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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Herstellungsverfahren für einen
Immunoassay zum Nachweis eines in einer Testflüssigkeit enthaltenen Analyten,
umfassend die folgenden Schritte:
- – Bereitstellen
eines porösen
Trägers;
- – Aufbringen
eines mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markierten Sondenantikörpers in
einer Startzone des porösen
Trägers,
wobei der Sondenantikörper
so gewählt
ist, dass er an ein in der Testflüssigkeit enthaltenes erstes
Antigen sowie an ein ebenfalls in der Testflüssigkeit enthaltenes zweites
Antigen binden kann und in der Startzone derart aufgebracht wird,
dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in der Startzone fixiert
ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem
porösen
Träger
bewegen kann;
- – dauerhaftes
Immobilisieren eines Detektionsantikörpers in einer Detektionszone
auf dem porösen
Träger,
wobei der Detektionsantikörper
so gewählt
ist, dass er geeignet ist, mit dem ersten Antigen und dem Sondenantikörper in
einer Sandwich-Reaktion zu binden, und weiter so gewählt ist,
dass er geeignet ist, mit dem zweiten Antigen und dem Sondenantikörper in
einer Sandwich-Reaktion zu binden;
- – Aufbringen
wenigstens eines Konkurrenzantikörpers
in der Startzone derart, dass er in einem trockenen Zustand des
porösen
Trägers
in der Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des
porösen
Trägers
mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem
porösen
Träger
bewegen kann.
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EP 0291 194 A1 offenbart
einen Immunoassay, wie er in der modernen Diagnostik vielfach verwendet
wird, um einen Analyten in einer Testflüssigkeit nachzuweisen. Allgemein
findet dabei ein streifenförmiger,
poröser
Träger
Anwendung, der in einer Applikationszone an einem Ende des Teststreifens mit
einer Testflüssigkeit
befeuchtbar ist, die mutmaßlich
den zu detektierenden Analyten enthält.
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Aufgrund
von Kapillarkräften
in dem porösen Träger wird
die Testflüssigkeit
durch den Teststreifen in ein an dem gegenüberliegenden Streifenende gelegenes
Flüssigkeitsreservoir
gesaugt. Auf ihrem Weg durch den Teststreifen passiert die Testflüssigkeit
verschiedene unterschiedlich präparierte
Zonen auf dem porösen
Träger.
Die Formulierung „auf
dem Träger" ist hier weit zu
verstehen und umfasst alle Zonenformen, die mit dem Trägermaterial
in Flüssigkeit leitender
Verbindung stehen. Das sind z.B. Präparationen, die den Teststreifen
durchdringen, solche, die allein seine Oberfläche betreffen, ebenso wie solche, bei
denen ein separates, präpariertes
Element, wie beispielsweise ein Glasfaserkissen mit darin aufgetrockneten
Substanzen, in direktem Kontakt zu dem Teststreifen steht.
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Von
der Applikationszone durchläuft
die Testflüssigkeit
stromabwärts
zunächst
eine Startzone, in welcher partikelmarkierte Sondenantikörper vorliegen.
Diese sind in der Startzone derart fixiert, dass sie im trockenen
Zustand des porösen
Trägers nicht
beweglich sind, im feuchten Zustand des porösen Trägers jedoch von der Testflüssigkeit
erfasst werden und sich mit dieser stromabwärts bewegen können. Die
Sondenantikörper
sind derart gewählt, dass
sie an den Analyten binden können.
Enthält
die Testflüssigkeit
den Analyten, kommt es daher in der Startzone zu einer ersten Immunreaktion
zwischen dem Analyten und dem Sondenantikörper.
