DE19731465A1 - Verwendung von Kontrollflächen zur Detektion von Störproben in einem Nachweisverfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Festphase mit mindestens einer Testfläche zum Nach­ weis eines Analyten, welche weiterhin mindestens eine Kontrollfläche zum Nach­ weis von Störungen umfaßt. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten unter Verwendung einer erfindungsgemä­ ßen Festphase, wobei Störreaktionen erkannt und gegebenenfalls korrigiert werden können.

Beim Nachweis eines Analyten durch Bindungsassays treten bei manchen Proben Störungen in der Nachweisreaktion auf, die zu falschen Meßwerten führen. Dieses Phänomen wird meist als Matrixeffekt der Probe bezeichnet. In bisher üblichen Testformaten kann das Vorhandensein einer Störung im allgemeinen nicht ange­ zeigt werden. Durch aufwendige Optimierung von Festphase, Testpuffern und Nachweisreagenz wird versucht, die Matrixeffekte der unterschiedlichen Proben völlig zu unterbinden oder so gering wie möglich zu halten. Eine solche Entstörung von Nachweisverfahren ist jedoch aufwendig und kostspielig. Zudem kann nicht ausgeschlossen werden, daß bei bestimmten Proben trotz Testoptimierung keine ausreichende Entstörung erfolgt, da eine Unterdrückung von Matrixeffekten leider nicht vollständig möglich ist. Weiterhin können neue, bei der Entwicklung des Nachweisverfahrens unbekannte Störungen auftreten, die ebenfalls zu falschen Ergebnissen führen. Folglich besteht das Problem, daß bei den bekannten Nach­ weisverfahren falsche Testergebnisse erhalten werden können, ohne daß der Anwender dies erkennt. Besonders tragisch ist dieser Umstand bei den qualitativen Tests zum Nachweis einer Infektionskrankheit. So hat zum Beispiel eine aufgrund von Matrixproblemen falsch positive Probe bei einem HIV-Test erhebliche Kon­ sequenzen.

US-A-4,558,013 beschreibt einen Teststreifen, der neben mit spezifischen Testrea­ genzien beschichteten Testregionen eine nicht begrenzte unbeschichtete, negative Kontrollregion enthält. Der Meßwert in der Testregion wird durch Subtraktion der unspezifischen Bindung in der Kontrollregion korrigiert. Durch eine solche Vor­ gehensweise können Störungen allerdings nur zum Teil korrigiert werden, da sich die unspezifische Bindung von Störkomponenten an die Testregion zumeist beträchtlich von der Bindung von Störkomponenten an die unbeschichtete Kon­ trollregion unterscheidet.

US-A-5,356,785 beschreibt eine Festphase mit mehreren Testflächen, die jeweils verschiedene Mengen eines Festphasenrezeptors zum Nachweis eines Analyten enthalten. Weiterhin enthält die Festphase eine Referenzfläche, die mit dem Testreagenz ein nachweisbares Signal bekannter Stärke liefert. Kontrollflächen zur Bestimmung unspezifischer Wechselwirkungen zwischen der Probe und der Festphase werden nicht offenbart.

US-A-4,916,056 (Brown III et al.) beschreibt eine Festphase zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten, insbesondere eines Antigens, Antikör­ pers oder eines DNA-Segments in einer Probe. Die Festphase enthält neben einer Testfläche eine Referenzfläche, die ein positives Signal im Test ergibt, sowie eine nicht begrenzte negative Kontrollfläche, in der die positive Referenzfläche und die Testfläche enthalten sind. Ein Nachteil dieser Vorrichtung besteht darin, daß sich die Oberfläche der unbeschichteten Kontrollregion zu stark von der Testfläche unterscheidet, um eine wirksame Korrektur von Störungen zu erreichen.

Eine Aufgabe der Erfindung war es daher, die Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von Analyten bereitzustellen, die einen direkten Hinweis auf das Vorhan­ densein und gegebenenfalls die Art von Störungen ermöglichen, so daß diese Störungen bei der Auswertung der Testergebnisse berücksichtigt werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Festphase mit mindestens einer begrenzten Testfläche zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß die Festphase weiterhin mindestens eine be­ grenzte Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen umfaßt. Unter "begrenzten Testflächen" auf einer Festphase ist dabei zu verstehen, daß die Testflächen definierte Bereiche der Festphase umfassen, die vorzugsweise durch inerte Bereiche von weiteren Testflächen räumlich getrennt sind. Die begrenzten Test­ flächen haben bevorzugt einen Durchmesser von 10 µm bis 1 cm und besonders bevorzugt 10 µm bis 5 mm. Am meisten bevorzugt sind miniaturisierte Testflächen mit einem Durchmesser von 10 µm bis 2 mm. Bevorzugt sind Festphasen mit mehreren Testflächen, die auch als Array-Systeme bezeichnet werden. Solche Array-Systeme sind z. B. bei Ekins und Chu (Clin. Chem. 37 (1995), 1955-1967) und in den US-Patenten 5,432,099, 5,516,635 und 5,126,276 beschrieben. Array- Systeme haben den Vorteil, daß mehrere Analyt- und Kontrollbestimmungen gleichzeitig an einer Probe durchgeführt werden können. Durch die Verwendung von Kontrollflächen zur Detektion von unspezifischen Bindungen und/oder Stör­ proben kann die Ergebnissicherheit gerade bei miniaturisierten Array-Testsystemen erheblich verbessert werden.

