beleuchtung mit einem Beleuchtungslicht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm₂ bis 1 MW/cm₂ aufweist, wenigstens ein Teil der fluoreszierenden Moleküle von einem ersten Zustand zu einem zweiten Zustand (welcher von dem ersten Zustand verschieden ist) transferiert, wodurch Fluoreszenzlicht emittiert wird.
Der erste Zustand kann ein fluoreszierender Zustand sein. Hier bedeutet ein ”fluoreszierender Zustand” insbesondere eine Konformation bzw. Gestaltung des Moleküls, wo die Absorption von Photonen in der unmittelbaren (Maßstab in dem Nanosekundenbereich) Emission von fluoreszierenden Photonen resultiert.
Der zweite Zustand kann ein semi-stabiler oder ein semi-lang andauernder dunkler (beispielsweise ein nicht-fluoreszierender) Zustand sein. Insbesondere kann der zweite Zustand ein reversibel gebleichter Zustand sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei einer Beleuchtung wenigstens ein Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung von dem ersten Zustand zu dem zweiten Zustand und nach einer Rückkehr zu dem ersten Zustand zu einem dritten, inaktiven Zustand transferiert.
Der dritte Zustand kann ein lang andauernder inaktiver (beispielsweise nicht-fluoreszierender oder dunkler) Zustand sein. Insbesondere kann der dritte Zustand ein irreversibel gebleichter Zustand sein. Die Ausdrücke ”fluoreszierend/nicht-fluoreszierend”, wie sie innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beziehen sich allgemein auf jegliche Zustände, welche spektral unterscheidbar sind. Insbesondere können sich die Ausdrücke ”fluoreszierend/nicht-fluoreszierend” auf unterschiedliche spektrale Bereiche beziehen. Innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck ”lang andauernd” auf ein Zeitintervall in dem Bereich von Minuten bis Stunden und der Ausdruck ”semi-stabil” oder ”semi-lang dauernd” bezieht sich auf den Zustand, welcher eine Stabilität innerhalb eines Intervalls eines Bereichs von einer Millisekunde bis einigen Minuten zeigt.
Die Beleuchtung kann entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Insbesondere kann das Beleuchten des einen Objekts oder der mehreren Objekte in der interessierenden Region mit Beleuchtungslicht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² aufweist, derart sein, daß in einem gegebenen, durch Beugung beschränkten Beobachtungsvolumen und zu einer gegebenen Zeit statistisch nur ein fluoreszierendes Molekül einer gegebenen fluoreszierenden Markierungsart vorhanden ist. Dementsprechend umfaßt jedes der Bilder, welches zu jedem Zeitschritt erhalten bzw. aufgenommen wird, eine Vielzahl von im wesentlichen räumlich getrennten Fluoreszenzsignalen von den einzelnen Fluoreszenzmolekülen der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung. Die Fluoreszenzsignale von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen werden durch den Information aufnehmenden bzw. erhaltenden bzw. erfassenden Sensor allgemein in einer Form von Fluoreszenzemissionsverteilungen detektiert. Zusätzlich erlaubt der verwendete Intensitätsbereich eine effiziente Zeitseperation bzw. -trennung der einzelnen fluoreszierenden Signale von den fluoreszierenden Molekülen.
Aus der erhaltenen Information betreffend die räumliche Position des Schwerpunkts der Fluoreszenzemission der einzelnen fluoreszierenden Moleküle der einen oder mehreren fluoreszierenden Markierung(en) kann Information betreffend die räumliche Position von einem oder mehreren fluoreszierten markierten Objekt(en) innerhalb der Probe und/oder die Größe des einen oder mehreren Objekts (Objekte); und/oder die Abstände zwischen den Objekten in wenigstens einer räumlichen Richtung erhalten werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Zugang zum Erhalten einer Auflösung höher als die durch Beugung begrenzte Auflösung (nachfolgend unterhalb der Auflösungsgrenze) durch Verwendung von Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie vorgeschlagen. Der Ausdruck fluoreszierende ”Lokalisierungsmikroskopie”, welcher verwendet wird, soll insbesondere eine spektrale Präzisionsabstandsmikroskopie/spektrale Positionsbestimmungsmikroskopie (SPDM) oder zugehörige mikroskopische Techniken, wie beispielsweise spektral zugeordnete Lokalisierungsmikroskopie (SALM) umfassen.
Der Intensitätsbereich von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² wurde üblicherweise als ungeeignet für ein Durchführen von Messungen mit Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie erachtet. Insbesondere wurde von dem Intensitätsbereich von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² angenommen, daß er nur Nachteile sowohl für die Weitfeldmikroskopie als auch für die konfokale Mikroskopie mit sich bringt. Es wurde somit angenommen, daß in der Weitfeldmikroskopie das Erhöhen der Intensität ein beträchtlich rascheres Bleichen der Probe bei keinerlei Vorteilen für die erzielbare Auflösung bewirkt. In der konfokalen Mikroskopie wurde angenommen, daß eine zusätzliche Intensität erforderlich ist, um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung bricht mit diesem konventionellen Gedanken und schlägt die Verwendung von Beleuchtungslicht hoher Intensität für den Zweck einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie vor. Insbesondere wurde in nicht erwarteter Weise entdeckt, daß die Verwendung von Beleuchtungslicht hoher Intensität in dem Bereich von 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² das Erhalten einer besseren bzw. effizienteren ”optischen Isolation” (sowohl räumlich als auch zeitlich) der Signale von den fluoreszierenden Molekülen erlaubt.
Die Verwendung von Lokalisierungsmikroskopie, wobei sich die Intensität des Beleuchtungslichts in dem vorgeschlagenen Intensitätsbereich befindet, erlaubt darüber hinaus die Verwendung von konventionellen, nicht genetisch modifizierten Proteinen und anderen, nicht auf Proteinen basierenden fluoreszierenden Markierungen für Messungen unterhalb der Auflösungsgrenze.
Zusätzlich wird es möglich, Lokalisierungsmikroskopiemessungen effizient mit anderen Entfernt- oder Weitfeldmessungen zu kombinieren, um zusätzliche räumliche Information, insbesondere zusätzliche räumliche Information in der Richtung normal auf die durch Lokalisierungsmikroskopie beobachtete Objektebene zu erhalten. Dies kann zu einer Erhöhung der axialen Auflösung im Vergleich mit konventionellen Methoden um einen Faktor von etwa 30 führen.
Ein weiterer Vorteil ist, daß die Detektion bzw. Sammlung von Daten relativ rasch, beispielsweise innerhalb von weniger als fünf Minuten durchgeführt werden kann, wobei dies einen Unterschied von bis zu zwei Größenordnungen im Vergleich mit alternativen Methoden darstellt, welche bis zu einigen Stunden erfordern. Dies ist insbesondere vorteilhaft für in vivo Beobachtungen in lebenden Systemen. Es ist somit möglich, anspruchsvolle und komplizierte technische Lösungen zu vermeiden, welche Driftproblemen begegnen oder diese mildern bzw. abschwächen können, oder eine Aufrechterhaltung eines lebenden Zustands der betrachteten Proben zur Verfügung stellen. Im Gegensatz dazu ist es mit dem vorgeschlagenen Verfahren möglich, eine sinnvolle in vivo Beobachtung auch an den kleinsten Strukturen auszuführen.
Unter dem Ausdruck ”Fluoreszenz” innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung soll jegliche Photon-Interaktion verstanden werden, wobei es Unterschiede zwischen dem Beleuchtungs- bzw. Erregungsspektrum und dem Emissionsspektrum desselben Objekts bzw. Gegenstands gibt, welche nicht lediglich basierend auf der monochromatischen Absorption erklärt werden können. Dies beinhaltet beispielsweise insbesondere Multiphoton-Interaktionen, durch welche die Erregungswellenlängen größer als die Emissionswellenlängen sein können. Somit wird der Ausdruck Fluoreszenz in dem Sinn dieser Anmeldung auch für die eng benachbarten bzw. zugehörigen Phänomene wie ”Lumineszenz” und ”Photophosphoreszenz” oder kurz ”Phosphoreszenz” verwendet werden. Dies beinhaltet insbesondere die Fälle einer längeren Fluoreszenzdauer, beispielsweise in dem Millisekundenbereich. Die Verwendung von phosphoreszierenden optischen Markierungen bzw. die Verwendung von phosphoreszierenden Molekülen für ein optisches Markieren anstelle von fluoreszierenden Molekülen kann beispielsweise vorteilhaft im Hinblick auf ein Verbessern der in vivo Anwendbarkeit des vorgeschlagenen neuen Verfahrens sein, da diese Moleküle eine Lokalisierung über eine längere Zeitperiode erlauben.
Unter dem Ausdruck ”Fluoreszenzmolekül” innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung soll jegliches ”punktweise” bzw. ”punktartige” fluoreszierende Element verstanden werden, das heißt jegliches fluoreszierende Element, welches eine Größe beträchtlich kleiner als die Wellenlänge der verwendeten Beleuchtung bzw. des Erregungslichts aufweist, welches für ein Markieren der gemessenen Proben geeignet ist.
Der Ausdruck ”unterschiedliche Arten von fluoreszierenden Markierungen” bezieht sich auf fluoreszierende Markierungen bzw. Labels, welche unterschiedliche spektrale Signaturen aufweisen. In diesem Kontext bedeutet ”spektrale Signatur” jegliche photophysikalische Eigenschaft, wie beispielsweise ein fluoreszierendes Spektrum, Absorption, Lebensdauer, etc., welches für eine optisch diskriminierte Registrierung verwendet werden kann.
Der teilweise zyklische Prozeßverlauf in der Lokalisierungsmikroskopie kann wie folgt beschrieben werden:
Es wurde überraschender Weise herausgefunden, daß durch ein Beleuchten fluoreszierend bzw. fluoreszenzmäßig markierter Proben mit Beleuchtungslicht, welches eine Intensität innerhalb des Intervalls von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² aufweist, die fluoreszierenden Moleküle von nahezu jeglichen konventionellen fluoreszierenden Molekülen (beinhaltend organische Fluorophore) zu einem fluoreszierenden Zustand und von diesem rasch zu einem semi-stabilen dunklen (nicht fluoreszierenden) Zustand transferiert werden.
Es wurde darüber hinaus überraschender Weise herausgefunden, daß von diesem semi-stabilen Zustand ein Teil der Farbstoffmoleküle, welche für das Markieren verwendet werden, aktiviert und wiederum zu einem fluoreszierenden Zustand transferiert wird. Die fluoreszierenden Moleküle sind bzw. werden dabei statistisch bzw. stochastisch aktiviert, so daß eine Dichte der aktivierten Moleküle geringer als ein Molekül pro durch eine Beugung begrenztes Detektionsvolumen ist. Dieses Volumen kann gut mit der Hilfe der effektiven Punktspreizfunktion dahingehend beschrieben werden, daß man beispielsweise alle Punkte mit einer Intensität höher als beispielsweise der Hälfte der maximalen Intensität der Punktspreizfunktion als zu dem Volumen gehörig zählt. Nach dem Aktivieren werden ein Erhalten des Signals mit der Hilfe eines Sensors und nachfolgend das Deaktivieren der aktiven Moleküle mit Hilfe eines Bleichens und Transferierens zu einem lang andauernden inaktiven Zustand durchgeführt.
Für die Zwecke einer Messung unterhalb der Auflösungsgrenze können sowohl der Transfer von dem fluoreszierenden Zustand zu einem semi-stabilen Zustand (beispielsweise einem reversibel gebleichten Zustand) und der Transfer von dem fluoreszierenden Zustand zu einem semi-stabilen Zustand und nach einer Erholung bzw. Rückführung zu dem fluoreszierenden Zustand zu einem anderen, lang andauernden inaktiven Zustand in vorteilhafter Weise verwendet werden. Die erste Technik (Transfer bzw. Übergang von einem fluoreszierenden Zustand zu einem reversibel gebleichten Zustand) kann Vorteile aufweisen, wenn fluoreszierende Farbstoffe oder Markierungen, welche entweder nicht ein Bleichen zeigen oder ein geringes Niveau eines Bleichens zeigen, verwendet werden. Derartige fluoreszierende Farbstoffe oder Markierungen werden oft bei einem Materialtesten verwendet oder wenn Quantenpunkte bzw. -dots verwendet werden. Der Effekt eines Schaltens bzw. Umschaltens zwischen einem fluoreszierenden Zustand und einem reversibel gebleichten Zustand wurde auch in der fluoreszierenden Markierung ALexa 488 beobachtet. Darüber hinaus kann die erste Technik verwendet werden, um wiederholt ein einzelnes Molekül zu detektieren (ähnlich den STORM und dSTORM Techniken).
Der oben beschriebene Schritt einer Bilddetektion bzw. eines Bilderhalts wird mehrere Male wiederholt und der erhaltene Satz oder Stapel von Daten, welche zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen werden (sogenannte Zeitstapel) wird mit Hilfe eines computerimplementierten Rekonstruktionsprozesses rekonstruiert. Für diesen Zweck kann eine Segmentation bzw. Unterteilung der Daten ursprünglich bzw. einleitend durchgeführt werden, um alle Moleküle zu identifizieren. In einem weiteren Schritt kann ein Fitten bzw. Anpassen der verwendeten zweidimensionalen oder dreidimensionalen Modellfunktionen für die Punktspreizfunktion an die identifizierten Signale durchgeführt werden. Die hohe Intensität einer Beleuchtung erlaubt die Detektion der aktiven Moleküle und ihre nachfolgende Deaktivierung innerhalb einer sehr kurzen Zeitperiode. Dies stellt sicher, daß die von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen erhaltenen Signale temporär bzw. zeitmäßig getrennt sind bzw. werden.
Die erhaltenen Lokalisierungsbilddaten umfassen somit eine Serie von Bildern der interessierenden Region, welche zu unterschiedlichen Zeitschritten aufgenommen werden, wobei jedes Bild die detektierten und im wesentlichen räumlich isolierten fluoreszierenden Signale von den erregten fluoreszierenden Molekülen umfaßt. Wenn der verwendete, die Information aufnehmende bzw. erfassende Sensor ein zweidimensionaler Sensor (beispielsweise ein CCD Chip oder ein anderer geeigneter zweidimensionaler Sensor bzw. ein Sensorarray) ist, sind die erhaltenen Bilder zweidimensionale Bilder der interessierenden Region. Demgemäß kann eine räumliche Information in zwei Dimensionen erhalten werden. In einem ersten Aspekt sind die erhaltenen Bilder in einer Objektebene, d. h. in einer (x, y) Ebene im wesentlichen parallel zu der optischen Achse des verwendeten Lokalisierungsmikroskops, wobei x und y kartesische Koordinaten in der Objektebene sind.
In Abhängigkeit von der Lebensdauer des semi-stabilen Zustands kann bzw. können die Integrationszeit des bildaufnehmenden Sensors und/oder die Intensität des Beleuchtungslichts eingestellt werden, um eine optimale zeitmäßige Trennung der fluoreszierenden Signale zu erhalten. Andererseits ist es in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit einer Bildaufnahme bzw. Integrationszeit des Information aufnehmenden bzw. erfassenden Sensors möglich, effizient halb- bzw. semi-stabile dunkle Zustände innerhalb einer Stabilitätsperiode von einem Bereich von Millisekunden bis zu einem Bereich von Sekunden und Minuten für die optische Isolierung von Fluoreszenzsignalen bei der Beleuchtung mit Licht hoher Intensität zu verwenden.
Es ist auch allgemein möglich, das Verfahren auf Perioden länger als Perioden in dem Minutenbereich zu erstrecken. In diesem Fall kann es notwendig sein, weitere Techniken zu verwenden, um die räumliche Stabilität der fluoreszierenden Moleküle sicherzustellen, welche für ein Markieren verwendet werden.
Die erhaltene Zeitserie von (zweidimensionalen) Bildern kann in einer geeigneten (dreidimensionalen) Datenstruktur gespeichert und einem weiteren Be- bzw. Verarbeiten unterworfen werden, um eine Lokalisierungsinformation über bzw. betreffend die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung, gewöhnlicherweise in wenigstens zwei orthogonalen räumlichen Richtungen zu erhalten. Insbesondere durch ein Bestimmen des Schwerpunkts, d. h. des Schwerkraftzentrums der Fluoreszenzemission der einzelnen fluoreszierenden Moleküle in jedem der erhaltenen zweidimensionalen Bilder der Serie kann Lokalisierungsinformation über bzw. betreffend die räumlichen Positionen der einzelnen fluoreszierenden Moleküle der verwendeten einen oder mehreren fluoreszierenden Markierung(en) (nachfolgend auch Fluorophore genannt) in wenigstens einer räumlichen Richtung, üblicherweise wenigstens in der Objektebene erhalten werden. Unterschiedliche, computerimplementierte Verfahren, wie beispielsweise ein Fitten bzw. Anpassen mit einer geeigneten Modellfunktion, können zu diesem Zweck verwendet werden.
Nach einer Registrierung der Positionen der fluoreszierenden Moleküle durch die gesamte Lokalisierungsbild-Zeitserie können alle detektierten Punkte bzw. alle detektierten Positionen der einzelnen fluoreszierenden Moleküle einem ”zusammengefaßten” Bild, insbesondere einem ”zusammengefaßten” zweidimensionalen Bild zugeordnet werden, welches Information über die räumliche Position und/oder Abstände zwischen dem einen oder den mehreren fluoreszierenden Molekül(en) der verwendeten fluoreszierenden Markierung (nachfolgend auch Fluorophor genannt) in der interessierenden Region und insbesondere in der Objektebene umfaßt.
Aus der Lokalisierungsinformation über die räumliche Position der einzelnen fluoreszierenden Moleküle, welche verwendet werden, um das eine oder die mehreren Objekt(e) zu markieren, kann bzw. können eines oder mehrere der räumlichen Position des einen oder der mehreren fluoreszenzmäßig markierten Objekts (Objekte); und/oder ihrer Größe bzw. Erstreckung in wenigstens einer räumlichen Richtung; und/oder der Abstände zwischen den fluoreszenzmäßig markierten Objekten; und/oder einer anderen räumlichen oder topographischen Information mit sehr hoher Präzision ermittelt bzw. bestimmt werden.
Gemäß einem ersten Aspekt ist der erste Zustand ein fluoreszierender Zustand (ein aktiver Zustand), ist der zweite Zustand ein reversibel gebleichter Zustand und ist der dritte Zustand ein irreversibel gebleichter Zustand.
Somit wird die erforderliche optische Isolation der fluoreszierenden Signale durch ein Verwenden eines reversiblen Photobleicheffekts (auch als ”Blinken” bzw. ”Blinking” oder ”Flackern” bezeichnet) erhalten. Im Gegensatz zu dem üblichen Bleicheffekt, welcher in PALM oder FPALM verwendet wird, wo die Struktur der fluoreszierenden Moleküle irreversibel in Richtung zu dem Zustand der nicht fluoreszierenden ”dunklen” spektralen Signatur (bei gegebenen Erregungsbedingungen) modifiziert wird, ist der durch einen Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendete Effekt ein reversibler.
Insbesondere wurde überraschender Weise herausgefunden, daß eine große Mehrzahl der konventionellen fluoreszierenden Markierungen (beinhaltend Proteine oder nicht-proteinartige Moleküle) einen reversibel gebleichten Zustand zeigen, wenn sie mit Licht mit einer Intensität in dem Bereich von 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² beleuchtet werden. Der übliche fluoreszierende Zustand ändert sich nach typischerweise einigen tausend Emissionszyklen in einen irreversibel gebleichten Zustand, welcher nicht länger für die charakteristische Erregung verfügbar ist. Zusätzlich wird jedoch ein zusätzlicher Reaktionskanal, welcher zu einem reversibel gebleichten Zustand für bzw. an den fluoreszierenden Markierungen bzw. fluoreszierenden Molekülen führt, verfügbar. Die automatische Erholung bzw. Rückkehr von diesem Zustand tritt typischerweise bei Zeitskalen in dem Bereich von Millisekunden bis Minuten auf. Sowohl die Wahrscheinlichkeit einer Änderung bzw. eines Übergangs in diesen speziellen Zustand als auch die Wahrscheinlichkeit einer Regeneration von diesem speziellen Zustand können stark mittels einer Beleuchtung mit einem geeigneten Licht und/oder einer Änderung in der chemischen Umgebung (beispielsweise pH-Wert) beeinflußt bzw. geregelt bzw. gesteuert werden. Entsprechend einem Aspekt der Erfindung wird der Übergang zwischen den drei unterschiedlichen Zuständen – reversibel gebleichter, fluoreszierender und irreversibel gebleichter Zustand – für die Zwecke einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie verwendet. Gemäß einem anderen Aspekt wird der Übergang zwischen zwei Zuständen – einem fluoreszierenden Zustand und einem reversibel gebleichten Zustand für die Zwecke einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie verwendet.
Für eine effiziente Ausführung kann die Übergangswahrscheinlichkeit für ein reversibles Bleichen derart manipuliert bzw. gesteuert bzw. geregelt werden, daß dieser Übergang beträchtlich wahrscheinlicher als der Übergang in einen irreversibel gebleichten Zustand wird. Das Objekt verliert seine Fluoreszenz (Übergang in einen vergleichsweise sehr langlebigen reversiblen gebleichten Zustand) und ein geringer Hintergrund wird erhalten. Die Moleküle, welche von dem reversiblen gebleichten Zustand stammen, werden bei einer geeignet eingestellten (typischerweise hohen) Laserintensität ausgelesen und in einen irreversiblen gebleichten Zustand umgewandelt bzw. transformiert. Dies stellt sicher, daß innerhalb eines Integrationszeitrahmens bzw. Zeitfensters des Information erhaltenden bzw. aufnehmenden bzw. erfassenden Sensors (üblicherweise ein CCD-Chip bzw. eine Kamera) die kritische Moleküldichte von einem Molekül pro durch Beugung beschränktes Volumen nicht überschritten wird. Auf diese Weise kann eine Zeit bzw. zeitmäßige Auftrennung der einzelnen Signale erhalten werden, welche ein effizientes Anwenden der Verfahren der Lokalisierungsmikroskopie erlaubt.
Das Verfahren kann darüber hinaus einen Schritt eines Markierens des einen oder der mehreren Objekts (Objekte) umfassen, so daß die Wahrscheinlichkeit eines Übergangs in einen reversibel gebleichten Zustand höher als die Wahrscheinlichkeit des Übergangs in einen irreversibel gebleichten Zustand ist. Die Wahrscheinlichkeit des Übergangs in einen reversibel gebleichten Zustand kann beispielsweise durch den pH-Wert der Umgebung beeinflußt werden. Dementsprechend kann das Markieren des einen oder der mehreren Objekts (Objekte) ein Regeln bzw. Steuern des pH-Werts der Umgebung umfassen.
Ein möglicher Weg, um die Zustände eines fluoreszierenden Moleküls bei der Existenz eines reversiblen Bleichens zu beschreiben, ist der folgende:
Die funktionale Verbindung zwischen den drei fundamentalen Zuständen eines Moleküls kann beschrieben werden durch einen Übergang
wobei:

Mrbl: der reversibel gebleichte Zustand ist,
Mfl: der fluoreszierende Zustand ist,
Mibl: der irreversibel gebleichte Zustand des Moleküls ist.