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Weiter
stromabwärts
läuft die
Detektionsflüssigkeit
zusammen mit dem gelösten
Sondenantikörper
in eine Detektionszone, in welcher ein Detektionsantikörper dauerhaft
immobilisiert ist. Das bedeutet, dass der Detektionsantikörper weder
im trockenen noch im feuchten Zustand des porösen Trägers beweglich ist. Der Detektionsantikörper ist
so gewählt,
dass er ebenfalls an den Analyten binden kann. Enthält die Testflüssigkeit
den Analyten, kommt es daher in der Detektionszone zu einer sogenannten Sandwich-Reaktion,
bei welcher der Analyt zusammen mit dem an den ihn gebundenen Sondenantikörper an
den Detektionsantikörper
bindet und so in der Detektionszone immobilisiert wird. In der Folge kommt
es zu einer Anfärbung
der Detektionszone, die optisch nachgewiesen werden kann.
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Die
für die
Herstellung eines derartigen Immunoassays erforderlichen Schritte
des Aufbringens von Reaktanden, insbesondere von Antikörpern in bestimmten
Zonen des porösen
Trägers
sind dem Fachmann allgemein bekannt. Auch die unterschiedliche Aufbringung,
d.h. dauerhafte Immobilisierung oder lediglich Fixierung, so dass
die im trockenen Zustand fixierten Antikörper sich im befeuchteten Zustand
des porösen
Trägers
mit der Testflüssigkeit stromabwärts bewegen
können,
sind hinlänglich
bekannt. Auf die Details derartiger Schritte soll daher im Rahmen
dieser Beschreibung nicht im Einzelnen eingegangen werden. Es sei
jedoch darauf hingewiesen, dass die Begriff „Aufbringen eines Antikörpers" sowohl das Aufbringen
des Antikörpers
selbst auf dem Träger
als auch das Aufbringen eines mit dem Antikörper versehenen Elementes,
wie etwa eines Glasfaserkissens, auf dem Träger umfasst.
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Ein
Anwendungsbeispiel für
derart hergestellte Immunoassays und mit diesen durchgeführte Nachweisverfahren
ist ein Schwangerschaftstest, bei dem die Testflüssigkeit beispielsweise weiblicher Urin
und der Analyt hCG ist.
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Aus
der
DE 696 23 458
T2 ist ein ähnlicher Immunoassy
bekannt, bei dem ein mit einer Testflüssigkeit auf einen Träger aufgebrachter
Analyt mit einem Markierungsreagenz einen Komplex bildet, der von
einem stationären
Fängerreagenz
in einer Nachweiszone gebunden wird. Die Qualität derartiger Tests hängt im Wesentlichen
von der hohen Selektivität
bzw. Spezifität
des Markierungsreagenzes ab.
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Aus
der
US 6,528,321 B1 ist
ein Immuno-Assay bekannt, der neben Sonden- und Detektionsantikörpern, die
jeweils für
den Analyten spezifisch gewählt
sind, sog. Scavenger- oder Konkurrenzantikörper zur Steigerung der Selektivität des Assays
enthält.
Die Konkurrenzantikörper
sind so gewählt,
dass sie Störantigene,
die mit dem Analyten kreuzreagieren könnten, spezifisch "wegfangen", sodass die Bindungsstellen
von Detektions- und Sondenantikörpern allein
dem Analyten zur Verfügung
stehen.
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Aus
der
US 5,026,653 ist
ein Immunoassy zum Nachweis von hCG bekannt, der neben hCG-spezifischen
Sonden- und Detektionsantikörpern
Konkurrenzantikörper
mit geringer Affinität
für hCG,
jedoch hoher Affinität
für kreuzreaktionsgefährdete Störhormone
wie LH, FSH und TSH aufweist. Diese Konkurrenzantikörper binden
an die Störhormone
und unterdrücken
sterisch eine Sandwichreaktion mit dem immobilisierten Detektionsantikörper.