Besonders interessant ist dabei die Erfassung von Störungen und unspezifischen Bindungen bei qualitativen Tests und insbesondere bei solchen mit hohen Anforde­ rungen an die Spezifität, wie etwa bei Tests auf Infektionen (z. B. HIV). Durch Anzeigen einer Störung und Korrektur des Meßwerts können falsch positive Ergebnisse deutlich reduziert und somit die Spezifität enorm verbessert werden.

Die erfindungsgemäße Festphase ist ein beliebiger, für Nachweisverfahren ge­ bräuchlicher Träger, vorzugsweise ein nichtporöser Träger, z. B. ein Träger mit Kunststoff-, Glas-, Metall- oder Metalloxidoberfläche. Auch poröse Träger wie etwa Teststreifen sind geeignet. Auf diesem Träger sind räumlich diskrete Bereiche (Testflächen) angeordnet. Auf diesen Testflächen sind immobilisierte Festphasen­ rezeptoren aufgebracht. Die Immobilisierung der Festphasenrezeptoren erfolgt nach bekannten Methoden, z. B. durch direkte adsorptive Bindung, durch kovalente Kopplung oder durch Kopplung über hochaffine Bindepaare, z. B. Streptavidin/Bio­ tin, Antigen/Antikörper oder Zucker/Lectin. Durch spezifische Bindung von Komponenten aus dem Nachweismedium, z. B. des zu bestimmenden Analyten oder eines Analytanalogons, an den Festphasenrezeptor kann das Vorhandensein oder/und die Menge des Analyten in einer Probe bestimmt werden.

Der Nachweis des Analyten und des Vorhandenseins von Störreaktionen erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren auf bekannte Weise durch Verwendung von ge­ eigneten Markierungsgruppen, z. B. Fluoreszenzmarkierungsgruppen. Alternativ kann - bei geeigneten Festphasen - die Wechselwirkung von Bestandteilen des Nachweismediums mit den Test- und Kontrollflächen auch durch Bestimmung der Schichtdicke der jeweiligen Fläche, z. B. durch Plasmonenresonanzspektroskopie, nachgewiesen werden.

Bei Array-Systemen, in denen ein gleichzeitiger Nachweis mehrerer Analyten aus einer Probe erfolgt, ist die Verwendung einer "universellen" Markierungsgruppe bevorzugt, mit der ein gleichzeitiger Nachweis mehrerer verschiedener Analyten an verschiedenen Testflächen möglich ist. Ein Beispiel für solche universellen Markie­ rungsgruppen sind Markierungsgruppen, die einen Rezeptor tragen, welcher eine spezifische Wechselwirkung (z. B. über ein hochaffines Bindepaar wie etwa Antikör­ per/Antigen oder Streptavidin/Biotin etc.) mit einem komplementären Rezeptor auf einem Testreagenz, z. B. einem löslichen Rezeptor für einen zu bestimmenden Analyten oder ein Analytanalogon eingehen kann.

Die Anwendung einer solchen universellen Markierungsgruppe ist exemplarisch in Abb. 1 erläutert. Dort wird ein fluoreszierendes Latexbead, welches mit einem Anti-Digoxigenin-Antikörper gekoppelt ist (<Dig< Label), für drei verschiedene Testformate auf einer einzigen Festphase, nämlich für die Bestimmung von HIV-Antikörpern, HBs-Antigen und Anti-HBc-Antikörper, eingesetzt. Bei der Anti-HIV-An­ tikörperbestimmung wird ein immobilisiertes HIV-Antigen und ein digoxige­ nyliertes lösliches HIV-Antigen verwendet, die mit den nachzuweisenden Anti-HIV-An­ tikörpern einen immobilisierten Immunkomplex bilden. An die auf diesem Immunkomplex vorhandenen Digoxigeningruppen kann die Markierungsgruppe binden. Bei der Bestimmung von HBs-Antigen werden auf entsprechende Weise ein immobilisierter Antikörper und ein digoxigenylierter löslicher Antikörper, der mit der Markierungsgruppe wechselwirken kann, verwendet. Bei der Anti-HBc-Bestim­ mung wird ein kompetitives Testformat verwendet, bei dem in der Probe vorhan­ dene Anti-HBc-Antikörper mit einem digoxigenylierten Anti-HBc-Antikörper um immobilisiertes HBc-Antigen konkurrieren. Die an die Testfläche gebundene Menge der Markierungsgruppe ist indirekt proportional zur Anti-HBc-Konzentration in der Probe.

