DE10343722A1

DE10343722A1 - Festkörper-Immersionslinsen-Spektroskopie und -Mikroskopie

Info

Publication number: DE10343722A1
Application number: DE2003143722
Authority: DE
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL; Jenoptik AG
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2003-09-17
Publication date: 2005-04-14
Also published as: WO2005029153A2; WO2005029153A3

Abstract

Es wird eine Festkörper-Immersionslinse (SIL) für ein Mikroskop mit einem Objektivsystem mit einer vorbestimmten numerischen Apertur bereitgestellt, wobei die Brechzahl des Materials der Festkörper-Immersionslinse so gewählt ist, daß bei dem Objektivsystem vorgeschalteter Festkörper-Immersionslinse die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Festkörper-Immersionslinse für ein Mikroskop sowie ein Mikroskopierverfahren mit einer Festkörper-Immersionslinse.

Die DE 101 1 420 A1 und die WO 02/073172 A2 beschreiben eine Prozedur und ein Verfahren zur Detektion einer chemischen Subtanz. Insbesondere die Ansprüche beschreiben eine Trennung der Probenflüssigkeit und der Fokussierungsoptik, d. h. eine Wärmeisolierung zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem Probenbehälter. Dieser Probenbehälter kann ein optisches Element zur Verbesserung der Fokussierung aufweisen. Dieses Verfahren beschreibt jedoch nicht, daß dieses optische Element eine SIL-Linse mit den spezifischen Auslegungsdaten eines solchen Elementes ist, noch beschreibt es dessen Materialanforderungen oder dessen optische Leistung.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Festkörper-Immersionslinse für ein optisches Verfahren zum Erzeugen einer guten Leuchffeld-Begrenzung, die für die Fluoreszenzspektroskopie sowie für die hochauflösende Mikroskopie besonders geeignet, aber nicht auf diese Spektroskopie- oder Mikroskopierverfahren beschränkt ist, bereitzustellen. Ferner soll noch ein entsprechendes Mikroskopierverfahren bereitgestellt werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch eine Festkörper-Immersionslinse für ein Mikroskop mit einem Objektivsystem mit einer vorbestimmten numerischen Apertur, wobei die Brechzahl des Materials der Festkörper-Immersionslinse so gewählt ist, daß die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht ist, wenn die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem vorgeschaltet ist. Durch Anpassen an der Festkörper-Immersionslinse, die aus einem Material mit einer hohen Brechzahl besteht, an ein herkömmliches Objektivsystem (Mikroskopobjektiv) kann eine Erhöhung der optischen Auflösung oder ein gut begrenztes Fokalvolumen erreicht werden. Das Probenvolumen kann von der SIL-Oberfläche über einen geeigneten optischen Aufbau verschoben werden.

Bevorzugt beträgt die Brechzahl der Festkörper-Immersionslinse größer oder gleich 1,3. Insbesondere kann die Festkörper-Immersionslinse eine Linsenform mit mindestens einer aplanatischen Oberfläche aufweisen.

Ferner kann die Festkörper-Immersionslinse mindestens eine diffraktiv optische Oberfläche umfassen.

Besonders bevorzugt ist es, wenn die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem so vorgeschaltet werden kann, daß sie vom Objektivsystem beabstandet ist, insbesondere um mindestens 1 mm. Die Festkörper-Immersionslinse kann auch so dem Objektivsystem vorgeschaltet werden, daß sie vom Objektivsystem vollständig thermisch, elektrisch und/oder mechanisch entkoppelt ist.

Die Festkörper-Immersionslinse kann hemisphärisch oder als abgeflachte Kugel ausgebildet sein. Des weiteren kann die Festkörper-Immersionslinse eine ebene Oberfläche aufweisen. Insbesondere kann die ebene Oberfläche mit einer Seite eines Objektivträgers fluchten.

Die Aufgabe wird auch noch gelöst durch ein Mikroskopierverfahren, bei dem mittels einer einem Objektivsystem eines Mikroskops vorgeschalteten Festkörper-Immersionslinse die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht wird.

Insbesondere kann das Mikroskopierverfahren als ein Fluoreszenzverfahren, das zur Einzelmoleküldetektion dient, verwenden werden. In diesem Fall ist es bevorzugt, das Mikroskopieverfahren als konfokales Verfahren zu betreiben, bei dem die Fluoreszenzemission über eine Lochblende (z.B. eine optische Faser) detektiert wird, um die Konfokalität zu gewährleisten.

Ferner kann bei dem Verfahren die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem beabstandet vorgeschaltet werden, bevorzugt um mindestens 1 mm.

Bei dem Verfahren kann zur Verschiebung des Fokalvolumens von einer Grenzfläche zwischen einem Objektträger und einer zur untersuchenden Flüssigkeit in die Flüssigkeit hinein eine einstellbare Aberration des Objektivsystems geändert werden.

Insbesondere kann die erfindungsgemäße Festkörper-Immersionslinse bzw. das erfindungsgemäße Verfahren bei der hochauflösenden Mikroskopie (Reflexions, -Durchlicht-, Polarisationsmikroskopie) in der konfokalen Mikroskopie, bei spektroskopischen Untersuchungen, bei Untersuchungen und Messungen, die sich insbesondere auf die Einzelmoleküledetektionen beziehen, und/oder für Fluoreszenzverfahren, die beispielsweise zur Einzelmoleküldetektion dienen, wie z.B. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzlebensdauer, Raman-Spektroskopie, eingesetzt werden.

Mehrere Festkörper-Immersionslinsen können als Array angeordnet werden. Die Festkörper-Immersionslinse kann auch in einer Biochip-Anordnung aufgenommen werden.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine Erhöhung der numerischen Apertur und eine erhöhte Lichtbegrenzung im Fokalvolumen möglich ist. Insbesondere kann die numerische Apertur des Objektivsystems bei der Erfindung kleiner oder gleich 1 sein.

Das Objektivsystem kann eine einstellbare Aberration (z.B. sphärische Aberration) aufweisen oder das Objektivsystem kann mit optischen Elementen kombiniert werden, die eine einstellbare Aberration (z.B. sphärische Aberration) ermöglichen. Insbesondere kann das Objektivsystem für diese Einstellung einen Korrekturring umfassen.

Bei der Erfindung kann mittels der einstellbaren Aberration eine Verschiebung des Fokalvolumens bewirkt werden und eine hohe optische Qualität mit einem Strehl-Verhältnis von größer oder gleich 0,8 ist möglich.

Die Festkörper-Immersionslinse ermöglicht neben der Erhöhung der numerischen Apertur bevorzugt auch noch eine erhöhte Lichtbegrenzung im Fokalvolumen.

Die Erfindung betrifft auch die Kombination der erfindungsgemäßen Festkörper-Immersionslinse mit dem Mikroskop, so daß ein verbessertes Mikroskop bereitgestellt wird.

Das Objektivsystem des Mikroskops kann eine einstellbare Aberration aufweisen.