Die Ratenkonstanten der kreuzenden Prozesse werden mit k_i (i = 1, 2, 3) bezeichnet, wobei bei den Prozessen angenommen wird, daß sie Reaktionen erster Ordnung sind. Das Verhältnis zwischen den Wahrscheinlichkeiten für das reversible und irreversible Bleichen
kann signifikant durch physiko-chemikalische Modifikationen des Moleküls aufgrund seiner Umgebung und/oder aufgrund des Beleuchtungslichts mit geeigneter Wellenlänge (”physiko-chemisch modifizierte Fluorophore”) beeinflußt werden.
Nach einem Starten eines Beleuchtens von fluoreszierenden Molekülen (M_fl) mit Erregungslicht wird eine gewisse Menge (abhängig von P_rbl) unmittelbar gebleicht
Eine andere Menge wird in einen reversiblen dunklen
Zustand
transferiert. Der Übergang zwischen dem fluoreszierenden Zustand und dem reversibel gebleichten Zustand bei einer Beleuchtung mit Licht, welches eine hohe Intensität aufweist, kann verwendet werden, um eine optische Isolierung in Messungen unterhalb der Auflösungsgrenze zu erzielen.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben daran gedacht bzw. zielten darauf ab, daß zusätzlich dazu die statistische Erholung bzw. Rückführung von fluoreszierenden Molekülen (”helle spektrale Signatur”) von dem reversibel gebleichten Zustand (M_rbl) und ein Übergang in einen irreversibel gebleichten Zustand einer ”dunklen” spektralen Signatur (M_ibl) mit einer Verzögerungszeit ausreichend für eine Registrierung eines einzelnen fluoreszierenden Moleküls eine zusätzliche Möglichkeit für eine optische Isolierung von einzelnen Molekülen in der Zeitdomäne erlauben würden. Dies bietet einen neuen Zugang zu einer SPDM/SALM Detektion hoher Auflösung der Anzahl und Position von fluoreszierenden Molekülen (selbst des gleichen Typs) innerhalb eines gegebenen Beobachtungsvolumens.
Um eine effiziente Lokalisierung unterhalb der Auflösungsgrenze zu realisieren, muß die Bedingung zur Verfügung gestellt werden, daß innerhalb der Integrationszeit des Detektors die Dichte von Molekülen mit einer ”hellen” spektralen Signatur (M_fl) nicht höher als statistisch ein fluoreszierendes Molekül pro durch Beugung begrenztes Beobachtungsvolumen ist. Zusätzlich ist es wünschenswert, schnelle Erholungs- und Bleichraten zu realisieren, da eine Aufnahmezeit ein sehr kritischer Faktor in einer Lokalisierungsmikroskopie aufgrund der bis zu einigen tausend von einzelnen Bildrahmen ist, welche für ein hochauflösendes SPDM/SALM Bild einer großen Anzahl von Molekülen erforderlich sein können. Zu diesem Zweck beschleunigt das Licht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² (Intensitätsbereich, welcher nicht vorher verwendet wurde bzw. in der Fluoreszenzmikroskopie vermieden wurde) aufweist, die Auslese- und Bleichzeit.
Die eine oder mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) kann bzw. können aus einer oder mehreren der folgenden Gruppen ausgewählt werden:

– grün fluoreszierendes Protein (GFP) und seine Derivate und/oder Modifikationen, beispielsweise grün fluoreszierendes Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), zyan fluoreszierendes Protein (CFP), orange fluoreszierendes Protein (OFP), verstärkt grün fluoreszierendes Protein (eGFP), modifiziertes GFP (emGFP), verstärkt gelb fluoreszierendes Protein (eYFP);
– monomeres rot fluoreszierendes Protein (mRFP) und seine Derivate und/oder Modifikationen, beispielsweise mCherry; und/oder
– Rhodamin Derivate, beispielsweise Alexa- und/oder Atto-Farbstoffe; und/oder
– Cumarin Derivate; und/oder
– Xanthen Derivate, beispielsweise Fluorescein; und/oder
– Cyanin Derivate.

Insbesondere kann bzw. können die eine oder mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) fluoreszierende Proteine und ihre Derivate, beispielsweise zyan fluoreszierendes Protein (CFP), grün fluoreszierendes Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), erweitert bzw. verstärkt orange fluoreszierendes Protein (OFP), verstärkt grün fluoreszierendes Protein (eGFP), modifiziert grün fluoreszierendes Protein (emGFP), verstärkt gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) und/oder monomeres rot fluoreszierendes Protein (mRFP) und ihre Derivate und/oder Modifikationen bzw. Derivate, beispielsweise mCherry umfassen.
Ein wichtiger weiterer Faktor, welcher die Präzision der Lokalisierungsmikroskopie beeinflußt, sind die verwendeten fluoreszierenden Markierungen selbst. Während fluoreszierende Proteine mit dem Protein coexprimiert sind bzw. werden, welches zu beobachten ist, und somit direkt an der Struktur anhaften, müssen alle anderen fluoreszierenden Moleküle an die Struktur über die spezifischen koppelnden Moleküle (beispielsweise Antikörper oder Antigene) oder andere chemische Verfahren oder Prozesse gekoppelt oder gebunden werden. Dieses Koppeln bzw. Binden über üblicherweise größere Distanzen beschränkt oft beträchtlich die erzielbare Lokalisierungspräzision, da die relative Position des Moleküls, welches das Signal emittiert, relativ zu der zu beobachtenden Struktur mit einigem Verwischen oder einiger Ungenauigkeit behaftet ist. Zusätzlich kann das nicht-spezifische Binden signifikante Probleme bewirken, da das Binden an der gewünschten Region einfach wahrscheinlicher als an irgendeiner anderen Position ist. Um ein ausreichend starkes Signal zu erhalten, können bzw. müssen signifikant mehr fluoreszierende Moleküle als tatsächlich erforderlich in die zu beobachtende bzw. zu untersuchende Probe eingebracht werden. Wenn sich die zu beobachtenden Objekte auf innere Strukturen – beispielsweise innerhalb der Zellen – beziehen, bewirkt dies einen ziemlich starken Hintergrund, welcher gehandhabt bzw. berücksichtigt werden muß. Dieses Problem zu überwinden, ist eines der wesentlichsten Ziele der Lokalisierungsmikroskopie.
Um die besten Resultate zu erhalten, können fluoreszierende Proteine oder andere strukturmäßig nahe bzw. verwandte Moleküle als Markierungen verwendet werden. Neue, genetisch modifizierte Proteine, welche nicht eine Fluoreszenz in einem Grundzustand zeigen, können beispielsweise erfolgreich photochemisch aktiviert und lokalisiert werden, so daß eine punktweise Rekonstruktion der markierten Struktur möglich wird. Diese speziell modifizierten Proteine müssen in den Organismus bzw. in das zu untersuchende bzw. zu überwachende Objekt über molekulare genetische bzw. Gentechniken eingebracht werden, welches insbesondere in dem Fall von eukaryotischen Zellen ein mühsamer, teurer und komplizierter Prozeß sein kann.
Andererseits waren konventionelle fluoreszierende Proteine, welche nicht genetisch modifiziert wurden, seit den sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt. Derartige Proteine wurden erfolgreich und vielfach verwendet und sind oft kommerziell in stabil exprimierten Zellinien erhältlich. Eine Verwendung derartiger fluoreszierender Eigenschaften für eine Lokalisierungsmikroskopie war jedoch bis jetzt nicht denkbar.
Überraschender Weise erlaubt die Verwendung des Beleuchtungslichts mit einer Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² die Verwendung von konventionellen, nicht-genetisch modifizierten fluoreszierenden Markierungen (beispielsweise fluoreszierenden Proteinen und ihren Derivaten, wie beispielsweise CFP, GFP, YFP), eYFP, mRFP, etc.) als fluoreszierende Markierungen für die Zwecke einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie unter der Auflösungsgrenze.
Derartige fluoreszierende Markierungen sind zu einem reversiblen Photobleichen fähig, wenn sie mit Beleuchtungslicht beleuchtet werden, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist.
Insbesondere wurde herausgefunden, daß, wenn mit Beleuchtungslicht beleuchtet, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist, konventionelle fluoreszierende Markierungen bzw. Farbstoffe (wie beispielsweise konventionelle fluoreszierende Proteine) den Effekt eines reversiblen Photobleichens zeigen, welches gemäß einem Aspekt in der Lokalisierungsmikroskopie verwendet werden kann. Wie oben bereits angedeutet, ist der Effekt pH abhängig und tritt auf einer Zeitskala von 10 bis 100 s auf, wobei dies unter Laserbeleuchtung bzw. -exponierung modifiziert werden kann.
Mit der Hilfe der verwendeten Beleuchtung mit einer Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² wird die Verwendung von konventionellen fluoreszierenden Farbstoffen und insbesondere von konventionellen fluoreszierenden Proteinen in gleicher Weise möglich wie die optimierte Aktivierung ihrer speziell modifizierten Angehörigen bzw. Verwandten. Somit können auch etablierte stabile Markierungen und Tausende von wertvollen Objektträgerpreparationen oder Proben in einem Nanometerbereich mit der Hilfe des Verfahrens gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Darüber hinaus können neue Fluoreszenzmarker, wie beispielsweise die sogenannten ”Smart-Probes” für das oben beschriebene Verfahren verwendet werden. Diese Marker sind nur aktiv, wenn sie an die bezeichnete bzw. bestimmte Struktur gebunden sind und somit ihre Konformation bzw. Ausbildung bzw. ihren Aufbau geändert haben. Alle der verbleibenden, nicht gebundenen und nicht weggewaschenen Moleküle verbleiben somit unsichtbar sowohl für die angewandte Weitfeldtechnik als auch für die Lokalisierungsmikroskopie. Der Hauptvorteil ist somit, daß ein störender Hintergrund, welcher in den konventionellen Verfahren existiert, im wesentlichen eliminiert werden kann. Darüber hinaus können exklusiv bzw. ausschließlich die Zellstrukturen rekonstruiert werden.
In einem Aspekt kann bzw. können die eine oder mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) beispielsweise Atto-Farbstoffe für Nicht-Proteine umfassen.
In einem weiteren Aspekt kann bzw. können die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) nicht auf Protein basierende fluoreszierende Markierungen, insbesondere Rhodamin Derivate, Derivate, wie beispielsweise Alexa 488, Alexa 568 und/oder Alexa 596 umfassen.
In noch einem weiteren Aspekt kann bzw. können die eine oder mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) Xanthen Derivate, wie beispielsweise Fluorescein und seine Derivate; und/oder Cyanin Derivate umfassen.
Insbesondere wurde gefunden, daß der Effekt eines reversiblen Photobleichens auch in nicht auf Protein basierenden fluoreszierenden Markierungen, wie beispielsweise Fluorescein Derivaten (z. B. Alexa 488, Alexa 568 und/oder Alexa 596) gezeigt wird.
Wie oben erwähnt, können auch andere auf Protein oder nicht auf Protein basierende fluoreszierende Markierungen effizient bzw. wirksam verwendet werden.
Dementsprechend wird nachfolgend jegliche fluoreszierende Markierung (d. h. sowohl auf Protein basierende und nicht auf Protein basierende fluoreszierende Markierungen) dieser Familie von durch Anregung bzw. Erregung aktivierten, reversibel photobleichenden Fluorophoren nachfolgend physikalisch modifizierbare Fluorophore (PHYMOD-Fluorophore) genannt werden.
Das verwendete Fluoreszenzlokalisierungsmikroskop kann einen Fernfeldaufbau des optischen Beleuchtungspfads aufweisen. Insbesondere kann das Fluoreszenzlokalisierungsmikroskop einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen Weitfeldaufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen 4Pi-Aufbau, einen STED-Aufbau oder einen STED-4Pi-Aufbau aufweisen. Der Detektionsweg bzw. -pfad kann eine Weitfeldanordnung oder einen Weitfeldaufbau aufweisen. Insbesondere kann der Information aufnehmende Sensor ein zweidimensionales Sensorarray sein, welches fähig ist, zweidimensionale Bilder der zu untersuchenden Region zu erhalten.
Das Prinzip einer Beleuchtung von fluoreszierend markierten Objekten mit Licht, welches eine hohe Intensität aufweist, und die nachfolgende Detektion des fluoreszierenden bzw. Fluoreszenzlichts, wie oben beschrieben, kann für mikroskopische Untersuchungen bzw. Beobachtungen unter Verwendung einer Vielzahl von optischen Set-ups bzw. Aufbauten des Beleuchtungspfads angewandt werden.
Insbesondere wird es durch ein Einführen von geringfügigen Modifikationen möglich, die bereits bestehenden konventionellen konfokalen Mikroskope für Messungen unterhalb der Auflösungsgrenze, beispielsweise für Messungen unterhalb der Auflösungsgrenze in dem Nanometerbereich zu adaptieren. Derartige geringfügige Modifikationen können beispielsweise die Einführung einer zusätzlichen Linse und/oder die Verwendung eines zweidimensionalen Sensorarrays bzw. -felds (beispielsweise einer CCD Kamera) für einen Bilderhalt; und/oder geringfügige Modifikationen der Software für eine Regelung bzw. Steuerung einer Strahlpositionierung und/oder -fokussierung sein. Beispielsweise kann eine konfokale Beleuchtung in einem Zwei-Photon-Modus verwendet werden, um Beobachtungen außerhalb der interessierenden Region durchzuführen.
In einem Mikroskop mit einem konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads kann allgemein eine kleine interessierende Region, welche einen Durchmesser von etwa 200 nm (beispielsweise in einem Fall eines durch Beugung begrenzten Fokussierens) bis etwa 1 μm (wie beispielsweise in einem Fall eines geringen Defokussierens) mit Beleuchtungslicht (üblicherweise einem Laserlicht) beleuchtet werden, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist. Die Fluoreszenz, welche von dem fluoreszierend markierten Objekt emittiert wird, kann durch einen zweidimensionalen Bildsensor (beispielsweise eine CCD Kamera) detektiert bzw. aufgenommen werden. Das Zentrum der Fluoreszenzemission kann dann unter Verwendung von geeigneten Bildbearbeitungsalgorithmen, wie beispielsweise den Algorithmen lokalisiert werden, welche im Detail unten beschrieben sind bzw. werden. Nach einem Fertigstellen der Messung (beispielsweise der SPDM Messung) an einer gegebenen interessierenden Region kann das Beleuchtungslicht auf eine andere interessierende Region gerichtet und die Messung wiederholt werden. Die obigen Prozeduren können wiederholt werden, bis das gesamte Objekt gescannt bzw. abgetastet ist.
Im Vergleich mit einer Weitfeldbeleuchtung kann die beleuchtete interessierende Region in einem Mikroskop, welches einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungswegs bzw. Pfads der optischen Beleuchtung aufweist, beträchtlich kleiner sein. Beispielsweise weist in einem Mikroskop, welches einen konfokalen Beleuchtungsaufbau aufweist, der Brennpunkt eine Oberfläche von etwa 0,1 μm² (d. h. etwa 0,3 μm × 0,3 μm) im Vergleich zu einer Oberfläche von etwa 100 × 100 μm² auf, welche üblicherweise in einem Mikroskop beleuchtet wird, welches einen Weitfeldbeleuchtungsaufbau aufweist. Somit kann in einem Mikroskop, welches einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads aufweist, die ausgegebene Laserleistung, welche für eine Beleuchtung der interessierenden Region mit dem erforderlichen Licht hoher Intensität notwendig ist, allgemein bis zu einigen Größenordnungen geringer als die ausgegebene Laserleistung sein, welche für eine Beleuchtung der interessierenden Region in einem Mikroskop notwendig ist, welches einen Weitfeldaufbau des optischen Beleuchtungspfads aufweist.
Dementsprechend ist es in einem Mikroskop, welches einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads aufweist, möglich, Laser zu verwenden, welche relativ geringe Laserleistungen für eine Beleuchtung aufweisen. Darüber hinaus ist es auch möglich, Farbstoffe, welche nicht leicht unter einer Weitfeldbeleuchtung erregbar sind, für ein fluoreszierendes Markieren der Objekte bzw. Gegenstände zu verwenden. Zusätzlich ist, da in einem konfokalen Mikroskop nur kleine ausgewählte Bereiche zu einer Zeit beleuchtet werden, die gesamte Energie E_tot, welche durch ein gemessenes Objekt (beispielsweise eine Zelle) bei einer gegebenen Intensität I des Beleuchtungslichts absorbiert wird, beträchtlich geringer als die gesamte Energie, welche in einem Fall einer Weitfeldbeleuchtung absorbiert wird. Dies kann durch das folgende Beispiel illustriert werden:
Die gesamte Energie kann durch die Formel: E_tot = k·I·S·t, berechnet werden,
wobei k ≤ 1 eine Konstante ist, welche die Absorption beschreibt,

I: die Intensität des Beleuchtungslichts ist;
S: der beleuchtete Oberflächenbereich ist; und
t: die Beleuchtungszeit ist.

Im Fall einer Weitfeldbeleuchtung kann der beleuchtete Oberflächenbereich beispielsweise etwa 10 × 10 μm² sein. Die gesamte Energie, welche durch das gemessene Objekt absorbiert wird, ist dann: E_tot ≈ k·I·100·t = I·t·100 Energieeinheiten.
Im Fall einer konfokalen Beleuchtung kann der beleuchtete Oberflächenbereich etwa 0,1 μm² sein. Die Anzahl von ausgewählten Clustern kann 10 sein, so daß die gesamte Beleuchtungszeit mit 10 multipliziert wird. Die gesamte Energie, welche durch das gemessene Objekt absorbiert wird, ist dann: E_tot ≈ I·0,1·10·t = I·t·1 Energieeinheiten.
Mit anderen Worten, ist im Fall einer konfokalen Beleuchtung die gesamte absorbierte Energie beträchtlich geringer als in dem Fall einer weiten bzw. Weitfeldbeleuchtung. Darüber hinaus wird Energie über eine längere Zeitperiode absorbiert. Dies kann von Wichtigkeit im Hinblick auf ein Minimieren von durch Photon induzierte Schäden bzw. Beschädigungen (beispielsweise im Fall von in vivo Messungen) sein.
Anwendungen von Mikroskopen, welche einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads aufweisen, können beispielsweise die Messungen von ausgewählten Proteinkomplexclustern in einer einzelnen Zelle (Membranproteincluster, nukleare Porenkomplexe, etc.) sein. Die Auswahl kann beispielsweise mittels eines konventionellen epi-Fluoreszenzmikroskops oder eines konfokalen Laserscanmikroskops durchgeführt werden.
Das verwendete Fluoreszenzlokalisierungsmikroskop kann andere verschiedene Moden bzw. Arten von Punktspreizfunktion-Engineering- und strukturierten/gemusterten Beleuchtungsschemata aufweisen. In diesem Fall kann die Kombination mit dem oben beschriebenen Lokalisierungsmikroskopieverfahren in beträchtlich kürzeren Detektions- bzw. Aufnahmezeiten resultieren.
Insbesondere kann eine mögliche Realisierung eines optischen Weitfeldaufbaus zwei Objektivlinsen mit einer gemeinsamen optischen Achse umfassen, welche derart ausgebildet sind, daß ein Feld einer stehenden Welle entlang der optischen Achse durch die Interferenz von zwei sich gegenläufig fortpflanzenden kollimierten Strahlen gebildet wird, welche in der rückwärtigen Brennpunktebene der zwei Objektivlinsen fokussiert sind. Die zu untersuchende Probe wird innerhalb des Felds der stehenden Welle positioniert. Dieser optische Aufbau bzw. diese optische Anordnung erlaubt eine effiziente Integration mit weiteren Weitfeldmethoden, welche ein strukturiertes Beleuchtungslicht, insbesondere ein räumlich moduliertes Beleuchtungslicht verwenden, wie dies unten in größerem Detail beschrieben werden wird.
Mit einem optischen Weitfeldaufbau kann ein zweidimensionaler Informationsempfangssender zu jedem Zeitschritt zweidimensionale Bilder des beleuchteten Bereichs von Interesse in der (x, y) Objektebene erhalten bzw. aufnehmen, welche allgemein normal auf die optische Achse des Weitfeldmikroskops ist. Dementsprechend kann laterale räumliche Information über die räumliche Position des einen oder der mehreren fluoreszierend markierten Objekts (Objekte); und/oder ihre Größen; und/oder die Abstände zwischen den Objekten in der (x, y) Ebene erhalten werden.
Das verwendete Beleuchtungslicht bzw. die optische Bestrahlung kann monochromatisch sein. Somit ist es möglich, eine einzige Wellenlänge für die gesamte Messung bzw. den Analyseprozeß zu verwenden. Die Lokalisierungsmikroskopie wird dadurch innerhalb des Intensitätsbereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² ausgeführt. Dies bringt ökonomische und technische Vorteile gegenüber konventionellen bzw. bekannten Systemen, welche lediglich Lokalisierungsmikroskopie verwenden und welche wenigstens zwei Wellenlängen für das Aktivieren, eine Erregung und ein Deaktivieren der Farbstoffmoleküle verwenden. Die Anzahl von Parametern, welche variiert werden muß, kann somit wenigstens auf die Hälfte reduziert werden. Selbstverständlich ist auch die Verwendung von mehr als einer Wellenlänge in Übereinstimmung mit der Erfindung. Dies kann beispielsweise vorteilhaft sein, wenn auf die Lokalisierung von mehreren Molekültypen bzw. -arten abgezielt wird.
Alternativ kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Arten von fluoreszierenden Markierungen verwendet werden und der Schritt eines Erhaltens bzw. Erfassens von Lokalisierungsbilddaten von einem oder mehreren Objekt(en) in einer interessierenden Region durch ein Verwenden von Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie kann getrennt für jede fluoreszierende Markierung unter Verwendung von Beleuchtungslicht mit einer optimalen Intensität durchgeführt werden, welche innerhalb des Bereichs von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² gewählt wird.
Dies erlaubt den Erhalt einer maximalen Lokalisierungspräzision und einer maximalen Anzahl von lokalisierten fluoreszierenden Molekülen. Insbesondere wird es durch ein Bestimmen einer molekülspezifischen optimalen Beleuchtung innerhalb des Intensitätsbereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² möglich, die Lokalisierungspräzision und die Anzahl der lokalisierten Moleküle und somit die Rekonstruktion zu optimieren. Da die Lokalisierungspräzision und die Anzahl der lokalisierten Moleküle oft nicht gleichzeitig maximiert werden kann, kann bzw. mag es notwendig sein, einen Kompromiß einzugehen.
Einige, durch Computer implementierte Algorithmen können verwendet werden, um räumliche Daten von den erhaltenen Bildserien zu extrahieren. So kann beispielsweise eine Gauß'sche Modellfunktion (welche gegebenenfalls jegliche Subtraktion eines Hintergrunds berücksichtigt) an die erhaltenen rohen oder vorbearbeiteten Lokalisierungsbilddaten angepaßt bzw. gefittet werden. Ein anderes Beispiel ist das Durchführen eines nicht-linearen Fits basierend auf dem Levenberg Marquard Algorithmus unter Verwendung einer analytisch berechneten Punktspreizfunktion. Das letztere Verfahren erlaubt, darüber hinaus eine Abschätzung der Lokalisierungspräzision zu erhalten.
Gemäß einem Aspekt umfaßt der Schritt eines Bearbeitens bzw. Verarbeitens der erhaltenen Lokalisierungsbilddaten ein Fitten bzw. Anpassen einer Modellfunktion f(x, y) an die erhaltenen Fluoreszenzemissionsverteilungen von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen in jedem der zweidimensionalen Bilder der Zeitserie:
wobei

x und y: kartesische Koordinaten in einer Objektebene, normal auf die optische Achse des Mikroskops sind;
x0 und y0: die Startparameter für die Position sind, welche als Zentrum des segmentierten Signals bestimmt werden;
A: die Amplitude der Verteilung ist, und
B0, B1, B2: Parameter sind, welche einen linearen Hintergrund beschreiben.

