-
Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums FI 1163 Die Erfindung
bezieht sich auf die Herstellung eines neuen Antibiotikums, das von den Erfindern
als »FI 1163« bezeichnet wird, durch Fermentierung eines neuen Stammes von Streptomyces
(Streptomyces lucensis), Abtrennen von der Fermentierungsflüssigkeit und anschließende
Reinigung.
-
Das erhaltene Antibiotikum besitzt eine spezifische Wirkung gegenüber
Pilzen und Hefen, welche bei Menschen. Tieren und Pflanzen Krankheiten hervorrufen.
-
Es sind bereits zahlreiche andere Substanzen mit fungizider Wirkung
bekannt, welche durch Synthese oder durch Fermentieren von Mikroorganismen gewonnen
werden. Im allgemeinen sind diese aber für die höheren Organismen sehr giftig, wodurch
ihre praktische Anwendbarkeit stark beschränkt wird. Unter diesen Substanzen seien
beispielsweise Candidin, Ascosin, Actinomycine, Streptotrycin, Geomycin usw. erwähnt,
welches Stoffwechselprodukte von anderen Streptomycesarten sind.
-
Wie erwähnt, gewinnt man das Antibiotikum FI 1163 durch Fermentieren
eines neuen Organismus von der Art Streptomyces. Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe
aus der Gegend von Lucca (Toscana) isoliert durch Suspendieren von Erde auf Tellern
in einem Glycerol-Glykokoll-l-ledium und 5tägiges Brüten in einem Thermostat bei
37° C. Er ist beim Institute of Microbiology der Rutgers University unter Nr. 3783
hinterlegt.
-
Unter dem lichtoptischen Mikroskop zeigt dieser Stamm verzweigte Hyphen
mit spira,lähnlichen Ästen, häufig mit gekräuselten Enden.
-
Kartoffel-Agar: Sehr gutes Wachstum, hell zitronengelbes vegetatives
Mycel, chamoisgraues oder pulverartig hellbraunes Luftmycel mit verstreuten heller
gefärbten Büscheln oder Zonen. Lösliches Pigment, nach 3 Tagen aschgrau, nachher
graubraun.
-
Czapek-Agar: Sehr bemerkenswertes Wachstum, farbloses bis honigfarbenes
vegetatives Mycel; pulveriges weißes bis opakweißes Luftmycel. Bildet kein lösliches
Pigment; ist rückseitig farblos bis sehr hell zitronengelb.
-
Rüben-Agar: Gutes Wachstum, farbloses vegetatives Mycel, pulveriges,
chamoisgraues Luftmycel; keine Bildung von löslichem Pigment; rückseitig farblos
bis ockergelb.
-
Stärke-Agar: Sehr gutes Wachstum, vegetatives Mycel farblos bis honiggelb.
Pulveriges Luftrnycel chamoisgrau bis hellbraun, manchmal mit kleinen weißen Büscheln;
kann auch malvenfarbig sein; ein lösliches Pigment fehlt; rückseitig farblos bis
sehr hellgelb. Es hydrolysiert Stärke ziemlich gut.
-
Hefe-Agar: Gutes Wachstum, braunes vegetatives Mycel ; sehr wenig
entwickeltes graubraunes Luftmycel ; wächst in kleinen abgesonderten Kolonien lösliches
braunes Pigment.
-
Glycerol-Glykokoll-Agar: Vorzügliches Wachstum, zitronengelbes vegetatives
Mycel mit gelblicher Rückseite; pulveriges graubraunes Luftmycel; bildet ein lösliches
Pigment.
-
Gelatine: Reichliches Wachstum, braunes vegetatives Mycel; zuerst
weißes und dann graubraunes Luftmycel. Starkes Bräunen des Substrates schon nach
3 Tagen. Keine Verflüssigung selbst nach 25 Tagen.
-
Fleischbrühe: Nach 20 Tagen sehr schwaches Wachstum in Flocken oder
Schwimmen auf der Oberfläche; starkes Bräunen der Nährflüssigkeit.
-
Dieser Stamm besitzt eine sehr geringe Aktivität gegenüber grampositiven
Keimen, keine Aktivität gegenüber gramnegativen Keimen und gegen Mycobakterien,
eine gute Aktivität gegenüber Hefen und eine sehr gute Aktivität gegenüber pathogenen
vegetabilischen oder animalischen Pilzen oder Saprophyten im allgemeinen.
-
Auf Grund der erwähnten Eigenschaften unterscheidet sich der isolierte
und als »Streptomyces lucensis« bezeichnete Streptomycesstamm von allen
anderen
aus der Literatur und insbesondere aus dem »Manual of General Microbiology« von
Bergey bekannten Arten.