Begrenzte Test- und Kontrollflächen können darüber hinaus zur Unterscheidung gegenüber inerten Bereichen der Festphase eine nachweisbare und analytunspezi­ fische Markierungsgruppe enthalten, die neben der analytspezifischen Markie­ rungsgruppe nachweisbar ist und nicht mit ihr interferiert. Ein Beispiel für eine solche analytunspezifische Markierungsgruppe ist eine Fluoreszenz-Markierungs­ gruppe, die bei einer Wellenlänge fluoresziert, die von der Fluoreszenzwellenlänge einer analytspezifischen Markierungsgruppe verschieden ist. Die analytunspezi­ fische Markierungsgruppe wird vorzugsweise - ebenso wie der Fesphasenrezep­ tor - über ein hochaffines Bindepaar, z. B. Streptavidin/Biotin immobilisiert.

Die erfindungsgemäße Festphase kann in beliebigen Nachweisverfahren einge­ setzt werden, z. B. in Immunoassays, Nukleinsäure-Hybridisierungsassays, Zucker- Lectin-Assays und ähnlichen Verfahren.

Die erfindungsgemäße Festphase ermöglicht selbst dann einen Nachweis von Störreaktionen zum Erhalt von zuverlässigen Testergebnissen, wenn die aus dem Stand der Technik bekannten Entstörungsmaßnahmen für bestimmte Proben nicht ausreichen. Die Kontrollflächen ermöglichen nicht nur einen qualitativen Nachweis von Störreaktionen sondern auch in vielen Fällen eine quantitative Korrektur der Störung.

Zum Nachweis unterschiedlicher Störungen kann die Festphase mehrere, ins­ besondere unterschiedliche Kontrollflächen zum Nachweis von Störreaktionen umfassen. Auf diese Weise können verschiedene Arten von Störungen spezifisch erfaßt werden. Es empfiehlt sich insbesondere eine Reihe von Kontrollflächen aufzubringen, die zum Nachweis von häufig auftretenden oder/und für den jeweili­ gen Test besonders relevanten Störkomponenten geeignet sind.

Störungen von Testverfahren können im allgemeinen durch unerwünschte, nicht-analytspezifische Wechselwirkungen von Substanzen auf der Testfläche mit Komponenten des Nachweismediums auftreten. Als Substanzen auf der Testfläche kommen dabei insbesondere Bestandteile der Festphase, Teile des Festphasenre­ zeptors sowie weitere, sich auf der Oberfläche der Festphase befindende Reagen­ zien in Betracht. Die störenden Komponenten des Nachweismediums stammen vor allem aus der Probe (Matrixeffekt) und führen in manchen Fällen zur unspezifi­ schen Bindung von Testreagenzien, z. B. dem Nachweisreagenz an die Festphase und führen zur Verfälschung des Meßsignals. Somit kommen störende Wechsel­ wirkungen zwischen der Testfläche und Probekomponenten, Testreagenzien, Reaktionsprodukten oder Komplexen von Probekomponenten und Testreagenzien in Betracht.

Die erfindungsgemäße Festphase umfaßt bevorzugt Kontrollflächen zum Nachweis von Störungen, die durch eine unerwünschte Bindung von Komponenten des Nachweismediums an den für den Analyten spezifischen Festphasenrezeptor hervorgerufen werden. In Proben liegen häufig Analyt-fremde Störbestandteile, wie etwa Antikörper oder Antigene vor, die zu einer erhöhten unspezifischen Bindung mit dem Festphasenrezeptor neigen und auf diese Weise zu fehlerhaften Test­ ergebnissen führen. Besonders vorteilhaft ist deswegen eine Kontrollfläche, welche einen nicht-analytspezifischen Festphasenrezeptor umfaßt, der mit Ausnahme der spezifisch mit dem Analyten bindefähigen Region völlig identisch mit dem Fest­ phasenrezeptor in den Testflächen ist.

Wenn der Festphasenrezeptor beispielsweise ein Antikörper oder ein Antikörper­ fragment ist, verwendet man eine Kontrollfläche, die einen unspezifischen Antikör­ per oder ein unspezifisches Antikörperfragment der gleichen Spezies, bevorzugt der gleichen Klasse und besonders bevorzugt der gleichen Subklasse wie der Festphasenrezeptor der Testfläche enthält. Wenn der Festphasenrezeptor bei­ spielsweise ein Antigen, z. B. ein Peptid oder ein Polypeptid ist, verwendet man eine Kontrollfläche, die ein mutiertes "Antigen" enthält, welches sich von einem immunologisch reaktiven Antigen durch Veränderungen, z. B. durch Veränderung einer möglichst geringen Anzahl Aminosäuren im Bereich immunogener Epitope unterscheidet. Diese Aminosäureveränderungen können Insertionen, Deletionen und vorzugsweise Substitutionen natürlicher Aminosäuren durch andere natürliche Aminosäuren oder nicht natürliche Aminosäurederivate, z. B. D-Aminosäuren umfassen. Wenn der Festphasenrezeptor beispielsweise eine Nukleinsäure ist, verwendet man eine Kontrollfläche, die eine "mutierte" Nukleinsäure enthält, die sich von der auf der Testfläche immobilisierten Nukleinsäure durch Veränderungen in der Nukleotidsequenz, beispielsweise durch einen Basenaustausch innerhalb der für die Erkennung einer Zielnukleinsäure verantwortlichen Sequenz, vorzugs­ weise in deren Mitte, unterscheidet. Am meisten bevorzugt wird ein Mutein des Festphasenrezeptors verwendet, welches mit Ausnahme der analytspezifischen Antigenbindungsstelle völlig identisch mit dem Festphasenantikörper in den Test­ flächen ist.