Die Erfindung beschreibt ein neues Bildgebungs- sowie Spektroskopieverfahren, mit dem eine hohe Auflösung sowie eine verbesserte Begrenzung des Leuchtfeldes für verschiedene Verfahren auf dem Gebiet der optischen Spektroskopie, insbesondere derjenigen, die für die Einzelmoleküldetektion (SMD) verwendet werden, möglich ist. Für alle diese Anwendungen ist eine gute Begrenzung der Leuchtfelder, wie sie durch dieses optische Konzept bereitgestellt wird, unerläßlich. Bei diesem Konzept wird die SIL-Linse mit einem herkömmlichen Mikroskopobjektiv kombiniert, was die numerische Apertur aufgrund der hohen Brechzahl des verwendeten Linsenmaterials erhöht.

Bei zahlreichen Anwendungen auf dem Gebiet der Lebenswissenschaften, der Biologie und der Medizin ist eine örtliche Erwärmung und/oder eine elektrische Sondierung der Probe usw. notwendig. Daher ist eine thermische, mechanische und/oder elektrische Entkopplung von großem Interesse und Nutzen. Diese Handhabungsbedingung wird aufgrund der Trennung der SIL-Linse (=Festkörper-Immersionslinse) und des Mikroskopobjektivs und/oder des Mikroskopkörpers ohne weiteres verwirklicht.

Die Erfindung beschreibt ferner ein spezifisches optisches Linsenelement, das in den Probenbehälter aufgenommen werden kann und das die Wärmeisolierung durch einen Abstand zwischen diesem SIL-Element und dem Mikroskopobjektiv von >= 1 mm sicherstellt. Die SIL gewährleistet eine verbesserte Fokussierung, welche die anfängliche numerische Apertur des Hauptobjektivs typischerweise um einen Faktor von 2 vergrößert. Eine weitere Erhöhung ist durch eine angepaßte SIL-Linsenauslegung und ein Linsenmaterial mit einer höheren Brechzahl möglich.

Es ist offensichtlich, daß die Elemente in einer linearen oder in jeder beliebigen 2-dimensionalen Konfiguration montiert werden können.