-
Dieser Stamm läßt sich gut konservieren auf einem festen Medium, welches
Kohlehydrate (wie Stärke, Glukose usw.), Stickstoff enthaltende Substanzen, wie
Aminosäuren und komplexe Substanzen, sowie Salze enthält.
-
In dieser Weise erzielt man eine reichliche Sporenbildung. Die Inkubationszeit
beträgt ungefähr 10 Tage bei einer Temperatur von 26 bis 37° C, vorzugsweise von
28° C.
-
Auf einem festen Medium kann der Stamm -bis 3 Monate lang bei
einer Temperatur von etwa 0° C konserviert werden. Er kann auch auf einem Iyophilisierten
sterilen Medium konserviert werden.
-
Die Herstellung des Antibiotikums erfolgt nach einem allgemeinen Verfahren,
welches darin besteht, daß man den Streptomycesstamm mit den vorerwähnten Eigenschaften
in Kontakt mit einer sterilen Flüssigkeit züchtet, welche eine oder mehrere Quellen
für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sowie Salze enthält. Als Quelle für
assimilierbaren Kohlenstoff können Dextrose, Saccharose, Dextrine oder andere assimilierbare
Polysaccharide dienen. Als Quelle für assimilierbaren Stickstoff können eiweißartige
Substanzen, wie Casein, Peptone oder auch einfachere Stickstoffverbindungen, wie
Aminosäuren, ferner vegetabilische Extrakte, Fleischextrakte oder andere Produkte,
wie Getreideweiche oder Eiweiß-Hydrolyseprodukte, verwendet werden.
-
Die Fermentierung kann in einem Erlenmeyer-Kolben von 100 bis 500
ccm durchgeführt werden unter guten Belüftungsbedingungen und bei einer optimalen
Temperatur von 25 bis 35° C. Die Aktivität macht sich bereits nach 30 Stunden bemerkbar
und bleibt bis zu etwa 70 Stunden hoch und konstant.
-
Die Züchtung der produzierenden Organismen kann auch durch Tauchfermentierung
unter den günstigsten Bedingungen des Rührens, der Belüftung und der Temperatur
entsprechend den Arbeitsweisen und mit den Apparaten durchgeführt werden, welche
dem Fachmann bekannt sind.
-
Die antibiotische Aktivität dieser Kulturen wird an einem Testorganismus
bestimmt, als welcher im vorliegenden Fall Debariomyces-märylandii, op. 52 L. C.
I., verwendet wird. Man gibt eine passende Suspension dieses Organismus auf ein
Sabouraud-Agar (auf 50° C gekühlt), brütet während 48 Stunden bei 25 bis 29° C und
mißt dann die gebildeten Hemmungszonen.
-
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Extraktion und Reinigung des
neuen Antibiotikums aus Kulturen von Streptomyces lucensis, in welchen dieses gebildet
wird.
-
Die Gewinnung von aktiven und genügend reinen Präparaten des Antibiotikums
gemäß der Erfindung erfolgt nach einem allgemeinen Verfahren, welches darin besteht,
daß man Kulturfiltrate und das Mycel separat oder die nichtfiltrierte Gesamtflüssigkeit
mit Lösungsmitteln wie Chloroform oder nicht mischbaren oder nur teilweise mit Wasser
mischbaren Alkoholen extrahiert. Unter den letzteren bevorzugt man n-Butylalkohol,
und es wurde die Extraktion des Kulturfiltrates und des Mycels separat mit diesem
Lösungsmittel durchgeführt.
-
Die getrennte Extraktion des Mycels kann mit diesen sowohl wie auch
mit anderen Lösungsmitteln durchgeführt werden, in welchen das Antibiotikum genügend
löslich ist, z. B. wasserfreie oder wässerige niedrige Alkohole, wässeriges Aceton.
Der pH-Wert der Kulturen wird vor dem Filtrieren und Extrahieren auf etwa pH-Wert
7 gestellt.
-
Die erhaltenen Auszüge werden dann unter Vakuum konzentriert, und
das aktive Produkt wird mit Hilfe eines Lösungsmittels, in welchem es unlöslich
ist, z. B. Petroläther, ausgefällt.
-
Der erhaltene Niederschlag, welcher getrocknet und pulverisiert wurde,
ist ein Pulver mit hellgelber, cremgelber oder hellbrauner Farbe.