Bevorzugt ist auch, wenn der auf die Kontrollfläche aufgebrachte Festphasenre­ zeptor identische Behandlungsschritte, z. B. Derivatisierungen, wie der auf die Test­ fläche aufgebrachte Festphasenrezeptor durchlaufen hat. So sollte, beispielswei­ se - bei einem biotinylierten Festphasenrezeptor - die Zahl der an den Festphasenre­ zeptor angekoppelten Biotinmoleküle in der Testfläche und der Kontrollfläche gleich sein. Weiterhin sollten die Festphasenrezeptoren in der Testfläche und der Kontrollfläche eine identische Kopplungschemie durchlaufen haben. Außerdem sollten auch identische Linker verwendet werden. Ein für eine Kontrollfläche ge­ eigneter Festphasenrezeptor darf keine spezifische Bindefähigkeit für den Analyten aufweisen, umfaßt aber vorzugsweise alle anderen Bereiche und somit Binde­ stellen des Festphasenrezeptors der Testfläche. Somit ist die unspezifische Bindung von Störkomponenten an den jeweiligen Festphasenrezeptor der Test­ fläche und Kontrollfläche im wesentlichen identisch, so daß eine quantitative Korrektur des Meßwertes der Testfläche anhand des Meßwertes der Kontrollfläche vorgenommen werden kann.

Bevorzugt umfaßt die Festphase weiterhin mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen, die durch die Reaktion anderer immobilisierter Reagen­ zien in den Testflächen mit Nicht-Analytkomponenten der Probe hervorgerufen werden. Dadurch werden insbesondere Störkomponenten erfaßt, die spezifisch oder/und unspezifisch mit Komponenten der zum Aufbringen des Festphasenre­ zeptors verwendeten Beladelösung reagieren. Eine solche Kontrollfläche kann beispielsweise bei einem Testsystem verwendete Reagenzien der Beladelösung wie etwa Puffer, Immobilisierungsreagenzien, wie Streptavidin, biotinylierte Sub­ stanzen, z. B. biotinylierte Fluoreszenzmarker, nicht-analytspezifische Antikörper etc., Blockierungsreagenzien oder Linker, enthalten.

Oftmals werden Tests durch Rheumafaktoren gestört. Daher ist es bevorzugt, mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis auf Rheumafaktoren auf die Fest­ phase aufzubringen. Rheumafaktoren sind zumeist IgM-Moleküle, seltener auch IgG-, IgA- und IgE-Moleküle, die mit dem Fc-Teil von Antikörpern reagieren und - wenn sie z. B. eine Kreuzreaktion mit dem auf der Testfläche immobilisierten Antikörper oder/und einem löslichen Nachweisantikörper zeigen - den Test stören, z. B. durch Vernetzung des Festphasen-gebundenen Antikörpers mit einem mar­ kierten Nachweisantikörper, wodurch ein unspezifisch erhöhtes Signal erhalten wird. Für eine entsprechende Kontrollfläche wird ein unspezifisches IgG-Molekül, bevorzugt der Fcy-Teil eines humanen IgG-Moleküls auf die Festphase aufge­ bracht. Während des Tests bindet dann der Rheumafaktor nicht nur an die Test­ fläche, sondern auch an die Kontrollfläche und zeigt so die Störung an.

Eine weitere relativ häufig auftretende Störung wird durch fremdspezies-spezi­ fische Antikörper in der Probe, d. h. Antikörper, die gegen Antikörper fremder Spezies gerichtet sind, z. B. humane Anti-Maus-Antikörper (HAMA), hervorgerufen.

Daher umfaßt die erfindungsgemäße Festphase bevorzugt auch mindestens eine Kontrollfläche zum Test auf fremdspezies-spezifische Antikörper. Fremdspezies-spe­ zifische Störkomponenten, z. B. HAMA führen beispielsweise in einem Doppel- Antikörper-Sandwich-Assay zu einer Vernetzung des Festphasen-Antikörpers mit dem Nachweis-Antikörper und folglich zu einem unspezifisch erhöhten Signal. Für eine geeignete Kontrollfläche wird bevorzugt ein unspezifischer Antikörper dersel­ ben Spezies wie der Testantikörper verwendet. Eine möglicherweise in der Probe vorhandene HAMA-Störkomponente bindet an den auf die Kontrollfläche aufge­ brachten Antikörper, wodurch die Störreaktion angezeigt wird.