Die Erfindung wird nachfolgend beispielshalber anhand der Zeichnungen noch näher erläutert.
Es zeigen:
1a eine erste Ausführungsform eines SIL-Mikroskop-Aufbaus, der bei einer FCS-Messung verwendet wird;
1b eine vergrößerte Ausschnittsdarstellung der SIL-Objektiv-Anordnung, wobei ein Beispiel für die Objektiv-SIL-Trennung gezeigt ist, mit der eine Wärmeentkopplung (z.B. ein Luftspalt) zwischen beiden optischen Elementen möglich ist;
2a und 2b typische Korrelationskurven von TMR-Konzentrationen von 1 nM bzw. 10 nM, die mit einem 1,15 NA-Objektiv erhalten wurden;
3 eine typische Korrelationskurve des Fluoreszenzsignals von TMR in einer Konzentration von 10 nM, erhalten mit einem 0,6 NA-Objektiv + SIL, wobei der Korrekturring auf die "-0,125"-Stellung eingestellt ist;
4a, 4b, 4c typische Korrelationskurven für das Fluoreszenzsignal TMR in einer Konzentration von 1 nM, 10 nM bzw. 1000 nM;
5 eine hemisphärische SIL;
6 eine abgeflachte Kugel-SIL;
7 ein 0,6 NA-Mikroskopobjektiv von Zeiss mit einem Deckglas-Korrekturring, der auf die Stellung "0 mm" (links) bzw. "-0,125 mm" (rechts) eingestellt ist;
8a, 8b typische Korrelationskurven von TMR in Konzentration von 1 nM bzw. 10 nM, die mit dem 1,15 NA-Objektiv erhalten wurden;
9 eine typische Korrelationskurve des Fluoreszenzsignals von TMR in einer Konzentration von 10 nM, erhalten mit dem 0,6 NA-Objektiv;
10 eine schematische Darstellung des Probenvolumens, das durch das Objektiv + SIL-Geometrie gebildet wurde;
11a, 11b, 11c typische Korrelationskurven des Fluoreszenzsignals für TMR bei Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1000 nM, erhalten mit dem 0,6 NA-Objektiv + SIL;
12 eine schematische Darstellung des Probenvolumens, das durch die Objektiv + SIL-Geometrie gebildet wurde, wobei das Probenvolumen etwa 6 bis 7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt angeordnet ist;
13 eine schematische Darstellung der chromatischen Aberration in dem 0,6 NA + SIL-Mikroskopobjektiv-System, und
14 einen Vergleich zwischen herkömmlichen Objektiven und Objektiv-SIL-Kombinationen.
In dieser Ausführungsform wird eine Festkörper-Immersionslinse für Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-Messungen verwendet. Wir vergleichen die Leistung der Festkörper-Immersionslinse in einem konfokalen Mikroskop-Aufbau mit der Leistung eines herkömmlichen konfokalen Mikroskops, das für die FCS verwendet wird. Die Neuheit dieses neuen SIL-FCS-Aufbaus besteht in einem System, das ein herkömmliches Objektiv (NA=0,6) in Kombination mit einer Festkörper-Immersionslinse enthält, die für eine Einzelmoleküldetektion verwendet wird. Wichtige Parameter für Einzelmolekül-Versuche, wie z. B. die Sammeleffizienz und die Anregungsfeldbegrenzung, werden für verschiedene Abstände zwischen SIL und Objektiv untersucht.
Jüngste Fortschritte in der Bildgebung mit einer Auflösung im Subwellenlängenbereich, sowie in der Fluoreszenzbildgebung [Rigler, R., et al., Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1993. 22(3): p. 169–175] und in der Nahfeldoptik-Datensicherung [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p.251–297] haben die Brauchbarkeit von Festkörper-Immersionslinsen (SILs) für verschiedene Anwendungen bewiesen. Hier beschreiben wir den SIL-Ansatz für spektroskopische Studien und insbesondere für die auf Einzelmoleküldetektionsversuchen beruhende Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie.
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist ein Versuchsverfahren, das bei Studien der chemischen und photophysikalischen Dynamik auf der Einzelmolekülebene verwendet wird [Mansfield, S.M. and G.S. Kino, Solid Immersion Microscope. Appl. Phys.Lett, 1990. 57(24): p. 2615]. Hier wird eine Autokorrelation durch Messen der zufälligen Intensitätsschwankungen I(t) einer Fluoreszenzantwort erhalten, die durch lichtangeregte Moleküle in einem konfokalen Volumen erzeugt wird [Yoshita, M., et al., Fourier imaging study of efficient near-field optical coupling in solid immersion fluorescence microscopy. J. Appl. Phys, 2002. 92(2): p. 862]. Eine Analyse der Korrelationsfunktion ergibt Informationen über die dynamischen Prozesse (Quer- und Rotationsdiffusion) und die kinetischen Prozesse (z. B. Triplettzustände) der fluoreszierenden Moleküle.
Für den allgemeinen Fall kann die Autokorrelationsfunktion folgendermaßen ausgedrückt werden:
Die Klammern bezeichnen das zeitliche Mittel; G_mo _tion (τ) entspricht der Bewegung der Moleküle, während X_kinetics (τ) die kinetischen Prozesse des Moleküls (der Moleküle) beschreibt. Der analytische Ausdruck für eine Vielzahl unterschiedlich gewichteter, sich frei und unabhängig voneinander bewegender Moleküle (mit dem Index j bezeichnet) läßt sich folgendermaßen darstellen (O. Krichevsky, and G. Bonnet, „Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications", Rep. Prog. Phys, Vol. 65, pp. 251–297, 2002):
Hier steht Q_j für die spezifische Quantenausbeute, N_j für die durchschnittliche Anzahl unterschiedlicher Moleküle, die in dem Detektionsvolumenelement vorhanden sind, τ_Dj für die Diffusionszeiten von Molekülen über den Probenbereich, ω für das Aspektverhältnis des Detektionsvolumenelementes, T_j für den Anteil der Farbstoffmoleküle im Triplettzustand, und τ_Tj für die Relaxationszeit. In unserem Fall werden nur Ein- und Zwei-Komponentenlösungen berücksichtigt.
Für das höchste Signal-Rausch-Verhältnis ist die Begrenzung des Anregungsfeldes von großer Bedeutung bei FCS-Versuchen, insbesondere dann, wenn Proben mit einer hohen Konzentration an farbstoffmarkierten Molekülen gemessen werden. Die Feldbegrenzung und die Sammeleffizienz stehen beide im Zusammenhang mit der numerischen Apertur (NA) des Mikroskopobjektivsystems.
Die SIL ist eine aplanatische Linse, welche die NA des optischen Systems um einen Faktor n erhöht (hemisphärische SIL (N-SIL)) [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p. 251–297]; worin n für die Brechzahl des SIL-Materials steht. Bei der H-SIL betrug die berichtete Sammeleffizienz etwa 60% bis 70% [Rigler, R., et al., Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1993. 22(3): p. 169–175]. Eine räumliche Auflösung von bis zu lediglich 139 nm wurde bei einer Wellenlänge von 560 nm erreicht [Wu, Q., et al., Realization of NA 2.0 using a gallium phosphide Solid Immersion Lens. Appl. Phys. Lett, 1999. 75(26): p. 4064–4066]. All dies macht die SIL zu einer nützlichen Komponente für die optische Spektroskopie mit hohem Durchsatz.