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Aus
der
DE 197 31 465
A1 ist eine Immunoassay-Vorrichtung mit einer Vielzahl
von Testfeldern bekannt, in denen jeweils unterschiedliche Substanzen,
die mit unterschiedlichen Komponenten einer Testflüssigkeit
auf unterschiedliche Weise reagieren, immobilisiert sind. Auf diese
Weise kann die Qualität des
Tests aus der Zusammenschau der Einzelergebnisse in den Testfeldern
abgeschätzt
und insbesondere Störungen
identifiziert werden.
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Nachteilig
bei den bekannten Herstellungsverfahren ist es, dass sie von Anfang
an auf die Herstellung eines für
einen bestimmten Analyten (oder eine Gruppe simultan detektierbarer
Analyten) optimierten Assays ausgerichtet ist. So wird insbesondere
großer
Aufwand getrieben, möglichst
hochselektive oder spezifische Antikörper herzustellen, die eine möglichst
kleine Gruppe von Antigenen oder günstigstenfalls nur genau ein
Antigen binden. Im Rahmen dieser Beschreibung wird der Begriff „selektiv" für Antikörper verwendet,
welche an eine kleine Gruppe biochemisch ähnlicher Antigene binden können. Als „spezifisch" werden hier Antikörper bezeichnet,
die jeweils genau an ein Antigen binden können. Der Begriff „Selektivität" umfasst daher in
seiner extremen Ausprägung
auch die „Spezifität". Die Entwicklung
hoch selektiver oder spezifischer Antikörper ist mit großem Zeitaufwand
und entsprechenden Kosten verbunden. Sollen, wie beispielsweise
im Fall der Sandwich-Reaktion mehre Antikörper an ein Antigen binden,
ist eine zweifach spezifische Bindung, etwa aus Gründen der
sterischen Inhibition, häufig nicht
möglich
oder nur mit extremem Entwicklungsaufwand realisierbar.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gattungsgemäßes Herstellungsverfahren für einen
Immunoassay derart weiterzubilden, dass möglichst viele Vorstufen von
Immunoassays zum Nachweis verschiedener Analyte gleichartig, vorzugsweise
in identischen Verfahrensschritten, hergestellt werden können und
ihre Optimierung für
einen bestimmten Analyten in einem möglichst späten Schritt des Herstellungsverfahrens
erfolgt.
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Diese
Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von
Anspruch 1 dadurch gelöst,
dass der Konkurrenzantikörpers
für einen
Immunoassay zum Nachweis des zweiten Antigens als Analyt mit hoher
Selektivität
und alternativ zu dem Sondenantikörper oder dem Detektionsantikörper an
das erste Antigen oder für
einen Immunoassay zum Nachweis des ersten Antigens als Analyt mit
hoher Selektivität
und alternativ zu dem Sondenantikörper oder dem Detektionsantikörper an
das zweite Antigen binden kann.
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Wirkungen
und Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
sollen nachfolgend im Zusammenhang mit dem resultierenden Immunoassay
sowie dem damit durchzuführenden
Nachweisverfahren diskutiert werden.
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Im
Gegensatz zu dem üblichen
Ansatz, den Detektionsantikörper
möglichst
selektiv, insbesondere spezifisch für den zu detektierenden Analyten
zu wählen
wird hier die Wahl eines Detektionsantikörpers vorgeschlagen, der grundsätzlich sowohl
mit dem ersten als auch mit einem zweiten Antigen binden kann, welches
bei herkömmlichen
Tests die Eindeutigkeit des Tests durch Kreuzreaktion mit den verwendeten
Antikörpern
verringert und daher allgemein als Störantigen bezeichnet wird. Dieser
Ansatz erscheint zunächst
paradox, da bei einem derartigen Test weder in der Startzone, wo
der markierte Sondenantikörper
geeignet ist, mit dem ersten sowie dem zweiten Antigen zu binden,
noch in der Detektionszone, wo der Detektionsantikörper geeignet
ist, mit dem ersten sowie dem zweiten Antigen zu binden, eine effektive
Unterscheidung zwischen erstem und zweitem Antigen gegeben zu sein
scheint.