Vor einem Durchführen des Anpassungs- bzw. Fitschritts können die einzelnen bzw. individuellen Signale von den fluoreszierenden Moleküle entlang der erhaltenen bzw. erfaßten Bildserie durch ein Durchführen einer Division von jeweils zwei aufeinanderfolgenden Bildern in der erhaltenen Zeitserie von Bildern detektiert werden. Dies erlaubt die Detektion von lokalen Intensitätsunterschieden und erleichtert die Eliminierung des Hintergrundrauschens. Das Fitten berücksichtigt dann die Hintergrundsubtraktion.
Nach einer Registrierung von Positionen der fluoreszierenden Moleküle durch die gesamte Zeitserie von Lokalisierungsbilddaten können alle detektierten Punkte einem ”zusammengefaßten” Bild, insbesondere einem zusammengefaßten zweidimensionalen Bild zugeordnet werden. Positions- und/oder Abstandsmessungen können aus den Schwerpunktabständen zwischen diesen rekonstruierten Punkten erhalten werden, indem die Lokalisierungspräzision berücksichtigt wird. Die rekonstruierten Punkte sind allgemein durch eine Gauß'sche Intensitätsverteilung mit einer Standardabweichung gleich der mittleren Lokalisierungspräzision der jeweiligen fluoreszierenden Moleküle verteilt.
Gemäß einem anderen Aspekt können die detektierten Signale (d. h. die detektierten Bilddaten) in ihre charakteristischen Komponenten oder Vektoren (beispielsweise mittels einer Fourier-Transformation oder anderen Transformationen) zerlegt werden. Um die Verteilung jeder Komponente bzw. jedes Vektors zu bestimmen, können die Bilddaten mit dem entsprechenden Vektor kreuzkorreliert werden. Für den Unterteilungs- bzw. Segmentierschritt ist es dann möglich, nur abgetastete bzw. ausgesuchte Daten (d. h. Bildpunkte) mit einer signifikanten Amplitude zu berücksichtigen. Mittels linearen Kombinationen von unterschiedlichen Vektoren ist es möglich, unterschiedliche Klassifikationen der detektierten Signale auszuführen.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bzw. werden in dem Schritt eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten das eine oder die mehreren Objekt(e) in der interessierenden Region durch ein strukturiertes Beleuchtungslicht beleuchtet.
Das strukturierte Beleuchtungslicht kann ein in geeigneter Weise räumlich strukturiertes bzw. gemustertes Beleuchtungslicht, insbesondere ein Beleuchtungslicht sein, welches geeignet räumlich strukturiert oder moduliert in der (x, y) Objektebene, d. h. Ebene normal auf die optische Achse des Lokalisierungsmikroskops ist. Entweder das Objekt (Objektscan) oder die Phase (Phasenscan) der Beleuchtung kann zwischen zwei detektierten Bildrahmen, d. h. zwischen zwei Bildaufnahmen bewegt werden. Es ist auch möglich, beide Techniken zu kombinieren.
Wie in DE 19830596.6 , JP 2000502406 , US 09462435 , PCT/EP 02/11343 und WO 2006/127692 A2 geoffenbart, kann die Lokalisierungspräzision weiter verbessert werden, wenn eine strukturierte Beleuchtung auch für die Lokalisierungsmikroskopie verwendet wird. Die Beleuchtung kann dadurch stationär während der Signalerfassung sein und die Tatsache wird ausgebeutet bzw. ausgenutzt, daß zusätzliche Information über die potentielle Stelle bzw. Position des detektierten einzelnen Moleküls erhalten wird, da die fluoreszierenden Moleküle vorzugsweise in einem Bereich mit einer höheren Intensität angeordnet sind.
Gemäß einem Aspekt kann eine (räumlich) strukturierte bzw. modulierte Beleuchtung, welche während der Erregung von wenigstens einem Farbstoffmolekül bewegt wird, verwendet werden. Die Phase der Modulation wird in diesem Fall in dem detektierten Signal von den Fluoreszenzmolekülen rekonstruiert. Dies ermöglicht die Bestimmung der Position von wenigstens einem Molekül, welches mit dem Signal assoziiert ist, relativ zu wenigstens einem Fluoreszenzreferenz- bzw. -bezugspunkt, welcher zu bestimmen ist, mit einer unter diesen Bedingungen maximalen Präzision.
Ein Vorteil der Bewegung der strukturierten Beleuchtung während der Signalerfassung ist, daß die einzelnen Moleküle mit einer unter diesen Umständen bzw. Bedingungen maximalen Präzision lokalisiert werden können. Es wird dadurch ausgenutzt, daß die relative Position der fluoreszierenden Moleküle zueinander oder relativ zu einer zusätzlichen Markierung aus der erhaltenen Phaseninformation bestimmt werden kann. Die Präzision, mit welcher die Phase bestimmt werden kann, liegt innerhalb eines einstelligen Nanometerbereichs. Diese Präzision unterscheidet sich um etwa eine Größenordnung von der konventionell unter diesen Bedingungen erhältlichen Lokalisierungspräzision.
Obwohl in verschiedenen SPDM/SALM Verfahren eine laterale (x, y) Lokalisierung einzelner Moleküle (d. h. in einer Objektebene normal auf die optische Achse) erfolgreich durchgeführt werden kann, hat sich die Lokalisierung entlang der optischen Achse (z) als Herausforderung erwiesen. Um eine dreidimensionale Rekonstruktion von markierten Objekten (d. h. die x, y, z Koordinaten der fluoreszierend markierten Moleküle) zu erhalten, können verschiedene Zugänge verwendet werden. Eine mögliche Lösung ist es, konfokale Laserscan- oder konfokale Laserscan-4Pi-Mikroskopie zu verwenden, um die dreidimensionalen Positionen der Objekte zu erhalten.
Eine andere Möglichkeit ist es, die dreidimensionale Information innerhalb des lateralen erhaltenen bzw. erfaßten Signals zu verwenden. Da alle Licht emittierenden (d. h. fluoreszierenden) Moleküle ”punktartig” sind, (d. h. eine Größe beträchtlich kleiner als die Wellenlänge des Beleuchtungslichts aufweisen), kann man annehmen, daß sie alle auf dieselbe Weise abgebildet werden (wobei räumliche Orientierungseffekte der Moleküle mißachtet werden, da sie Aberrationen in dem Bereich von 1 nm unter den verwendeten Bedingungen erzeugen).
Die Tatsache, daß außerhalb des Fokus bzw. Brennpunkts liegende Objekte verschwommener bzw. verwischter erscheinen und daß die Punktspreizfunktion (PSF) nicht symmetrisch entlang der optischen Achse ist, kann auch verwendet werden, um Photonen emittierende Quellen in allen räumlichen Dimensionen zu lokalisieren. Wenn der Propagations- bzw. Bewegungspfad der elektromagnetischen Wellen gut bekannt ist, ist unter von idealen Registrierungsbedingungen verschiedenen Bedingungen die Genauigkeit der axialen Lokalisierung (d. h. entlang der optischen Achse) nur durch die Anzahl von detektierten Photonen ähnlich der lateralen Lokalisierung (d. h. in der Objektebene (x, y)) beschränkt. Unter Verwendung von üblichen photoaktivierbar oder photoumschaltbaren Fluorophoren in Kombination mit einer Zwei-Ebenen-Detektion oder einer systematisch modifizierten PSF kann eine 3D Lokalisierungsgenauigkeit von etwa 60 bis 80 nm FWHM erzielt werden.
Gemäß einem Aspekt werden die Lokalisierungsmikroskopiemessungen mit Entfernt- bzw. Weitfeldmikroskopmessungen unter Verwendung einer räumlich strukturierten oder modulierten Beleuchtung kombiniert.
Somit kann in einem Aspekt das Verfahren darüber hinaus ein Erhalten von zusätzlichen Weitfeldbilddaten, umfassend eine Serie von Weitfeldbildern der interessierenden Region durch ein Verwenden von Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Beleuchtungslicht umfassen, welches räumlich strukturiert bzw. moduliert entlang einer optischen Achse des Mikroskops ist, wobei das Erhalten bzw. Erfassen von zusätzlichen Weitfeldbilddaten erhalten wird durch:

– Beleuchten des einen oder der mehreren Objekts (Objekte) in der interessierenden Region mit dem strukturierten Beleuchtungslicht;
– Detektieren eines Weitfeldbilds des fluoreszierenden Lichts, welches von den fluoreszierenden Molekülen der einen oder mehreren fluoreszierenden Markierung(en) emittiert wird;
– Bewegen des Gegenstands bzw. Objekts und/oder des strukturierten Beleuchtungslichts in diskreten Schritten entlang der optischen Achse und Detektieren bei jedem Schritt eines Weitfeldbilds des Fluoreszenzlichts, welches von den fluoreszierenden Molekülen emittiert wird, wodurch die Serie von Weitfeldbildern der interessierenden Region erhalten wird, wobei der Schritt eines Erhaltens von zusätzlichen Weitfeldbilddaten des einen Objekts oder der mehreren Objekte vor dem Schritt eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten durchgeführt wird.

Das Verfahren kann darüber hinaus den Schritt eines Bearbeitens der erhaltenen zusätzlichen Weitfeldbilddaten umfassen, um zusätzliche räumliche Information zu erhalten, umfassend Information über die räumliche Erstreckung entlang der optischen Achse von wenigstens einem fluoreszierend markierten Objekt in der Probe und/oder zusätzliche räumliche Information der Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilung der einzelnen fluoreszierenden Moleküle in der Richtung der optischen Achse. Die durch die Lokalisierungsmikroskopie erhaltene Lokalisierungsinformation kann mit der zusätzlichen räumlichen Information kombiniert werden, welche durch die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht erhalten wurde.
Einer der Vorteile der obigen Zugänge ist, daß es möglich ist, die Grenze für die Lokalisierungspräzision oder Genauigkeit entlang der optischen Achse bei andernfalls identischen Bedingungen der Lokalisierungsmikroskopiebeobachtung zu überwinden. In Abhängigkeit von der Technik bzw. Art der strukturellen Beleuchtung ist es möglich, mit einer Präzision bis zu einigen Nanometern die Größe der fluoreszierend markierten Objektstrukturen zu bestimmen, welche eine geringere Erstreckung bzw. Größe als der Abstand zwischen den Maxima der Intensität in der strukturierten Beleuchtung zeigen. Dasselbe gilt auch für die Position des Zentrums bzw. Schwerpunkts der Markierung. Da man bei bzw. mit einer Lokalisierungsmikroskopie primär an sehr kleinen Strukturen interessiert ist, ist es unmittelbar nach einer lateralen Detektion und Lokalisierung des Signals bekannt, in welcher ”Tiefe” (Schwerpunkt der Markierung) das Molekül liegen muß und mit welcher Präzision seine Position bestimmt wurde (Erstreckung des Objekts). Auf diese Weise ist es möglich, dreidimensionale einzelne molekulare Lokalisierungen mit einer absoluten Präzision (keine Standardabweichung) von unter 40 nm in einer axialen und unter 10 nm (etwa 4 nm Standardabweichung) in einer lateralen Richtung selbst bei sehr geringen bzw. schwachen Photonenausbeuten durchzuführen.
Ein weiterer Vorteil ist, daß das kombinierte Verfahren, welches sowohl eine Lokalisierungsmikroskopie als auch eine Weitfeldfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von räumlich strukturiertem Beleuchtungslicht verwendet, beträchtlich weniger abhängig von den Photonenstatistiken der einzelnen fluoreszierenden Molekülen ist, welche für ein Markieren verwendet werden, da immer eine große Anzahl von Molekülen gleichzeitig zu dem Signal beiträgt. Ein kombiniertes Verfahren gemäß einem Aspekt der Erfindung kann die Präzision einer axialen Lokalisierung um einen Faktor von 30 im Vergleich zu konventionellen Methoden bzw. Verfahren erhöhen.
Das Beleuchtungslicht kann räumlich strukturiert bzw. gemustert in einer Anzahl von unterschiedlichen Arten bzw. Weisen sein. Insbesondere kann das strukturierte Beleuchtungslicht ein Beleuchtungslicht sein, welches räumlich entlang wenigstens der optischen Achse des verwendeten (Weitfeld-)Mikroskops strukturiert oder moduliert ist. Ein Beispiel eines derartigen Beleuchtungslichts, welches räumlich entlang der optischen Achse strukturiert ist, ist beispielsweise das Feld einer stehenden Welle, welche durch eine Interferenz von zwei gegenläufig fortschreitenden Laserstrahlen gebildet wird. Dies kann beispielsweise durch ein Fokussieren von zwei Strahlen, welche von derselben Laserquelle emittiert werden, in die rückwärtigen fokalen bzw. Brennpunktebenen von zwei gegenüberliegenden Objektivlinsen hoher numerischer Apertur erzielt werden. Die fluoreszenzmäßig markierten Objekte bzw. Objektstrukturen, welche in dem Feld der stehenden Welle bzw. in dem Feld der strukturierten Beleuchtung positioniert sind, werden gemäß ihrer Position erregt. Die relevanten Bilddaten können entweder durch ein Bewegen des Objekts in der statischen strukturierten Beleuchtung (Objektscan), durch ein Bewegen der strukturierten Beleuchtung, während das Objekt statisch verbleibt (Phasenscan), oder durch eine Kombination von beiden Verfahren erhalten werden. Information betreffend die räumliche Erstreckung entlang der optischen Achse von wenigstens einem fluoreszierend markierten Objekt in der Probe und/oder zusätzliche räumliche Information der Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilung der einzelnen fluoreszierenden Moleküle in der Richtung der optischen Achse kann bzw. können aus dem Intensitätsprofil entlang der optischen Achse erhalten werden.
Gemäß einem Aspekt kann eine Weitfeldbeobachtung bzw. -betrachtung bzw. -messung des Objekts vorab durchgeführt werden. Dies erlaubt, einige wichtige Rückschlüsse oder Bestätigungen betreffend das Objekt selbst zu ziehen, bevor das Objekt mit der Lokalisierungsmikroskopie rekonstruiert wird. Somit ist es möglich, beispielsweise vorab abzuschätzen, wie gut das Markieren durchgeführt wurde. Grobe oder relativ große Änderungen in der Struktur, wie beispielsweise Strom- oder Strömungsprozesse können in vivo gemessen werden.
Die Detektion bzw. Sammlung von Daten gemäß einem Aspekt kann innerhalb weniger als fünf Minuten durchgeführt werden, wobei dies einen Unterschied von bis zu zwei Größenordnungen im Vergleich zu alternativen Methoden darstellt, welche bis zu einigen Stunden erfordern. Dies ist insbesondere vorteilhaft für in vivo Beobachtungen in lebenden Systemen. Es ist somit möglich, anspruchsvolle und komplizierte technische Lösungen zu vermeiden, welche Driftproblemen begegnen oder diese mildern, oder die Erhaltung der Lebensfähigkeit der beobachteten Probe zur Verfügung zu stellen. Im Gegensatz dazu ist es mit dem vorgeschlagenen Verfahren möglich, eine sinnvolle in vivo Beobachtung auch an den kleinsten Strukturen vorzunehmen.
Die Weitfeldmessungen unter Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht, insbesondere räumlich moduliertem Beleuchtungslicht entlang einer optischen Achse des mikroskopischen Systems können durch ein Beleuchten mit Lichtintensitäten unter 1 kW/cm² durchgeführt werden.
Das Be- bzw. Verarbeiten der erhaltenen Daten kann umfassen:

– Erzeugen einer gemeinsamen theoretischen dreidimensionalen Modellfunktion für alle detektierten Signale innerhalb des einen Objekts oder der mehreren Objekte, wobei die dreidimensionale Modellfunktion in eine Vielzahl von zweidimensionalen Schichten entlang der optischen Achse unterteilt wird, und
– Durchführen einer lateralen Kreuzkorrelation der erhaltenen dreidimensionalen Bilddaten und der dreidimensionalen Modellfunktion, wobei die Maxima der Korrelationsfunktion sowohl eine Objekt- bzw. Gegenstandsidentifikation als auch eine dreidimensionale Lokalisierung darstellen.

Die dreidimensionale Modellfunktion kann beispielsweise ein dreidimensionales Modell der Punktspreizfunktion sein. Die dreidimensionale laterale Korrelation (nur zwei der drei möglichen Integrationen werden ausgeführt) kann gemäß etablierten mathematischen Prinzipien durchgeführt werden, mit jeder Schicht bzw. Lage der dreidimensionalen Punktspreizfunktion mit jeder Bildlage. Somit ist bzw. wird es beispielsweise möglich, die Maxima der lateralen und der axialen Amplitude zu erhalten, welche Information betreffend sowohl die laterale Position (Pixel bzw. Bildpunkt mit hoher Amplitude) als auch die axiale Position (Schicht bzw. Lage mit höchster Amplitude) des fluoreszierenden Moleküls bzw. fluoreszierend markierten Objekts tragen.
Die dreidimensionale Modellfunktion kann beispielsweise in ”n” zweidimensionale Schichten unterteilt werden. Die dreidimensionalen Bilddaten werden durch ein Kombinieren von ”n” Kopien eines einzelnen zweidimensionalen Bilds von der erhaltenen Serie von Weitfeldbildern zu einem dreidimensionalen Datenstapel erhalten. Derselbe Vorgang (d. h. die laterale Kreuzkorrelation) wird für alle Bilder der erhaltenen Zeitserie von Weitfeldbildern durchgeführt.
Es ist auch möglich, eine gemeinsame zweidimensionale Modellfunktion zu erzeugen bzw. zu generieren und eine laterale Kreuzkorrelation der Modellfunktion mit jedem zweidimensionalen Bild von der erhaltenen Serie von Weitfeldbildern durchzuführen.
Die oben beschriebenen Verfahren sind auch auf die Bilddaten anwendbar, welche mit Hilfe einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie erhalten werden. Insbesondere kann das Kreuzkorrelationsverfahren auch für Sätze von Bildern angewandt werden, welche ohne die Verwendung einer strukturierten Beleuchtung erhalten werden. In diesem Fall wird das Volumen bzw. die dreidimensionale Information der Punktspreizfunktion lokal mit den Bilddaten ”verglichen”. Es ist somit möglich, nicht nur die Segmentations- und Lokalisierungsprozesse zu kombinieren, sondern auch auf ein relativ berechnungsmäßig intensives Anpassen bzw. Fitten der Modellfunktion über Fit-Algorithmen, wie beispielsweise Levenberg-Marquardt oder andere modifizierte Algorithmen geringster Quadrate zu verzichten. Insbesondere kann das Segmentieren bzw. Unterteilen durch ein Anwenden eines Schwellwertverfahrens durchgeführt werden, wobei signifikant höhere Amplituden den Kreuzkorrelationsobjekten zugeordnet werden. Die Lokalisierung jedes Objekts wird – wie oben beschrieben – durch ein Evaluieren der Amplitude in der segmentierten Region durchgeführt.
Das Rekonstruktionsverfahren gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß es die Tatsache verwendet, daß alle detektierten Signale von den Farbstoffmolekülen innerhalb einer einzigen kleinen Struktur emittiert werden. In einem derartigen Fall ist es möglich, die störenden Unterschiede in dem Brechungsindex der Umgebung bzw. dem umgebenden Bereich zu mißachten bzw. zu vernachlässigen. Eine einzelne bzw. einzige dreidimensionale Modellfunktion wird dadurch erzeugt und beispielsweise mit dem erhaltenen Datensatz bzw. Datenstapel kreuzkorreliert, wie dies oben erläutert wurde.
In dem resultierenden Stapel ist es möglich, unmittelbar eine Identifikation der einzelnen Moleküle und gleichzeitig der Position eines jedes Moleküls in dem Objekt- oder Bildraum aus den auftretenden Maxima auszuführen, welche die Ähnlichkeit der Modellfunktion mit dem Signal in einer speziellen Lage beschreiben. Somit kann beispielsweise Information betreffend die Position in dem Objekt- oder Bildraum durch ein Analysieren der Position des Maximums der Intensität erhalten werden.
Ein Schwellwertverfahren kann auf die erhaltenen Korrelationsmaxima angewandt werden. Das Schwellwertverfahren kann für ein Optimieren der Objektidentifikation und der 3D Lokalisierung der fluoreszierenden Farbstoffmoleküle in einem Schwellwertverfahren verwendet werden. Insbesondere kann das Schwellwertanalyseverfahren verwendet werden, um das Rekonstruktionsverfahren durch ein Evaluieren von lediglich signifikanten Maxima zu optimieren. Somit können zusätzliche Mittel für eine Qualitätskontrolle der Rekonstruktion erhalten werden.
Anstelle einer Kreuzkorrelation können eine Wavelet-Korrelation oder ähnliche Verfahren bzw. Methoden verwendet werden.
Das Verfahren kann darüber hinaus einen Schritt einer räumlichen Kalibrierung der strukturierten Beleuchtung umfassen, wobei die räumliche Kalibrierung mit der Hilfe von wenigstens einem fluoreszierenden Referenzpunkt durchgeführt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann eine räumliche Kalibrierung der strukturierten Beleuchtung mit der Hilfe von wenigstens einem fluoreszierenden bzw. Fluoreszenzreferenzpunkt durchgeführt werden. Durch ein Verwenden eines Kalibrierungsverfahrens und die Verwendung bzw. den Einsatz von wenigstens einem fluoreszierenden Referenz- bzw. Bezugspunkt, mit dessen Hilfe die Stelle bzw. Position und die Intensität des Felds der stehenden Welle direkt gemessen und orientiert werden können, ist es möglich, die Verwendung der strukturierten Beleuchtung zu optimieren und/oder die strukturierte Beleuchtung mit maximaler Präzision zu beschreiben. Als ein Bezugspunkt kann eine dünne, schwach fluoreszierende Schicht auf dem Deckglas des Objektträgers bzw. der Probenzubereitung, wie beispielsweise eine Schicht von Photolack bzw. Photoresist verwendet bzw. eingesetzt werden.
Gemäß einem Aspekt wird bzw. werden während des Schritts eines Erhaltens von zusätzlichen Bilddaten des einen oder der mehreren Objekts (Objekte) mit einer Weitfeldfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht das eine oder die mehreren Objekt(e) mit der strukturierten Beleuchtung derart beleuchtet, daß wenigstens ein Teil der Fluoreszenzmoleküle der wenigstens einen fluoreszierenden Markierung in einen aktiven Zustand transferiert wird und für die entsprechende Weitfeldbeobachtung verwendet wird, während ein zweiter Teil der Fluoreszenzmoleküle in einem inaktiven Zustand verbleibt. Während des Schritts eines Erhaltens bzw. Erfassens von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden von Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie wird ein zweiter Teil der Fluoreszenzmoleküle durch ein Ändern der Beleuchtungslichtintensität der optischen Strahlung auf diejenige aktiviert, welche innerhalb des Bereichs von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² liegt, wobei der Schritt eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden von Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie auf Basis des zweiten Teils der fluoreszierenden Moleküle durchgeführt wird. Der oben erwähnte aktive Zustand kann ein fluoreszierender Zustand sein und der oben erwähnte inaktive Zustand kann ein nicht-fluoreszierender Zustand, beispielsweise ein reversibel gebleichter Zustand oder ein irreversibel gebleichter Zustand sein. Insbesondere in einem aktiven Zustand ist das Fluorophor (oder fluoreszierende Molekül) fähig, eine charakteristische Strahlung in einem gegebenen spektralen Bereich (welcher durch das Bildgebungssystem detektierbar ist) bei bzw. nach einer Erregung zu emittieren. in einem inaktiven Zustand zeigt das Fluorophor keinerlei detektierbare Emission. Die inaktiven Zustände können allgemein in ”reversible” und ”irreversible” in Abhängigkeit von ihrer Lebensdauer unterteilt werden.
Demgemäß ist es möglich, ursprünglich inaktive fluoreszierende Moleküle für die Weitfeldmessungen zu verwenden, wenn ein ausreichender Teil bzw. Anteil dieser Moleküle für den Zweck der Weitfeldbeobachtung aktiviert ist bzw. wird. Das teilweise Aktivieren der Moleküle für den Zweck der Weitfeldbeobachtung kann beispielsweise mit einer zweiten Beleuchtungswellenlänge durchgeführt werden. Unterschiedliche Aktivierungsmethoden, wie beispielsweise eine thermische Aktivierung, können auch verwendet werden. Der zweite Teil der Farbstoffmoleküle wird für die nachfolgende Lokalisierung in der Lokalisierungsmikroskopie verwendet. Es ist auch möglich, die Objekte mit mehreren Markierungen zu markieren, umfassend mehr als eine Art eines Farbstoffs bzw. von Farbstoffmolekülen, so daß eine Art für die Weitfeldbeobachtung und die andere für die nachfolgende Lokalisierung eines einzelnen Moleküls in der Lokalisierungsmikroskopie verwendet werden können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Fluoreszenzlokalisierungsmikroskop für ein Erhalten einer unterhalb einer Auflösungsgrenze liegenden, räumlichen Information einer Probe, welche mit wenigstens einer Art einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die unterhalb der Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information Lokalisierungsinformation über die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt, wobei das Mikroskop umfaßt:

– eine Beleuchtungsoptik, welche einen optischen Beleuchtungspfad bzw. -weg definiert, welcher konfiguriert ist, um das eine Objekt oder die mehreren Objekte in einer interessierenden Region zu beleuchten;
– wenigstens ein zusätzliches optisches Element, welches innerhalb des optischen Beleuchtungspfads des Lokalisierungsmikroskops positioniert ist, wobei das wenigstens eine zusätzliche optische Element konfiguriert ist, um ein Umschalten der Intensität des Beleuchtungslichts auf eine Intensität, welche innerhalb des Bereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² liegt, und/oder eine Einstellung bzw. Regulierung der Intensität des Beleuchtungslichts innerhalb des Bereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² zu ermöglichen,
– wenigstens einen Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor, welcher in einem optischen Detektionspfad positioniert ist, welcher konfiguriert ist, um den wenigstens einen Teil des emittierten Fluoreszenzlichts zu detektieren, welches durch wenigstens ein Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung bei einer Beleuchtung emittiert wird, wodurch ein Bild der beleuchteten interessierenden Region erhalten wird.