Die in 1a und 1b gezeigte Ausführungsform beruht auf dem konfokalen Prinzip. Der Laserstrahl von einem diodengepumpten Festkörperlaser (532 nm, Kimmon DPSS-Laser, Modell 5526) wurde durch einen Strahlaufweiter (L₁ und L₂) aufgeweitet, um die hintere Pupille des Mikroskopobjektivs überauszuleuchten. Das Anregungslicht wurde über einen dichroitischen Spiegel (Chroma, 565LP) in ein Mikroskopobjektiv eingekoppelt, wobei die Fluorophor-Farbstoffmoleküle innerhalb des Fokalvolumens angeregt wurden. Die Fluoreszenzemission wurde durch dasselbe Objektiv gesammelt und durch einen Bandfilter (Chroma HQ585/40) geführt, der das Signal gegenüber dem Hintergrundlicht ausfilterte.
Schließlich wurde die Fluoreszenzemission durch die Tubuslinse (L₃) in die optische Eingangsfaser (Ø 50 μm, als Lochblende dienend) eines faseroptischen 50/50-Strahlteilers (OZ Optics Ltd.) fokussiert. Die Ausgangsfasern des Strahlteilers wurden mit den Einphotonen-Zählmodulen SPCM-AQR-13 (Perkin Elmer Optoelectronics) gekoppelt. Die photoinduzierten Impulse der Detektoren wurden in einem Zweikanal-Korrelator registriert (correlator.com, Flex990EM-12C), der die Kreuzkorrelationsfunktion berechnete. Diese entspricht der Autokorrelationsfunktion des Fluoreszenzsignals, wobei die Kreuzkorrelationsmessung ein elektronisches Nachpulsen unterdrückt. Die erhaltenen Daten wurden im Computerspeicher gespeichert und dann mit einer Software anhand eines nicht linearen Marquardt-Levenberg-Algorithmus analysiert, mit dem die Anzahl von Molekülen, die Diffusionszeiten der Moleküle, der Bruchteil der Moleküle im Triplettzustand und die Relaxationszeit extrahiert werden können.
Für die Messungen wurden zwei verschiedene Mikroskopobjektive verwendet. Für herkömmliche FCS-Messungen, die als Bezugsmessungen betrachtet werden, verwendeten wir ein 40x, NA=1,15, Wasserimmersionsobjektiv (Olympus, Uapo/340, Deckglas korrigiert). Für den SIL-FCS-Aufbau wurde ein Zeiss-Objektiv (LD Achroplan 40x/0.60 Kor) mit einem Arbeitsabstand von 1,8 mm verwendet. Dieses Objektiv weist eine ausreichend große numerische Apertur (NA=0,6) und einen ausreichenden Arbeitsabstand auf, um die SIL anzuordnen. Dieses 0,6NA-Objektiv hat eine variable Deckglas-Korrektur mit einem Bereich von „0,125 mm" bis „2 mm". Sobald die SIL angebracht und die Korrektur auf die "0"-Stellung eingestellt war, wurde das Probenvolumen in unmittelbarer Nähe der ebenen Oberfläche der SIL angeordnet (T.D. Milster, S.Jo. Joshua, K. Hirota, „Roles of propagating and evanesvent waves in solid immersion lens systems", Appl. Optic, Vol. 38, pp. 5046–5057, 1999). Als die Korrektur auf die "-0,125"-Stellung eingestellt war, wurde das Probenvolumen auf etwa 7 μm über der ebenen SIL-Oberfläche verschoben (simuliert mit ZEMAX (Focus Software, Inc.)).
Die N-SIL mit einem Radius von 0,7 mm war aus LaSF35-Glas (n=2,02) gefertigt. Für die Proben verwendeten wir Nukleotid-Triphosphate (TMR, Tetramethylrhodamin-6-dCTP, New England Labs-425) in Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1 μM. Die farbstoffmarkierten Moleküle wurden in einem Tröpfchen auf einem Deckglas oder direkt auf der ebenen Oberfläche der SIL verteilt. Die optische Leistung auf der Probe betrug 1,2 mW für das 1,15 NA-Objektiv und 0,7mW für die Kombination aus 0,6 NA-Objektiv und SIL.
Typische mit dem 1,15 NA-Objektiv erhaltene Korrelationskurven sind in 2a (TMR-Konzentration von 1 nM) und 2b (TMR-Konzentration von 10 nM) gezeigt, wobei Kreuze für die Meßdaten stehen und die durchgezogene Linie eine Anpassung der analytischen Funktion gemäß Gleichung (2) ist. Aufgrund der symmetrischen Detektion und Kreuzkorrelations-Signalanalyse ist in den Korrelationskurven kein Nachpulsen vorhanden. Die erhaltenen Korrelationskurven wurden mit der Gleichung (2) an den Ein-Komponenten-Fall (j = 1) angepaßt. Die translatorische Diffusionszeit der Moleküle betrug D = 110 μs, wobei die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Probenvolumen N = 0,86 für 1 nM und N = 16 für 10 nM Lösungen betrug. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand betrug T = 0,3. Der Zählrate pro Molekül (Count rate Per Molecule = CPM)-Parameter betrug 84 kHz.
Die in 3 gezeigte Korrelationskurve wird aus dem Probenvolumen erhalten, das mit einer SIL auf deren ebener Oberfläche gebildet wurde (die Korrektur ist auf die "0"-Stellung eingestellt). In 3 ist die typische Korrelationskurve des Fluoreszenzsignals von TMR in einer Konzentration von 10 nM gezeigt, erhalten mit dem 0,6 NA-Objektiv plus SIL. Der Korrekturring ist auf die "-0,125"-Stellung eingestellt. Die "Kreuze" stehen für Meßdaten; die durchgezogene Linie ist eine Anpassung an die gemessene Korrelationskurve. Zur bestmöglichen Anpassung wurden die erhaltenen Korrelationskurven mit der Gleichung (2) für einen Zwei-Komponenten-Fall (j = 2) angepaßt. Für diesen Versuch gehen wir davon aus, daß zwei Arten von Molekülen vorliegen, nämlich i) frei diffundierende Moleküle plus ii) Moleküle, die nahe der SIL-Oberfläche mit einer Geschwindigkeit diffundieren, die etwa siebenmal langsamer ist. Durch die Anpassungsanalyse erhielten wir τ_D1 = 25 μs, τ_D2 = 200 μs und N₁=0,86, N₂=0,9. Der gemessene CPM-Wert betrug 100 kHz, was unter Berücksichtigung der geringeren Anregungsleistung (0,7 mW), die für das SIL-Experiment verwendet wurde, im Vergleich zu dem 84 kHz-Wert, der mit dem 1,15 NA-Objektiv (1,2 mW) erhalten wurde, bemerkenswert ist. Der Anteil der Moleküle, die im Triplettzustand vorliegen, ist T=0,44. Dies ist ein 1,5-mal höherer Faktor als bei den 1,15 NA-Objektiv-Versuchen.
Für die "-0,125 mm"-Stellung typische Korrelationskurven sind in 4a, 4b und 4c gezeigt, wobei typische Korrelationskurven für das Fluoreszenzsignal von TMR in Konzentrationen von 1 nM (4a), 10 nM (4b) und 1000 nM (4c), die mit dem 0,6 NA-Objektiv plus SIL erhalten wurden, gezeigt sind. Die Korrektur ist auf die "-0,125 mm"-Stellung eingestellt. Die "Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie stellt die Anpassung mit der Gleichung (2) dar. Für diese Fälle wurde die beste Anpassung mit dem Ein-Komponenten-Modell (j = 1) erhalten. Dies weist auf eine freie 3D-Diffusion hin. Für alle Messungen betrug die Diffusionszeit τ_D = 38 ± 1μs. Die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Probenvolumen betrug N=0,19, N=2,2, und N=215 für Konzentrationen von 1 nM, 10 nM bzw. 1000 nM. Der CPM-Wert betrug bis zu 82 kHz für die Messung mit 10 nM. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand lag bei T=0,3.
