DE102017111578A1

DE102017111578A1 - Verfahren zur Unterscheidung einzelner fluoreszierender Markierungsstoffmoleküle in der SPDM-Lokalisationsmikroskopie durch deren zeitliches Langzeit-Emissionsverhalten über 10ms

Info

Publication number: DE102017111578A1
Application number: DE102017111578.1A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: Wladimir Schaufler
Current assignee: SCHAUFLER, WLADIMIR, DE
Priority date: 2017-05-29
Filing date: 2017-05-29
Publication date: 2018-11-29

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterscheidung verschiedener fluoreszierender Markierungsstoffe in der SPDM-Lokalisationsmikrokopie fixierter Proben durch deren Langzeit-Emissionsverhalten nach einer Aussetzung mit einem zirkular polarisierten Photonenfluss von 1 KW/cm^2 bis zu 1 MW/cm^2 in der Zeitspanne zwischen 10 Millisekunden und 10 Minuten.

Description

Das vorliegende neuentwickelte Verfahren wird dem Fachgebiet der höchstauflösenden optischen Lokalisationsmikroskopie zugeordnet.
Aufgrund der Wellennatur des Lichtes ist die klassische optische Auflösung auf etwa 200 nm lateral und etwa 600 nm axial begrenzt. Die bereits bekannten Methoden der Lokalisationsmikroskopie (SPDM, PALM, dSTORM, STORM, GSDIM), welche auf der zeitlichen optischen Isolation der einzelnen fluoreszierend markierten Moleküle basieren, überwinden diese Auflösungsgrenzen und ermöglichen Positionsbestimmungen bis zu wenigen Nanometern.
Weitere Informationen dazu sind in der Begründung des Chemienobelpreises 2014 aufgeführt [1].
Die optische Isolation zwecks Auflösungsverbesserung erfolgt bei der Lokalisationsmikroskopie durch ein sich zeitlich änderndes Emissionsverhalten einzelner fluoreszierender Moleküle. Dieses sich zeitlich ändernde Emissionsverhalten kann durch mehrere Laserwellenlängen mit Laserleistungsdichten unter 1KW/cm^2 (PALM, STORM, GSDIM: US7535012 B2 & WO2009085218 A1 ) oder durch die Nutzung einer Wellenlänge mit einer Laserleistungsdichte zwischen 1 KW/cm² und 1 MW/cm² (SPDM: DE 112009000698 ) hervorgerufen werden. Die zeitlichen Abstände zwischen den leuchtenden und den dunklen Zuständen liegen im Bereich von wenigen Millisekunden und mehreren Minuten. Die kollektive Steuerung der Dunkelzeitdauer aller in einem Experiment eingesetzten Molekülsorten kann über gezielte Konzentrationvariationen von Reduktions- und Oxidationsmittel im Mikromilieu innerhalb einer Probe erfolgen [2].
Für die spätere Rekonstruktion eines hochaufgelösten Lokalisationsbildes werden typischerweise über eine Zeitspanne von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten viele tausend Weitfeldaufnahmen derselben Zellenregion (ROI) mit einer EM-CCD oder CMOS Kamera dokumentiert. Dadurch wird der zeitliche Wechsel zwischen den fluoreszierenden und den nicht-fluoreszierenden Zuständen einzelner Moleküle festgehalten.
Die einzelnen Bilder des Bildstapels enthalten räumlich verteilte optisch isolierte Punktspreizfunktionen bzw. Punkt-Bild-Verwaschungsfunktionen (PSFs) der Moleküle.
Zur Positionsbestimmung (Lokalisation) der Moleküle aus den geometrisch voneinander getrennten Punktspreizfunktionen wird nach dem heutigen Stand der Technik eine Vielzahl von Positionsbestimmungsalgorithmen verwendet [3], die entweder auf der Anpassung einer zweidimensionalen Gaußfunktion oder durch die Maximum-Likelihood-Methode basieren.
Die gefundenen Positionen werden anschließend mittels mehrerer Visualisierungsmethoden in einem neuen Bild mit erhöhter Auflösung dargestellt [4].
Somit wird nach dem heutigen Stand der Technik das sich zeitlich ändernde Emissionsverhalten der Moleküle ausschließlich zur Erhöhung der Auflösung in allen drei Raumrichtungen in fixierten und lebenden Präparaten benutzt.
Die getrennte Detektion einzelner fluoreszierender Molekülarten erfolgt nach dem heutigen Stand der Technik durch unterschiedliche Anregungs- und Emissionsspektren oder Fluoreszenzlebensdauern innerhalb der 0,1 bis 100 Nanosekunden-Zeitspannen unter Verwendung von gepulsten Lasern mit Picosekundendetektoren.
Die Trennung unterschiedlicher fluoreszierender Substanzen durch deren in der biomedizinischen Forschungspraxis üblichen spektralen Peak-to-Peak Abstanden von 20 bis 60 nm im sichtbaren Spektralbereich (400-700 nm) ist aufgrund der spektralen Überlappungen auf typischerweise 7 Substanzen begrenzt.
Eine weitere Auftrennung der sich überlappenden Spektren kann fehlerbehaftet durch aufwendige Mehrfarbengeräte und spectral-unmixing-Algorithmen [5] zur Unterscheidung von mehr als 10 fluoreszierender Substanzen, typischerweise jedoch nicht in der Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie sondern vorwiegend in der Durchflusszytometrie [6] oder vereinzelt in der konfokalen Mikroskopie [7], erfolgen.
Durch die Nutzung von unterschiedlichen Emissionsspektren entstehen chromatische Aberrationen. Diese können aufgrund des zum Untersuchungszeitpunkt unbekannten sich räumlich ändernden Dispersionsverhaltens innerhalb vieler biologischer Proben weder vorhergesagt noch korrigiert werden. Nutzt man den ganzen sichtbaren Spektralbereich (400-700nm) aus, so verursachen die Aberrationen in über 30 µm dicken Proben nicht korrigierbare chromatische Verschiebungen im Bereich zwischen 10 und 20 nm. Bei der Nutzung von Gewebeproben steigen die chromatischen Aberrationen auf über 20 nm an.