-
Das Produkt kann gereinigt werden, indem man sich die Eigenschaft
des Antibiotikums zu Nutze macht, in Wasser löslich zu sein (in Form des Natriumsalzes
in einer Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7 oder in einer Natriumbicarbonatlösung),
während es in Wasser bei einem pH-Wert von 4 bis 5 kaum löslich ist. Es wird vorzugsweise
ein Verfahren angewendet, welches auf dieser Eigenheit beruht, weshalb man das Rohprodukt
mit einer Phosphatpufferlösung bei einem PH-Wert 7 oder mit einer Natriumbicarbo.natlösung
extrahiert, worauf man die erhaltene Suspension zentrifugiert zur Abtrennung eines
inaktiven Rückstandes. Die klaren Lösungen werden mit Mineralsäure auf einen pH-Wert
von 4,5 gestellt. Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert und getrocknet.
-
Diese Operationen werden wenn möglich unter Stickstoff, in Abwesenheit
von Licht und bei niedriger Temperatur durchgeführt.
-
Eine weitere Reinigung des Produktes kann nach bekannten Methoden
erreicht werden durch Extrahieren und Waschen mit Lösungsmitteln, in welchen FI
1163 löslich bzw. unlöslich ist.
-
In allen Fällen zeigen sowohl das wie oben erwähnt erhaltene als auch
das weiter gereinigte Produkt stets die erwähnten biologischen Eigenschaften, wodurch
die praktische Verwendbarkeit des Antibiotikums gegeben ist.
-
Das neue Antibiotikum ist eine stickstoffhaltige Verbindung von saurem
Charakter, sie ist in Wasser kaum löslich, während das Natriumsalz wasserlöslich
ist; sie enthält keinen Schwefel. Sie ist sehr gut löslich in Chloroform und Äthylcellosolve,
löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Pyridin, Dimethylformamid, kaum löslich
in Aceton und Äthylacetat und unlöslich in Äther, Benzin und Petroläther. Mit konzentrierter
Schwefelsäure entsteht eine rotbraune Farbe. Die Lösung von FI 1163 in Methanol
zeigt Ultraviolettspektren mit drei Absorptionsspitzen bei den folgenden Wellenlängen:
290, 304 und 318 mli.
-
Das Infrarotabsorptionsspektrum in KBr ist in der Figur der Zeichnung
dargestellt, in welcher die Ordinate die Prozentdurchlassung und die Abszisse die
Wellenlänge in 1L angeben.
-
Zur vollständigeren Charakterisierung des neuen Produktes werden nachfolgend
die Rf-Werte angegeben, welche bei chromatographischen Untersuchungen auf Whatman-Papier
Nr. 1 mit aufsteigender Entwicklung und bioautographischer Sichtbarmachung auf mit
»Candida albicans« geimpften Platten erhalten wurden. Lösungsmittelsystem Rf 1.
Butanol-Essigsäure-Wasser, 2: 1 : 1 .... 0,75 z. Benzol-Essigsäure-Wasser, 2.- 1
: 1 ..... 0,21 3. Butanol-Pyridin-Wasser, 2:0,6: 1 ..... 0,60 4. Butanol, gesättigt
mit Wasser, -I- 2 °% Ammoniumhydrat ........................... 0.06 FI 1163 im
festen Zustand ist sehr stabil, insbesondere in Abwesenheit von Licht und Luft.
Die
neutralen wässerigen Lösungen behalten, wenn sie bei +5° C gelagert werden, ihreAktivität
mehrere Tage lang unverändert bei. Bei Aufbewahrung der deichen Lösungen bei Zimmertemperatur
nimmt jedoch die Aktivität rasch ab.
-
Wie aus den obenerwähnten Eigenschaften hervorgeht, gehört die gefundene
Substanz zur Gruppe der polyenischen Antibiotika mit einem tetraenischen Chromophor.
-
Die Art Streptomyces lucensis unterscheidet sich auf Grund ihrer morphologischen
und züchterischen Eigenschaften eindeutig von anderen Arten, welche andere fungizide
Antibiotika hervorbringen, insbesondere von S. noursei, S. rimosus, S. Aureus, S.
antibioticus und S. M.-4575.
-
Die durch FI1163 gebildete Substanz zeigt chemische und physikochemische
Eigenschaften, welche ihre Unterscheidung von den erwähnten anderen Substanzen ermöglichen.
-
Die fungizideAktivität von FI 1163 wird durch die im folgenden angegebenen
biologischen Eigenschaften der Substanz bestätigt. In Tabelle 1 werden die Daten
angegeben, welche sich auf die antibiotische Aktivität »in vitro« von FI 1163 beziehen.