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Erfindungsgemäß ist jedoch
weiter vorgesehen, dass in der Startzone zusätzlich ein hochselektiver Konkurrenzantikörper vorgesehen
ist, welcher lediglich zur Bindung mit einem der beiden Antigene in
der Lage ist. Dies bedeutet, dass für eines der beiden Antigene
in der Startzone eine sehr viel größere Zahl von Bindungsstellen
(nämlich
die des Sondenantikörpers
sowie des Konkurrenzantikörpers) zur
Verfügung
stehen als für
das andere der beiden Antigene (nur die Bindungsstellen des Sondenantikörpers).
Bei geeigneter Wahl der in der Startzone aufgebrachten Menge von
Sondenantikörper
und Konkurrenzantikörper
kann erreicht werden, dass eines der beiden Antigene im Wesentlichen
an den markierten Sondenantikörper
bindet, während
das andere Antigen im Wesentlichen an den unmarkierten Konkurrenzantikörper bindet.
Es handelt sich bei diesem Prinzip um eine besonders vorteilhafte
Anwendung des immunologischen Analogons zum Massenwirkungsgesetz.
Man beachte, dass der Konkurrenzantikörper dabei tatsächlich konkurrierend binden
muss, d.h. eine gleichzeitige Bindung von Konkurrenzantikörper und
Sondenantikörper
oder – bei
einer anderen Ausführungsform – von Konkurrenzantikörper und
Detektionsantikörper
an einem einzelnen Antigen muss im wesentlichen unterdrückt sein.
Die Bindung des Konkurrenzantikörpers
an eines der Antigene muss daher nicht nur mit hoher Selektivität sondern
auch alternativ zu dem Sondenantikörper (bei einer ersten Ausführungsform)
oder alternativ zu dem Detektionsantikörper (bei einer zweiten Ausführungsform)
erfolgen. Der Begriff der „gleichzeitigen
Bindung" bezieht
sich dabei nicht nur auf ein simultanes Bindeereignis sondern auch
auf einen Zustand, in dem zu einer Zeit ein Konkurrenzantikörper und
ein Sondenantikörper
bzw. ein Konkurrenzantikörper
und ein Detektionsantikörper
an einem einzelnen Antigen gebunden sind.
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Dieser
Grundgedanke kann in zwei Hauptvarianten der Erfindung verkörpert sein.
Bei einer ersten Variante inhibiert die Bindung eines Konkurrenzantikörpers an
einem einzelnen Antigen die zusätzliche
Bindung eines Sondenantikörpers
an demselben Antigen. Da sowohl Sondenantikörper wie auch Konkurrenzantikörper mit
der Testflüssigkeit
stromabwärts
bewegbar sind, kommt es in der Detektionszone zu einer kompetitiven
Bindungsreaktion mit dem dort immobilisierten Detektionsantikörper. Allerdings
führt eine
Sandwichreaktion, an welcher der unmarkierte Konkurrenzantikörper beteiligt
ist, nicht zu einer Anfärbung
der Detektionszone. Diese Reaktion bleibt daher für den Benutzer
unsichtbar. Die Sandwichreaktion, an welcher der markierte Sondenantikörper beteiligt
ist, führt
hingegen in gewohnter Weise zu eine Anfärbung der Detektionszone.
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Im
Vergleich zu den bekannten Verfahren wird sich jedoch ein gewisser
Fehler dadurch einstellen, dass nicht nur eines der beiden Antigene
an der Sondenantikörper
gebunden ist. Wie zuvor erläutert, ist
jedoch die Menge des anderen Antigens, welches ebenfalls an den
Sondenantikörper
gebunden ist, gering und kann durch geeignete Wahl der Aufbringungsmenge
des Konkurrenzantikörpers
in der Startzone auf nahezu jedes gewünschte Maß reduziert werden. Der unvermeidliche
Fehler kann somit bedarfsgerecht für den jeweiligen Test eingestellt
werden.