Bei steigender Anzahl der zur unterscheidenden Emissionsspektren steigt bei einer simultanen multispektralen Aufnahme auch die Anzahl der teilweise lichtabsorbierenden dichroitischen Strahlteiler/diffrakteren Gitter oder akusto-optischer Strahlteiler (AOBS). Dadurch verringert sich die Zahl der detektierten Photonen, während sich die Werte der Zernike-Koeffizienten (Maßeinheit für die optischen Abbildungsfehler) mit jedem zusätzlichen Strahlteiler erhöhen. Beides verschlechtert die maximal erreichbare Auflösung in der Lokalisationsmikrokopie.
Nimmt man als Alternative unterschiedliche Spektren (Anregung und Emission) mit einer sequentiellen Aufnahme auf, so steigt die Gesamtaufnahmedauer eines multispektralen Lokalisationsbildstapels auf ein Vielfaches an. Die Erhöhung der Gesamtaufnahmedauer verschlechtert in diesem Fall zusätzlich zu den chromatischen und strahlteilerbedingten Aberrationen die Bildqualität wegen der thermischen und mechanischen Drifte.
Durch die im Hauptanspruch vorgeschlagene Methode der getrennten Detektion aufgrund vom zeitlichen Emissionsverhalten kann bei Verwendung mehrerer fluoreszierender Substanzen die Aufnahmedauer verkürzt und die thermischen und mechanischen Drifte verringert werden. Dazu werden durch Wegfall mehrere optischer Elemente die Abbildungsfehler vermindert und die Detektionseffizienz gesteigert. Die chromatischen Aberrationen werden bei Auswahl von spektral ähnlichen fluoreszierenden Substanzen stark verringert.
Benutzt man die Methode nach Anspruch 1 als Zusatz zur spektralen Trennung sowie in Kombination mit Trennung durch Fluoreszenzlebensdauer zusätzlich zu der Kombination mit fehlerbehafteten Spectral-Unmixing-Alghorithmen [5], so kann die Anzahl der trennbaren Markierungsstoffe bis auf ein mehrfaches der heute in der Lokalisationsmikroskope genutzten Anzahl erhöht werden.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen neben der Reduzierung von chromatischen Aberrationen und Verkürzung der Aufnahmedauer insbesondere darin, dass unter Einsparung einer Vielzahl optomechanischer Komponenten wie Laser, Strahlteiler und Befestigungsmaterial, die bisher für Mehrfarbenaufnahmen erforderlich sind, nun eine kostengünstige Anordnung für die Lokalisationsmikrokopie multiplex-markierter Proben ausreicht.
Die zeigt ein Ausführungsbeispiel eines optischen Aufbaus, welches nach dem Hauptanspruch zur gleichzeitigen Aufnahme und Trennung von wenigstens zwei fluoreszierenden Substanzen ausreicht. Ein mindestens 100 mW starker Dauerstrichlaser aus dem sichtbaren Spektralbereich (10) erhöht in Kombination mit einer Einfokussierlinse (7) und einem Objektiv (2) die Laserleistungsdichte auf ein Niveau zwischen 1 KW/cm^2 und 1 MW/cm^2 im Probenraum, wobei die Laserleistungsdichten entweder durch Verschiebung der Einfokussierlinse (7) entlang des optischen Pfades zur Anregung (9) oder durch eine Vorrichtung zur Laserleistungsteuerung (typischerweise ein Filterrad oder ein Akustooptischer Modulator) (8) modifiziert werden können. Das dadurch hervorgerufene sich zeitlich änderndes Emissionsverhalten fluoreszierender Substanzen wird anschließend in dem optischen Pfad zur Detektion (5), bestehend aus einer Objektivlinse (2), einer Tubuslinse (4) und einer Kamera (6) detektiert und durch ein dichroitisches Element (3) vom Anregungslicht getrennt.
Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt in der Regel mit einem EMCCD oder einem CMOS Sensor.
Das Boxplot-Diagramm in der zeigt ein Ausführungsbeispiel der Separation zweier fluoreszierender Substanzen anhand von der Gesamtdauer der Hellperioden einzelner optisch isolierter Einzelmoleküle während einer 40-Sekunden Aufnahme.
Bei der Verwendung von Kohlenstoff-Punkten (C-Dots, vgl. und DE102014108166 ) in Kombination mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor 647 [8] werden die fluoreszierenden Substanzen mit der Laserlinie 642 nm und einer Laserleistungsdichte von 1 KW/cm^2 angeregt.
Sowohl C-Dots wie auch einzelne Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa Fluor 647 sind auf einer Glasoberfläche immobilisiert und befinden sich in der für die biomedizinischen Forschungspraxis üblichen Mikroumgebung einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS).
Die Emissionsspektren der Markierungsstoffe werden ohne gegenseitige chromatische Aberrationen in einem spektralen Bereich zwischen 660 und 690 nm detektiert.
Die Zuordnung der jeweiligen fluoreszierenden Substanzen erfolgt durch Setzung eines Schwellwerts für die Gesamtdauer der Hellperioden einzelner Moleküle.
Fluoreszierende Einzelmoleküle mit einer Gesamtdauer der Hellperioden kleiner als 3 Sekunden werden den C-Dots zugeordnet.
Fluoreszierende Einzelmoleküle mit einer Gesamtdauer der Hellperioden größer als 3 Sekunden werden den Alexa Fluor 647 Molekülen zugeordnet.
Die Wahrscheinlichkeiten der Überschneidung liegen hier unterhalb von 10%.