Wie oben bereits erklärt, wird gemäß einem Aspekt bei einer Beleuchtung mit einem Beleuchtungslicht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist, wenigstens ein Teil der fluoreszierenden Moleküle von einem ersten (fluoreszierenden) Zustand zu einem zweiten semi-stabilen (beispielsweise reversibel gebleichten Zustand) transferiert bzw. übergeführt.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei einer Beleuchtung wenigstens ein Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung von dem ersten Zustand zu dem zweiten Zustand und nach einer Erholung bzw. Rückkehr zu dem ersten Zustand zu einem dritten, langlebigen inaktiven Zustand (beispielsweise einem irreversibel gebleichten Zustand) transferiert.
Der Information erfassende bzw. erhaltende Sensor kann ein zweidimensionaler Sensor (beispielsweise ein CCD Chip oder ein anderer zweidimensionaler Sensor bzw. ein Sensorarray) sein, wobei die erhaltenen Bilder zweidimensionale Bilder der interessierenden Region sind. Demgemäß kann räumliche Information in zwei Dimensionen erhalten werden. In einem Aspekt sind die erhaltenen Bilder Bilder in einer Objektebene, d. h. in einer (x, y) Ebene im wesentlichen parallel zu der optischen Achse des verwendeten Lokalisierungsmikroskops, wobei x und y kartesische Koordinaten in der Objektebene sind.
Das Mikroskop kann darüber hinaus Speichermittel (beispielsweise einen Speicher) für ein Speichern des Bilds umfassen, welches durch den Information erhaltenden Sensor detektiert wird. In einem Aspekt sind die Speichermittel konfiguriert, um eine Vielzahl bzw. eine Serie von Bildern zu speichern, welche durch den Information erhaltenden Sensor bei unterschiedlichen Typschritten durch ein wiederholtes Beleuchten der Probe und Detektieren des Fluoreszenzlichts detektiert werden, welches von den fluoreszierenden Molekülen emittiert wird. Die Serie von Bildern kann in einer geeigneten Datenstruktur, beispielsweise in einem dreidimensionalen Datenstapel gespeichert werden, welcher eine Vielzahl von zweidimensionalen Bildern umfaßt.
Das Mikroskop kann darüber hinaus eine oder mehrere Belichtungsquelle(n), beispielsweise einen oder mehrere Laser umfassen. In einem Aspekt kann das Beleuchtungslicht geeignet räumlich strukturiert bzw. moduliert in wenigstens einer räumlichen Richtung, insbesondere entlang der optischen Achse des Mikroskops sein. Dementsprechend kann das Mikroskop darüber hinaus Mittel für ein räumliches Strukturieren bzw. Modulieren des Beleuchtungslichts in wenigstens einer räumlichen Richtung umfassen. Ein Beispiel eines geeignet räumlich strukturierten bzw. modulierten Lichts entlang der optischen Achse ist das Feld der stehenden Welle bzw. Beleuchtung, welches durch die Interferenz von zwei gegenläufig bzw. entgegengesetzt sich fortpflanzenden Lichtstrahlen gebildet wird. Ein derartiges Feld einer stehenden Welle kann beispielsweise durch ein Fokussieren von zwei Strahlen, welche von derselben Lichtquelle emittiert werden, in den rückwärtigen Brennpunktebenen von zwei gegenüberliegenden Objektivlinsen gebildet werden, welche hohe numerische Aperturen aufweisen. Darüber hinaus können relativ preisgünstige Realisierungen einer strukturierten Beleuchtung beispielsweise mit Hilfe von einem oder mehreren optischen Gitter(n) mittels einer Mehrstrahl-Interferenz sein.
In einem Aspekt können sehr günstige Laserzeiger als Beleuchtungsquellen verwendet werden. Dies ermöglicht die Realisierung eines vollständig funktionellen Weitfeldlokalisierungsmikroskopieaufbaus gegebenenfalls mit einer gewissen Art einer strukturierten Beleuchtung, welche darin zu einem relativ geringen Preis integriert ist. Selbst ohne eine Verwendung von teuren speziellen Objektiven, Main Frame oder Computern großer Kapazität und speziellen Sensoren kann die Abbildungsleistung derartiger Systeme innerhalb einer akzeptablen Zeitperiode von unter einer Stunde besser als diejenige von konventionell erhältlichen mikroskopischen Systemen sein. Zusätzlich stellt die Tatsache, daß es in dem einfachsten Fall nur einen Freiheitsgrad gibt, welcher für einen Benutzer für eine Handhabung verfügbar ist (beispielsweise Intensitätsregelung bzw. -steuerung über eine Linsenposition), sicher, daß eine derartige Vorrichtung durch jedermann selbst ohne weitere Kenntnis auf dem Gebiet der Optik, Mechanik oder Elektronik verwendet werden kann.
Das Lokalisierungsmikroskop kann einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen Weitfeldaufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen 4Pi Aufbau, einen STED Aufbau oder einen STED-4Pi Aufbau oder andere Moden bzw. Arten eines Punktspreizfunktion-Engineering und von strukturierten/gemusterten Beleuchtungsschemata aufweisen. Der Detektionspfad bzw. -weg kann eine Weitfeldanordnung aufweisen. Insbesondere kann der Information erfassende bzw. erhaltende Sensor ein zweidimensionales Sensorarry bzw. -feld sein, welches fähig ist, zweidimensionale Bilder der zu untersuchenden Region zu erhalten.
Gemäß einem Aspekt kann eine konventionelle Weitfeldbeleuchtung leicht durch die Verwendung von wenigstens einem geeigneten optischen Element modifiziert werden, um das Umschalten und/oder die Einstellung der Intensität der optischen Strahlung bzw. des Beleuchtungslichts auf eine Intensität zu ermöglichen, welche innerhalb des Intensitätsbereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² liegt. Somit können die Verfahren gemäß irgendeinem der Aspekte der Erfindung ermöglicht bzw. erleichtert werden. Mit gewissen Farbstoffen oder Markierungen bzw. Markern kann es vorteilhaft sein, dieses Intensitätsintervall oder -fenster in der Richtung der höheren oder niedrigen Werte zu erstrecken bzw. zu erweitern.
Das wenigstens eine zusätzliche optische Element kann eines oder mehrere umfassen von

– wenigstens einer Linse oder einem Linsensystem;
– wenigstens einem Graufilter oder einem Graufiltersatz;
– wenigstens einem Polarisationsfilter;
– wenigstens einem akusto-optischen Modulator; und/oder
– wenigstens einem elektro-optischen Modulator.

Insbesondere einfach zu installieren in einem Mikroskop sind beispielsweise eine einzelne Linse oder ein Linsensystem oder ein einzelner Graufilter oder ein Graufiltersatz. Ein Polarisationsfilter oder ein Satz von Polarisationsfiltern kann eine geeignete Alternative für ein kontinuierliches Einstellen oder Regulieren der Intensität der Beleuchtung mit polarisierten Lichtquellen zur Verfügung stellen.
Akusto-optische oder elektro-optische Modulatoren stellen dementsprechend noch eine andere Alternative dar. In ähnlicher Weise ist es möglich, eine Kombination der obigen Elemente, beispielsweise eine Kombination aus einer einzelnen Linse und einem Graufiltersatz zu installieren.
Das Mikroskop kann darüber hinaus wenigstens einen zusätzlichen Sensor umfassen, welcher in wenigstens einem zusätzlichen optischen Detektionspfad verwendet wird, wobei der zusätzliche Sensor und der zusätzliche optische Detektionspfad konfiguriert sind, um wenigstens ein Teil des Fluoreszenzlichts zu registrieren, welches nicht den Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor erreicht.
Wenigstens ein zweites zusätzliches optisches Element kann in dem wenigstens einen zusätzlichen optischen Detektionspfad positioniert sein.
Das Mikroskop kann darüber hinaus eine Bearbeitungseinheit umfassen, welche konfiguriert ist, um die erhaltenen Lokalisierungsbilddaten zu bearbeiten, um eine unterhalb einer Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information einer Probe zu erhalten, welche mit wenigstens einer Art einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die unterhalb der Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information Lokalisierungsinformation über die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt. Insbesondere kann die Bearbeitungseinheit konfiguriert sein, um in jedem der detektierten Bilder der Serie die Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilungen von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen der einen oder der mehreren fluoreszierenden Markierung(en) in wenigstens einer räumlichen Richtung zu bestimmen.
Die Bearbeitungseinheit kann darüber hinaus konfiguriert sein, um die Lokalisierungsinformation betreffend die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung zu bearbeiten, um eine, unterhalb einer Auflösungsgrenze liegende räumliche Information betreffend ein oder mehrere fluoreszierend markierte Objekte in dem Bereich von Interesse zu erhalten, wobei die räumliche, unterhalb der Auflösungsgrenze liegende Information Information über die räumliche Position des einen oder der mehreren Objekts (Objekte), und/oder die Größe des einen oder der mehreren Objekts (Objekte); und/oder die Abstände zwischen den Objekten in wenigstens einer Raumrichtung umfaßt.
Gemäß einem Aspekt kann die Be- bzw. Verarbeitungseinheit darüber hinaus konfiguriert sein, um ein Fitten bzw. Anpassen einer Modellfunktion f(x, y) an die erhaltenen Fluoreszenzemissionsverteilungen von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen in jedem der zweidimensionalen Bilder der Zeitserie durchzuführen:
wobei x und y kartesische Koordinaten in einer Objektebene, normal auf die optische Achse des Mikroskops sind;
x₀ und y₀ die Startparameter für die Position sind, welche als das Zentrum des segmentierten Signals bestimmt werden;
A die Amplitude der Verteilung ist, und
B₀, B₁, B₂ Parameter sind, welche einen linearen Hintergrund beschreiben.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann die Bearbeitungseinheit darüber hinaus konfiguriert sein, um zusätzliche Weitfeldbilddaten zu bearbeiten, welche unter Verwendung von Weitfeldfluoreszenzmikroskopie mit strukturiertem Beleuchtungslicht erhalten werden, um eine zusätzliche räumliche Information zu erhalten, umfassend Information betreffend die räumliche Erstreckung entlang einer weiteren räumlichen Richtung von wenigstens einem fluoreszenzmäßig markierten Objekt in der Probe und/oder zusätzliche räumliche Information der Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilung der einzelnen fluoreszierenden Moleküle in der wenigstens einen zusätzlichen Richtung. Die wenigstens eine weitere Richtung kann entlang der optischen Achse des Mikroskops sein. Die Bearbeitungseinheit kann darüber hinaus konfiguriert sein, um die Lokalisierungsinformation, welche durch die Lokalisierungsmikroskopie erhalten wird bzw. ist, mit der zusätzlichen räumlichen Information zu kombinieren, welche durch Weitfeldfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht erhalten wird.
In einem Aspekt kann die Bearbeitungseinheit konfiguriert sein zum:

– Erzeugen einer gemeinsamen theoretischen dreidimensionalen Modellfunktion für alle detektierten Signale innerhalb des einen Objekts oder der mehreren Objekte, wobei die dreidimensionale Modellfunktion in eine Vielzahl von zweidimensionalen Schichten bzw. Lagen entlang der optischen Achse unterteilt ist, und
– Durchführen einer lateralen Kreuzkorrelation der erhaltenen dreidimensionalen Bilddaten und der dreidimensionalen Modellfunktion, wobei die Maxima der Korrelationsfunktion sowohl eine Objektidentifikation als auch eine dreidimensionale Lokalisierung darstellen.