Ein Vergleich der SIL-Ergebnisse mit den Bezugsergebnissen zeigt eine Verbesserung der Feldbegrenzung um einen Faktor von 5 bis 7. Beim Vergleich der Diffusionszeiten stellen wir fest, daß die Diffusionszeit, die mit der SIL erhalten wird, 3 mal kleiner ist als die für das 1,15 NA-Objektiv. Dies impliziert, daß der transversale Querschnitt des Probenvolumens im Vergleich zum 1,15 NA-Objektiv dreimal kleiner (200 nm bei λ = 560 nm) ist.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß wir die Brauchbarkeit einer hemisphärischen Festkörper-Immersionslinse für FCS-Messungen untersucht haben. Wir haben gezeigt, daß die SIL für Messungen von Molekülen nahe oder an der Oberfläche, ii) Tiefenmessungen im Inneren der Probe, d.h. 6–7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt, verwendet werden kann. Dies zeigt uns eine Flexibilität des SIL-Ansatzes für FCS. Abschließend gehen wir davon aus, daß die SIL folgendes ermöglicht: i) eine mehrfache Erhöhung der Auflösung des Systems gegenüber den derzeit verwendeten FCS-Systemen; ii) Bereitstellung einer hohen Sammeleffizienz des optischen Systems; iii) eine Tiefenabtastung der Probe von bis zu mindestens 7 μm; iv) Messungen an den Proben mit bis zu 10-mal höheren Fluorophor-Konzentrationen (im Vergleich zu Wasser-Immersionsobjektiven).
Die zweite Ausführungsform betrifft spektroskopische Vorrichtungen und Verfahren unter Verwendung einer Festkörper-Immersionslinse für Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-Messungen. Es wird die Leistung einer konfokalen Mikroskops mit Festkörper-Immersionslinse mit der Leistung eines herkömmlichen konfokalen Mikroskops, das für die FCS verwendet wird, verglichen. Das Kernstück des neuen SIL-FCS-Mikroskops ist ein System, das ein herkömmliches Objektiv (keine Immersionsflüssigkeit) aufweist, welches mit einer Festkörper-Immersionslinse "bestückt" ist. Wichtige Parameter für Einzelmolekülversuche, wie zum Beispiel die Sammeleffizienz und die Anregungsfeldbegrenzung, werden für verschiedene Modi des SIL-Objektivsystems untersucht.
Jüngste Fortschritte in der Bildgebung mit sehr hoher räumlicher Auflösung, sowie in der Fluoreszenzbildgebung auf einer großen Vielfalt von Systemen belegten die Brauchbarkeit der Festkörper-Immersionslinsen (SILs). In diesem Fall ist eine SIL eine analoge Festkörperkomponente zu einer Immersionsflüssigkeit, die für eine Bildgebung mit Subwellenlängen-Auflösung gut geeignet ist. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß der SIL-Ansatz ein Potential hat, das über die Weitwinkelbildgebungsmikroskopie hinausgeht, insbesondere ein Potential für Einzelmoleküldetektionsversuche, z.B. die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, wie dies nachfolgend gezeigt werden wird.
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist ein Versuchsverfahren, das bei Untersuchungen der chemischen und photophysikalischen Dynamik auf der Einzelmolekülebene verwendet wird [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p. 251–297]. Hier wird eine Autokorrelation durch Messen der zufälligen Intensitätsschwankungen einer Fluoreszenzantwort erhalten, die durch lichtangeregte Moleküle in einem konfokalen Volumen erzeugt wird. Eine Analyse der Korrelationsfunktion ergibt Informationen über den dynamischen Prozeß (Quer- und Rotationsdiffusion) und den kinetischen Prozeß (z.B. Triplettzustände) der fluoreszierenden Moleküle. Im Lauf des letzten Jahrzehnts hat sich FCS als leistungsfähiges Verfahren zum Analysieren der Prozesse auf Molekularebene herausgestellt: Molekülinteraktionen, Konformationsänderungen, chemische Reaktionen, Proteinbindung an Zellmembranen, photophysikalische Dynamik usw.
Für das höchste Signal-Rausch-Verhältnis ist die Begrenzung des optischen Anregungsfeldes von großer Bedeutung bei FCS-Versuchen, insbesondere bei der Messung an Proben mit einer hohen Konzentration von farbstoffmarkierten Molekülen, z.B. in biologischen Zellen. Eine starke Begrenzung (weniger als ein Femtoliter) schlägt sich nicht nur in einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis nieder, sondern auch in einer höheren Auflösung, die beide bei einem Einzelmolekülexperiment eine Schlüsselrolle spielen.
Neben der Begrenzung ist eine hohe Sammeleffizienz des optischen Systems für ein erhöhtes Signal-Rausch-Verhältnis von Bedeutung, was folglich zu einer kürzeren Meßzeit führt. Die Feldbegrenzung und die Sammeleffizienz sind beide direkt proportional zur numerischen Apertur (NA) des Mikroskopobjektivsystems.
Festkörper-Immersionslinsen-Mikroskopie
Die SIL, eine aplanatische Linse, wurde ursprünglich als Technik zum Verbessern der räumlichen Auflösung der herkömmlichen Abbildungsmikroskopie entwickelt. Die SIL ist eine abgeflachte Glaskugel, welche die numerische Apertur des optischen Systems um einen Faktor n (hemisphärische SIL (H-SIL), 5: NA_eff = n·sinα = n·NA_MO) oder sogar n² (abgeflachte Kugel SIL (T-SIL), 6: NA_eff = n²·NA_MO ) erhöht [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p.251–297], wobei n die Brechzahl des Linsenmaterials ist. Dabei wird auf der ebenen Oberfläche der SIL ein fokussierter Punkt erhalten. Bei beiden Linsenauslegungen (aplanatische H-SIL-Linse, auch als H-SIL bezeichnet (aufgrund ihrer hemisphärisch-planaren Form) und aplanatische T-SIL-Linse: 1. Oberfläche aplanatisch, 2. Oberfläche planar) kann eine Erhöhung der numerischen Apertur erreicht werden; die chromatische Abweichung ist jedoch sehr groß.
Die Auflösung der H-SIL ist Δd=λ/(2·n·NA) und die der T-SIL ist Δd=λ/(2·n²·NA), worin NA für die numerische Apertur der Hauptobjektivlinse steht.
Für die H-SIL betrug die berichtete Sammeleffizienz mit dem NA = 0,8-Objektiv und der n = 1,845 SIL etwa 60%–70%, was den Beugungsgrenzwert von 50% für die 2π-Raumwinkel-Sammlung bei herkömmlichen Verfahren deutlich überschreitet [Rigler, R., et al., Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1993. 22(3): p.169–175]. Mit der T-SIL (n = 1,845) und dem Objektiv mit NA = 0,55 betrug die Sammeleffizienz der, Fluoreszenz von farbstoffdotierten Mikrokugel-Tropfenproben mit einem Durchmesser von 0,11 μm das 21-fache dessen, was bei der herkömmlichen Mikroskopie gemessen wurde (dasselbe Objektiv ohne die SIL wird verwendet), d.h. schätzungsweise 76% [Quabis, S., et al., The focus of light – theoretical calculation and experimental tomographic reconstruction. Applied Physics B-Lasers and Optics, 2001. 72(21): p. 109–113 und Yoshita, M., et al., "Improved high collection efficiency in fluorescence microscopy with a Weierstrass-sphere solid immersion lens", Japanese Journal of Applied Physics Part 2-Letters, Vol. 41, pp. L858-L860, 2002].
Darüber hinaus kann die Festkörper-Immersionsmikroskopie (SIM) sogar noch leistungsfähiger werden, wenn sie mit einem konfokalen Mikroskopieverfahren kombiniert wird. In jüngster Vergangenheit wurde über eine erfolgreiche Verwendung von SIL für die Konfokalmikroskopie berichtet [Stamnes, J., Waves in Focal Regions. 1986, Bristol: Adam Hilger und K. Karrai, X. Lorenz, L. Novotny, "Enhanced reflectivity contrast in confocal solid immersion lens microscopy", Appl. Phys. Letters, Vol. 77, pp. 3459–3461, 2000].
All dies macht die SIL zu einer nützlichen Komponente für die optische Spektroskopie mit hohem Durchsatz.
Für unsere Versuche beschränkten wir unsere Arbeit aus den folgenden Gründen auf die H-SIL:

1. H-SILs haben aufgrund der Materialdispersion nur geringe chromatische Aberrationen, d.h. die H-SILs können als achromatisch betrachtet werden.
2. Sie ist im Vergleich zur T-SIL toleranter gegenüber der Dicke der Linse [0].

Wir bauten eine hemisphärische SIL in einen Konfokalmikroskopaufbau ein, der ursprünglich für FCS-Versuche aufgebaut war. Später untersuchten wir die Leistung unseres SIL-FCS-Aufbaus und verglichen sie mit der Leistung eines herkömmlichen FCS-Systems. Dies zeigt die Leistung des SIL-FCS-Systems für zuverlässige Messungen der photophysikalischen Dynamik auf der Einzelmolekülebene mit einer Auflösung im Subwellenlängenbereich.
Die Grundlagen für die FCS wurden vor etwa 25 Jahren geschaffen [Guo, F., T.E. Schlesinger, and D.D. Stancil, Optical field study of near-field optical recording with a solid immersion lens. Applied Optics, 2000. 39(2): p.324–332 und D. Madge, E.L. Elson, W.W. Webb, "Thermodynamic Fluctuations in a Reacting System-Measurement by Fluorescence Correlation Spectroscopy", Phys. Rev. Lett., Vol. 29, pp. 705–711, 1972; Hess, S.T. and W.W. Webb, Focal volume optics and experimental artifacts in confocal fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal, 2002. 83(4): p.2300–2317 und M. Ehrenberg, R. Rigler, "Rotational brownian motion and fluorescence intensity fluctuations", Chem. Phys, Vol. 4, pp.390–401, 1974], detaillierte Berichte über die FCS sind andernorts zu finden [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy. the technique and its applications. Rep. Prog. Phys, 2002. 65: p. 251–297; Terris, B.D., et al., Near-field optical data storage using a Solid Immersion Lens. Appl. Phys. Lett, 1994. 65(4): p. 388].
Im allgemeinen wird ein Anregungslaser in eine Probe fokussiert. Jedes Molekül, das durch den Anregungsbrennpunkt diffundiert, bewirkt ein Ansteigen von Fluoreszenz-Photonenschauern. Die Länge jedes Photonenschauers (bzw. Photonen-Bursts) entspricht der Zeit, die das Molekül im Detektionsvolumenelement verweilt. Um Beiträge außerhalb des Fokus und Streulicht zu verwerfen, wird ein konfokaler Aufbau verwendet, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird (R. Rigler, U. Mets, J. Widengren, P.Kask, „Fluorescence correlation spectroscopy with high count rates and low background: analysis of translational diffusion", Eur. Biophys. J. Vol. 22, pp. 169–175, 1993). Danach werden die Fluoreszenzphotonen mit einem Einzelphotondetektor detektiert, der im Geiger-Modus arbeitet. Jedes detektierte Einzelfluoreszenzphoton erzeugt einen Impuls, der an einen Korrelator übertragen wird, in dem die Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensitätsschwankungen berechnet wird.
Die Autokorrelationskurve enthält Informationen über die Dynamik von Intensitätsschwankungen in dem Zeitintervall von typischerweise 30 ns (Totzeit des Detektors) bis zur Dauer der Messung. Durch Anpassen der Autokorrelationsfunktion an einen analytischen Ausdruck können wichtige Grundparameter extrahiert werden: Diffusionszeit (durchschnittliche Durchgangszeit eines Moleküls im Detektionsvolumenelement), durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Detektionsvolumenelement, Molekülanteile (wenn mehrere Arten unterschiedlicher diffundierender Moleküle in der Probe vorhanden sind), und der Anteil von Teilchen, die den Triplettzustand belegen (langlebige, nicht fluoreszierende Dunkelzustände).
Für den allgemeinen Fall kann die Korrelationsfunktion folgendermaßen ausgedrückt werden:
worin G_motion (τ) die Bewegung der Moleküle widerspiegelt, z.B. Quer- und Rotationsdiffusion, und X_kinetics (τ) kinetische Prozesse des Moleküls (der Moleküle) beschreibt. Für den einfachsten möglichen Fall einer Diffusion einer einzelnen chemischen Spezies in einer verdünnten Lösung lautet der analytische Ausdruck für die Autokorrelationsfunktion folgendermaßen:
worin I(t) für die Intensität der Fluoreszenz, die in dem Detektionsvolumenelement vorhanden ist, und 〈〉 für das Zeitmittel steht. N ist die mittlere Anzahl von Molekülen, die in dem Detektionsvolumenelement V = π^3/2ω 2 / xyω_z vorliegen, wobei ω = w_z/ω_xy für das Aspektverhältnis des Detektionsvolumenelementes und τ_D = ω 2 / xy/4D für die Diffusionszeit im gesamten Probenbereich steht, wobei D der Diffusionskoeffizient ist. Somit ist die durchschnittliche Konzentration der Moleküle in dem Volumenelement C=N/V. Der kinetische Teil der Gleichung (1) für den einfachsten Fall lautet:
Hier steht T für den Anteil von Farbstoffmolekülen im Triplettzustand, und τ_T ist die Relaxationszeit; d. h. die Zeit, während der sich die Moleküle im Triplettzustand befinden.
Schließlich kann der analytische Ausdruck für eine Vielzahl unterschiedlich gewichteter, sich frei und unabhängig voneinander bewegender Moleküle geschrieben werden als (O. Krichevsky, and G. Bonnet, „Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications", Rep. Prog. Phys., Vol. 65, pp. 251–297, 2002):
Hier wird jeder Beitrag der verschiedenen Moleküle (mit dem Index j bezeichnet), die in dem Detektionsvolumenelement vorhanden sind, mit den spezifischen Quantenausbeuten Q_j gewichtet. In unserem Fall wird nur eine Zwei-Komponenten-Lösung in Betracht gezogen.
Der Versuchsaufbau dieser Ausführungsform entspricht dem, der in 1a und 1b dargestellt ist. Der Aufbau arbeitet mit dem Konfokalmikroskop-Prinzip.
Der Laserstrahl eines diodengepumpten Festkörper-Lasers (532 nm, Kimmon DPSS Laser, Modell 5526) wurde durch einen Strahlaufweiter aufgeweitet (L₁ (f=25 mm), L₂ (f=400 mm)), um die hintere Pupille des Mikroskopobjektivs überauszuleuchten. Ferner wurde das Anregungslicht an einem dichroitischen Spiegel (Chroma, 565LP) in ein Mikroskopobjektivsystem reflektiert, das die Fluorophorfarbstoff-Moleküle innerhalb des Fokalvolumens anregte. Die Fluoreszenzemission wurde durch dasselbe Objektiv gesammelt und durch einen Bandfilter (Chroma HQ 585/40) geleitet, der das Signal gegenüber dem Hintergrundlicht herausfilterte. Schließlich wurde die Fluoreszenzemission durch die Tubuslinse (L₃ (f=180 mm)) in die optische Eingangsfaser (Ø 50 μm, als Lochblende dienend) eines faseroptischen 50/50-Strahlteilers (von OZ Optics Ltd) fokussiert. Die Ausgangsfasern des Strahlteilers wurden mit den Detektionsmodulen SPCM-AQR-13 (Einzelphotonen-Zählmodul von Perkin Elmer Optoelectronics) verbunden. Die photoinduzierten Impulse von den Detektoren wurden durch einen Hardware-Korrelator mit zwei Eingängen registriert (correlator.com, Flex99OEM-12C), der die Kreuzkorrelationsfunktion berechnete. Diese entspricht der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenz, wobei der Kreuzkorrelationsansatz ein elektronisches Nachpulsen in dem Korrelationssignal unterdrückt. Die erhaltenen Daten wurden im Computerspeicher gespeichert und dann mit einer Software analysiert, die auf einem nichtlinearen Minimierungsalgorithmus der kleinsten Quadrate (Marquardt-Levenberg) basierte und die Anzahl der Moleküle und die Diffusionszeiten der Moleküle anzeigt.
Zwei unterschiedliche Mikroskopobjektive wurden für die Messungen verwendet. Für herkömmliche FCS-Messungen, die als Bezugsmessungen betrachtet werden, verwendeten wir einen 40x NA=1,15-Wasserimmersions-Objektiv (Olympus, Uapo/340, Deckglas korrigiert). Für den SIL-FCS-Aufbau wurde ein Zeiss-Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 1,8 mm verwendet (LD Achroplan 40x/0,60 Kor). Die Wahl dieses Objektives ist durch das Erfordernis einer hohen numerischen Apertur (NA=0,6) einerseits und eines ausreichenden Arbeitsabstandes zum Anordnen der SIL andererseits bedingt. Für die N-SIL verwendeten wir eine Kugellinse mit einem Radius von 0,7 mm aus einem Material mit einer Brechzahl von n=2,02 (Glas-Typ Schott-Glas LaSF35), die durch Polieren in eine hemisphärische Form gebracht wurde.
Proben
Nukleotidtriphosphate (TMR, Tetramethylrhodamin-6-dCTP New England Labs-425) wurden in Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1 μm für Diffusionsmessungen verwendet. Die farbstoffmarkierten Moleküle wurden in einem Tröpfchen auf einem Deckglas oder direkt auf der ebenen Oberfläche der SIL verteilt. Die optische Leistung auf der Probe betrug 1,2 mW für das 1,15 NA-Objektiv und 0,7 mW für das 0,6 NA-Objektiv plus SIL.
Messungen, Ergebnisse und Diskussionen
In diesem Abschnitt beschreiben wir die spektroskopischen Messungen, die mit und ohne SIL durchgeführt wurden. Wir werden die Leistung unterschiedlicher Objektivsysteme vergleichen:

i) 1,15 NA-Objektiv
ii) 0,6 NA-Objektiv plus SIL.

Das 0,6 NA-Objektiv weist einen Deckglas-Korrekturring auf, der in das Objektiv integriert ist. Der Korrekturbereich erstreckt sich von -0,125 mm bis 2 mm, siehe 7 (0,6 NA-Mikroskopobjektiv von Zeiss mit einem Deckglas-Korrekturring, der auf die Stellung "0 mm" (links) bzw. "-0,125 mm" (rechts) eingestellt ist.).
Bei der Messung mit einer SIL muß die Korrektur auf die "0"-Stellung eingestellt werden. In diesem Fall befindet sich das Probenvolumen (beugungsbegrenzt) in unmittelbarer Nähe der ebenen Oberfläche der SIL. Wir verwendeten jedoch auch die "-0,125"-Stellung des Korrekturrings an dem Objektiv, was zuverlässige FCS-Messungen ergab, wenn die SIL verwendet wird. In diesem Fall war das Probenvolumen schätzungsweise etwa 7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind nachfolgend angegeben.
Messungen mit dem 1,15 NA-Objektiv
Das verwendete Objektiv mit seiner hohen NA = 1,15 ergibt eine hohen Sammeleffizienz und eine gute Begrenzung des Anregungsfeldes.
Typische Korrelationskurven, die mit dem 1,15 NA-Objektiv erhalten wurden, sind in 8a, 8b (die "Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie ist eine Anpassung der analytischen Funktion, Gleichung (6)) für zwei verschiedene Konzentrationen, nämlich 1 nM (8a) und 10 nM (8b), gezeigt. Aufgrund des Konzeptes der abgeglichenen Detektoren und der Kreuzkorrelations-Signalanalyse ist in den Korrelationskurven kein Nachpulsen vorhanden.
Die erhaltenen Korrelationskurven wurden mit der Gleichung (6) für eine Komponente (j=1) angepaßt. Die Translationsdiffusionszeit der Moleküle betrug τ_D = 110 μs, die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Probenvolumen war N = 0,86 für eine 1 nM-Lösung und N=16 für eine 10 nM- Lösung. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand war T=0,3. Der Zählrate pro Molekül (CPM)-Parameter betrug bei manchen Messungen bis zu 100 kHz. Das Hintergrundrauschen (2,3 kHz) wird nicht berücksichtigt.
NA 0,6+SIL, Korrekturring in "0"-Stellung
Dieses Objektiv wird aufgrund seiner geringen numerischen Apertur nicht alleine für FCS-Messungen verwendet. Für sich genommen, ergibt es nur eine CMP von etwa 18 kHz. Wenn es jedoch mit einer SIL kombiniert wird, zeigt diese Kombination eine gute FCS-Leistung, wie dies nachfolgend beschrieben wird.
Die in 9 gezeigte Korrelationskurve wird aus dem Probenvolumen erhalten, das mit einer SIL auf deren ebener Oberfläche bei einer Konzentration von 10 nM gebildet wird (die "Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie ist eine Anpassung an die gemessene Korrelationskurve). Die Korrelationskurve erfüllte nicht gut ein Ein-Komponenten-Modell, wobei wir davon ausgehen, daß dies durch die Modifikation der freien 3D-Diffusion nahe der Oberfläche bedingt war. Da das Probenvolumen in unmittelbarer Nähe der Oberfläche liegt (in 10; Probenvolumen, das durch diese Objektiv + SIL-Geometrie gebildet wurde – das Probenvolumen befindet sich unmittelbar auf der SIL-Proben-Grenzfläche), sollte nicht nur die Beobachtung einer freien 3D-Diffusion zu erwarten sein, sondern auch eine 2D-Diffusion auf der SIL-Oberfläche. Daher wurde die erhaltene Korrelationskurve gemäß der Gleichung (6) für einen Zwei-Komponenten-Fall (j=2) angepaßt.
Dieses Modell paßt gut zu den Versuchsdaten. Aus der Anpassungsanalyse erhielten wir τ_D ₁ = 25 μs, τ_D ₂ = 200 μs, und N₁ = 0,86, N₂ = 0,9. Der CPM-Wert betrug 100 kHz, was bemerkenswert hoch ist. Der Anteil der Moleküle, die im Triplettzustand vorliegen, ist T=0,44. Dies ist ein 1,5-mal höherer Faktor als bei den Versuchen mit dem 1,15 NA-Objektiv. Innerhalb dieses Modells gehen wir davon aus, daß zwei Typen von Molekülen vorliegen, nämlich i) frei diffundierende Moleküle plus ii) Moleküle, die an der SIL-Oberfläche mit einer etwas langsameren Geschwindigkeit diffundieren (wie gemessen).
Aus einem Vergleich der Messungen, die mit dem 1,15 NA-Objektiv und mit dem 0,6+SIL-Objektiv bei einer Konzentration von 10 nM durchgeführt wurden, schlossen wir, daß das mit der SIL erhaltene Probenvolumen etwa 9-mal kleiner ist. Die CPMs sind für beide Schemata vergleichbar (siehe Daten in 8a, 8b und 9). Dies paßt gut zu den numerischen Aperturen NA=1,15 für das Immersionsobjektiv und NA=1,2 für das 0,6 NA+SIL-System. Die optischen Feldverteilungen sind jedoch sehr unterschiedlich und müssen näher untersucht werden [Milster, T.D., Chromatic Correction of High-Performance Solic Immersion Lens System. Jpn. J. Appl. Phys., 1999. 38(Part 1, 3B): p. 1777–1779].
Der Rausch-Beitrag für das SIL-System betrug 8 kHz. Dieses relativ hohe Rauschen ist durch die von der ebenen SIL-Oberfläche zurückreflektierten Photonen bedingt.
NA 0,6+SIL, Korrekturring in "-0,125"-Stellung
Durch Verkleinern des Abstandes zwischen dem Objektiv und der SIL um 20 μm erhielten wir den höchsten CPM-Wert. Das Probenvolumen wurde um etwa 6–7 μm von der SIL-Oberfläche wegverschoben.
In diesem Fall entsprachen die erhaltenen Korrelationskurven gut einem Ein-Komponenten-Modell (j = 1 in Gleichung (6)), was sich durch die Probenvolumen-Verschiebung und eine zu erwartende, freie 3D-Diffusion erklärt. Die typischen Korrelationskurven sind in 11a, 11b, 11c (die „Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie steht für die Anpassung gemäß Gleichung 6) für Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1000 nM gezeigt.
Für alle Messungen wurde festgestellt, daß die Diffusionszeit τ_D = 38±1μs war. Die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Probenvolumen war N = 0,19, N = 2,2 und N = 215 für die Konzentrationen von 1 nM, 10 nM bzw. 1000 nM. Der CPM-Wert betrug bis zu 120 kHz für die 10 nM-Messung (Einzelmolekül-Modus), und der Rauschpegel lag bei 2500 Hz. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand betrug etwa T=0.3.
Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Ergebnissen, die mit dem 1,15NA-Objektiv erhalten wurden, zeigt die Verbesserung der Feldbegrenzung um einen Faktor von 5 bis 7 mit niedrigeren CPM-Werten für die Konzentrationen von 1 nM und 1000 nM TMR. Im Fall der höchsten Konzentration erkennt der Detektor keine Zwei- und Mehrphotonen-Ereignisse, im Fall der niedrigsten Konzentration ist der optimale Ort schwer zu bestimmen, was zu niedrigeren CPM-Werten führte.
12 zeigt die Detektionsgeometrie bzw. das Probenvolumen, das durch diese Objektiv+SIL-Geometrie gebildet wurde – das Probenvolumen ist etwa 6 bis 7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt angeordnet. Wie die höhere Feldbegrenzung durch eine restliche axiale chromatische Aberration und durch chromatische Variation der sphärischen Aberration bedingt ist, siehe 13: Der Fokus für die Wellenlänge von 532 nm (Anregungslicht) und der Fokus für 560 nm (angeregtes Licht) überlappen sich nicht vollständig, sondern weisen nur einen gemeinsamen Teil auf, der schließlich das Probenvolumen bildet, das 5- bis 7-mal kleiner als das mit dem 1,15NA-Objektiv mögliche ist. Aufgrund der Aberrationen befindet sich das Probenvolumen in der Überlappung der Punktverwaschungsfunktionen (PSF) für unterschiedliche Wellenlängen, nämlich für die anregenden und für die angeregten.
Bei einem Vergleich der Diffusionszeiten stellten wir fest, daß die mit der SIL erhaltene Diffusionszeit 3-mal kürzer ist als die für das 1.15NA-Objektiv. Dies bedeutet, daß der XY-Durchmesser des Probenvolumens sowie die Auflösung des SIL-„bestückten" Systems gegenüber dem 1.15NA-Objektiv ebenfalls 3 mal kleiner ist (200 nm bei λ = 560 nm).
Bei dieser Arbeit untersuchten wir die Brauchbarkeit einer hemisphärischen Festkörper-Immersionslinse für FCS-Messungen. Wir bauten ein Festkörper-Immersionslinsen-Konfokalmikroskop, um FCS-Messungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Fluoreszenzmolekülen durchzuführen. Wir zeigten die Leistung dieses Mikroskopsystems hinsichtlich der Sammeleffizienz und der Feldbegrenzung, die beide von großer Bedeutung für FCS-Experimente sind. Es wurde gezeigt, daß die Sammeleffizienz des SIL-Mikroskops nahezu dieselbe ist wie die eines herkömmlichen FCS-Mikroskops; wir erreichten mit der SIL-Konfiguration eine Zählrate von bis zu 100 kHz pro Molekül. Das Probenvolumen, das mit der SIL gemessen wurde, schien bis zu 9-mal kleiner zu sein (für die „0"-Korrektur) als im Vergleich mit dem Wasserimmersionsobjektiv, während die Querauflösung etwa 200 nm (bei λ = 560 nm) betrug. Dies ebnet den Weg für FCS-Messungen mit höherer Auflösung sowie für Messungen mit höheren Fluorophorkonzentrationen – was durch die mit der SIL durchgeführten Messungen bei einer TMR-Konzentration von 1000 nM gezeigt wurde. Wir zeigten zwei unterschiedliche Verwendungsmöglichkeiten der SIL für FCS: i) die SIL wird für Messungen von Molekülen nahe oder auf der Oberfläche, ii) für Tiefenmessungen im Inneren der Probe, d. h. 6 bis 7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt, verwendet. Dies zeigt uns eine Flexibilität des SIL-Ansatzes für FCS.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die SIL-Konfiguration für die Einzelmolekülspektroskopie