Anstelle eines Festphasenrezeptors, welcher mit dem Nachweisreagenz in der Testfläche, abgesehen von der spezifisch analytbindefähigen Region, identisch ist, kann auf eine Kontrollfläche auch der bei der Nachweisreaktion gebildete Komplex, z. B. Festphasenantikörper-Analyt-Nachweisantikörper (ohne Markierung), aufge­ bracht werden, so daß keine spezifische Reaktion mehr möglich ist, während die unspezifischen Bindungsstellen nahezu identisch mit denen der Testfläche sind.

Es sind auch Störkomponenten in Serum bekannt, die gegen Neo-Epitope eines Antikörperfragments gerichtet sind. Solche Neo-Epitope entstehen z. B. bei der F(ab')₂-Spaltung eines IgG-Moleküls. Hier ist es bevorzugt, eine Kontrollfläche vorzusehen, die ein Fragment eines unspezifischen Antikörpers enthält, welches mit derselben Methode (Spaltbedingungen und Spaltprotein) hergestellt wurde, wie die Antikörperfragmente der Testfläche. Die Störkomponenten binden an diese unspezifischen Antikörperfragmente, wodurch sie nachgewiesen werden können.

Außerdem besteht die Möglichkeit, mit geeigneten Kontrollflächen auch gegebe­ nenfalls in einer Probe vorliegende Störkomponenten, z. B. Störantikörper zu erfassen, die gegen Immobilisierungsreagenzien auf den Testflächen wie Streptavi­ din gerichtet sind. Hierzu wird Streptavidin (SA) auf eine Kontrollfläche aufgebracht und dem Nachweisreagenz markiertes SA zugesetzt. Bei Anwesenheit von Anti- SA-Antikörpern in der Probe wird ein Sandwichkomplex ausgebildet und der Antikörper spezifisch nachgewiesen.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße Festphase eine Kontrollfläche zum Nach­ weis des Gesamt-IgE-Gehalts enthalten. Eine solche Kontrollfläche ist insbeson­ dere bei Allergie-Tests empfehlenswert. Bei der spezifischen IgE-Bestimmung in der Allergiediagnostik wird die spezifische Nachweisreaktion eines bestimmten IgE oftmals durch Proben mit hohem Gesamt-IgE-Gehalt gestört. Mit Hilfe einer Kontrollfläche, auf die Anti-IgE-Antikörper aufgebracht worden sind, kann parallel zum Nachweisverfahren der Gesamt-IgE-Gehalt bestimmt werden.

Schließlich können auch Kontrollflächen zum Nachweis von Störungen vorgesehen werden, die durch Reaktionen von Komponenten des Nachweismediums mit dem Festphasenträger hervorgerufen werden. Hierzu werden alle Bestandteile des Festphasenträgers, wie Trägermaterial (z. B. Polystyrol), Weichmacher, funktionelle Gruppen usw. auf eine Kontrollfläche aufgebracht.

Außerdem können bei bestimmten Testverfahren, z. B. bei qualitativen oder semi­ quantitativen Tests auf Infektionskrankheiten, Allergien etc. Kontrollflächen zur Ermittlung eines Cut-off Werts verwendet werden. Der "Cut-off"-Wert ist ein Grenz­ wert, der bei Testverfahren gesetzt wird, um zwischen positiven und negativen Werten unterscheiden zu können. Ein solcher "Cut-off"-Wert ist insbesondere bei Testverfahren, welche Infektionskrankheiten betreffen, von Bedeutung. Zum einen kann eine "Negativ"-Kontrollfläche verwendet werden, die eine Beladelösung ohne das Testreagenz oder ein Mutein des Testreagenzes enthalten kann. Der große Vorteil liegt darin, daß für jede Probe ein probenspezifischer Wert der unspezifi­ schen Bindung erfaßt wird und somit eine verbesserte Spezifität des Tests erhal­ ten wird. Auf diese Weise kann eine separate Negativkontrolle entfallen.

Abb. 2 zeigt die Wirkung einer Kontrollfläche beim Einsatz in einem Test, bei dem ein Cut-off-Wert verwendet wird. Bei einer großen Anzahl von Proben wird bei einer konventionellen Testdurchführung eine gewisse Anzahl falsch negativer und falsch positiver Ergebnisse erhalten (linke Seite). Bei der erfindungsgemäßen Verwendung von Kontrollflächen (rechte Seite) kann eine selektive Verringerung der Signale aus negativen Proben erzielt werden, was zu einer Verringerung des Cut-off-Werts führt. Auf diese Weise kann eine positiv/negativ Unterscheidung mit erheblich geringerer Fehlerwahrscheinlichkeit getroffen werden.