[1] The Nobel Prize in Chemistry 2014 n.d. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014 (accessed October 11, 2015).
[2] Heilemann M, van de Linde S, Sauer M, Mukherjee A. Hochaufloesende Mikroskopie mit kleinen organischen Farbstoffen. Angew Chemie 2009;121:7036-41. doi:10.1002/ange.200902073.
[3] Small A, Stahlheber S. Fluorophore localization algorithms for super-resolution microscopy. Nat Methods 2014;11:267-79. doi:10.1038/nmeth.2844.
[4] Baddeley D, Cannell MB, Soeller C. Visualization of localization microscopy data. Microsc Microanal 2010;16:64-72. doi:10.1017/S143192760999122X.
[5] Zimmermann T, Rietdorf J, Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett 2003;546:87-92. doi:10.1016/S0014-5793(03)00521-0.
[6] Baumgarth N, Roederer M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods 2000;243:77-97.
[7] Do D, Chun W, Gweon D-G. Design and analysis of multi-color confocal microscopy with a wavelength scanning detector. Rev Sci Instrum 2012;83:53704. doi:10.1063/1.4717679.
[8] Goat Anti-Mouse-IgG (H+L) Alexa Fluor 647 Conjugated, Bestellnummer A-21236. Thermo Fish Sci Waltham, Massachusetts, USA

Bezugszeichenliste

1.: axial und lateral verschiebbare piezo-elektrische Bühne
2.: Objektivlinse
3.: dichroitisches Element
4.: Tubuslinse
5.: optischer Pfad zur Detektion
6.: CCD oder CMOS Kamera
7.: bewegbare Einfokussierlinse
8.: Vorrichtung zur Laserleistungsteuerung
9.: optischer Pfad zur Anregung
10.: monochromatischer Dauerstrichlaser