• die Auflösung des Systems gegenüber derzeit verwendeten FCS-Systemen um ein Vielfaches erhöht,
• eine höhere Sammeleffizienz des optischen Systems bereitstellt,
• ein Erfassen der Probe in der Tiefe von mindestens bis zu 7 μm zuläßt und
• Messungen an den Proben mit (im Vergleich zu Wasserimmersionsobjektiven) bis zu 10-mal höheren Fluorophor-Konzentrationen ermöglicht.

14 zeigt einen Vergleich zwischen herkömmlichen Objektiven und Objektiv-SIL-Kombinationen.

Claims

Festkörper-Immersionslinse für ein Mikroskop mit einem Objektivsystem mit einer vorbestimmten numerischen Apertur, wobei die Brechzahl des Materials der Festkörper-Immersionslinse so gewählt ist, daß die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht ist, wenn die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem vorgeschaltet ist.
Festkörper-Immersionslinse nach Anspruch 1, bei der die Brechzahl größer oder gleich 1,3 beträgt.
Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, wobei der die Festkörper-Immersionslinse eine Linsenform mit mindestens einer aplanatischen Oberfläche aufweist.
Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, bei der die Festkörper-Immersionslinse mindestens eine diffraktive optische Oberfläche umfaßt.
Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die so dem Objektivsystem vorgeschaltet werden kann, daß sie vom Objektivsystem beabstandet ist, bevorzugt um mindestens 1 mm.
Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die so dem Objektivsystem vorgeschaltet werden kann, daß sie vom Objektivsystem vollständig thermisch, elektrisch und/oder mechanisch entkoppelt ist.
Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die als hemisphärische oder als abgeflachte Kugel ausgebildet ist.
Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die eine ebene Oberfläche aufweist.
Festkörper-Immersionslinse nach Anspruch 8, bei der die ebene Oberfläche mit einer Seite eines Objektträgers fluchtend verläuft.
Verwendung der Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche bei einem Mikroskop mit einem Objektivsystem, wobei mehrere der Festkörper-Immersionslinsen in einer 2-dimensionalen Anordnung dem Objektivsystem vorgeschaltet sind.
Mikroskopierverfahren, bei dem mittels einer einem Objektivsystem eines Mikroskops vorgeschalteten Festkörper-Immersionslinse die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 11, das als Fluoreszenzverfahren, das zur Einzelmoleküldetektion dient, betrieben wird.
Verfahren nach Anspruch 12, das als konfokales Mikroskopieverfahren betrieben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, bei dem die Festkörper-Immersionslinse beabstandet dem Objektivsystem vorgeschaltet wird, bevorzugt um mindestens 1 mm.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, bei dem zur Verschiebung des Fokalvolumens von einer Grenzfläche zwischen einem Objektivträger und einer zu untersuchenden Flüssigkeit in die Flüssigkeit hinein eine einstellbare Aberration des Objektivsystems geändert wird.