Auch eine Positivkontrolle kann durch eine Referenzfläche, die den Analyten oder ein analytähnliches Reagenz enthält, simuliert werden. Der große Vorteil liegt darin, daß mit der Kombination von einer Negativ-Kontrollfläche mit einer Positiv-Re­ ferenzfläche ein probenspezifischer Cut-off-Wert für jede einzelne Messung bestimmt werden kann. Dies hat den Vorteil, daß keine indirekte Kalibrierung notwendig ist und eine bessere Testspezifität erreicht wird.

Es ist selbstverständlich möglich, neben den oben genannten bevorzugten Kon­ trollflächen je nach Testführung andere oder/und weitere Kontrollflächen vorzuse­ hen, um in einer Probe vorhandene oder vermutete Störkomponenten zu erfassen.

Die erfindungsgemäß vorgesehenen Kontrollflächen ermöglichen nicht nur eine qualitative Erkennung von Störreaktionen, sondern oftmals auch eine quantitative Korrektur der Störung. Bei geeigneter Wahl der Testbedingungen wird gerade die in den Testflächen auftretende unspezifische Bindung von Nicht-Analytkomponen­ ten in bestimmten Kontrollflächen abgebildet. Somit kann der Meßwert in einer Testfläche einfach korrigiert werden, wodurch ein korrektes und unverfälschtes Ergebnis erhalten wird. Auch bei nicht identischer unspezifischer Bindung in der Testfläche und der Kontrollfläche, kann eine Korrektur des Meßsignals bei qualita­ tiven Tests erfolgen, da hier nur eine Aussage über "positiv" oder "negativ" not­ wendig ist.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß es mit der erfindungsgemäßen Festphase möglich ist, ohne großen Aufwand das Vorliegen mehrerer Störkomponenten separat zu erkennen und es möglich ist, die Art der Störung zu bestimmen. Der Anwender erkennt unmittelbar, daß das Ergebnis aufgrund des Vorliegens einer oder mehrerer Störkomponenten verfälscht sein könnte. Der Anwender kann dann entweder anhand der ermittelten Daten die Messergebnisse korrigieren, die Mes­ sung mit einem anderen Testformat wiederholen oder die Probe in geeigneter Weise vorbehandeln, z. B. durch Abtrennung der Störkomponenten.

Die erfindungsgemäße Festphase kann zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, z. B. in einer Körperflüssigkeit, wie etwa Blut, Serum, Plasma, Speichel etc. verwendet werden. Vorzugsweise werden Festphasen mit mehreren Testflächen, d. h. Array-Systeme, zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Analyten verwendet. Vorzugsweise wird in solchen Array-Systemen für jede Testfläche mindestens eine Kontrollfläche verwendet. Die erfindungsgemäßen Festphasen können in allen bekannten heterogenen Testverfahren eingesetzt werden, insbesondere bei Immunoassays und Nukleinsäurehybridisierungsassays.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten unter Verwendung einer Festphase mit mindestens einer begrenz­ ten Testfläche, die weiterhin mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störreaktionen umfaßt. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung der Kontrollflächen zur quantitativen Korrektur von Störungen.

Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Kontrollflächen in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten zur gleichzeitigen Erkennung von Störungen.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele näher erläutert. Es zeigen:

Abb. 1: ein Beispiel für ein miniaturisiertes Array-System (Microspot), das unter Verwendung einer universellen Markierungsgruppe die gleich­ zeitige Bestimmung von 3 Parametern auf einer Festphase erlaubt;

Abb. 2: die Spezifitätsverbesserung, die in Testformaten, bei denen ein Cut­ off-Wert bestimmt wird, durch die erfindungsgemäße Verwendung von Kontrollflächen erzielt wird und

Abb. 3: die schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Festphase zur Bestimmung von HBs-Antigen, die neben der Testfläche (<HBsAg<) zusätzlich mehrere Kontrollflächen (<CK-MB<; <TNT< und <TSH<) enthält.

Beispiele Beispiel 1 Durchführung eines HBsAg-Tests

Auf einen Polystyrolträger wird auf eine Testfläche von ca. 100 µm ein monoklona­ ler Antikörper gegen HBsAg aufgebracht. Durch mehrmaliges Aufbringen der identischen Reagenzlösung kann ohne Mehraufwand bei der Testdurchführung pro Probenpipettierung eine Mehrfachbestimmung durchgeführt werden. Auf die Testfläche werden 30 µl mit Probenpuffer vorverdünnte Probe pipettiert und 20 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen der Probe und Waschen des Testfeldes mit Waschpuffer werden 30 µl Reagenzlösung 1 mit Digoxigenin (Dig)-markiertem Anti-HBsAg-Antikörper zupipettiert und wiederum 20 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen der Reagenzlösung 1 und Waschen des Testfeldes mit Waschpuffer werden 30 µl Reagenzlösung 2 mit Nachweisreagenz auf das Testfeld pipettiert. Als Nachweis­ reagenz dienen 100 nm große, fluoreszenzgefärbte Latexpartikel, die kovalent mit einem Anti-Dig-Antikörper beschichtet sind. Dieses Nachweisreagenz wird wiede­ rum 20 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend abgesaugt, gewaschen und trockengesaugt. Das Testfeld wird mit einem He-Ne-La­ ser mit 633 nm Wellenlänge bestrahlt und die Fluoreszenz bei 670 nm Wellen­ länge mit einer CCD-Kamera vermessen. Eine schematische Darstellung dieses Testformates ist in Abb. 1 Mitte gezeigt.