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Bei
einer zweiten Variante inhibiert die Bindung eines Konkurrenzantikörpers an
einem einzelnen Antigen die zusätzliche
Bindung eines Detektionsantikörpers
in der Detektionszone an demselben Antigen. Eine gleichzeitige Bindung
eines Sondenantikörpers
und eines Konkurrenzantikörpers
an demselben ein zelnen Antigen in der Startzone ist bei dieser Variante
hingegen nicht notwendig ausgeschlossen. In der Detektionszone hingegen
ist nur eine Sandwich-Reaktion zwischen Detektionsantikörper und
Antigenen-Sondenantikörper-Komplexen,
nicht aber zwischen Detektionsantikörper und Antigenen-Konkurrenzantikörper-Komplexen
möglich.
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Bei
der Wahl der Aufbringungsmenge des Konkurrenzantikörpers sind
unter anderem die Selektivitätsgrade
der verwendeten Antikörper,
die in der Testflüssigkeit
erwarteten, typischen Konzentrationen der Antigene sowie deren Aktivität hinsichtlich der
Bindungsreaktion mit den verwendeten Antikörpern zu berücksichtigen.
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Die
erläuterte
Grundidee der Erfindung schlägt
sich in besonders vorteilhafter Weise in dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren
für einen Immunoassay
nieder, da für
verschiedene Immunoassays zum Nachweis verschiedener Antigene, die bei
herkömmlichen
Tests ein Analyt-Störantigen-Paar
darstellen, ein bis auf den Schritt der Aufbringung des Konkurrenzantikörpers in
der Startzone identisches Herstellungsverfahren angewendet werden
kann. Insbesondere können „Rohlinge" in großer Zahl
auf Halde produziert werden, auf denen in einem sehr späten Arbeitsschritt
in der Startzone ein bestimmter Konkurrenzantikörper aufgebracht, z.B. aufgetrocknet,
wird. Erst durch Auswahl des Konkurrenzantikörpers dem späten Herstellungsschritt
wird somit entschieden, zum Nachweis welchen Analyten sich der so
hergestellte Immunoassay eignet, d.h. als, welches Antigen als Analyt
und welches als Störantigen
betrachtet wird. Die Vorteile, die sich aus der so gewonnen Produktionsflexibilität ergeben,
liegen auf der Hand und betreffen sowohl die Kosten wie die Lieferflexibilität.
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Bei
einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind
Sondenantikörper,
Detektionsantikörper
und Konkurrenzantikörper
so gewählt,
dass das erste Antigen und das zweite Antigen jeweils ein Hormon
aus der Gruppe hCG, LH, FSH, TSH und untereinander unterschiedlich
sind. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass Sondenantikörper und
Detektionsantikörper
jeweils eine Selektivität
für die α-Kette der genannten
Hormone haben, welche bei allen Hormonen dieser Gruppe im Wesentlichen
identisch ist. Der Konkurrenzantikörper muss dann so gewählt sein,
dass wenigstens eines der genannten Hormone an ihn nicht bindet,
etwa weil er eine Selektivität
für ein
Epitop auf der β-Kette
aufweist, in welcher sich die genannten Hormone voneinander unterscheiden.
Selbstverständlich
ist es auch möglich,
dass Sondenantikörper und
Detektionsantikörper
beide an Epitope auf der β-Kette
binden, wobei dann jedoch Epitope zu wählen sind, die bei mindestens
zwei der genannten Hormone identisch sind.
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Das
erfindungsgemäße Prinzip
ist auch bei Verwendung mehrerer Sondenantikörper, Detektionsantikörper und/oder
Konkurrenzantikörper
anwendbar. Grundsätzlich
kann das Reaktionsschema beliebig komplex aufgebaut werden.