-
Die Untersuchungen an Blastomyces und Schizomycetes wurden auf einer
mit Glucose versetzten Fleischbrühe durchgeführt. Diejenigen an den sogenannten
Hyphomycetes wurden auf einem flüssigen Sabouraud-112edium durchgeführt.
-
Die Messungen erfolgten nach 8 Tagen bei 30° C.
Tabelle 1 |
Minimale Inhibitionsdosis (MID) in p.g/ccm |
1. Actinomvces boströmi A . . .. .. . . .. .. . > 100 |
2. \Tocardia asteroides .................. > 100 |
3. Candida albicans ... .. .. .. .. .. .. .. ... 0,8 |
4. Candida albicans val. ... ...... ...... . 0,7 |
5. Debarv omy ces hudeloi . . . . . . . . . . . . . . . 0,7 |
6. Debaryomyces neoformans ........... 0,6 |
7. Debaryomyces tyrocola .............. 8 |
B. Debaryomyces marylandii ............ 2 |
9. Debary omyces guillermondii . . . . . . . . . 3 |
10. Debary omy ces cannensis . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
11. Torulopsis neoformans ............... 0,3 |
12. Saccaromvces cerevisiae . .. .. .. .. .. .. . 2 |
13. Eremothecium hashbvii . .. .. .. . . . . . . . 25 |
14. Penicillium sp. ...................... 20 |
15. Aspergillus sp. (T) .................. 10 |
16. Aspergillus niger .................... 20 |
17. Glenospora graphii ................... 100 |
18. Glenosporella dermatitidis . . . . . .. . . . . . <
10 |
19. Pseudomycoderma matalense .. .. .. .. . 1 |
20. Trichophyton faviforme ochraceum ... 30 |
21. Trichophyton maggini ............... 30 |
22. Trichophyton radians ................ 30 |
23. Trichophyton rhodainii .............. 30 |
24. Trichophyton plicatile .. . . . . . . . . . . . . . <
10 |
25. Trichophyton mentagrophytes ........ 30 |
26. Epidermophyton floccosum .... .. .. .. . < 10 |
27. Sabouraudites gypseus ............... < 10 |
28. Histoplasma Capsulatum (My celium- |
phase) .............................. < 10 |
Impfung: Etwa 1000 Zellen bei Blastomycetes und Schizomycetes; Bruchstücke einer
jungen Kultur bei den sogenannten Hyphomycetes. Es wurde außerdem festgestellt,
daß die Anwesenheit von 10% Serum im Kulturmedium nur eine schwache Veränderung
von MID zur Folge hat.
-
Toxizität: Der akute toxikologische Aspekt von FI 1163 ist günstig,
da die LD5o, bestimmt an Ratten bei verschiedenartiger Verabreichung, weit über
den therapeutischen Dosen liegen.
-
Beispiel 1 Es werden vierzig 300-ccm-Erlenmeyer-Kolben bereitgestellt,
die je 60 ccm eines Mediums von folgender Zusammensetzung (1/o) enthalten: Zucker
(Dextrin) 20, Getreideweiche 10, Casein 5, Calciumcarbonat 4, Ammoniumsulfat 1,
Kaliumdiphosphat 0,1 (pg des Mediums: 6,7). Diese Kolben werden 20' Minuten lang
bei 120° C sterilisiert und dann je mit 0,2 ccm einer Suspension von Sporen geimpft,
welche erhalten wurden, durch Waschen einer 20 Tage alten Kultur in einem flötenmundstückartigen
Rohr mit 10 ccm sterilem destilliertem Wasser.
-
Die Kolben werden bei 20° C gehalten und durch wechselnde Rotationsbewegung
mit 220 U/min während 60 Stunden gerührt.
-
Wie aus den folgenden Angaben hervorgeht, erreicht die Aktivität nach
40 Stunden ihren Maximalwert
Durchmesser des |
Fermentierungs- des Hemmungshofes |
dauer P,1 auf Debar. märyl. |
Stunden Nährmediums (Agarschalen) |
mm |
38 6,4 33 |
41 6,6 34,5 |
47 7,8 31,5 |
54 7,8 30,25 |
61 7,0 28 |
Beispiel 2 Es werden 3000 ccm eines Mediums mit folgender Zusammensetzung hergestellt:
Dextrin .......................... 20% Getreideweiche . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 3% Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 °/o
(T H4) 2 S O4 (technisch) . . . . . . . . . . 1 % Casein ...........................