Eine Bearbeitungseinheit kann darüber hinaus konfiguriert sein, um ein Schwellwertverfahren an den erhaltenen Korrelationsmaxima anzuwenden.
Die Bearbeitungseinheit kann darüber hinaus ein geeignet programmierter Bearbeitungschip für allgemeine Zwecke oder eine spezielle bzw. zugewiesene Hardware umfassen. Die Bearbeitungseinheit kann mit den Speichermitteln verbunden und konfiguriert sein, um Daten zu lesen, welche in den Speichermitteln gespeichert sind.
Die obigen Verfahren und Vorrichtungen (Mikroskope bzw. mikroskopischen Systeme) gemäß einem der Aspekte der vorliegenden Erfindung erlauben eine präzise Bestimmung von Objektpositionen und haben das Potential, das optische Auflösungslimit zu umgehen, welches durch die Beugungstheorie gegeben ist. Um eine Lokalisierung zu verwenden, um strukturelle Information weit unterhalb des Beugungslimits zu erhalten, müssen die ”punktartigen” Komponenten der Struktur unabhängig detektiert werden, selbst wenn ihr Abstand geringer als das konventionelle optische Auflösungslimit ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wurde das konventionelle SPDM/SALM Konzept erweitert, indem eine Beleuchtungsintensität in dem Bereich von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² (ein Bereich, welcher früher in der Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie vermieden wurde) und Übergänge zwischen drei fluoreszierenden Zuständen verwendet bzw. ausgenützt werden. Ein derartiger Übergang kann beispielsweise durch die Verwendung von neuartigen spektralen Signaturen realisiert werden, welche durch ein reversibles Photobleichen von fluoreszierenden Molekülen, insbesondere fluoreszierenden Proteinmolekülen geboten werden. Ein Vorteil ist, daß ”konventionelle” fluoreszierende Proteine, d. h. Proteine ohne die chemischen Modifikationen, welche für eine PALM und FPALM Anwendung beschrieben sind, erfolgreich für die Zwecke einer Fluoreszenzmikroskopie unterhalb einer Auflösungsgrenze verwendet werden können. Da biologische Proben, welche mit derartigen fluoreszierenden Proteinen markiert sind, am üblichsten sind, haben die Verfahren gemäß einem Aspekt der Erfindung, welche derartige Fluorophore verwenden, einen großen Bereich von Anwendungen, beinhaltend das Potential für in vivo Messungen. Ein weiterer Vorteil ist, daß es möglich ist, eine laterale (x, y) Lokalisierungsgenauigkeit für ein einzelnes Molekül unter 10 nm nicht nur für spezielle photoaktivierbare fluoreszierende Proteine, sondern auch für ”konventionelle” zu erhalten.
Noch andere Vorteile sind die kurzen Datenerhalts- bzw. -erfassungs- und Datenbearbeitungszeiten. In einem Beispiel ist die typische Datenerfassungsrate etwa 100 s, in welcher ein Objektbereich bzw. eine Objektfläche von bis zu 90 μm × 90 μm aufgenommen werden könnte und beträchtlich mehr als 100,00 Moleküle angeordnet sind. Der Datenbearbeitungsaspekt einer Moleküllokalisierung erfordert gegenwärtig Zeiten in der Größenordnung von einigen Minuten. Durch eine Verwendung von modernen Dual-Core-Prozessoren ist es möglich, Berechnungen on-line während einer Bilderfassung durchzuführen. Somit wird ein hoher Durchsatz eines Fluoreszenzabbildens bei einer molekularen optischen Auflösung unter Anwendung von sichtbarem Licht in Kombination mit weit verbreitet verwendeten Fluorophoren machbar.
Ein anderer Aspekt der Verwendung bezieht sich auf eine Kombination dieser Technik (d. h. SPDM/SALM laterale ((x, y)) Lokalisierungsmikroskopie) mit räumlich modulierten Beleuchtungs-(SMI) Mikroskopietechniken für eine Bestimmung einer axialen Größe dz und/oder mittleren Position z₀. Diese neuartige Technik erlaubt ein schnelles dreidimensionales (3D) Abbilden von Nanostrukturen, insbesondere biologischen Nanostrukturen mit einer effektiven 3D optischen Auflösung (x, y, z) von einzelnen Molekülen von etwa 20 nm in der lateralen und 50 nm in der axialen Richtung entsprechend etwa 1/25 bis 1/10 der erregenden Wellenlänge. Für die Anwendung des kombinierten SPDM/SMI 3D Abbildungszugangs kann eine a priori Information über das markierte Objekt erforderlich sein. Diese Bedingung kann jedoch für die meisten Nanostrukturen, insbesondere für die meisten, zu analysierenden biologischen Nanostrukturen erfüllt werden.
Ein Beispiel einer Anwendung der kombinierten erweiterten SPDM/SMI Technik ist es, die 3D Zellstruktur von kleinen Zellprotrusionen unter Verwendung von einer Membran zugeordneten Proteinen zu beleuchten. In einem Beispiel wurde die stabartige 3D Struktur einer derartigen Protrusion mit einem Durchmesser von etwa 50 nm das erste Mal unter Verwendung eines Weitfeldfluoreszenzmikroskopie-Zugangs beleuchtet bzw. erklärt. Eine derartige ultra-strukturelle 3D Auflösung ist nahezu unmöglich durch eine konventionelle konfokale Laserscanmikroskopie zu erhalten.
Da die erzielbare effektive dreidimensionale (3D) optische Auflösung auf etwa 20 nm lateral und 50 nm axial (und höher) erhöht werden kann, sind zahlreiche Anwendungen in der strukturellen Erhellung bzw. Erfassung von zellularen Nanostrukturen machbar. Beispiele für eine derartige Anwendung sind individuelle Gendomänen in den genetisch aktiven und inaktiven Zuständen; umweltbedingte Änderungen von Chromatin-Nanostrukturen; Größe und nukleare Verteilung von Replikationsfabriken und Reparaturkomplexen; Verteilung eines nuklearen Porenkomplex; Anordnung von Polyribosomen; Verteilung von Ionenkanälen an der Zellmembran, etc. Eine andere wichtige Anwendung ist die Möglichkeit, einzelne Moleküle, beispielsweise an der Zellmembran, oder RNA Transkripts zu zählen. Obwohl die SPDM Prozedur bisher erlaubt, nur einen Teil von allen markierten Molekülen zu registrieren, sind die erhaltenen Anzahlen minimale absolute Anzahlen. Beispielsweise würde eine SPDM Zählung von 100.000 Proteinen in einer Zellmembran (beinhaltend sowohl die obere als auch die untere Seite) von etwa 20 × 20 × 2 = 800 μm² in einer minimalen mittleren absoluten Membrandichte von 125 Proteinen/μm² oder einem Protein in 90 nm × 90 nm resultieren. Darüber hinaus würde sie erlauben, die Homogenität einer Molekülverteilung auf einem Auflösungsniveau in dem makromolekularen Bereich zu beurteilen. Vielfältige Anwendungen eines derartigen Molekülzählens und einer Verteilungsanalyse können erdacht werden, von ”fundamentaler molekularer Biophysik” bis zur Effizienz eines Transports von pharmazeutischen Verbindungen durch die Zellmembran.
Falls ausreichend photostabile Fluorochrome mit photokonvertierbaren ”dunklen” und ”hellen” Signaturen verwendet werden, kann vom Standpunkt einer SPDM/SMI Mikroskopie eine weitere Verbesserung einer effektiven 3D Auflösung erzielt bzw. erhalten werden. Beispielsweise ist, wenn 5.000 bis 10.000 Photonen von einem einzigen Molekül registriert werden könnten, unter andernfalls idealen Bedingungen eine Verbesserung der Genauigkeit einer axialen Lokalisierung bis zu einer Genauigkeit einer axialen (z₀) Lokalisierung von etwa 1 nm erzielbar. Um auch eine Verbesserung in der Genauigkeit der lateralen Lokalisierung bis zu 1 nm mit derartigen Photonenzahlen bzw. -anzahlen zu erzielen, kann zusätzlich zu einer axial strukturierten Beleuchtung eine lateral strukturierte Beleuchtung verwendet werden. Eine derartige Verbesserung in einer x, y, z Lokalisierung würde eine effektive optische 3D Auflösung in dem Bereich von 2 nm erlauben und somit ausreichend sein, um lichtoptisch strukturelle Weitfeldanalysen selbst der Komponenten von makromolekularen Komplexen im Inneren der Zellen möglich zu machen. Einige mögliche Anwendungen können sein: einzelne Gendomänen; die Replikationsfabriken, welche für das Verdoppeln der zellulären DNA verantwortlich sind; die Reparaturkomplexe, welche für die Reparatur von durch Umgebungsbedingungen induzierte Genomänderungen verantwortlich sind; die Chromatin-Remodellier/Silencing-Komplexe, welche für die Expression verantwortlich sind, welche mit einer Modifikation einer Genom-Nanostruktur zusammenhängt; die Transkriptionsfabriken, welche das ”Lesen” des genetischen Codes erlauben; die Splicing-Fabriken, welche die transkribierte RNA bearbeiten; die nuklearen Porenkomplexe, welche den Verkehr zwischen Zellkern und dem Rest der Zelle kontrollieren bzw. steuern; die Ribosome, welche RNA in Proteine übersetzen; die Proteasome, welche die Zersetzung von Proteinen regeln bzw. steuern; die Ionenkanalkomplexe, welche den Transport von Ionen durch die Zellmembran kontrollieren bzw. steuern; oder die Zellverbindungskomplexe, welche für eine Bildung von Gewebe verantwortlich sind.
Es wird daher angenommen, daß das erweiterte SPDM/SALM Verfahren gemäß einem Aspekt der Erfindung und insbesondere eine Kombination dieses Verfahrens mit SMI und anderen neuartigen Entwicklungen in einer Laseroptik-Nanoskopie gegebenenfalls den Spalt in einer Auflösung zwischen ultrastrukturellen Verfahren (d. h. mit einer Auflösung von nm) und Weitfeldmikroskopie mit sichtbarem Licht (üblicherweise eine Auflösung von einigen Hundert nm) in einer derartigen Weise überbrücken werden, daß dieselben Zellstrukturen bei nahezu gleicher bzw. ähnlicher (hinunter bis zu molekularer) Auflösung abgebildet werden können. Eine derartige ”korrelative Mikroskopie” kann einen wesentlichen Beitrag zu einem direkten Einblick in den ”Mechanismus” des Lebens auf dem Niveau einer einzelnen Zelle zur Verfügung stellen, von der Änderung beim Falten der Chromatinfaser bei der Aktivierung/Stillegung bzw. Silencing eines Gens, zu seiner Transkription, zur Bearbeitung der erzeugten mRNA, zum Transport zu dem Zytoplasma durch die nuklearen Poren, zu der Translation in Proteine, zum Zusammenbau und der Auflösung von makromolekularen Komplexen, bis zu der Signalübertragung an der Zellmembran und zu Zell-zu-Zell-Interaktionen. Über diese aufregenden Möglichkeiten für die molekulare Biophysik der Zelle wird angenommen bzw. vorausgesehen, daß laseroptische Nanoskopieverfahren bzw. -methoden auch ein zusätzliches wertvolles Werkzeug für die Analyse der Interaktion von ”biomolekularen Maschinen” (BMM's) und pharmazeutischen Drogen bzw. Medikamenten auf dem Niveau von Einzelzellen/Einzel BMM's zur Verfügung stellen werden. Die Zugänge einer erweiterten SPDM/SALM Weitfeldfluoreszenzmikroskopie gemäß einem Aspekt der Erfindung können nicht nur für Messungen auf den Gebieten der Biowissenschaft und der Physik von biologischen Strukturen angewandt werden, sondern auch in der Materialwissenschaft. Beispielsweise würde, wo immer eine Oberflächennanostruktur zu charakterisieren ist und ein Fluoreszenzmarkieren von Oberflächenmolekülen machbar ist, eine schnelle lichtoptische Analyse möglich werden und dies die Messungen hoher Auflösung, jedoch auch größeren Zeitverbrauchs durch Elektronenmikroskopie ergänzen bzw. vervollständigen.
Details der Erfindung ebenso wie weitere Merkmale, Anwendungen und Vorteile werden in den nachfolgenden Ausführungsformen oder Beispielen unter Bezugnahme auf 1 bis 10 diskutiert. Alle geoffenbarten oder gezeigten Merkmale, alleine genommen oder in willkürlichen Kombinationen miteinander, können der Gegenstand der Erfindung, unabhängig von ihren Kombinationen in den Patentansprüchen ihrer Rückbeziehungen als auch unabhängig von ihrer Formulierung oder Darstellung in der Beschreibung oder in den Figuren sein.
1 zeigt ein Beispiel einer Vorrichtung mit einer strukturierten Weitfeldbeleuchtung und einem Linsensystem, wodurch zwei unterschiedliche optische Detektionspfade bzw. -wege realisiert werden.
2 zeigt eine Erklärung eines Verfahrens gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt ein zweites Beispiel einer Vorrichtung gemäß einem Aspekt der Erfindung mit einer minimalen Anzahl von notwendigen Komponenten.
4 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Beispiels eines mikroskopischen bzw. Mikroskop-Aufbaus unter Verwendung von Lokalisierungsmikroskopie (SPDM) gemäß einem Aspekt der Erfindung.
5 illustriert ein Beispiel der Frequenzverteilung einer abgeschätzten 2D Lokalisierungspräzision.
6 zeigt eine Frequenzverteilung der Abstände des nächsten Nachbars für jedes lokalisierte fluoreszierende Protein und dieselbe Analyse für drei simulierte zufällige Verteilungen derselben Punktdichte.
7 ist eine schematische Darstellung eines noch anderen Beispiels eines kombinierten SPDM/SMI Mikroskop-Aufbaus gemäß einem Aspekt der Erfindung.
8 illustriert das Prinzip von dreidimensionalen Messungen unterhalb einer Auflösungsgrenze eines gegebenen fluoreszenzmäßig markierten Objekts.
9a und 9b zeigen die entsprechenden Histogramme der Verteilung von Photonenzahlen, welche pro Molekül für zwei gemessene Cal-51 Zellen registriert sind bzw. werden.
10 zeigt ein Histogramm einer Lokalisierungsgenauigkeit (paarweiser Mittelwert einer x und y Lokalisierungspräzision) für eine gemessene Cal-51 Zelle.
Eine Vorrichtung (ein Mikroskop) gemäß einem Beispiel der Erfindung ist in 1 gezeigt. Der Apparat bzw. die Vorrichtung umfaßt eine optische Lichtquelle 1, welche für die Emission einer optischen Strahlung mit wenigstens einer Wellenlänge geeignet ist. Das beste Kosten-Nutzen-Verhältnis wird durch Laser als optische Quellen geboten. Ein bewegbares Linsensystem 2 wird verwendet, um den Intensitätsbereich zu ändern oder in diesen umzuschalten, welcher für eine Lokalisierungsmikroskopie verwendet wird, nachdem eine Weitfeldmessung unter Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht abgeschlossen ist. Zusätzlich kann das bewegbare Linsensystem verwendet werden, um die Intensität des Beleuchtungslichts innerhalb des Intensitätsintervalls bzw. -bereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² einzustellen. Zu diesem Zweck ist bzw. wird die optische Strahlung von der Lichtquelle 1 auf einen dünnen Strahl mit der Verwendung des Linsensystems 2 kollimiert.
In diesem Beispiel wird eine periodische strukturierte Beleuchtung 17 zwischen dem ersten Objektiv 9 und dem zusätzlichen zweiten Objektiv 10 generiert bzw. erzeugt. Die Probe 11 kann frei durch die strukturierte Beleuchtung in dem Objektraum zwischen dem ersten Objektiv (9) und dem zweiten zusätzlichen Objektiv 10 bewegt werden. Um dies zu erzielen, wird ein interferometrischer Aufbau mit der Hilfe des Strahlteilers 3 realisiert. Der Spiegel 4 ist bewegbar, wodurch die Änderung der oberen Armlänge des Interferometers in bezug auf die untere Armlänge ermöglicht wird. Auf diese Weise ist es möglich, die strukturierte Beleuchtung durch den Objektraum zu bewegen oder zu verschieben. Die erste fokussierende Linse 5 und die zweite fokussierende Linse 6fokussieren jeweils in der rückwärtigen Brennpunktebene des entsprechenden Objektivs und ermöglichen somit die Erzeugung einer strukturierten Weitfeldbeleuchtung. Der erste dichroitische Strahlteiler 7 und der zweite dichroitische Strahlteiler 8 trennen das Erregungslicht der Quelle (punktierte Linie) von dem Emissionslicht (strichlierte Linie), welches von der Probe 11 kommt bzw. stammt.
Die Probe 11 ist transparent für das Licht auf beiden Seiten der optischen Achse. Auf diese Weise erreichen die Photonen, welche von der Probe 11 in der Richtung des ersten Sensors 13 ausgesandt bzw. emittiert werden, den ersten Sensor 13. Dasselbe ist auch gültig für den zweiten Sensor 14 und die Photonen, welche in der Richtung des zweiten Sensors 14 emittiert werden. Wenn es wünschenswert ist, nur den ersten optischen Detektionspfad bzw. -weg 15 zu realisieren, welcher das erste Objektiv 9, den zweiten dichroitischen Strahlteiler 7 und den ersten Sensor 13 umfaßt bzw. von diesen gebildet ist, dann kann der zweite dichroitische Strahlteiler 8 durch einen zusätzlichen Spiegel 26 und die zylindrische Linse 12 ersetzt werden und der zweite Sensor 14 kann weggelassen werden.
Die Hinzufügung des zweiten optischen Detektionspfads 16 allein verbessert die Lokalisierungsgenauigkeit um etwa 40% bei einer ungefähr isotropen Strahlung des Moleküls aufgrund der höheren Anzahl von detektierten Photonen im Vergleich mit der Detektion, welche nur einen optischen Detektionspfad 15 verwendet. Die Verwendung der zylindrischen Linse 12 erlaubt darüber hinaus ein Verbessern der axialen Lokalisierungsgenauigkeit mit reiner Lokalisierungsmikroskopie auf Kosten der lateralen Lokalisierungsgenauigkeit.
Die präsentierte Vorrichtung bzw. der optische Aufbau ist lediglich ein Beispiel eines optischen Aufbaus, welcher die Grenze bzw. Begrenzung der Lokalisierungspräzision mit der reinen Lokalisierungsmikroskopie mit Hilfe eines Verwendens einer zusätzlichen Entfernt- bzw. Weitfeldanalyse zu überwinden erlaubt. Die erzeugte homogen strukturierte Beleuchtung ist in ähnlicher Weise nur ein Beispiel einer strukturierten Beleuchtung und kann durch andere Arten bzw. Typen einer räumlich strukturierten Beleuchtung ersetzt werden.
Ein Verfahren zum Überwinden der Grenze bzw. des Limits für die Lokalisierungspräzision ist im Detail in 2 gezeigt. Für eine klarere Darstellung ist eine der lateralen Dimensionen (y) weggelassen, da sie vollständig äquivalent zu der anderen lateralen Dimension x ist.
Das Objekt bzw. der Gegenstand 18 wird ursprünglich bzw. anfangs der strukturierten Beleuchtung 17 unterworfen. Zwei Arten von Messungen können dadurch unternommen werden: der sogenannte Phasenscan, bei welchem die strukturierte Beleuchtung 17 verschoben oder bewegt wird und das Objekt 18 unbewegbar bzw. nicht bewegt ist, und der sogenannte Objektscan, während welchem das Objekt 18 relativ zu der statischen strukturierten Beleuchtung 17 und relativ zu dem statischen Objektiv bewegt wird. Eine Kombination beider Methoden bzw. Verfahren ist auch möglich.
Mit jedem der beiden Scanverfahren wird das Licht, welches von dem gesamten Objekt 18 in der interessierenden Region emittiert wird, durch den Sensor (beispielsweise einen zweidimensionalen Sensor) detektiert und das entsprechende Sensorbild wird in geeigneten Speichermitteln gespeichert. Aus dem Phasenscan ist es möglich, die relative z-Phase jedes lateralen Punkts mit einer Präzision von einigen wenigen Nanometern durch ein Evaluieren der resultierenden Modulation 19 für jedes Sensorelement zu extrahieren. Aus dieser Information ist es möglich, die Position der Schwerpunkte der Fluoreszenz der beobachteten Objekte 18 zu erhalten. Aus dem Objektscan ist es möglich, mit einer Präzision von etwa einigen Nanometern die Erstreckung entlang der optischen Achse jedes lateralen Punkts durch ein Evaluieren der resultierenden Modulation 21 für jedes Sensorelement zu extrahieren. Die Erstreckung des Objekts 18 entlang der optischen Achse kann mit einer Nanometerpräzision aus den Modulationskontrasten bestimmt werden (1-R1/R2, wobei R1 die innere Umhüllende der Modulation ist und R2 die äußere Umhüllende der Modulation ist). Insgesamt wird vollständige Information betreffend die Position und Erstreckung des Objekts 18 entlang der optischen Achse 23 erhalten. Für jedes lateral lokalisierte Fluoreszenzmolekül können die axiale Position (relative Phase umgewandelt auf reale Abstände) und die Lokalisierungspräzision (Erstreckung des Objekts 18) mit einer Nanometerpräzision bestimmt werden. Für die beschriebene Entfernt- bzw. Weitfeldmessung ist ein einziger Objektscan oder ein einzelner Phasenscan ausreichend. Optimale Resultate können durch eine Kombination der zwei Scans erzielt werden, wie dies in 2 gezeigt ist, da die Methoden unterschiedlich geeignet für ein Erhalten von unterschiedlichen Rückschlüssen bzw. Information geeignet sind. In 2 bezieht sich das Bezugszeichen 20 auf die Bestimmung der axialen Position des Schwerpunkts der Emission (Objektposition) und das Bezugszeichen 22 bezieht sich auf die axiale Erstreckung des beobachteten Objekts entlang der z-Achse.
Ein weiteres Beispiel einer Vorrichtung (Mikroskop) gemäß einem Aspekt der Erfindung ist in 3 gezeigt. Diese Vorrichtung verwendet eine minimale Anzahl von optischen und mechanischen Komponenten. Der optische Beleuchtungspfad besteht nur aus einer einzigen Quelle einer optischen Strahlung 1, einer bewegbaren Linse 24, einem ersten dichroitischen Strahlteiler 7 und dem ersten Objektiv 9. Die Brennweite der Linse 24 wird derart bestimmt, daß ein Umschalten auf die oder eine Einstellung der Intensität innerhalb des Intervalls von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² möglich ist. Das Erregungslicht von der Quelle 1 (punktiert) tritt durch die Probe 11 hindurch und wird durch den bewegbaren Spiegel 25 zurück reflektiert. Zwischen dem ersten Objektiv 9 und dem bewegbaren Spiegel 25 wird ein Feld einer stehenden Welle aufgebaut, welches für die Weitfelduntersuchung in der oben beschriebenen Weise verwendet werden kann. Die strukturierte Beleuchtung kann mittels einer Bewegung des Spiegels 25 verschoben werden. In ähnlicher Weise kann ein optisches Gitter oder ein weiteres optisches Element verwendet werden, um die strukturierte Beleuchtung zu realisieren. Mit dem oben beschriebenen Verfahren und der oben beschriebenen Vorrichtung ist es möglich, eine hoch präzise, schnelle und zur selben Zeit einfache, ökonomische und kostengünstige Lokalisierung von einzelnen Farbstoffmolekülen in der Fluoreszenzmikroskopie zu realisieren.
4 bis 6 beziehen sich auf noch ein anderes Beispiel einer Vorrichtung und eines entsprechenden Verfahrens für eine Lokalisierungsinformation unterhalb einer Auflösungsgrenze in dem Maßstab einer Nanometerauflösung durch Verwendung einer SPDM mit konventionellen Fluorochromen, welche ein ”reversibles Photobleichen” oder ”Blinking” zeigen. Wie bereits oben erläutert, wurde das ”reversible Photobleichen” als ein allgemeines Verhalten in verschiedenen fluoreszierenden Proteinen, beispielsweise eGFP, eYFP oder eCFP oder mRFP bei einer Beleuchtung bzw. Bestrahlung mit Licht hoher Intensität gezeigt. Dieser Effekt wurde als pH-abhängig beschrieben, wobei er üblicherweise auf einer Zeitskala von 10–100 s auftritt, wobei dies unter einem Aussetzen an Laser modifiziert werden kann. Ähnliche ”Blinking” Mechanismen existieren für andere, nicht auf einem Protein basierende fluoreszierende Farbstoffe, z. B. Alexa 488. Jegliches Fluorochrom dieser Familie von durch Erregung aktivierten, reversiblen photobleichenden Fluorochromen wird mit einer Abkürzung ”PHYMOD” Fluorochrome genannt (PHYsically MODifiable fluorochromes, physikalisch modifizierbare Fluorochrome).
Subzellulare Strukturen wurden mit unterschiedlichen PHYMOD Fluorochromen markiert und Bilder wurden in einer raschen Zeitsequenz unter geeigneten Fokussierungsbedingungen der Erregung erhalten bzw. erfaßt. In diesem speziellen Beispiel konnte eine Lokalisierungspräzision hinab bis zu 5 nm erzielt werden, und die gemessenen Strukturen durch Weitfeldlichtnanoskopie mit einer effektiven optischen Auflösung bis zu dem molekularen Maßstab in dem Bereich von 10 nm visualisiert werden.
In 4 ist der prinzipielle Aufbau des SPDM Mikroskops schematisch gezeigt. Muster bzw. Proben 41, welche auf Standardglasträgern gemäß routinemäßigen biologischen Herstellungsbedingungen vorbereitet bzw. hergestellt wurden, wurden verwendet. Die vorbereitete Probe 41 wurde auf einer piezoelektrischen Bühne 44 angeordnet, welche durch einen Controller bzw. eine Regel- bzw. Steuereinrichtung geregelt bzw. gesteuert wird.
Die Proben 41 können beispielsweise in einem standardmäßigen Weitfeld-Epifluoreszenz-Modus oder in einem Einzelmolekül-SPDM-Nanoskopie-Modus abgebildet werden. Die Proben 41, welche durch PHYMOD Fluorochrome markiert sind, werden durch einen ersten Laser 31 (beispielsweise einen Ar+-Laser 32 bei 488 nm) oder einen zweiten Laser 32 (beispielsweise einem Kr+-Laser bei 568 nm) bestrahlt bzw. beleuchtet, welche durch eine Objektivlinse 33, beispielsweise eine Objektivlinse mit 100x/NA1.4, oil (Leica) fokussiert werden. Unter Verwendung von zusätzlichen Rohr- bzw. Tubusoptiken kann dieses Fokussieren in einer derartigen Weise modifiziert werden, daß viele fluoreszierende Moleküle in dem Beobachtungsvolumen durch bzw. an moderate bzw. mittlere bis hohe Laserleistung (etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm²) innerhalb einer breiten interessierenden Region (”subkritisches Fokussieren”) ausgesetzt werden. Unter diesen Bedingungen zeigen PHYMOD Fluorochrome ihr charakteristisches reversibles Photobleichen oder Blinking, welches verwendet wird, um die Lokalisierung von individuellen bzw. einzelnen Molekülen zu identifizieren und räumlich zuzuordnen.
In einem spezifischen Beispiel konnten etwa 10.000 bis 100.000 einzelne Moleküle in einer interessierenden Region von gegenwärtig bis zu 70 μm × 70 μm detektiert werden. Unter Verwendung einer empfindlichen Bilderfassungskamera 42 (beispielsweise SensiCam qe, PCO) mit einer quadratischen Bildpunkt- bzw. Pixelgröße von 6,45 μm × 6,45 μm als einem Bildinformation erhaltenden bzw. erfassenden Sensor, wurden Zeitserien von zweidimensionalen (2D) Bildern mit einer Wiederholungsrate von etwa 10–16 Hz erhalten bzw. aufgenommen. Ein typischer Zeitstapel von 2.000 Bildern wird allgemein innerhalb von etwa 2,5 min erhalten. Die zweidimensionalen Bilder, welche durch die Kamera 42 erhalten bzw. aufgenommen bzw. erfaßt werden, werden in einer Speichereinheit bzw. Speichermitteln einer Be- bzw. Verarbeitungseinheit 45 gespeichert. Die Bearbeitungseinheit 45 kann darüber hinaus den Controller bzw. die Regel- bzw. Steuereinrichtung umfassen bzw. implementieren, welche(r) die Piezo-Bühne regelt bzw. steuert. Zusätzlich kann die Bearbeitungseinheit 45 konfiguriert sein, um die erhaltene Bildserie zu bearbeiten, um räumliche und/oder Distanzinformation zu erhalten. Die Bearbeitungseinheit 45 kann beispielsweise ein Computer für allgemeine Zwecke, wie beispielsweise ein Personal Computer, eine speziell bestimmte Hardware, etc. sein. Die Bearbeitungseinheit 45 kann darüber hinaus ein graphisches Benutzerinterface, beispielsweise ein interaktives graphisches Benutzerinterface umfassen, welches die Darstellung der detektierten Bilder und der Resultate der Bildbearbeitung erlaubt.
In 4 bezeichnen Bezugszeichen 34 und 35 dichroitische Elemente (dichroitische Spiegel), Bezugszeichen 36 bis 39 bezeichnen Linsen oder Linsensysteme, Bezugszeichen 40 bezeichnet ein blockierendes Filter bzw. dichroitisches Element, um das Beleuchtungslicht zu blockieren; Bezugszeichen bezeichnet eine Objektivlinse und Bezugszeichen 46 bis 48 bezeichnen Spiegel.
Für Lokalisierungs- und Distanz- bzw. Abstandsmessungen zwischen einzelnen Molekülen können verschiedene Computeralgorithmen, welche durch die Bearbeitungseinheit 45 ausgeführt werden, verwendet werden. In einem Beispiel können die PHYMOD Fluorochrome entlang der erhaltenen Bildserie durch eine Unterteilung von jeweils zwei aufeinanderfolgenden Bildern detektiert werden, welches die Detektion von lokalen Intensitätsänderungen entsprechend einem Erscheinen und Verschwinden von Signalen eines einzelnen Moleküls erlaubt. In einem gegebenen Bildrahmen werden alle Signale von PHYMOD Fluorochromen gleichzeitig registriert, und eine Modellfunktion wird an ihren Schwerpunkt der Fluoreszenz (d. h. ”Schwerpunktzentrum der Intensität”) in dem ursprünglichen Bild gefittet bzw. angepaßt. Diese genaue Positionsbestimmung kann durch einen nicht-linearen Fit basierend auf dem Levenberg Marquard Algorithmus unter Verwendung einer analytisch berechneten Punktspreizfunktion oder einer Gauß'schen Verteilung durchgeführt werden, welche beide eine Hintergrundsignalnäherung berücksichtigen. Die Positionen können gemeinsam mit Abschätzungen der individuellen Lokalisierungspräzision bestimmt werden, welche mit den Abschätzungen konsistent sind, welche die erhaltene Photonenanzahl für jedes Signal berücksichtigen.
Nach einer Registrierung der Positionen der einzelnen Moleküle durch den gesamten Bildzeitstapel werden alle diese Positionen einem ”zusammengefaßten” 2D Bild zugeordnet. Um die Lokalisierungsgenauigkeit anzuzeigen, können sie durch eine Gauß'sche Intensitätsverteilung mit einer Standardabweichung gleich der mittleren Lokalisierungspräzision der jeweiligen Moleküle verteilt werden. Abstandsmessungen können aus den Abständen des Schwerpunkts zwischen diesen rekonstruierten Positionen erhalten werden, welche die Lokalisierungspräzision für Fehlerabschätzungen berücksichtigen.
Um das Potential der SPDM Nanoskopie gemäß einem Aspekt der Erfindung in zellularen Systemen anzuzeigen, wurden als ein Beispiel SKBr3 Mammakarzinomzellen auf Trägerplatten bzw. Objektträgern gemäß Standardbedingungen wachsen gelassen und die Plasmamembran und ihre Protrusionen wurden unter Verwendung von Organelle Lights^TM (Invitrogen) gemäß dem Herstellerprotokoll mit YFP, ausgesetzt an PHYMOD Bedingungen visualisiert. Jeweils 20 oder 48 Stunden nach der Transduktion wurden die Zellen mit 4 Formaldehyd in PBS fixiert und mit ProLong^® Gold Schwundminderungsreagenz (Invitrogen) eingebettet. Auf diese Weise wurden nur Proteine, welche auf die Zellmembran beschränkt sind, markiert bzw. gekennzeichnet.
Die derart vorbereiteten menschlichen SKBr3 Zellen wurden unter Verwendung des obigen optischen Aufbaus gemessen. Die einzelnen YFP Moleküle in dieser Zelle konnten mit einer Präzisionsabschätzung von etwa 14 nm im Durchschnitt hinab bis zu einem Minimum von 5 nm lokalisiert werden.
5 illustriert die Frequenzverteilung (Ordinate), welche als eine Funktion der abgeschätzten 2D-Lokalisierungspräzision in nm (Abszisse) von gemessenen 12.115 fluoreszierenden Molekülen mit einer mittleren Lokalisierungspräzision von 14,8 nm gezeigt bzw. dargestellt ist. Mehr als 500 Moleküle in diesem Bild zeigen eine Lokalisierungspräzision von besser als 8 nm. Aus diesen Lokalisierungsdaten können Abstände in dem Bereich von 10–30 nm bestimmt werden.
6 zeigt die Frequenzverteilung (Ordinate) der Abstände des nächsten Nachbars in nm (Abszisse) für jedes lokalisierte fluoreszierende Protein (Linie L1) und dieselbe Analyse für drei simulierte zufällige Verteilungen derselben Dichte (Linie L1 bis L4). In 6 wird eine Bestimmung des Abstands des nächsten Nachbars für alle Moleküle innerhalb einer vorbestimmten interessierenden Region mit drei zufälligen Verteilungen (einheitliches Aufweiten bzw. Verbreitern) derselben Markerdichte verglichen. Das Resultat zeigt, daß die fluoreszierenden Proteine zufällig in diesem Bereich verteilt sind. Strukturinformation, wie eine lokale Dichte als auch Periodizitäts- oder Orientierungsmerkmale können aus der Form bzw. Gestalt der berechneten Kurven erhalten werden.
Somit war es möglich, individuelle Moleküle in Zellmembranen durch die SPDM Nanoskopie gemäß einem Aspekt der Erfindung zu lokalisieren. Die Resultate deuten an, daß es unter Verwendung von PHYMOD Fluorochromen möglich ist, Bilder zu erhalten, in welchen Abstände in dem Bereich von 10 nm nur unter Verwendung von lediglich geringfügig modifizierten standardmäßigen Epifluoreszenzmikroskopie-Aufbauten und konventionell markierten Mustern bzw. Proben bzw. konventionellen fluoreszierenden Markierungen aufgelöst werden. Dies macht die Technik einfach handhabbar, schnell und wirtschaftlich. Der Erhalt bzw. die Erfassung eines Bildstapels von einigen tausend Bildern erfordert lediglich einige wenige Minuten. Auf diese Weise werden selbst Anwendungen in einem Abbilden von lebenden Zellen möglich. PHYMOD Fluorochrome sind nicht auf gelb fluoreszierende Proteine allein beschränkt. Es wurde erfolgreich SPDM Nanoskopie auch auf zellulären Proben angewandt, welche mit den folgenden Fluorochromen markiert waren: eGFP, CFP, Alexa 488, Alexa 568. Eine Positions- und Abstandsbestimmung bei dem niedrigen Nanomaßstab bietet die Möglichkeit für eine große Anzahl von strukturellen Untersuchungen. Dies eröffnet neue Perspektiven für eine korrelative Mikroskopie (Lichtmikroskopie gegenüber ionisierenden Abbildungstechniken). Für das hier gezeigte Beispiel wurden bisher nur 2D-SPDM Nanoskopie angewandt. Mit der Kombination von SPDM Nanoskopie und SMI Mikroskopie (Spatially Modified Illumination, räumlich modifizierte Beleuchtung) oder anderen Techniken einer strukturierten Beleuchtung wird ein 3D-Abbilden mit einer effektiven optischen Auflösung in dem Bereich von einigen wenigen zehn Nanometer im Prinzip erzielbar. Diese Entwicklungen in einer Hochauflösungs-Fluoreszenz-Nanoskopie werden neue Einblicke in zelluläre Struktur und Funktion bieten.
Somit betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine neuartige Technik einer Weitfeldlokalisierungs-Nanoskopie unter Kombination von Spektralpräzisions-Abstandsmikroskopie (SPDM, Spectral Precision Distance Microscopy) und weit verbreitet verwendeten Fluorochromen, wie beispielsweise GFP Derivativen CFP, eGFP, YFP und eYFP, als auch den Fluoreszeinderivativen, wie beispielsweise Alexa 488 und Alexa 568. SPDM erlaubt das Überschreiten bzw. Überwinden von klassischen Auflösungslimits bzw. -grenzen in Fluoreszenzweitfeldmikroskopie durch eine präzise Objektlokalisierung nach einer optischen Isolation in der Zeit. Basierend auf den Prinzipien dieser Technik wurde ein nanoskopischer bzw. Nanoskopie-Aufbau für eine laseroptische Präzisionslokalisierung und Bildrekonstruktion mit einer stark erhöhten Auflösung in intakten Zellen realisiert. Dies erlaubt insbesondere eine räumliche Nanometerzuordnung von individuellen fluoreszierenden Molekülen mit einer Subpixelpräzision, welches mit Hilfe eines von einer Erregungsintensität abhängigen reversiblen Photobleichens von fluoreszierenden Proteinen und eines raschen zeitsequentiellen Abbildens unter entsprechenden Fokussierbedingungen erzielt wurde. Der Vorteil der Technik ist, daß sie leicht für eine zelluläre Nanostrukturanalyse angewandt werden kann. Unter Verwendung von genetisch codiertem gelb fluoreszierendem Protein können Membranstrukturen durch sichtbares Licht mit einer Lokalisierungsgenauigkeit bis zu 5 nm bestimmt werden; somit wurden Abstände in dem Bereich von 10–30 nm nanoskopisch zwischen individuellen fluoreszierenden Molekülen aufgelöst, wobei dies erlaubt, unterschiedliche quantitative Strukturanalysewerkzeuge anzuwenden.
7 bis 10 beziehen sich auf noch ein anderes Beispiel einer Vorrichtung (Mikroskop) und eines Verfahrens unter Verwendung von SPDM/SALM in Kombination mit räumlich modulierter Beleuchtung (SMI) entlang der optischen Achse, um dreidimensionale Messungen, insbesondere eine dreidimensionale (3D) Einzelmoleküllokalisierung und eine entsprechende 3D effektive Auflösung durchzuführen.
Die Verwendung der SMI Mikroskopie erlaubt die Bestimmung der axialen Erstreckung (d. h. ”Größe”) einer fluoreszenzmäßig markierten Nanostruktur (bei einer gegebenen x, y Position) hinab bis zu einigen zehn nm. Beispielsweise bedeutet, wenn für die axiale (z) Erstreckung dz einer derartigen Nanostruktur bestimmt wurde, daß sie 30 nm beträgt, dies, daß die meisten der Moleküle innerhalb dieser Nanostruktur einen axialen Abstand voneinander aufweisen, welcher 30 nm nicht übersteigt. Dementsprechend würde der kleinste auflösbare axiale Abstand (oder eine z-Auflösung) ebenfalls etwa 30 nm betragen; wenn eine signifikante Anzahl von Molekülen einen größeren z-Abstand voneinander haben würde, würde dies zu einer breiteren (z) Erstreckung als gemessen führen. Zusätzlich wird die maximale axiale Lokalisierung z₀ dieser Moleküle durch das Maximum der axialen SMI Intensitätsverteilung gegeben.
Aus dieser allgemeinen Idee wurde der folgende Zugang gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung abgeleitet. Zuerst wird das Positionsintervall dz der Moleküle entlang der optischen Achse (z) für jedes einzelne (x, y) Pixel bestimmt. Je kleiner die axialen Erstreckungen dz der markierten Nanostrukturen sind, um so präziser können ihre Marker bzw. Markierungen (fluoreszierenden Moleküle) entlang der optischen Achse lokalisiert werden, und um so besser wird die axiale effektive optische Auflösung sein (d. h. der kleinste axiale Abstand zwischen zwei markierten Molekülen, welcher detektiert werden kann). Beispielsweise sollte, wenn für die laterale (x, y) Lokalisierungsgenauigkeit angenommen wird, daß sie 15 nm beträgt, und wenn für die minimale meßbare axiale (z) Erstreckung dz angenommen wird, daß sie 30 nm beträgt, dann ein lateraler Abstand zwischen Molekülen gleich und größer als etwa 35 nm detektierbar sein, wobei dies aufgrund der resultierenden Verbreiterung der axialen Erstreckung detektierbar sein sollte. Aus diesem kann für dieses Beispiel eine gesamte 3D Auflösung von etwa 40 nm abgeschätzt werden.
Optischer Aufbau
7 ist ein schematischer Überblick eines kombinierten SPDM/SMI optischen Aufbaus, welcher verwendet wird, um Messungen unterhalb einer Auflösungsgrenze durchzuführen. Eine wesentliche Verbesserung verglichen mit einem Weitfeldfluoreszenzmikroskop ist das Muster einer strukturellen Beleuchtung in der Form eines Felds einer stehenden Welle entlang der optischen Achse, welches zwischen den zwei Objektivlinsen erzeugt wird. Dieses Feld einer stehenden Welle erlaubt, eine genaue Größen- und Positionsinformation entlang der optischen Achse z zu erhalten. Ein zweiter Detektionspfad unter Verwendung des zweiten Objektivs und eines weiteren Sensors kann leicht aufgebaut werden, wobei dies erlaubt, daß entweder die detektierte Photonenanzahl verdoppelt wird oder eine biplanare Detektion implementiert wird, während dieselbe Stärke in einer Ebene beibehalten wird.
In diesem Beispiel kann ein SMI Mikroskopaufbau verwendet werden, um SPDM Beobachtungen mit Molekülen durchzuführen, welche einem reversiblen Photobleichen unterworfen sind. Für eine Beleuchtung und eine Erregung sind bis zu drei Laserquellen 51 für ein λ_exc = 488 nm, 568 nm und 647 nm verfügbar. Die Lichtquellen 51 können unabhängig voneinander mit Verschlüssen ein- und abgeschaltet werden, bevor sie mit dichroitischen Spiegeln kombiniert werden. Die drei Laserlinien sind bzw. werden in den Kollimator 52 gerichtet, welcher zwei Achromate mit Brennweiten von 10 mm und 100 mm umfaßt, um den Strahl auf einen Durchmesser von etwa 20 mm aufzuweiten. Der aufgeweitete Laserstrahl wird dann durch einen 50:50 Strahlteiler 53 aufgespaltet, wobei dies zwei Kohärente, sich gegenläufig fortpflanzende und kollimierte Laserstrahlen ergibt, welche in der rückwärtigen Brennebene von zwei gegenüberliegenden Ölimmersions-Objektlinsen 54 und 55 (beispielsweise Ölimmersionslinsen 100x, NA = 1,4) fokussiert sind bzw. werden. Dies resultiert in zwei sich gegenläufig bzw. entgegengesetzt fortpflanzenden kollimierten Strahlen. Eine Interferenz zwischen diesen zwei Strahlen erzeugt ein Feld einer stehenden Welle in dem Raum zwischen den zwei Objektivlinsen 54 und 55 und somit eine cos²-Form Verteilung der Intensität entlang der optischen Achse z.
Proben können unter Verwendung von gewöhnlichen Objektträgern und/oder Deckgläsern vorbereitet werden und werden dann zwischen den zwei Objektivlinsen angeordnet und entlang der optischen Achse mit einer piezoelektrischen Bühne 56 bewegt, wobei dies erlaubt, daß 3D Bildstapel der Muster bzw. Proben aufgenommen werden. Eine zusätzliche piezo-elektrische Bühne, welche die Position eines montierten Spiegels 57 (Piezospiegel) regelt bzw. steuert, erlaubt, daß die relative Phase in den zwei Interferometerarmen bzw. -wegen variiert wird. Das Emissionslicht von den fluoreszierend markierten Target- bzw. Zielregionen, welches durch die Detektionsobjektivlinse 55 gesammelt wird, wird dann von dem Erregungslicht durch einen dichroitischen Spiegel 58 getrennt und durch eine Rohrlinse (nicht gezeigt) auf eine hoch-empfindliche 12-bit schwarz-weiß CCD Kamera 59 für ein Abbilden bzw. Bildaufnehmen fokussiert. Vor dem CCD Chip blockiert ein blockierendes Filterrad 60 jegliches verbleibende Erregungslicht und in Abhängigkeit von der Filterauswahl einer Bandfluoreszenz. Darüber hinaus kann ein weißes Licht emittierende Diode in einem Transmissionsmodus verwendet werden, um die Brenn- bzw. Brennpunktebene zu lokalisieren, um ein Bleichen der Farbstoffe zu reduzieren. In 7 bezeichnen die Bezugszeichen 61 und 62 jeweils eine erste (61) und eine zweite fokussierende (62) Linse und das Bezugszeichen 63 bezeichnet einen Spiegel.
Datenerfassung
Die Kombination von SPDM/SMI Verfahren für ein hoch auflösendes 3D Abbilden verwendet zwei unterschiedliche Erfassungsprozesse, einen SPDM Lokalisierungsbild-Erfassungsprozeß und einen SMI Bild-Erfassungsprozeß.
Zuerst werden SMI Bilder bei niedrigen Beleuchtungsintensitäten mit einem vernachlässigbaren Bleichen aufgenommen. Eine typische Intensität ist etwa 100 W/cm² und eine Kameraintegrationszeit von 100 ms pro Rahmen. Dafür werden das Objekt und die strukturierte Beleuchtung relativ zueinander in diskreten Schritten (Δz) von typischerweise 20 bis 40 nm bewegt. In dem Fall, wo das Objekt stationär ist und die strukturierte Beleuchtung beispielsweise durch ein Einstellen des Piezospiegels 57 des optischen Aufbaus bewegt wird, der in 7 gezeigt ist, wird dies ein Phasenscan genannt. Andernfalls wird, wenn das Objekt selbst in dem Feld der stehenden Welle beispielsweise durch ein Einstellen der Piezo-Bühne 56 in dem optischen Aufbau bewegt wird, der in 7 gezeigt ist, dieser Prozeß ein Objektscan genannt. Jeder des Phasen- und des Objektscans ergibt die gewünschte axiale Information. Nach jedem Δz Schritt wird ein Weitfeldbild durch die CCD Kamera aufgenommen und alle Bilder (in einem spezifischen Fall etwa 200) werden auf einem geeigneten Speichermedium innerhalb eines ersten Datenstapels gespeichert, welcher ein z-Stapel genannt wird.
Nachdem die SMI Modus Registration abgeschlossen ist, wird eine Datenerfassung für die 2D SPDM Lokalisierung bei höheren Laserintensitäten von etwa 1 kW/cm² bis etwa 1 MW/cm² durchgeführt. In einer Implementierung wird nur eine Laserlinie (λ_exc = 488 nm) für alle Messungen verwendet. Keine weitere Objektbewegung ist während des 2D SPDM Erfassungsprozesses notwendig. Unter Anwendung von Rahmenraten von 10 fps bis 18 fps (fps – frame per second, Rahmen pro Sekunde) werden die einzelnen Weitfeldbilder (etwa 1000 bis 3000 pro Objekt) in einer Aufeinanderfolge innerhalb eines zweiten Datenstapels gesichert bzw. gespeichert, welcher ein Zeitstapel genannt wird.
Die interessierende Region kann dieselbe für die zwei Erfassungsprozesse sein. Die interessierende Region kann beispielsweise auf 100 μm² bis 5000 μm² in Abhängigkeit von der interessierenden Struktur festgelegt werden.
Datenevaluierung
2-D Lokalisierung
Nach der Datenerfassung kann der erste Evaluierungsschritt die 2D SPDM Lokalisierung sein. Da die Quelle des erfaßten bzw. erhaltenen Signals ein ”punktartiges” Molekül ist (d. h. Durchmesser << λ_exc), kann für die Evaluierung die Kenntnis, wie ”punktartige” Objekte durch das Mikroskopsystem abgebildet werden, angewandt werden. Basierend auf dieser Kenntnis kann eine Modellfunktion an die erhaltenen bzw. erfaßten Signale gefittet bzw. angepaßt werden, welche Effekte einer Datenabtastung bzw. Probennahme (Größe und Abstand der Pixel der CCD Kamera) und der entsprechenden Rauschnatur berücksichtigt.
Um die Rauschbetrachtungen des Fitalgorithmus in einer geeigneten Weise zu verwenden, kann eine Konversion bzw. Umwandlung von Kamerazählungen auf Photonen unter Verwendung insbesondere von Information betreffend die Quanteneffizienz in dem spezifischen Lichtmodus (beispielsweise Niedriglichtmodus) der CCD Kamera durchgeführt werden, welche üblicherweise mit dem Handbuch der CCD Kamera und einer Information über den Analog/Digital (A/D) Umwandlungsfaktor des spezifischen Verstärkungsmodus zur Verfügung gestellt wird. In einem Beispiel ist die verwendete CCD Kamera eine 12-bit schwarz-weiß Kamera (SensiCam QE, PCO Imaging, Kelheim, Deutschland), für welche in einem Niedriglichtmodus die Quanteneffizienz für eine YFP Emissionsstrahlung zwischen 490 und 560 nm 64 ± 1% oder 0,64 e^–/Photon ist. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß der Analog/Digital (A/D) Umwandlungsfaktor in diesem Hochverstärkungsmodus 2e^–/Zählung ist, kann die Zählanzahl mit 2/0,64 Photonen/Zählung = 3,13 Photonen/Zählung multipliziert werden.
Der Fitprozeß kann unter Verwendung von beispielsweise zwei unterschiedlichen Implementierungen des Levenburg-Marquardt Algorithmus mit einer Gauß'schen Verteilung f(x, y) von Photonen und einer Modellfunktion für das Signal in der Objektebene durchgeführt werden:
In der obigen Formel sind x₀ und y₀ die Startparameter für die Position, welche als das Zentrum des segmentierten Signals bestimmt wurden. A ist die Amplitude der Verteilung und B₀, B₁, B₂ sind Parameter, welche einen linearen Hintergrund beschreiben.
Dieser erste Fitalgorithmus löst das Problem der gewichteten geringsten Quadrate, wobei das bekannte Rauschmodell der Signalerfassung berücksichtigt wird (Gauß'sches Auslese-Rauschen des Detektors kombiniert mit einem Poisson Photon- und Umwandlungsrauschen). Der zweite Fitalgorithmus ist ein Algorithmus geringster Quadrate. Beide Algorithmen sind computerimplementiert und können in verschiedenen Programmiersprachen oder Softwarepackages implementiert sein, welche auf einem Computer für allgemeine Zwecke oder einem spezialisierten Computer oder einer Computerhardware oder einem Netzwerk von Computern ausgeführt werden.