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Bei
einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung, ist auf dem porösen Träger stromabwärts der
Detektionszone eine Kontrollzone vorgesehen, in der ein Kontroll-Detektionsagens
dauerhaft mobilisiert ist, welches in der Lage ist, mit dem Sondenantikörper zu
binden. Wird im Rahmen des Herstellungsverfahrens nämlich eine
solche Kontrollzone eingerichtet, färbt sich diese Kontrollzone
aufgrund derjenigen markierten Sondenantikörper, welche die Detektionszone
passieren ohne eine Bindung einzugehen, an, unabhängig davon,
ob sie zuvor mit einem Antigen reagiert haben oder nicht. Die Kontrollzone kann
somit zur Feststellung der Beendigung des Nachweisverfahrens verwendet
werden.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
ist das in der Kontrollzone immobilisierte Kontroll-Detektionsagens
so gewählt,
dass es nicht mit dem Sondenantikörper bindet, sondern vielmehr
mit einem von dem Sondenantikörper
verschiedenen Kontrollantikörper,
welcher mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markiert ist
und der in einer stromaufwärts der
Kontrollzone gelegenen Kontroll-Startzone, die vorzugsweise der
Startzone entspricht, derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen
Zustand des porösen
Trägers
in der Kontroll-Startzone
fixiert ist und. sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit
der Testflüssigkeit
stromabwärts
in den porösen
Träger
bewegen kann. Dies hat zur Folge, dass die Kontrollreaktion vollkommen
unabhängig
von der Detektionsreaktion stattfindet, so dass es hier zu keiner
den Test eventuell verfälschenden
Wechselwirkung kommen kann.
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Als
optisch detektierbarer Farbstoff, der sowohl zur Markierung des
Sondenantikörpers
als auch ggf. zur Markierung des Kontrollantikörpers verwendet werden kann,
eignet sich in besonderer Weise ein partikelförmiger Direktfarbstoff, der
vorzugsweise Gold und/oder Latexpartikel enthält. Andere Färbemethoden
sind jedoch grundsätzlich
auch anwendbar.
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Weitere
Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden speziellen
Beschreibung sowie den Zeichnung, in denen
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1 eine
Ausführungsform
eines Nachweisverfahrens unter Verwendung einer Ausführungsform
des erfindungsgemäß hergestellten
Immunoassays zeigt und
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2 eine
weitere Ausführungsform
eines Nachweisverfahrens unter Verwendung einer weiteren Ausführungsform
des erfindungsgemäß hergestellten
Immunoassays zeigt.
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1 zeigt
in schematischer Darstellung einen beispielhaften Immunoassay 10,
der im Wesentlichen als ein poröser
Träger
dargestellt ist, der in verschiedene Zonen eingeteilt ist. Die Teilfiguren
I und II beziehen sich auf zwei Immunoassays, die sich allein in
der Wahl des Konkurrenzantikörpers
unterscheiden.
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Zunächst soll
das Schema I erläutert
werden. Mit A ist eine Applikationszone bezeichnet, die beispielsweise
als schwammartiger Fortsatz in Flüssigkeit leitender Verbindung
mit dem porösen
Träger ausgeführt sein
kann. Die Applikationszone wird bei Anwendung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens
mit einer Testflüssigkeit
benetzt, die (mutmaßlich)
mindestens zwei Antigene 1 und 2 enthält.
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Aufgrund
von Kapillarkräften
strömt
die Testflüssigkeit
mit den Antigenen 1, 2 stromabwärts entlang
des porösen
Trägers.
Sie passiert dabei die Startzone S. In der Startzone S sind ein
Sondenantikörper 3 und
ein Konkurrenzantikörper 4 beispielsweise
durch Auftrocknen fixiert. Sondenantikörper 3 und Konkurrenzantikörper 4 unterscheiden
sich in wenigstens zwei Kriterien. Sondenantikörper 3 ist zum einen
mittels eines vorzugsweise partikelförmigen Direktfarbstoffs, der
als Gold- oder Latexpartikel 5 ausgeführt sein
kann, markiert, während
Konkurrenzantikörper 4 keine
oder eine von der Markierung des Sondenantikörpers 3 unterscheidbare
Markierung aufweist. Bei der gezeigten Ausführungsform ist der Konkurrenzantikörper 4 nicht
markiert.