5°/0 K2 H P O4 '******«**''* . . . . . . . . . . . 0,10/0 Nach 60 Minuten Sterilisieren
bei 120° C (pH-Wert nach dem Sterilisieren 7,10) in einem 5-1-Labor-Fermentierungsgefäß
impft man mit einer Sporensuspension, die durch Waschen von Halb-Kolles erhalten
wurde. Es werden folgende Fermentierungsbedingungen eingehalten: Rührung ....................
400 U/min Belüftung ................... 11/1/min Temperatur ................. 27°
C Dauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Stunden Für die Produktion
wird ein 10-1-Fermentierungsgefäß mit 6000 ccm eines Mediums mit folgender Zusammensetzung
verwendet: Saccharose ....................... 20% Dextrose .. .. .. ...................
10% Dextrin .......................... 10% Getreideweiche . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 10% Ca C 03 .......................... 4% K2 H P O4 . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0 (NH4)2S0, technisch . . . . . . . . .
. . . 10/0 Silicon (flüssig) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 % Die Sterilisation
des Mediums folgt während 90 Minuten bei 120° C. Saccharose und Dextrose werden
separat
während 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Nach der Sterilisation beträgt der pa-Wert
7,04. Das Medium wird mit 2,5% eines 24 Stunden alten vegetativen Mycels geimpft.
-
Es werden folgende Fermentierungsbedingungen eingehalten Rührung ....................
450 U/min Belüftung ................... 11/1/min Temperatur ................. 27°
C
Fermentierungsverlauf |
Alter p$ Wert Gehalt gg/ccm |
DS 7,0 - |
24 6.6 200 |
48 7,0 580 |
55 7,0 1020 |
Beispiel 3 Die Fermentierung wird in gleicher Weise durchgeführt wie im vorhergehenden
Beispiel, wobei man aber als Medium für die Produktionsstufe ein solches mit der
gleichen Zusammensetzung wie bei der vegetativen Stufe verwendet.
-
Maximaler Gehalt: 280 [,g/ccm nach 48 Stunden. Beispiel 4 Die Fermentierung
wird gleich durchgeführt wie im Beispiel 2 und 3, wobei man an Stelle des Mediums
der Produktionsstufe ein solches von folgender Zusammensetzung verwendet: Saccharose
......................... 20% Dextrose .......................... 100% Na C1 .............................
3% (1T H4)2 S O4 (technisch) . . . . . . ...... 200/a Ca C 03 ............................
10% Silicon (flüssig) .................... l0/0 Maximaler Gehalt: 230 l,g/ccm nach
24 Stunden. Beispiel 5 Die Fermentierung erfolgt gleich wie in den Beispielen 2,
3 und 4, wobei man in der Produktionsstufe ein Medium mit der folgenden Zusammensetzung
verwendet: Dextrose ............ . ........ . .... 20% Na Cl ...
. ........ . ................. 3% Getreideweiche . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . 201/o (NH4)2S04 (technisch) . . . . . . . . . . . . 3% Ca
C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100/0 Silicon (flüssig)
.................... 10/0 Maximaler Gehalt: 170 u9/ccm nach 24 Stunden. Beispiel
6 181 einer gemäß Beispiel2 erhaltenen Fermen.tierflüssigkeit werden mit einem Hilfsstoff
filtriert. Das erhaltene Mycel wird durch Rühren mit drei Portionen n-Butylalkohol
extrahiert, welche 2,5 und hochmal 5 1 umfassen. Die filtrierte Flüssigkeit (17,100
1) wird mit 3 Portionen Butanol extrahiert (Gesamtmenge 6,6 1). Sämtliche Auszüge
werden vereinigt und mit Wasser (2 1) gewaschen und dann unter Vakuum bei einer
Temperatur unterhalb 40° C eingedampft. Aus der erhaltenen konzentrierten Flüssigkeit
wird das Antibiotikum durch Zusatz von Petroläther ausgefällt. Ausbeute 16,6 g,
Beispiel 7 128 g rohes Antibiotikum, welches nach einem Ver fahren ähnlich demjenigen
von Beispiel 6 erhalten wurde, werden in 1250 ccm einer gesättigten Natriumbicarbonatlösunggelöst.
Diese Operation erfolgt unter Durchleiten eines Stickstoffstromes durch die Flüssigkeit.
-
Nach Verdünnen mit einem gleichen Volumen zentrifugiert man die Suspension
und stellt den pH-Wert der erhaltenen braunen Lösung durch Zugabe von 6 n-Salzsäure
auf 4,5.
-
Das Antibiotikum, welches als freie Säure ausfällt, wird durch Zentrifugieren
abgetrennt und getrocknet. Ausbeute: 95 g.