Der Ursprung des Signals und somit die Position des Quellmoleküls (d. h. des fluoreszierenden Moleküls, welches die Quelle eines speziellen Signals ist) kann lateral (d. h. in der Objektebene x, y) mit einer Genauigkeit (Standardabweichung) σ_lat von weniger als 5 nm (Lokalisierungsgenauigkeit) bestimmt werden. Unter den Bedingungen, welche in der zweiten Ausführungsform verwendet werden, können die Lokalisierungsfehler, welche aus der unbekannten Orientierung der Moleküle resultieren, vernachlässigt werden. Da das Limit der Lokalisierungsgenauigkeit durch die Beziehung σ_lat ≈ λ_emission/[NA·n_γ1/2] abgeschätzt werden kann, die Emissionswellenlänge λ_emission, die numerische Apertur der Optiken NA und die Anzahl von detektierten Photonen n_γ gegeben sind, ist die hauptsächliche Beschränkung der Lokalisierungsgenauigkeit die Anzahl der gesammelten Photonen.
3D Lokalisierung
Das Prinzip einer 3D Lokalisierung wird in 8 zusammengefaßt. Eine beispielhafte Nanostruktur von Interesse (d. h. Objekt von Interesse bzw. interessierendes Objekt) mit einer lateralen (x, y) und einer axialen (z) Verteilung ist in 8a gezeigt. Von allen Molekülen der Nanostruktur bei einer gegebenen x, y Position wird angenommen, daß sie eine axiale Erstreckung von weniger als etwa 130 nm (beispielsweise dz ^~ 60 nm) aufweisen. Das interessierende Objekt (8a) wird innerhalb eines Felds einer stehenden Welle entlang der optischen Achse angeordnet und dadurch erregt, wie dies in 8b gezeigt ist. Entweder das Feld der stehenden Welle (Phasenscan) oder das Objekt (Objektscan) wird in gleichmäßigen Schritten (beispielsweise Δz = 20 nm – 40 nm) bewegt. 8c zeigt die detektierte Intensitätsverteilung entlang der z-Achse für einen Phasenscan, 8d zeigt die detektierte Intensitätsverteilung entlang der z-Achse für einen Objektscan.
Bei jedem Schritt wird die Fluoreszenzemission detektiert und getrennt in einem Rahmen gespeichert. Alle Rahmen werden dann in einem 3D Datenstapel (z-Stapel) gespeichert, welcher die axiale mittlere Position z₀(e) darstellt, wie dies in 8e gezeigt ist, welche von dem Maximum der Intensitätsverteilung erhalten wird, welche in 8d gezeigt ist. Durch ein Evaluieren der Scandaten (Phasenscandaten, welche in 8c gezeigt sind, oder Objektscandaten, welche in 8d gezeigt sind), kann die räumliche Erstreckung dz des Objekts, welche aus dem Kontrast in der Modulation r = max – min / max bestimmt wird, wobei max die maximale Intensität ist und min die minimale Intensität entlang der Zeitachse (entsprechend der z-Koordinate) ist, mit einer Präzision von einigen Nanometern erhalten werden. 8g zeigt die zusammengefaßten axialen (z) Daten für alle Pixel der interessierenden lateralen (x, y) Region.
Die interpolierte axiale Information (8g) kann dann mit den Einzelmolekülpositionen der 2D SPDM Lokalisierung kombiniert werden, wobei dies in einem 3D Bild mit einer effektiven optischen 3D Auflösung in dem Nanomaßstab resultiert, wie dies in 8h gezeigt ist. In einem Beispiel hat das resultierende 3D SPDM Bild eine effektive 3D optische Auflösung von etwa 30 nm lateraler effektiver optischer Auflösung (erhalten aus der x, y Lokalisierungsmikroskopie) und 40 nm axialer effektiver optischer Auflösung (erhalten aus den z-Erstreckungs-Messungen). Wenn nur ein Fluorophor mit einer ausreichenden Photostabilität entlang der z-Achse erregt wird, kann seine z-Position durch SMI mit einer Genauigkeit sogar in dem Bereich von 1–2 nm überwacht werden.
Unten sind einige Beispiele der Anwendung des obigen Verfahrens und optischen Aufbaus auf Messungen unterhalb einer Auflösungsgrenze von biologischen Strukturen.
Probenvorbereitung
Als ein erstes Anwendungsbeispiel zum Verwenden des oben beschriebenen hoch auflösenden 3D SPDM/SMI für ein Abbilden von biologischen Nanostrukturen wurde die Plasmamembran der menschlichen Brustkrebszellinie Cal-51 analysiert, welche mit gelb fluoreszierendem Protein (YFP) markiert war.
Cal-51 Brustkrebszellen von menschlichem Ursprung wurden routinemäßig in einem DMEM Medium kultiviert, ergänzt mit 10% FCS, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin bei 37°C und 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator. Die Zellen wurden dann auf 20 × 20 nm Objektträger angesetzt und über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator wachsen gelassen. Ein Markieren der Plasmamembran wurde durch Organelle lights (Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das Kit basiert auf genetisch codierten fluoreszierenden Proteinen (YFP), welche mit Signalpeptiden verschmolzen sind, welche die fluoreszierenden Marker (Markierung) zu spezifischen zellulären Bereichen, in diesem Fall die Plasmamembran richten. Eine zelluläre Lieferung wird durch BacMam Technologie basierend auf dem Baculovirus erzielt. Die Zellen wurden dann für 24 h bei 37°C und 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator inkubiert und nachfolgend in 4% Formaldehyd in PBS fixiert, um die Zellstruktur zu stabilisieren. Die Transduktionseffizienz war etwa 60%.
Die Zellen wurden mit ProLOngGold Schwundminderungsreagenz (Invitrogen) montiert. Ein Tropfen von Antifade- bzw. Schwundminderungsreagenz wurde auf einem Objektträger angeordnet und das Deckglas wurde, mit der Zellseite nach unten, sorgfältig abgesenkt. Die Objektträger bzw. -gläser wurden mit Nagellack versiegelt und bei 4°C im Dunkeln bis zu einer Verwendung gelagert.
Beispiel 1: Zweidimensionale SPDM Rekonstruktion
Als ein erstes Anwendungsbeispiel wurde das SPDM mikroskopische Verfahren gemäß der obigen Beschreibung für die zweidimensionale (2D) Rekonstruktion der Verteilung von Membranproteinen verwendet. Für dieses Beispiel wurden Zellen von menschlichem Brustkrebs Cal-51 mit gelb fluoreszierenden Proteinen (YFP) markiert. Während des SPDM Abbildungsprozesses wurden die YFP Moleküle einer geeigneten physikalischen Modifikation basierend auf einem reversiblen Photobleichen unterworfen, wie dies oben beschrieben ist. Für ein glatteres Aussehen und für eine Anzeige der Lokalisierungspräzision wurden die Pixel (10 nm Pixelgröße) entsprechend den Positionen und der Anzahl der lokalisierten fluoreszierenden Proteine über einen Gauß'schen Kernel mit einer Standardabweichung von 15 nm verschmiert. In diesem Beispiel betrug die (x, y) Breite der feinsten aufgelösten Strukturen (zelluläre Protrusionen) in den SPDM Bildern etwa 50 nm–60 nm. Die Verteilung der Anzahl von gesammelten Photonen pro Molekül (9) erlaubt, die begrenzende Lokalisierungsgenauigkeit aufgrund einer Photonenstatistik dahingehend abzuschätzen, daß sie in dem Bereich von 6 nm liegt; dies ist kompatibel mit der experimentellen Lokalisierungsgenauigkeit von etwa 15 nm, welche durch die Fitprozedur erhalten wird (10).
9a, b zeigen Histogramme der Verteilung von Photonenzahlen, welche pro Molekül für zwei beobachtete CAL-51 Zellen registriert wurden. Die abgeschätzten mittleren Photonenzahlen sind 1.361 für die Verteilung, welche in 9a gezeigt ist, und 1.080 für die Verteilung, welche in 9b gezeigt ist. Die gesamte Anzahl von lokalisierten Proteinmolekülen ist 12.691 für das Beispiel, welches in 5a gezeigt ist, und 6.871 für das Beispiel, welches in 5b gezeigt ist.
10 zeigt ein Histogramm der Lokalisierungsgenauigkeit (paarweiser Mittelwert einer x und y Lokalisierungsgenauigkeit) für eine der Cal-51 Zellen, deren Photonenverteilung in 9a gezeigt ist. Der gesamte Mittelwert der Lokalisierungspräzision ist 14,9 nm mit einer Standardabweichung von 3,9 nm. Die gesamte Anzahl von fluoreszierenden Molekülen ist 12.691.
In beiden Fällen war die gesamte Datenerfassungszeit etwa zweieinhalb Minuten, während 2000 Weitfeldbilder bei einer durchschnittlichen Rahmenrate von etwa 13 Rahmen pro Sekunde aufgenommen wurden. Die registrierte mittlere Photonenanzahl pro Molekül war etwa 1.300 für die Zelle, welche in 9a gezeigt ist, und 1.100 für die Zelle, welche in 9b gezeigt ist. Die Fitprozedur erfordert etwa 3 bis 10 Minuten auf einem konventionellen Single Core PC ohne Implementierung von Beschleunigungsmethoden. Die relevanten Werte (Photonenanzahl, Lokalisierungsgenauigkeit und die Anzahl von lokalisierten Molekülen) waren sehr ähnlich durch die gesamte Serie von mehr als 100 SPDM Bildern, welche von zwei Proben innerhalb einiger weniger Tage erhalten bzw. aufgenommen wurden.
Beispiel 2: dreidimensionale SPDM/SMI Rekonstruktion
Das zweite Beispiel bezieht sich auf eine dreidimensionale SPDM/SMI Rekonstruktion einer Cal-51 Zelle (Plasmamembran markiert mit physiko-chemisch modifiziertem YFP) durch ein erstes Abbilden in einem Weitfeldmodus mit räumlich modifizierter Beleuchtung (cos² Intensitätsverteilung entlang der optischen Achse). Das Feld der stehenden Welle wurde mit einer Schrittgröße Δz = 25 nm für 5 μs (Phasenscan) bewegt. Die Emission der zellulären Plasmamembranprotrusionen wurde für jeden Δz Schritt aufgezeichnet. Verglichen mit der experimentell effektiven Wellenlänge (λ_ecx/n ≈ 330 nm) und der Standardabweichung der Genauigkeit der z-Positionierung des Piezo Stellglieds von 84 nm) entspricht dieser Prozeß einem starken Oversampling. Jedoch gab es, da die gesamte Erfassungszeit etwa 20 Sekunden war, keine Notwendigkeit, größere Schrittgrößen oder weniger Schritte zu verwenden.
Durch ein Durchführen einer Fouriertransformation in einer einzigen Dimension entlang der Zeitachse und in Kenntnis der Wellenlänge des Lichtmusters (330 nm) wurde die Phase für jedes laterale (x, y) Pixel des Stapels bestimmt. Um die Position des Emissionszentrums für jedes Pixel zu erhalten, wurde die Phase um π/2 verschoben und mit der Wellenlänge der modulierten Beleuchtung multipliziert.
Um die Erstreckung dz des Objekts entlang der optischen Achse zu bestimmen, wurde der modifizierte Kontrast R_mod = I_max/I_min aus der Information berechnet, welche in den SMI Modus Bildern gespeichert ist. Unter Verwendung der Fourier-Domäne wurden die Amplitude und die der Modulation zugehörige Konstante direkt nach einem Einstellen des Null-Niveaus durch ein Subtrahieren des Hintergrunds bestimmt. In dem nächsten Schritt wurde das Kontrastbild mit den entsprechenden Strukturgrößen korreliert.
Strukturelemente mit einer geringen axialen Erstreckung (⌀) entsprechen einer Objektscan-Intensitätsverteilung mit einem geringen modifizierten Modulationskontrast R_mod. In der Struktur wird angenommen, daß sie rohrartig und homogen markiert ist, wobei die folgenden Zusammenhänge für ein cos²-förmiges Feld einer stehenden Welle abgeschätzt werden können, welches mit einem Erregungslicht von 488 nm erzeugt wird: R_mod = 10% → ⌀ ≈ 50 nm, R_mod = 40% → ⌀ ≈ 140 nm, R_mod = 70% → ⌀ ≈ 190 nm.
Der nächste Schritt nach der Analyse von axialen Positionen z₀ und Erstreckungen dz war eine zweidimensionale (2D) SPDM Lokalisierung der einzelnen Moleküle in demselben Objekt. Dann wurden die erhaltenen Daten des 2D Lokalisierungsbilds (x, y) mit der Information betreffend die SMI (z₀) Position und Größe (axiale Erstreckung dz) kombiniert, um eine dreidimensionale Positionsinformation zu erhalten. In dem spezifischen Fall konnten sehr kleine Zellprotrusionen beobachtet werden, sobald in einer x, y Breite (minimale Breite etwa 55 nm) und in der z-Richtung (minimales Δz etwa 50 nm). Somit wurde bestimmt, daß die Struktur dieser Protrusionen kompatibel mit einer Stange bzw. einem Stab von etwa 3 μm Länge und ca. 50 nm Durchmesser ist.
In dem obigen Beispiel wurde nur eine Art von Molekülen (an der Zellmembran gebundene Proteine) durch SPDM/SMI abgebildet. Dafür wurde nur eine Laserlinie für eine Erregung verwendet und die Emission war auf ein kleines Wellenlängenband beschränkt. Das obige Verfahren kann jedoch auf eine geeignete bzw. entsprechende Vielfarben-SPDM/SMI mit einigen Erregungswellenlängen und geeignet diskriminierten Emissionsspektren erweitert werden. In diesem Fall müssen die chromatischen Aberrationen berücksichtigt werden. Unter Verwendung von Objektivlinsen hoher Qualität können diese unverändert bis 50 nm in lateraler (x, y) und in axialer (z) Richtung sein. Dementsprechend muß spezielle Sorge dafür getragen werden, daß bei einem Vielfarben-SPDM/SALM Abbilden diese Abberationen durch geeignete in situ Kalibrationsvorgänge korrigiert werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf einen oder mehrere der folgenden Aspekte:
Gemäß einem Aspekt werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Lokalisierung von einzelnen Farbstoffmolekülen in der Fluoreszenzmikroskopie zur Verfügung gestellt, mit deren Hilfe die Fluoreszenzfarbstoffmoleküle, welche für das Markieren der Probe bzw. des zu beobachtenden bzw. zu analysierenden Objekts verwendet werden, statistisch und individuell von einem nicht-fluoreszierenden Zustand zu einem fluoreszierenden Zustand und mittels einer Emission von fluoreszierendem Licht zu einem lang andauernden inaktiven Zustand transferiert werden.
Ihre Fluoreszenz wird auf einem Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor gesammelt und eine nachfolgende Lokalisierung der einzelnen fluoreszierenden Moleküle in dem Bildraum wird durchgeführt. Die Gegenstands- bzw. Objektinformation für wenigstens ein fluoreszierend markiertes bzw. gekennzeichnetes, zu beobachtendes Objekt wird auf der Basis der Beobachtung des Objekts mit der Hilfe von wenigstens einem Weit- bzw. Entferntfeldverfahren und unter Einsatz von wenigstens einer Art einer strukturierten Beleuchtung erhalten, aus welchen die räumliche Erstreckung des beobachteten, fluoreszenzmäßig markierten Objekts in wenigstens einer Raumrichtung und die Schwerpunktposition des Farbstoffs in dieser Richtung bestimmt werden. Zusätzlich wird ein geeignetes Fenster für die Intensität der optischen Strahlung, welche innerhalb des in der Fluoreszenzmikroskopie vermiedenen Bereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² liegt, bestimmt, in welchem die fluoreszierenden einzelnen Farbstoffmoleküle in ihrem Signal vorübergehend getrennt mittels einer Lokalisierungsmikroskopie lokalisiert werden. Die erhaltene Objektinformation und die Resultate der Lokalisierungsmikroskopie werden kombiniert, wodurch ermöglicht wird, die Begrenzung bzw. Beschränkung der Lokalisierungspräzision zu überwinden, welche mit einer rein photonabhängigen Lokalisierung der beobachteten Farbstoffmoleküle auftritt. Dementsprechend wird eine unter diesen Umständen maximale Lokalisierungspräzision der individuellen Farbstoffmoleküle erzielt.
Gemäß dem obigen Aspekt wird die Lokalisierungsmikroskopie mit Weitfeld-mikroskopischen Untersuchungen mit strukturierter Beleuchtung kombiniert. Somit ist es möglich, die Grenze für die Lokalisierungspräzision oder -genauigkeit entlang der optischen Achse bei andernfalls identen Bedingungen der Lokalisierungs-Mikroskopiebeobachtung zu überwinden. In Abhängigkeit von der Technik bzw. Art der strukturellen Beleuchtung ist es möglich, mit einer Präzision von bis zu einigen Nanometer die Größe der fluoreszierend markierten Objektstrukturen zu bestimmen, welche eine kleinere Erstreckung bzw. Größe als der Abstand zwischen den Maxima der Intensität in der strukturierten Beleuchtung zeigen. Dasselbe gilt auch für die Position des Zentrums bzw. Schwerpunkts der Markierung bzw. Kennzeichnung. Da man mit bzw. bei einer Lokalisierungsmikroskopie primär in sehr kleinen Strukturen interessiert ist, ist es unmittelbar nach einer lateralen Detektion und Lokalisierung des Signals bekannt, in welcher ”Tiefe” (Schwerpunkt der Markierung) das Molekül liegen muß und mit welcher Präzision seine Position bestimmt wurde (Erstreckung des Objekts). Auf diese Weise ist es möglich, dreidimensionale einzelne molekulare Lokalisierungen mit einer absoluten Präzision (keine Standardabweichung) von unter 40 nm in einer axialen und unter 10 nm (etwa 4 nm Standardabweichung) in einer lateralen Richtung selbst bei sehr geringen Photonenausbeuten auszuführen.
Gemäß einem Aspekt kann eine Weitfeldbeobachtung bzw. -messung des Objekts vorab durchgeführt werden. Dies ermöglicht einige wichtige Rückschlüsse oder Bestätigungen über das Objekt selbst, bevor das Objekt mit der Lokalisierungsmikroskopie rekonstruiert wird. Es ist somit beispielsweise möglich, vorab abzuschätzen, wie gut das Markieren ausgeführt wurde. Grobe oder relativ große Änderungen in der Struktur, wie beispielsweise Strömungs- oder Flußprozesse können in vivo gemessen werden.
Die Detektion bzw. Sammlung von Daten gemäß einem Aspekt kann innerhalb von weniger als fünf Minuten durchgeführt werden, wobei dies einen Unterschied von bis zu zwei Größenordnungen im Vergleich zu alternativen Methoden darstellt, welche bis zu einigen Stunden erfordern. Dies ist insbesondere vorteilhaft für in vivo Beobachtungen an bzw. in lebenden Systemen. Somit ist bzw. wird es möglich, anspruchsvolle und komplizierte technische Lösungen zu vermeiden, welche Driftproblemen begegnen oder diese mildern können oder den Erhalt des Lebens bzw. der Lebensfähigkeit der beobachteten Proben zur Verfügung stellen. Im Gegensatz dazu wird es mit dem vorgeschlagenen Verfahren möglich, eine sinnvolle in vivo Beobachtung auch an den kleinsten Strukturen durchzuführen.
Anstelle von fluoreszierenden Molekülen ist es auch möglich, phosphoreszierende Moleküle zu verwenden, um die in vivo Anwendbarkeit des vorgeschlagenen neuen Verfahrens zu verbessern. Diese Moleküle ermöglichen eine Lokalisierung über eine längere Zeitperiode.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann eine räumliche Kalibrierung der strukturierten Beleuchtung mit der Hilfe von wenigstens einem fluoreszierenden Referenz- bzw. Bezugspunkt durchgeführt werden. Durch Verwendung eines Kalibrierverfahrens und die Verwendung von wenigstens einem fluoreszierenden Referenzpunkt, mit dessen Hilfe der Ort bzw. die Position und die Intensität des Felds der stehenden Welle direkt gemessen und orientiert werden können, ist es möglich, die Verwendung der strukturierten Beleuchtung zu optimieren. Dadurch ist es möglich, die strukturierte Beleuchtung mit maximaler Präzision zu beschreiben. Als ein Referenzpunkt kann eine dünne, schwach fluoreszierende Schicht auf dem Deckglas des Objektträgers bzw. der Probenzubereitung, wie beispielsweise eine Schicht eines Photolacks bzw. Photoresists verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt wird wenigstens ein Fluoreszenzfarbstoff für das Markieren verwendet und während der Entfernt- und insbesondere Weitfeldbeobachtung befindet sich wenigstens ein für die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens ausreichender Teil der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle in einem aktiven Zustand und wird für die entsprechende Beobachtung verwendet. Ein weiterer Teil der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle verbleibt in einem inaktiven Zustand und wird nur mittels der Änderung oder des Umschaltens der Intensität der optischen Strahlung auf eine aktiviert, welche innerhalb des Fensters von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² liegt. Das Abbilden des beobachteten fluoreszenzmäßig markierten Objekts in der Lokalisierungsmikroskopie wird auf der Basis des zweiten Teils des fluoreszierenden Farbstoffmoleküls durchgeführt.
Dementsprechend ist es möglich, für die Entfernt- bzw. Weitfeldbeobachtungen ursprünglich inaktive fluoreszierende Moleküle zu verwenden, wenn ein ausreichender Anteil bzw. Teil dieser Moleküle für den Zweck der Entfernt- bzw. Weitfeldbeobachtung aktiviert wird. Das teilweise Aktivieren der Moleküle für den Zweck der Entfernt- bzw. Weitfeldbeobachtung kann beispielsweise mit einer zweiten Beleuchtungswellenlänge durchgeführt werden. Unterschiedliche aktivierende Verfahren, wie beispielsweise eine thermische Aktivierung können auch verwendet bzw. eingesetzt werden. Der zweite Teil der Farbstoffmoleküle wird für die nachfolgende Lokalisierung in der Lokalisierungsmikroskopie verwendet. Es ist auch möglich, die Objekte mit mehreren Markierungen bzw. Kennzeichnungen zu markieren, welche mehr als eine Art von fluoreszierenden Farbstoffen bzw. Farbstoffmolekülen umfassen bzw. enthalten, so daß eine Art eines Farbstoffs für die Entfernt- bzw. Weitfeldbeobachtung und die andere für die nachfolgende Einzelmoleküllokalisierung bzw. Lokalisierung eines einzelnen Moleküls in der Lokalisierungsmikroskopie verwendet werden kann.
Die verwendete optische Strahlung kann monochromatisch sein. Somit ist es möglich, eine einzige Wellenlänge für den gesamten Beobachtungs- bzw. Analyseprozeß zu verwenden. Die Lokalisierungsmikroskopie wird dadurch bzw. dabei innerhalb des Intensitätsbereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² durchgeführt. Dies bringt ökonomische und technische Vorteile gegenüber konventionellen Systemen, welche lediglich Lokalisierungsmikroskopie verwenden und welche wenigstens zwei Wellenlängen für das Aktivieren, die Erregung und das Deaktivieren der Farbstoffmoleküle einsetzen. Die Anzahl von Parametern, welche variiert werden müssen, kann somit wenigstens um die Hälfte reduziert werden. Naturgemäß ist die Verwendung von mehr als einer Wellenlänge auch in Übereinstimmung mit der Erfindung. Dies kann beispielsweise vorteilhaft sein, wenn auf die Lokalisierung von mehreren Molekülarten abgezielt wird.
Gemäß einem anderen Aspekt wird eine optimale Intensität innerhalb des Bereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² für jede einzelne verwendete Art eines fluoreszierenden Farbstoffs oder von fluoreszierenden Farbstoffmolekülen bestimmt. Somit wird die Erzielung einer maximalen Lokalisierungspräzision und einer Anzahl von lokalisierten Farbstoffmolekülen während des Abbildens des beobachteten fluoreszenzmäßig markierten Objekts in der Lokalisierungsmikroskopie sichergestellt.
Insbesondere ist es möglich, die Lokalisierungspräzision und die Anzahl der lokalisierten Moleküle und somit die Rekonstruktion des Lokalisierungsverfahrens durch ein molekülspezifisches Bestimmen einer optimalen Beleuchtung innerhalb des Intensitätsbereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² zu optimieren. Da die Lokalisierungspräzision und die Anzahl der lokalisierten Moleküle oft nicht gleichzeitig maximiert werden können, kann es erforderlich sein, einen Kompromiß einzugehen bzw. herzustellen.
Wie oben bereits beschrieben, kann der teilweise zyklische Prozeßverlauf in der Lokalisierungsmikroskopie wie folgt beschrieben werden: ein Teil der Farbstoffmoleküle, welche für das Markieren verwendet werden, wird aktiviert, wobei die Dichte aktivierter Moleküle geringer als ein Molekül pro durch Beugung beschränktes bzw. begrenztes Detektionsvolumen sein muß. Dieses Volumen kann gut mit der Hilfe der effektiven Punktspreizfunktion dahingehend beschrieben werden, daß beispielsweise alle Punkte mit einer Intensität höher als beispielsweise der Hälfte der maximalen Intensität der Punktspreizfunktion als zu dem Volumen gehörig gezählt werden. Nach dem Aktivieren werden ein Erhalt des Signals mit der Hilfe eines Sensors und nachfolgend das Deaktivieren der aktiven Moleküle beispielsweise durch ein Bleichen ausgeführt. Diese Schritte werden mehrere Male wiederholt und die erhaltene Menge oder der Stapel an Daten, welche zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen werden, werden mit Hilfe eines computerimplementierten Rekonstruktionsprozesses rekonstruiert. Für diesen Zweck kann eine Segmentation bzw. Unterteilung der Daten einleitend durchgeführt werden, um alle Moleküle zu identifizieren. In einem weiteren Schritt wird ein Fitten der verwendeten zweidimensionalen oder dreidimensionalen Modellfunktionen für die Punktspreizfunktion an den identifizierten Signalen ausgeführt.
Gemäß einem Aspekt wird dieselbe Punktspreizfunktion für die Anwendung der Lokalisierungsmikroskopie für alle fluoreszierenden Signale innerhalb eines Objekts verwendet.
Für alle detektierten Signale der fluoreszierenden Farbstoffmoleküle wird eine gemeinsame theoretische 3D-Modellfunktion erzeugt bzw. generiert. Die 3D Modellfunktion wird in der Richtung der optischen Achse in viele Schichten bzw. Lagen unterteilt und eine laterale Kreuzkorrelation mit dieser 3D Modellfunktion und einem Datenstapel, welcher durch Kopien eines einzigen Bilds von den erhaltenen Bilddaten gebildet wird, wird ausgeführt. Die Maxima der Korrelationsfunktion repräsentieren sowohl eine Objektidentifikation als auch eine 3D-Lokalisierung.
Es ist somit möglich, nicht nur die Segmentations- und Lokalisierungsprozesse zu kombinieren, sondern auch auf ein computermäßig relativ intensives Fitten der Modellfunktion über Fit-Algorithmen, wie beispielsweise Levenberg-Marquardt oder andere modifizierte Algorithmen geringster Quadrate zu verzichten. Das Rekonstruktionsverfahren gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß es die Tatsache verwendet, daß alle detektierten Signale von den Farbstoffmolekülen innerhalb einer einzigen kleinen Struktur emittiert werden. In einem derartigen Fall ist es möglich, die störenden Unterschiede in dem Brechungsindex der Umgebung bzw. den umgebenden Bereichen zu vernachlässigen. Eine einzige dreidimensionale Modellfunktion wird dadurch erzeugt und beispielsweise mit dem Datensatz bzw. Datenstapel kreuzkorreliert, welcher durch Kopien der einzelnen Bilder des erhaltenen Bildstapels (d. h. der erhaltenen bzw. erfaßten Zeitserie) gebildet wird. In dem resultierenden Stapel ist es möglich, unmittelbar eine Identifikation der einzelnen Moleküle und gleichzeitig der Position jedes Moleküls in dem Objekt- oder Bildraum aus den auftretenden Maximalen auszuführen, welche die Ähnlichkeit der Modellfunktion mit dem Signal in einer speziellen Lage beschreiben.
Für das Optimieren der Objektidentifikation und der 3D-Lokalisierung der fluoreszierenden Farbstoffmoleküle kann ein Schwellwertverfahren verwendet werden. Das Schwellwertanalyseverfahren kann verwendet werden, um das Rekonstruktionsverfahren durch ein Evaluieren von lediglich signifikanten Maxima zu optimieren. Somit können zusätzliche Mittel für eine Qualitätskontrolle der Rekonstruktion erhalten werden.
Anstelle einer Kreuzkorrelation können eine Wavelet-Korrelation oder ähnliche Verfahren verwendet werden. Es ist auch möglich, das Verfahren einer gleichzeitigen Segmentation und Lokalisierung, welche oben beschrieben wurden, in anderen Bereichen außerhalb der Mikroskopie anzuwenden, wobei dies signifikante wirtschaftliche Vorteile bringen kann. In diesem Fall kann der Korrelationsvorgang verwendet werden, um das Signal in Basisvektoren oder -komponenten zu zerlegen. In dem Segmentationsschritt kann die Tatsache, daß es bekannt ist, wie die Signale aussehen bzw. wie das Gewichten der einzelnen Signale aussehen sollte (Klassifikation bzw. Klassifikatoren), effizient verwendet werden.
Wie dies in DE 19830596.6 , JP 2000502406 , US 09462435 , PCT/EP 02/11343 und WO 2006/127692 A2 geoffenbart ist, kann die Lokalisierungspräzision weiter verbessert werden, wenn eine strukturierte Beleuchtung auch für die Lokalisierungsmikroskopie verwendet wird. Die Beleuchtung ist dadurch stationär während der Signalerfassung und es wird die Tatsache ausgenützt, daß zusätzliche Information über den potentiellen Ort des detektierten einzelnen Moleküls erhalten wird, da das Molekül vorzugsweise in einem Bereich bzw. einer Region mit einer höheren Intensität angeordnet ist.
Gemäß einem Aspekt wird eine strukturierte Beleuchtung, welche während der Erregung von wenigstens einem Farbstoffmolekül bewegt wird, auch für die Anwendung der Lokalisierungsmikroskopie verwendet. Die Phase der Modulation wird in dem detektierten Signal von wenigstens einem Farbstoffmolekül rekonstruiert, so daß die Position von wenigstens einem Molekül, welches mit einem Signal assoziiert ist, relativ zu wenigstens einem fluoreszierenden Referenzpunkt mit einer unter dieser Bedingung maximalen Präzision bestimmt wird.
Die Bewegung der strukturierten Beleuchtung während des Signalerhalts resultiert darin, daß die individuellen Moleküle mit einer unter diesen Umständen maximalen Präzision lokalisiert werden können. Es wird dadurch ausgenutzt, daß die relative Position der fluoreszierenden Moleküle zueinander und in bezug auf ein zusätzliches Markieren von der erhaltenen Phaseninformation bestimmt werden kann. Die Präzision, mit welcher die Phase bestimmt werden kann, liegt innerhalb eines einstelligen Nanometerbereichs, wobei dies der erzielbaren Lokalisierungspräzision entspricht und sich um etwa eine Größenordnung von der konventionellen, unter diesen Umständen erzielbaren Lokalisierungspräzision unterscheidet.
Ein weiterer Faktor, welcher die Präzision der Lokalisierungsmikroskopie beschränkt, ist die verwendete Markierung selbst. Während fluoreszierende Proteine mit dem Protein coexprimiert werden, welches zu beobachten bzw. zu betrachten ist, und somit direkt an der Struktur anhaften, müssen alle anderen fluoreszierenden Moleküle an die Struktur über spezifische verbindende bzw. koppelnde Moleküle (beispielsweise Antikörper oder Antigene) oder andere chemische Verfahren oder Prozesse gekoppelt oder gebunden werden. Dieses Koppeln bzw. Binden über gewöhnlicherweise größere Abstände beschränkt oft beträchtlich die erzielbare Lokalisierungspräzision, da die Position des Moleküls, welches das Signal emittiert, relativ zu der beobachtenden Struktur mit einem gewissen Verwischen oder einer gewissen Unschärfe behaftet ist. Zusätzlich existieren signifikante Problem mit bzw. bei einem nicht-spezifischen Binden, da das Binden an der gewünschten Region einfach wahrscheinlicher ist als an irgendeiner anderen Position. Um ein ausreichend starkes Signal zu erhalten, werden jedoch signifikant mehr Farbstoffmoleküle als erforderlich in das unter Beobachtung stehende Objekt eingebracht, so daß bei inneren Strukturen (beispielsweise innerhalb der Zellen) ein sehr starker Hintergrund vorhanden ist, welcher gehandhabt bzw. berücksichtigt werden muß. Die Überwindung dieses Problems ist eines der wichtigsten Ziele bzw. Gegenstände der Lokalisierungsmikroskopie.
Um die besten Resultate zu erhalten, können fluoreszierende Proteine oder andere strukturell nahe Moleküle als Markierungen verwendet werden. Neue, genetisch modifizierte Proteine, welche keine Fluoreszenz in einem Grundzustand zeigen, können aufeinanderfolgend, beispielsweise photochemisch aktiviert und lokalisiert werden, so daß eine punktweise Rekonstruktion der markierten Struktur möglich wird. Diese speziell modifizierten Proteine müssen in den Organismus bzw. das zu beobachtende Objekt über molekulare genetische Techniken eingebracht werden, welches insbesondere in dem Fall von eukaryotischen Zellen ein mühsames, teures und kompliziertes Verfahren ist.
Andererseits waren konventionelle fluoreszierende Proteine, welche nicht auf diese Weise modifiziert wurden, seit den sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt. Derartige Proteine wurden vielfach und erfolgreich verwendet und sind oft kommerziell in stabilen exprimierten Zellinien verfügbar. Eine Verwendung derartiger fluoreszierender Eigenschaften für eine Lokalisierungsmikroskopie war jedoch bis jetzt nicht denkbar.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden nicht-aktivierbare und nicht-umschaltbare fluoreszierende Moleküle statistisch erregt, wenn sie mit Licht mit einer Intensität beleuchtet werden, welches innerhalb eines Intensitätsbereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² der optischen Strahlung liegt.
Konventionelle Methoden einer Lokalisierungsmikroskopie verwenden üblicherweise sogenannte photoumschaltbare oder photoaktivierbare fluoreszierende Moleküle oder Proteine. Derartige Moleküle können durch ein Beleuchten mit unterschiedlichen charakteristischen Wellenlängen aktiviert/deaktiviert werden. Die Mikroskoptechniken basierend auf derartigen speziellen photoumschaltbaren oder photoaktivierbaren fluoreszierenden Molekülen oder Proteinen arbeiten auf dem Prinzip einer Abwesenheit von Fluoreszenz und unterscheiden sich von dem in der Anmeldung vorgeschlagenen Verfahren, welches eine Beleuchtung mit Licht hoher Intensität verwendet. Die konventionellen Verfahren und Vorrichtungen sind beträchtlich komplizierter als die Methoden und Verfahren unter Verwendung von Beleuchtungslicht hoher Intensität. Insbesondere muß eine Anzahl von Parametern, wie beispielsweise die Intensitäten der Vielzahl von Laserquellen oder die Vielzahl von Filtern gleichzeitig geregelt bzw. gesteuert und während des Verlaufs einer Bilderfassung geändert werden. Darüber hinaus ist die Bildaufnahme- bzw. -erfassungszeit üblicherweise sehr lang, so daß eine sehr hohe mechanische Stabilität des gesamten Systems erforderlich ist.
Durch ein Verwenden von Beleuchtungslicht hoher Intensität können konventionelle nicht-aktivierbare und nicht-umschaltbare fluoreszierende Moleküle effizient für ein Ausführen von Messungen unterhalb einer Auflösungsgrenze verwendet werden. Darüber hinaus kann der gesamte Prozeß beträchtlich weniger kompliziert und leicht zu regeln bzw. zu steuern sein. In ähnlicher Weise kann die Datenerfassungszeit beträchtlich reduziert werden.
Zusätzlich ist die Verwendung von konventionellen fluoreszierenden Proteinen in gleicher Weise mit der Hilfe der verwendeten Beleuchtung mit einer Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² als die optimierte Aktivierung ihrer speziell modifizierten Verwandten möglich. Weitfelderfassungen können insbesondere gut mit der Hilfe derartiger Proteine ausgeführt werden. Bisher wurde jedoch angenommen, daß derartige konventionelle Fluoreszenzproteine nicht für Lokalisierungsmikroskopieverfahren geeignet sind. Der Grund, bis jetzt nicht derartige konventionelle Fluoreszenzproteine, beispielsweise GFP (grün fluoreszierendes Protein) und YFP (gelb fluoreszierendes Protein) für die Lokalisierungsmikroskopie zu verwenden, liegt insbesondere in der Tatsache, daß von dem Intensitätsbereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² angenommen wurde, daß er nur Nachteile sowohl für die Weitfeldmikroskopie als auch für die konfokale Mikroskopie bringt. Insbesondere wurde in der Weitfeldmikroskopie für das Erhöhen der Intensität angenommen, daß es ein beträchtlich schnelleres Bleichen der Probe bei keinerlei Vorteilen für die erzielbare Auflösung bewirkt, während in der konfokalen Mikroskopie angenommen wurde, daß eine zusätzliche Intensität (d. h. Intensität höher als der obige Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm²) erforderlich ist, um ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erzielen.
Darüber hinaus ist die konfokale ”Einpunktdetektion” (einziger Sensor, beispielsweise eine Photodiode), welche üblicherweise in einem konfokalen Aufbau verwendet wird, weniger oder nicht geeignet, die technischen Effekte gemäß der Erfindung aufgrund der Tatsache zu visualisieren, daß alle erregten Moleküle innerhalb des Brennpunktvolumens gleichzeitig zu dem räumlich nicht diskriminierten Signal beitragen.
Mit der Hilfe des Verfahrens gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können bewährte stabile Markierungen auch verwendet werden. Somit können Tausende wertvolle Objektträgerzubereitungen oder -proben in einem Nanometerbereich analysiert werden. Darüber hinaus können neue Fluoreszenzmarker, wie beispielsweise die sogenannte ”Smart Probes” für das oben beschriebene Verfahren gemäß einem Aspekt der Erfindung verwendet werden. Diese Marker bzw. Markierungen sind nur aktiv, wenn sie an die bestimmte bzw. bezeichnete Struktur gebunden sind und derart ihre Ausbildung bzw. Gestalt geändert haben. Alle der verbleibenden, nicht gebundenen und nicht entfernten Moleküle verbleiben derart unsichtbar sowohl für die angewandte Entfernt- bzw. Weitfeldtechnik als auch für die Lokalisierungsmikroskopie. Somit ist der hauptsächliche Vorteil, daß ein störender Hintergrund, welcher in dem konventionellen Verfahren existiert, im wesentlichen eliminiert werden kann. Darüber hinaus kann exklusiv die Zellstruktur rekonstruiert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens zum Lokalisieren von einzelnen Farbstoffmolekülen in der Fluoreszenzmikroskopie gemäß einem der oben beschriebenen Aspekte, wobei ein Lichtmikroskop mit einem Weitfeldaufbau des optischen Beleuchtungspfads verwendet wird. Die Vorrichtung umfaßt wenigstens ein zusätzliches optisches Element, welches innerhalb des optischen Beleuchtungspfads des Lichtmikroskops eingebaut bzw. positioniert ist, um eine Einstellung der bestimmten optimalen Dichte der Intensität der optischen Strahlung auf den oder in den Bereich von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² zu ermöglichen.
Dementsprechend kann eine konventionelle Weitfeldbeleuchtung durch die Verwendung wenigstens eines geeigneten optischen Elements geändert werden, so daß die Intensität der optischen Strahlung auf das Intensitätsfenster oder -intervall von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² einstellbar ist. Somit können die Verfahren gemäß irgendeinem der Aspekte der Erfindung ermöglicht bzw. erleichtert werden. Mit bestimmten Farbstoffen oder Markierungen kann es vorteilhaft sein, dieses Intensitätsintervall oder -fenster in der Richtung der höheren oder niedrigeren Werte zu erweitern bzw. zu erstrecken.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens zum Lokalisieren von einzelnen Farbstoffmolekülen in der Fluoreszenzmikroskopie gemäß einem der oben beschriebenen Aspekte, wobei ein Lichtmikroskop mit einem konfokalen Aufbaus des optischen Beleuchtungspfads verwendet wird, wobei wenigstens ein zusätzliches optisches Element innerhalb des Beleuchtungspfads des Lichtmikroskops eingebaut bzw. positioniert ist, um eine Einstellung der bestimmten optimalen Intensität der optischen Strahlung auf den und/oder in den Bereich von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² zu ermöglichen.
In einer Vorrichtung gemäß einem Aspekt der Erfindung kann bzw. können wenigstens eine Linse und/oder wenigstens ein Graufilter und/oder wenigstens ein akusto-optischer oder elektro-optischer Modulator als ein zusätzliches optisches Element in dem optischen Beleuchtungspfad des Lichtmikroskops eingebaut bzw. eingebracht sein bzw. werden. Insbesondere leicht zu implementieren sind hiebei beispielsweise eine einzelne Linse oder Linsensysteme oder ein einzelnes Graufilter oder ein Graufiltersatz. Ein Polarisationsfilter stellt eine andere günstige Alternative für ein kontinuierliches Einstellen oder Regulieren der Intensität der Beleuchtung mit polarisierten Lichtquellen zur Verfügung. Akusto-optische oder elektro-optische Modulatoren repräsentieren noch eine andere Alternative. Ein Weitfeldaufbau, welcher durch die Verwendung einer zusätzlichen Linse als auch eine Kombination einer einzelnen Linse und eines Graufiltersatzes modifiziert wurde, wurde auch erfolgreich getestet.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die Verwendung eines sehr kostengünstigen Laserpointers bzw. -zeigers als eine Beleuchtungsquelle auch in ähnlicher Weise möglich ist, folgt, daß ein voll funktionsfähiger Weitfeldlokalisierungsmikroskopieaufbau mit einer gewissen Art einer strukturierten Beleuchtung, welche darin integriert ist, auch zu einem relativ geringen Preis möglich ist. Niedrigpreisrealisationen der strukturierten Beleuchtung können beispielsweise mittels eines optischen Gitters oder einer Mehrfachstrahl-Interferenz integriert werden. Selbst ohne eine Verwendung von teuren speziellen Objektiven, Main Frame – oder Computern großer Kapazität und spezieller Sensoren ist die Abbildungsleistung derartiger Systeme innerhalb einer akzeptablen Zeitperiode von unter einer Stunde besser als diejenige von konventionell erhältlichen mikroskopischen Systemen. Zusätzlich stellt die Tatsache, daß in dem einfachsten Fall nur ein Freiheitsgrad für einen Benutzer für eine Manipulation (beispielsweise Intensitätsregelung bzw. -steuerung über eine Linsenposition) verfügbar ist, sicher, daß eine derartige Vorrichtung durch jedermann selbst ohne weitere Kenntnis auf dem Gebiet der Optik, Mechanik oder Elektronik verwendet werden kann.
Darüber hinaus kann wenigstens ein zusätzlicher Sensor in wenigstens einem zusätzlichen optischen Detektionspfad verwendet werden, um zusätzliche Photonen zu registrieren, welche andernfalls nicht den ersten Sensor erreichen würden. Auf diese Weise kann zusätzliche Information für die laterale und axiale Lokalisierung gesammelt werden.
Der wenigstens eine zusätzliche optische Detektionspfad kann durch ein Einsetzen bzw. Einführen wenigstens eines zusätzlichen optischen Elements modifiziert werden, so daß die Daten von dem zusätzlichen (zweiten) optischen Pfad eine verbesserte Lokalisierungspräzision entlang der optischen Achse auf Kosten der lateralen Lokalisierungspräzision bieten. Beispielsweise kann durch eine statistische Kombination der einzelnen Lokalisierungen eine unter diesen Umständen maximale dreidimensionale Lokalisierungspräzision erzielt werden.
Die Lokalisierung von einzelnen fluoreszenten Molekülen kann zusätzlich durch die Verwendung eines zweiten Sensors optimiert werden. Der zusätzliche Sensor kann beispielsweise für eine Phasenbestimmung, insbesondere für die Rekonstruktion der Phasenmodulation verwendet werden, wenn eine strukturierte Beleuchtung, welche während der Erregung bewegt wird, für die Lokalisierungsmikroskopie in dem wenigstens einen zusätzlichen optischen Detektionspfad verwendet wird, wie er zur Verfügung gestellt wird.
In ähnlicher Weise ist es auch möglich, den zusätzlichen Sensor hinter dem modifizierten zusätzlichen optischen Detektionspfad zu verwenden, mit welchem beispielsweise eine Verbesserung der axialen Lokalisierungspräzision auf Kosten der lateralen Lokalisierungspräzision erhalten bzw. erzielt werden kann. Die Daten, welche durch alle Sensoren gesammelt werden, können beispielsweise statistisch kombiniert werden, um den Lokalisierungs- und Rekonstruktionsprozeß zu optimieren.
Wie oben bereits beschrieben, werden gemäß einem Aspekt ein Verfahren und eine Vorrichtung für eine Verbesserung der Lokalisierungspräzision und der erzielbaren Objektinformation in der Lokalisierungsmikroskopie zur Verfügung gestellt, indem sie mit Weitfeldtechniken mit strukturierter Beleuchtung kombiniert wird, wobei die für das fluoreszierende Markieren verwendeten Farbstoffmoleküle nachfolgend auf eine konventionelle Weitfeldbeleuchtung bei einer Intensität unterhalb von 1 kW/cm² durch eine optische Bestrahlung erregt werden, welche eine Intensität innerhalb eines Intensitätsbereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist.
Zusätzlich wird gemäß einem weiteren Aspekt eine Verbesserung der Lokalisierungspräzision mittels einer Bewegung der strukturierten Beleuchtung und eines automatischen kombinierten Segmentations- und Lokalisierungsverfahrens implementiert. Die beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen gemäß einem Aspekt der Erfindung erweitern die bekannten konfokalen oder Weitfeldbeleuchtungsaufbauten durch wenigstens eine Art einer strukturierten Beleuchtung und durch zusätzliche optische Elemente, welche die erforderliche Dichte der Intensität zur Verfügung stellen.
Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung zum Erhalten einer, unterhalb einer Auflösungsgrenze liegenden, räumlichen Information einer Probe, welche mit wenigstens einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die unterhalb der Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information Lokalisierungsinformation betreffend die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art einer fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt. Das Verfahren umfaßt: – Erhalten von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie, wobei die Lokalisierungsbilddaten eine Serie von Bildern umfassen, erhalten durch – Beleuchten einer interessierenden Region der Probe mit einem Beleuchtungslicht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist, – Detektieren durch einen Information erhaltenden Sensor wenigstens eines Teils des Fluoreszenzlichts, welches durch wenigstens einen Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung bei einer Beleuchtung emittiert wird, wodurch ein Bild der interessierenden Region erhalten wird; -mehrfaches Wiederholen der Schritte eines Beleuchtens und Detektierens des emittierten Fluoreszenzlichts, wodurch die Serie von Bildern erhalten wird, wobei jedes Bild bei einem unterschiedlichen Zeitschritt aufgenommen wird; – Bearbeiten der erhaltenen Lokalisierungsbilddaten, um dadurch die Lokalisierungsinformation betreffend die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung zu erhalten, wobei der Schritt eines Bearbeitens ein Bestimmen in jedem der detektierten Bilder der Serie der Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilungen von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen der einen oder mehreren fluoreszierenden Markierung(en) in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt.
Bezugszeichenliste