Bezugszeichenliste für die Abbildung 2
Die Molekülstruktur eines Kohlenstoff-Punktes (C-Dots)
Bezugszeichenliste für die Abbildung 3
Die logarithmische Boxplot-Darstellung der Gesamtdauer der Hellperioden einzelner Lichtemissionen eines Moleküls der Sorten Alexa Fluor 647 und C-Dots. Die Versuchsdauer der ca. 1.000 ausgewerteten Messungen beträgt 40 Sekunden
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 7535012 B2 [0003]
WO 2009085218 A1 [0003]
DE 112009000698 [0003]
DE 102014108166 [0018]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Heilemann M, van de Linde S, Sauer M, Mukherjee A. Hochaufloesende Mikroskopie mit kleinen organischen Farbstoffen. Angew Chemie 2009;121:7036-41 [0019]
Small A, Stahlheber S. Fluorophore localization algorithms for super-resolution microscopy. Nat Methods 2014;11:267-79 [0019]
Baddeley D, Cannell MB, Soeller C. Visualization of localization microscopy data. Microsc Microanal 2010;16:64-72 [0019]
Zimmermann T, Rietdorf J, Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett 2003;546:87-92 [0019]
Baumgarth N, Roederer M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods 2000;243:77-97 [0019]
Do D, Chun W, Gweon D-G. Design and analysis of multi-color confocal microscopy with a wavelength scanning detector. Rev Sci Instrum 2012;83:53704. doi:10.1063/1.4717679 [0019]

Claims

(Hauptanspruch) Verfahren zur Unterscheidung verschiedener fluoreszierender Markierungsstoffe in der SPDM-Lokalisationsmikrokopie fixierter Proben wird dadurch gekennzeichnet, dass deren Langzeit-Emissionsverhalten nach einer Aussetzung mit einem zirkular polarisierten Photonenfluss von 1 KW/cm^2 bis zu 1 MW/cm^2 [DE112009000698T5] in der Zeitspanne zwischen 10 Millisekunden und 10 Minuten zur Unterscheidung benutzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die fluoreszierende Substanz ein fluoreszierendes Molekül aus den Farbstoffgruppen der Acridinfarbstoffe, der Cyaninfarbstoffe, der Fluoronfarbstoffe, der Oxazinfarbstoffe, der Phenanthridinfarbstoffe der Rhodaminfarbstoffe oder ein fluoreszierendes Protein der Gruppen GFP, YFP, RFP ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Markierungsstoff ein fluoreszierender Nanopartikel aus den Gruppen der Kohlenstoff-Nanokristalle, der Diamanten, der Edelmetall-Nanokristalle, der Lanthaniden-Nanokristalle oder der Halbleitermaterialien-Nanokristalle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei verschiedenartige fluoreszierende Moleküle (Anspruch 2) und fluoreszierende Nanopartikel (Anspruch 3) voneinander unterschieden werden.
Verfahren nach Anspruch 1,2,3 und 4, wobei die unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungsstoffe das Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen mit einem typischen spektralen Peak-to-Peak Abstand von 20 bis 60 nm emittieren.
Verfahren zur Vermeidung von durch chromatische Aberrationen der abbildenden Optik entstehenden Abbildungsfehlern, wobei gemäß Anspruch 1, 2 und 3 die unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungsstoffe das Licht mit den gleichen Wellenlängen emittieren.
Verfahren nach den Ansprüchen 1,2,3,4,5 und 6, wobei zur Unterscheidung des zeitlichen Emissionsverhaltens die fluoreszierenden Markierungsstoffe durch einen zirkular polarisierten Photonenfluss von 1 KW/cm^2 bis zu 1 MW/cm^2 [DE112009000698T5] zunächst in einem nicht-fluoreszierenden Zustand gebracht und anschließend die Latenzzeit bis zum Ausbleichen der Fluoreszenz gemessen wird. Sowohl die Zeit zum Ausbleichen als auch die Zeit bis zum Wiederauftreten der Fluoreszenz sowie alle darauffolgenden Zeiten des Auslöschens und Wiederauftretens werden zur Unterscheidung herangezogen.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Gesamtdauer der Dunkelperioden und der Hellperioden ausgedrückt durch das Verhältnis welches sich aus Produkt, Differenz, Summe der kleinesten Quadrate oder Quotient errechnet als Unterscheidungsmerkmal benutzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Frequenzspektren der Hell- und Dunkelzeiten durch eine Fourier-Analyse, Laplace-Transformation oder Wavelet-Analyse bestimmt und als Unterscheidungsmerkmale genutzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Trennung von wenigstens zwei fluoreszierenden Substanzen an einem optischen Aufbau bestehend aus einer verschiebbaren piezo-elektrischen Bühne, einer Objektivlinse, einem dichroitischen Element, einer Tubuslinse, einer CMOS- oder EMCCD-Kamera und einem monochromatischen Dauerstrichlaser durchführbar ist.