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Zweitens
unterscheiden sich die beiden Antikörpern in ihren Bindungseigenschaften.
Während der
Sondenantikörper 3 sowohl
mit dem ersten Antigen 1 als auch mit dem zweiten Antigen 2 eine
Bindung eingehen kann, kann der Konkurrenzantikörper 4 lediglich mit
dem zweiten Antigen 2 in nicht vernachlässigbarem Ausmaß reagieren.
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Aus
der schematischen Darstellung von 1 wird deutlich,
dass bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel
für das
zweite Antigen 2 in der Startzone S wesentlich mehr Bindungsstellen
zur Verfügung stehen,
als für
das erste Antigen 1. Da auf diese Weise ein großer Teil
des zweiten Antigens 2 von dem Konkurrenzantikörper 4 gebunden
wird, ist die Wahrscheinlichkeit einer Bindung mit dem Sondenantikörper 3 für das erste
Antigen 1 im Vergleich zum Antigen 2 deutlich
erhöht.
Entsprechend bindet im Wesentlichen nur das erste Antigen 1 an
den partikelmarkierten Sondenantikörper 3.
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Da
der Sondenantikörper 3 sowie
der Konkurrenzantikörper 4 in
der Startzone nicht dauerhaft fixiert sind, strömen sie mit der Testflüssigkeit
stromabwärts
in dem porösen
Träger.
Sie passieren im Folgenden die Detektionszone D, in der ein Detektionsantikörper 6 dauerhaft
immobilisiert ist. Der Detektionsantikörper 6 ist so gewählt, dass
er sowohl mit dem ersten Antigen 1, als auch mit dem zweiten
Antigen 2 binden kann. Aufgrund der oben erläuterten Vorselektion
durch Verschiebung der Bindungswahrscheinlichkeiten in der Startzone
S kommt es in der Detektionszone D im Wesentlichen nur durch die
an den Sondenantikörper 3 gebundenen
ersten Antigene 1 zu einer die Detektionszone anfärbenden
Sandwichreaktion. Die Sandwichreaktion, an welcher das zweite Antigen 2 beteiligt
ist, erfolgt im Wesentlichen nur unter Beteiligung des unmarkierten
Konkurrenzantikörpers 4,
so dass diese Reaktion für
den Benutzer unsichtbar bleibt.
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In
einer sich stromabwärts
anschließenden Kontrollzone
C ist bei dem gezeigten Immunoassay ein Kontroll-Detektionsantikörper dauerhaft
immobilisiert, welcher an ein markiertes Kontrollagens bindet, das
bei einer Ausführungsform
der Sondenantikörper 3 sein
kann, bei einer alternativen Ausführungsform aber auch ein hiervon
unabhängiger
Kontrollantikörper.
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Um
den Flüssigkeitsstrom
durch den porösen
Träger
möglichst
lange aufrechtzuerhalten, ist im Anschluss vorzugsweise ein Flüssigkeitsreservoir
R vorgesehen, welches schwämmchenartig
ausgebildet sein kann.
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In
dem mit II gekennzeichneten Teil von 1 ist im
Wesentlichen dasselbe Schema wie unter I dargestellt, wobei sich
lediglich der Konkurrenzantikörper 4' von dem unter
I gezeigten Konkurrenzantikörper 4 unterscheidet.
Dieser weist nämlich eine
hohe Selektivität
für das
erste Antigen 1 anstelle des zweiten Antigens 2,
wie zuvor erläutert,
auf.