1: optische Lichtquelle
2: bewegbares Linsensystem
3: Strahlteiler
4: Spiegel (bewegbar)
5: erste fokussierende Linse
6: zweite fokussierende Linse
7: erster dichroitischer Strahlteiler
8: zweiter dichroitischer Strahlteiler
9: erstes Objektiv
10: zweites Objektiv
11: Probe
12: zylindrische Linse
13: erster Sensor
14: zweiter Sensor
15: erster optischer Detektionspfad
16: zweiter optischer Detektionspfad
17: strukturierte Beleuchtung
18: Objekt bzw. Gegenstand
19: ”Phasenscan”-Modulation
20: axiale Positionsbestimmung
21: Modulation
22: Bestimmung axialer Erstreckung/Größe
23: optische Achse
24: bewegbare Linse
25: bewegbarer Spiegel
26: zusätzlicher Spiegel
31: Laser
32: Laser
33: Objektivlinse
34: dichroitisches Element
35: dichroitisches Element
35 bis 39: Linsen oder Linsensysteme
40: blockierendes Filter
41: Probe
42: Erfassungskamera
43: Objektivlinse
44: piezo-elektrische Bühne
45: Be- bzw. Verarbeitungseinheit
46 bis 48: Spiegel
51: Laserquellen
52: Kollimator
53: Strahlteiler
54: Objektivlinse
55: Objektivlinse
56: piezo-elektrische Bühne
57: Piezo-Spiegel
58: dichroitischer Spiegel
59: Kamera
60: blockierendes Filter
61: erste fokussierende Linse
62: zweite fokussierende Linse
63: Spiegel