Folgende testspezifischen Reagenzien wurden verwendet:
Festphasenantikörper: Monoklonaler Maus Anti-HBsAg-Antikörper-1 (Fab'₂-Fragment)-Biotin-Konjugat 1 : 1 Subtyp IgG1
Nachweisantikörper: Monoklonaler Maus Anti-HBsAg-Antikörper-2 IgG-Dig-Konjugat 1 : 10
Folgende Meßwerte (Counts) wurden gemessen:

Bei einem Cut-off < 1 ist der Test positiv. Bei einem Cut-off < 1 ist der Test negativ.

Beispiel 2 HBsAg-Test mit Kontrollspots zur Detektion von HAMA-Störern

Zur Detektion von HAMA-Störern wurden neben HBsAg-spezifischem Antikörper weitere unspezifische monoklonale Antikörper (MAKs) zur Detektion von HAMA-Störern aufgebracht (siehe Abb. 3). Dabei wurden Antikörper gegen Creatinki­ nase-MB (<CK-MB<), Troponin T (<TNT<) und Thyroid-stimulierendes Hormon (<TSH<) in Form von Fab'₂- oder Fab'-Biotin-Konjugaten eingesetzt. Aufgrund der Tatsache, daß die humanen Anti-Maus-Antikörper in der Probe eine Vernetzung des an der Festphase gebundenen unspezifischen MAKs und des spezifischen Nachweisantikörpers hervorrufen, kann die sogenannte HAMA-Störung nach­ gewiesen werden. Ziel des Versuches war es, den optimalen MAK zur HAMA-De­ tektion zu finden. Das HBsAg/Kontroll-Panel wurde mit 6 verschiedenen HAMA-Proben vermessen. Dazu wurden dem Probenpuffer kein bzw. 100 µg/ml HAMA-Entstörreagenz zugesetzt.

a) Versuchsergebnisse ohne HAMA-Entstörreagenz

Dieses Ergebnis zeigt, daß der HBsAg-Test durch 5 der 6 HAMA-Proben stark gestört wird und zu einem falsch positiven Ergebnis führt. Durch die Anwesenheit der Kontrollspots kann die Störung eindeutig angezeigt werden. Am besten eignet sich dafür der TSH-MAK, der das identische Spaltfragment (Fab'₂), die identische Biotin-Stöchiometrie und die identische Kopplungschemie aufweist. Die beiden MAKs mit Fab'-Fragmenten reagieren dagegen schlechter als der HBsAg-MAK mit den HAMA-Störproben und sind deshalb zur Identifizierung von allen HAMA-Störern weniger geeignet.

b) Versuchsergebnisse mit 100 µg/ml HAMA-Entstörreagenz

Durch den Zusatz von einer sehr großen Menge von 100 µg/ml Entstörreagenz, die den Test für Routineanwendungen zu teuer machen würde, können zwar 5 der 6 HAMA-Proben entstört werden. Ein Problem bleibt allerdings die HAMA-Probe 6, die trotz der hohen Konzentration an Entstörreagenz nicht entstört werden kann. Mit Hilfe der beiden Kontrollspots kann die noch vorhandene HAMA-Störung deutlich angezeigt werden. Da die unspezifische Bindung im TSH-Kontrollspot der unspezifischen Bindung im spezifischen HBsAg-Spot entspricht, kann das spezif­ ische Signal mit Hilfe des Signals im Kontrollspot korrigiert werden. Mit dieser Maßnahme wird auch diese Probe eindeutig negativ, was zu einer deutlichen Verbesserung der Spezifität führt. Daher können mit Hilfe der Kontrollspots unter Verbesserung der Spezifität die Konzentrationen an Entstörprotein im Probenpuffer und somit die Herstellungskosten deutlich gesenkt werden.

Beispiel 3 HBsAg-Test mit Kontrollspots zur Detektion von probenspezifi­ schen Matrixeffekten

Es ist allgemein bekannt, daß in Bindungsassays durch unterschiedliche Matrix­ effekte unspezifische Bindungen des Nachweisreagenz hervorgerufen werden können. Durch das Aufbringen von Kontrollspots, die ein vergleichbares Verhalten gegenüber Matrixeffekten wie der testspezifische Spot aufweisen, ist es möglich, solche Matrixeffekte anzuzeigen und gegebenenfalls sogar zu korrigieren. Dies führt folglich zu einer deutlichen Verbesserung der Spezifität.

Im nachfolgenden Versuch wurde wiederum ein HBsAg-Test mit verschiedenen HBsAg-negativen Proben vermessen, die aufgrund von auffälligen Matrixeffekten ausgewählt wurden.