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Das
Ergebnis dieser Modifikation ist, dass an den Sondenantikörper 3 nun
im Wesentlichen das zweite Antigen 2 bindet. Der gesamte
Test kann somit zum Nachweis des zweiten Antigens 2 als
Analyt verwendet werden (das erste Antigen 1 wirkt hierbei als
Störantigen),
während
die weiter oben unter I beschriebene Variante dem Nachweis des ersten
Antigens 1 als Analyt diente (das zweite Antigen 2 wirkt hierbei
als Störantigen).
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Durch
die erfinderische Grundidee kann daher das Herstellungsverfahren
eines Immunoassays soweit vereinfacht werden, dass erst in einem
sehr späten
Herstellungsschritt durch Wahl des Konkurrenzantikörpers 4 oder 4' ausgewählt und
entschie den wird, ob der gesamte Test zum Nachweis eines ersten
Antigens 1 oder eines zweiten Antigens 2 eingesetzt
werden kann.
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2 zeigt
ein weiteres Nachweisverfahren unter Verwendung einer weiteren Ausführungsform des
erfindungsgemäß hergestellten
Immunoassays. Zur Vereinfachung -soll bei der Beschreibung von 2 nur
auf deren Unterschiede zu 1 eingegangen
werden.
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Bei
der Ausführungsform
gemäß Spalte
I in 2 treffen in der Startzone erstes und zweites
Antigen 1 und 2 auf dort im trockenen Zustand
fixierte und markierte Sondenantikörper 3 sowie auf unmarkierte
Konkurrenzantikörper 9.
Diese sind so gewählt,
dass sie mit hoher Selektivität
an Antigen 2 binden können
(Bildung eines Immunkomplexes 11), welches hierdurch als
Störantigen
identifiziert wird, während
Antigen 1 hierdurch als Analyt identifiziert wird. Der
Konkurrenzantikörper 9 ist
weiter so gewählt,
dass er zwar die gleichzeitige Bindung des Sondenantikörpers 3 zur
Bildung eines mobilen Sandwich-Immunkomplexes 12 ermöglicht.
Eine Bindung des in der Detektionszone D immobilisierten Detektionsantikörpers 6 wird
jedoch inhibiert, sodass dort weder der Immunkomplex 11 noch
der Sandwich-Immunkomplex 12 gebunden werden kann. Die Anfärbung der
Detektionszone wird also klar von dem an Sondenantikörper 3 gebundenen
Antigen 1 dominiert.
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Die
Ausführungsform
gemäß Spalte
II von 2 unterscheidet sich allein durch den Austausch des
Konkurrenzantikörpers 9 durch
den Konkurrenzantikörper 9', der mit hoher
Selektivität
an das Antigen 1 bindet, ansonsten aber im Wesentlichen
die gleichen Eigenschaften wie der Konkurrenzantikörper 9 hat,
von der oben erläuterten
Ausführungsform gemäß Spalte
I. In der Startzone S kommt es daher zu der Bildung des Immunkomplexes 11' und ggf. des Sandwich-Immunkomplexes 12', die bei de
das Antigen 1 enthalten, welches hierdurch als Störantigen identifiziert
wird, während
Antigen 2 in diesem Fall den Analyten darstellt. Die Anfärbung der
Detektionszone D wird klar von dem an Sondenantikörper 3 gebundenen
Antigen 2 dominiert Natürlich
stellen die in der Beschreibung erläuterten Ausführungsbeispiele lediglich
vorteilhafte Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Prinzips
dar. Modifikationen sind in weitem Umfang innerhalb des Erfindungsbereiches möglich. Insbesondere
liegt die spezielle Wahl der verwendeten Antikörper, ihre Selektivitäten oder Spezifitäten, ihre
Mengen sowie Belegungsdichten auf dem porösen Träger im Ermessen des Fachmanns,
welcher seine Wahl in Abstimmung mit den ihn speziell interessierenden
Antigenen, deren biochemischen Besonderheiten und typischerweise
in der Testflüssigkeit
vorliegenden Mengen oder Konzentrationen zu treffen hat.