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 10052823 [0023]
- DE 597050090-08 [0023]
- DE 29701663 [0023]
- US 09/3316444 [0023]
- DE 19830596 [0023, 0101, 0243]
- JP 2000502406 [0023, 0101, 0243]
- US 09462435 [0023, 0101, 0243]
- EP 02/11343 [0023, 0101, 0243]
- WO 2006/127692 A2 [0023, 0023, 0101, 0243]
- US 20080032414 A1 [0023]

Claims

Verfahren zum Erhalten einer unterhalb einer Auflösungsgrenze liegenden, räumlichen Information einer Probe, welche mit wenigstens einer Art einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die unterhalb der Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information Lokalisierungsinformation über die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt, umfassend die Schritte: – Erhalten von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden einer Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie, wobei die Lokalisierungsbilddaten eine Serie von Bildern umfassen, erhalten durch – Beleuchten einer interessierenden Region der Probe mit einem Beleuchtungslicht, welches eine Intensität in dem Bereich von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² aufweist, – Detektieren durch einen Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor wenigstens eines Teils des Fluoreszenzlichts, welches durch wenigstens einen Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung bei einer Beleuchtung emittiert wird, wodurch ein Bild der interessierenden Region erhalten wird; – mehrfaches Wiederholen der Schritte eines Beleuchtens und Detektierens des emittierten Fluoreszenzlichts, wodurch die Serie von Bildern erhalten wird, wobei jedes Bild bei einem unterschiedlichen Zeitschritt aufgenommen wird; – Bearbeiten der erhaltenen Lokalisierungsbilddaten, um dadurch die Lokalisierungsinformation betreffend die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung zu erhalten, wobei der Schritt eines Bearbeitens ein Bestimmen in jedem der detektierten Bilder der Serie der Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilungen von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen der einen oder mehreren fluoreszierenden Markierung(en) in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei bei einer Beleuchtung wenigstens ein Teil der fluoreszierenden Moleküle von einem ersten fluoreszierenden Zustand zu einem zweiten, reversibel gebleichten Zustand transferiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei bei einer Beleuchtung wenigstens ein Teil der fluoreszierenden Moleküle der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung von dem ersten Zustand zu dem zweiten Zustand und nach einer Rückkehr zu dem ersten Zustand zu einem dritten, inaktiven Zustand transferiert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der dritte Zustand ein irreversibel gebleichter Zustand ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) fluoreszierende Proteine und/oder ihre Derivate und/oder Modifikationen umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) nicht auf Protein basierende fluoreszierende Markierungen und/oder ihre Derivate umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) grün fluoreszierendes Protein (GFP) und/oder seine Derivate und/oder Modifikationen, beispielsweise grün fluoreszierendes Protein (GFP), zyan fluoreszierendes Protein (CFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), OFP, verstärkt grün fluoreszierendes Protein (eGFP), emGFP, verstärkt gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) monomeres rot fluoreszierendes Protein (mRFP) und seine Derivate und Modifikationen, beispielsweise mCherry umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) Rhodamin Derivate, beispielsweise Alexa- und/oder Atto-Farbstoffe für Nicht-Proteine umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) Xanthen Derivate, beispielsweise Fluorescein umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) Rhodamin Derivate, beispielsweise Alexa- und/oder Atto-Farbstoffe umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) Cumarin Derivate umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren fluoreszierende(n) Markierung(en) Cyanin Derivate umfaßt (umfassen).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das verwendete Fluoreszenzlokalisierungsmikroskop einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen Weitfeld-Aufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen 4Pi-Aufbau, einen STED-Aufbau oder einen STED-4Pi-Aufbau aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das verwendete Beleuchtungslicht monochromatisch ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Vielzahl von unterschiedlichen Arten von fluoreszierenden Markierungen verwendet wird und der Schritt eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten von einem oder mehreren Objekt(en) in einer interessierenden Region durch ein Verwenden von Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie getrennt für jede fluoreszierende Markierung unter Verwendung von Beleuchtungslicht mit einer optimalen Intensität durchgeführt wird, welche innerhalb des Bereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² gewählt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Schritt eines Bearbeitens der erhaltenen Lokalisierungsbilddaten ein Fitten bzw. Anpassen einer Modellfunktion f(x, y) der erhaltenen Fluoreszenzemissionsverteilungen von den einzelnen fluoreszierenden Molekülen in jedem der zweidimensionalen Bilder der Zeitserie umfaßt:
wobei x und y kartesische Koordinaten in einer Objektebene, normal auf die optische Achse des Mikroskops sind; x₀ und y₀ die Startparameter für die Position sind, welche als das Zentrum des segmentierten Signals bestimmt werden; A die Amplitude der Verteilung ist, und B₀, B₁, B₂ Parameter sind, welche einen linearen Hintergrund beschreiben.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in dem Schritt eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten das eine oder die mehreren Objekt(e) in der interessierenden Region durch ein strukturiertes Beleuchtungslicht beleuchtet wird (werden).
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiterhin umfassend ein Erhalten von zusätzlichen Weitfeldbilddaten, umfassend eine Serie von Weitfeldbildern der interessierenden Region durch ein Verwenden einer Weitfeldfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Beleuchtungslicht, welches räumlich strukturiert bzw. moduliert entlang einer optischen Achse des Mikroskops ist, wobei das Erhalten bzw. Erfassen der zusätzlichen Weitfeldbilddaten erhalten wird durch: – Beleuchten des einen oder der mehreren Objekts (Objekte) in der interessierenden Region mit dem strukturierten Beleuchtungslicht; – Detektieren eines Weitfeldbilds des Fluoreszenzlichts, welches von den fluoreszierenden Molekülen der einen oder mehreren fluoreszierenden Markierung(en) emittiert wird; – Bewegen des Gegenstands bzw. Objekts und/oder des strukturierten Beleuchtungslichts in diskreten Schritten entlang der optischen Achse und Detektieren bei jedem Schritt eines Weitfeldbilds des Fluoreszenzlichts, welches von den fluoreszierenden Molekülen emittiert wird, wodurch die Serie von Weitfeldbildern der interessierenden Region erhalten wird, wobei der Schritt eines Erhaltens von zusätzlichen Weitfeldbilddaten des einen oder der mehreren Objekts (Objekte) vor dem Schritt eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, weiterhin umfassend: – Bearbeiten der erhaltenen zusätzlichen Weitfeldbilddaten, um zusätzliche räumliche Information zu erhalten, welche Information über die räumliche Erstreckung entlang der optischen Achse von wenigstens einem fluoreszierend markierten Objekt in der Probe und/oder zusätzliche räumliche Information der Positionen der Schwerpunkte der detektierten Fluoreszenzemissionsverteilung der einzelnen fluoreszierenden Moleküle in der Richtung der optischen Achse umfaßt; und – Kombinieren der Lokalisierungsinformation, welche durch die Lokalisierungsmikroskopie erhalten wird, mit der zusätzlichen räumlichen Information, welche durch die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, weiterhin umfassend: – Erzeugen einer gemeinsamen theoretischen dreidimensionalen Modellfunktion für alle detektierten Signale innerhalb des einen oder der mehreren Objekts (Objekte), wobei die dreidimensionale Modellfunktion in eine Vielzahl von zweidimensionalen Schichten bzw. Lagen entlang der optischen Achse unterteilt wird, und – Durchführen einer lateralen Kreuzkorrelation der erhaltenen dreidimensionalen Bilddaten und der dreidimensionalen Modellfunktion, wobei die Maxima der Korrelationsfunktion sowohl eine Objektidentifikation als auch eine dreidimensionale Lokalisierung darstellen.
Verfahren nach Anspruch 21, weiterhin umfassend ein Anwenden eines Schwellwertverfahrens auf die erhaltenen Korrelationsmaxima.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, weiterhin umfassend einen Schritt eines Ausführens einer räumlichen Kalibrierung der strukturierten Beleuchtung, wobei die räumliche Kalibrierung mit der Hilfe wenigstens eines fluoreszierenden Bezugspunkts durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei – während eines Erhaltens von zusätzlichen Bilddaten des einen oder der mehreren Objekts (Objekte) mit Weitfeldfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht das eine oder die mehreren Objekt(e) mit der strukturierten Beleuchtung derart beleuchtet wird bzw. werden, daß wenigstens ein Teil der Fluoreszenzmoleküle der wenigstens einen fluoreszierenden Markierung in einen aktiven Zustand transferiert wird und für die entsprechende Weitfeldbeobachtung verwendet wird, während ein zweiter Teil der Fluoreszenzmoleküle in einem inaktiven Zustand verbleibt; und – während des Schritts eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden von Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie ein zweiter Teil der Fluoreszenzmoleküle durch ein Ändern der Beleuchtungslichtintensität der optischen Bestrahlung auf diejenige, welche innerhalb des Bereichs von etwa 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² liegt, aktiviert wird, wobei der Schritt eines Erhaltens von Lokalisierungsbilddaten durch ein Verwenden von Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie auf der Basis des zweiten Teils der fluoreszierenden Moleküle durchgeführt wird.
Fluoreszenzlokalisierungsmikroskop zum Erhalten einer, unterhalb einer Auflösungsgrenze liegenden, räumlichen Information einer Probe, welche mit wenigstens einer Art einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die, unterhalb der Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information Lokalisierungsinformation über die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt, wobei das Mikroskop umfaßt: – eine Beleuchtungsoptik, welche einen optischen Beleuchtungspfad definiert, welcher konfiguriert ist, um das eine oder die mehreren Objekt(e) in einer interessierenden Region zu beleuchten; – wenigstens ein zusätzliches optisches Element, welches innerhalb des optischen Beleuchtungspfads des Lokalisierungsmikroskops positioniert ist, wobei das wenigstens eine zusätzliche optische Element konfiguriert ist, um ein Umschalten der Intensität des Beleuchtungslichts auf eine Intensität, welche innerhalb des Bereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² liegt, und/oder eine Einstellung bzw. Regulierung der Intensität des Beleuchtungslichts innerhalb des Bereichs von 1 kW/cm² bis 1 MW/cm² zu ermöglichen; – wenigstens einen Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor, welcher in einem optischen Detektionspfad positioniert ist, welcher konfiguriert ist, um wenigstens einen Teil des emittierten Fluoreszenzlichts zu detektieren, wodurch ein Bild der beleuchteten interessierenden Region erhalten wird.
Mikroskop nach Anspruch 25, wobei das Lokalisierungsmikroskop einen konfokalen Aufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen Weitfeldaufbau des optischen Beleuchtungspfads, einen 4Pi-Aufbau, einen STED-Aufbau oder einen STED-4Pi-Aufbau aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 25 oder 26, wobei das wenigstens eine zusätzliche Element eines oder mehrere umfaßt von – wenigstens einer Linse oder einem Linsensystem; – wenigstens einem Graufilter oder einem Graufiltersatz; – wenigstens einem Polarisationsfilter; – wenigstens einem akusto-optischen Modulator; und/oder – wenigstens einem elektro-optischen Modulator.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 25 bis 27, weiterhin umfassend wenigstens einen zusätzlichen Sensor, welcher in wenigstens einem zusätzlichen optischen Detektionspfad verwendet wird, wobei der zusätzliche Sensor und der zusätzliche optische Detektionspfad konfiguriert sind, um wenigstens einen Teil des Fluoreszenzlichts zu registrieren, welches nicht den Information erhaltenden bzw. erfassenden Sensor erreicht.
Mikroskop nach Anspruch 28, weiterhin umfassend wenigstens ein zweites zusätzliches optisches Element, welches in dem wenigstens einen zusätzlichen optischen Detektionspfad positioniert ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 25 bis 29, darüber hinaus umfassend eine Bearbeitungseinheit, welche konfiguriert ist, um die erhaltenen Lokalisierungsbilddaten zu bearbeiten, um eine unterhalb einer Auflösungsgrenze liegende, räumliche Information einer Probe zu erhalten, welche mit wenigstens einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei die räumliche, unterhalb der Auflösungsgrenze liegende Information Lokalisierungsinformation über die Positionen von fluoreszierenden Molekülen der wenigstens einen Art der fluoreszierenden Markierung in wenigstens einer räumlichen Richtung umfaßt.