Von den vermessenen 9 auffälligen Negativproben führen 2 Proben zu falsch­ positiven Ergebnissen. Durch Korrektur des Meßwerts mit Hilfe des Kontrollspots werden alle Proben auf Null gebracht und sind somit eindeutig negativ.

Beispiel 4 HBsAg-Test mit Kontrollflächen zur Detektion von Störungen durch Rheumafaktoren

Zur Detektion einer Störung durch Rheumafaktoren wurden neben dem HBsAg-spe­ zifischen Antikörper weitere MAKs vom Subtyp IgG1 aufgebracht. Aufgrund der Tatsache, daß Rheumafaktoren mit dem Fc-Teil von Antikörpern reagieren, kann eine Vernetzung des an der Festphase gebundenen testspezifischen MAKs und des spezifischen Nachweisantikörpers hervorgerufen und somit eine falsch positive Reaktion erzeugt werden. Ziel des Versuches war es, den optimalen MAK zur Detektion von Rheumafaktoren zu finden. Aus diesem Grund wurden unterschied­ liche MAKs der Subklasse IgG1 aufgetragen. Dieses HBsAg/Kontroll-Panel wurde mit einer Negativkontrolle, 3 verschiedenen Positivkontrollen, 4 normalen Negativ­ proben und 5 Negativproben mit ansteigenden Rheumafaktoren (RF 1-5) vermes­ sen. Der jeweilige Gehalt der Positivkontrollen an HBsAg und der Gehalt der Rheumafaktorproben an Rheumafaktoren ist in U/ml angegeben. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß Negativproben mit einer Konzentration an Rheumafaktoren < 1000 U/ml den HBsAg-Test deutlich stören und ein falsch positives Ergebnis liefern. 2 der 3 geprüften MAK-Kontrollflächen simulieren die Störung des HBsAg-Tests und liefern ebenfalls deutlich positive Reaktionen mit den 3 hochtitrigen Rheumaseren. Auf diese Weise wird die Teststörung sofort erkannt, so daß ein falschpositives Ergebnis vermieden wird. Am besten ist der MAK "2" geeignet, um die Rheumafaktorstörung anzuzeigen.

Claims (20)

1. Festphase mit mindestens einer begrenzten Testfläche zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin mindestens eine begrenzte Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen umfaßt.

2. Festphase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mehrere Testflächen zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Analy­ ten in einer Probe umfaßt.

3. Festphase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen umfaßt, die durch eine nicht-analytspezifische Bindung von Komponenten des Nachweismediums an die Testfläche hervorgerufen werden.

4. Festphase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen umfaßt, die durch eine nicht-analytspezifische Bindung von Komponenten des Nachweismediums an den Festphasenrezeptor auf einer Testfläche hervorgerufen werden.

5. Festphase nach Anspruch 3 oder 4 dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen umfaßt, die durch eine nicht-analytspezifische Bindung von Komponenten des Nachweismediums an immobilisierte Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene oder/und Nukleinsäuren auf einer Testfläche hervorgerufen wer­ den.

6. Festphase nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrollfläche einen modifizierten Festphasenrezeptor enthält, der sich von einem Festphasenrezeptor auf einer Testfläche durch das Fehlen einer analytspezifischen Bindungsstelle unterscheidet.

7. Festphase nach Anspruch 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen durch Rheumafaktoren umfaßt.

8. Festphase nach Anspruch 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen durch fremdspezies-spezifische Antikörper umfaßt.

9. Festphase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen umfaßt, die durch die unspezifische Bindung von Komponenten des Nach­ weismediums an nicht-analytspezifische Substanzen auf dem Festphasen­ träger hervorgerufen werden.

10. Festphase nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Streptavidin enthaltende Testfläche und minde­ stens eine Kontrollfläche zum Nachweis von Störungen durch nicht-analyt­ spezifische Streptavidin-bindende Komponenten des Nachweismediums um­ faßt.

11. Festphase nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kontrollfläche zum Nachweis des Gesamt-IgE-Gehalts umfaßt.

12. Festphase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin mindestens eine Positiv-Referenzfläche mit dem zu bestimmenden Analyten umfaßt.

13. Festphase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Testflächen und Kontrollflächen jeweils einen Durchmesser von 10 µm bis 1 cm aufweisen.

14. Verwendung einer Festphase nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis eines Analyten in einer Probe.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphase mehrere Testflächen zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Analyten umfaßt.

16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15 in einem Immunoassay.

17. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15 in einem Nukleinsäure-Hybridisie­ rungsassay.

18. Verfahren zum Nachweis eines Analyten unter Verwendung einer Festphase mit mindestens einer begrenzten Testfläche, die weiterhin mindestens eine begrenzte Kontrollfläche zum Nachweis von Störreaktionen umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrollflächen zur quantitativen Korrektur von Störungen ver­ wendet werden.

20. Verwendung von begrenzten Kontrollflächen zur gleichzeitigen Erkennung und gegebenenfalls zur quantitativen Korrektur von Störungen in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten.