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Die Erfindung betrifft ein Mikroskop, welches zur Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie fähig ist (TIRFM-fähiges Mikroskop), sowie ein Verfahren zum Betreiben desselben.
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Bei der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (engl.: total internal reflexion fluorescence microscopy , TIRFM), also Mikroskopie mit TIRF-Beleuchtung, wird eine Fluoreszenz eines Präparats bzw. einer Probe über ein evaneszentes (abklingendes) Feld angeregt. Zur Erzeugung des evaneszenten Feldes wird Licht an der Innenseite eines Reflexionselements, z.B. eines Deckglases, an der Grenzfläche zur Probe totalreflektiert. Dabei wird ausgenutzt, dass Licht, das in einem Medium mit einem höheren Brechungskoeffizienten n
1 unter einem flachen Winkel auf eine Grenzfläche zu einem Medium mit geringerem Brechungskoeffizienten n
2 fällt, totalreflektiert wird, wenn dieser Auftreffwinkel ϑ
1, der von der Normalen zur Grenzfläche gerechnet wird, einen kritischen Winkel
übersteigt. Jenseits der Grenzfläche bildet sich dabei in der Probe auf dem Glas ein senkrecht zur Grenzfläche exponentiell abklingendes Lichtfeld aus, mit einer typischen Eindringtiefe für sichtbares Licht von 100-200 nm. Befinden sich dort fluoreszierende Moleküle, die Licht der eingestrahlten Wellenlänge absorbieren können, so werden diese zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Solches Fluoreszenzlicht wird Totalreflexionsfluoreszenz (engl.: total internal reflection fluorescence, TIRF) genannt. TIRF führt zu einer sehr guten Begrenzung der erzeugten Fluoreszenz auf glasnahe Bereiche, die beobachtete Schicht ist nur 100-200 nm dünn. Dadurch wird eine deutlich bessere Auflösung entlang der optischen Achse erzielt als bei normaler Fluoreszenzmikroskopie oder Konfokalmikroskopie.
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Die meisten TIRFM-fähigen (=TIRF-Mikroskopie-fähigen) Mikroskope verwenden ein Objektiv sowohl zur Beleuchtung als auch zur Sammlung des Fluoreszenzlichts. Dazu muss das Objektiv geeignet sein, die Probe unter Winkeln zu beleuchten, die den kritischen Winkel übersteigen. Daher muss die numerische Apertur NA des Objektivs größer als der Refraktionsindex
n2 des dünneren Mediums sein, also
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Die Position, an der Licht die hintere Fokalebene des Objektivs durchtritt, bestimmt den Winkel, unter dem das Licht durch die Fokalebene des Objektivs tritt, gemäß
wobei r den radialen Abstand des Durchtrittsorts eines Lichtstrahls vom zentralen Strahlengang des optischen Systems in der hinteren Fokalebene des Objektivs beschreibt und f die Brennweite bzw. die Fokallänge des Objektivs. Um ein abklingendes Lichtfeld zu erzeugen, muss der Winkel des Lichts in der Fokalebene den kritischen Winkel übersteigen, die Distanz des Lichtbündels vom Zentrum der hinteren Fokalebene muss dementsprechend einen kritischen Radius r
c übersteigen. TIRFM-fähige Mikroskope sind daher häufig als inverse Lichtmikroskope mit einem Objektiv in Ölimmersion und sehr hoher numerischer Apertur (NA) von 1,45 oder höher ausgebildet. Diese hohe numerische Apertur erlaubt es, flache Einstrahlwinkel zu realisieren, wobei das Anregungslicht am Rand des Objektivs eingekoppelt wird, so dass es unter einem flachen, totalreflektierenden Winkel auf die Grenzfläche zur Probe gelangt.
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Um zu verhindern, dass Licht auch unter Winkeln auf die Grenzfläche tritt, die kleiner als der kritische Winkel sind, unter denen Licht also nicht totalreflektiert wird, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Bei Verwendung einer inkohärenten Lichtquelle, beispielsweise LEDs oder einer Glühbirne, kann in den Strahlengang an einer Stelle, die zur hinteren Fokalebene („back focal plane“, BFP) des Objektivs konjugiert ist, eine ringförmige Blende verwendet werden, die den zentralen Teil des Lichts ausblendet. Eine solche Anordnung ist beispielsweise aus
US 6,597,499 B2 bekannt. Die Verwendung einer solchen Blende hat jedoch zur Folge, dass ein Großteil des von der Lichtquelle ausgesendeten Lichts nicht verwendet wird, was noch dadurch verstärkt wird, dass der von der Mikroskopoptik aufgespannte Phasenraum (Etendue) sehr schlecht mit dem von der Lichtquelle aufgespannten Phasenraum übereinstimmt, so dass teilweise nur ca. 1 % des ausgesandten Lichts überhaupt für die Anregung zur Verfügung steht.
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Eine andere Lösung, die dieses Problem umgeht, ist die Verwendung einer Laserlichtquelle in sogenannten Laser-TIRFMs, die so in den Strahlengang des Mikroskops eingekoppelt wird, dass das von der Laserlichtquelle erzeugte Licht fast vollständig an der Grenzfläche zur Probe ankommt. Diese Lösung ist allerdings teurer und hat optisch die Nachteile, dass das Licht nur ein sehr schmales Spektrum aufweist und durch die Kohärenz des Laserlichts Beugungseffekte und Interferenzeffekte auftreten können, die das Bild stören können.
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Im Fachartikel von A. Kogel et al., „Artifact-free objective-type multicolor total internal reflection fluorescence microscopy with light-emit ting diode light sources“ - Part I, in: Journal of Biophotonics, Vol. 12, Issue 11, 2019, S. 1 - 11, wird ebenfalls ein TIRF-Mikroskop vorgestellt. Als Lichtquelle dienen verschiedenfarbige LEDs, die im Zusammenhang eines „LED-TIRF condensers“ eingesetzt werden. Auch in Schaefer, M., Kalwa, H., „Theoretical background of lightemitting diode total internal reflection fluorescence microscopy and photobleaching lifetime analysis of membrane-associated proteins“ - Part II, in: Journal of Biophotonics, Vol. 13, Issue 4, 2020, S. 1 - 14, wird TIRF-Mikroskopie einer inkohärenten LED-Lichtquelle angewendet. Es wird ein theoretisches Framework für die Konstruktion und Einstellung von LED-TIRF vorgestellt. Ferner offenbart
US 2015/0009315 A1 eine Mikroskopvorrichtung, insbesondere ein Hellfeld-Mikroskop oder ein Phasenkontrast-Mikroskop. Die Verteilung der Lichtintensität wird mittels einer Steuereinheit über ein variables Lichtmodulationselement eingestellt.
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Es ist auf der Grundlage dieses Standes der Technik die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein TIRFM-fähiges Mikroskop und ein Verfahren zum Betreiben desselben zur Verfügung zu stellen, die eine hohe Flexibilität der Messung erlauben.
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Diese Aufgabe wird durch ein Mikroskop, welches zur Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie fähig ist (TIRFM-fähiges Mikroskop) gelöst, umfassend eine erste Lichtquelle, die zur Erzeugung und Aussendung von inkohärentem Anregungslicht auf einen ersten optischen Pfad ausgebildet ist, welcher nacheinander ein erstes projizierendes Linsensystem, eine erste räumliche Filtervorrichtung, ein zweites projizierendes Linsensystem und ein Objektiv umfasst, wobei das erste projizierende Linsensystem ausgebildet ist, das Anregungslicht auf die erste räumliche Filtervorrichtung zu projizieren und die erste räumliche Filtervorrichtung ausgebildet ist, das Anregungslicht mit zweidimensionalen Mustern räumlich zu filtern, wobei die erste räumliche Filtervorrichtung in einer ersten Konfiguration in einer zur hinteren Fokalebene (BFP) des Objektivs konjugierten Ebene (cBFP) liegt, wobei das Objektiv eine Objektivlinse umfasst, die ausgebildet und angeordnet ist, das Anregungslicht auf eine Probe zu lenken und Fluoreszenzlicht von der Probe aufzunehmen, wobei für eine numer ische Apertur NAobj des Objektivs und den Brechungsindex nspec der Probe NAobj >nspec gilt, und wobei eine erste Steuereinheit umfasst und ausgebildet ist, die erste räumliche Filtervorrichtung zur Auswahl
oder Erzeugung verschiedener zweidimensionaler Muster anzusteuern und die Position, Form und/oder Größe eines zweidimensionalen, insbesondere ringförmigen, Musters so auszuwählen oder anzupassen, dass eine TIRF-Beleuchtung der Probe erzeugt wird, wobei das Mikroskop dadurch weitergebildet ist, dass die erste Steuereinheit ausgebildet ist, die erste räumliche Filtervorrichtung anzusteuern,
eine Suchmusterfolge von zweidimensionalen Mustern auf der ersten räumlichen Filtervorrichtung zum Auffinden des Zentrums der hinteren Fokalebene (BFP) des Objektivs zu erzeugen, die jeweils einen einzelnen kleinen Pixelcluster zur Weiterleitung von Anregungslicht auf dem ersten optischen Pfad aufweisen, der innerhalb der Suchmusterfolge über, insbesondere gerade, Suchpfade bewegt wird, um Orte zu vermerken, an denen die Lumineszenz des aus dem Objektiv zurückkommenden Fluoreszenzlichts Maxima aufweisen, und um als Zentrum der hinteren Fokalebene (BFP) des Objektivs das Zentrum eines Kreises zu ermitteln, auf dem die mehreren aufgefundenen Maxima der Lumineszenz liegen.
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Mit dem erfindungsgemäßen TIRFM-fähigen Mikroskop wird die Variante, in der das Objektiv sowohl zum Sammeln als auch zum Beleuchten verwendet wird, weitergebildet. Anstelle einer fixen ringförmigen Blende wird eine variable räumliche Filtervorrichtung verwendet. Eine erfindungsgemäße TIRF-Beleuchtung der Probe erfolgt bei dem erfindungsgemäß eingesetzten inkohärentem Licht durch die Auswahl oder Erzeugung eines ringförmigen zweidimensionalen Musters, bei dem Licht nur innerhalb der so erzeugten oder ausgewählten ringförmigen Blende im optischen Strahlengang verbleibt, während Licht im zentralen Teil des Musters und außerhalb des Rings geblockt wird. Mittels der Einstellung der Dimension des ringförmigen Musters lässt sich unter anderem die Eindringtiefe des abklingenden Feldes in die Probe steuern.
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Ein zweidimensionales Muster, welches eine TIRF-Beleuchtung ermöglicht, muss nicht notwendigerweise ringförmig sein. Es reicht aus, dass der zentrale Teil bis zum kritischen Radius ausgeschlossen ist. Außerhalb dieses zentralen Teils jenseits des kritischen Radius wird jedes Muster zu einer TIRF-Beleuchtung führen. Ein ringförmiges Muster sorgt allerdings für eine vergleichsweise hohe Luminosität und Gleichmäßigkeit der Ausleuchtung.
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In Ausführungsformen ist die Steuereinheit ausgebildet, die erste räumliche Filtervorrichtung anzusteuern, als zweidimensionale Muster ein ringförmiges Muster und ein kreisförmiges Muster bereitzustellen, um zwischen TIRF-Beleuchtung und nicht-TIRF-Beleuchtung umzuschalten. Mit dem kreisförmigen Muster, bei dem Anregungslicht auch innerhalb des kritischen Radius weitergeleitet wird, lässt sich das TIRFM-fähige Mikroskop auch als Epifluoreszenzmikroskop mit sogenannter Epi-Beleuchtung betreiben, welches ebenso wie die TIRF-Beleuchtung durch das Objektiv hindurchtritt. Allerdings erfährt das Epi-Anregungslicht keine Totalreflexion, sondern dringt vollständig durch die Grenzfläche hindurch in die Probe ein. Diese wird so in ihrer gesamten Dicke beleuchtet und zum Fluoreszieren angeregt. Eine größere Lichtausbeute wird so auf Kosten der Ortsauflösung durch Selektion der grenznahen Schicht erreicht.
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Vorzugsweise ist der äußere Radius des ringförmigen Musters kleiner oder gleich einem Maximum der Erstreckung der hinteren Fokalebene des Objektivs und ist der innere Radius des ringförmigen Musters größer oder gleich einem kritischen Radius der hinteren Fokalebene, der dem kritischen Winkel für die interne Totalreflexion in der Fokalebene des Objektivs entspricht. Die Begrenzung des äußeren Radius des ringförmigen Musters sorgt dafür, dass der Anteil des durchgelassenen Lichts innerhalb des Strahlengangs des Mikroskops bleibt und somit keine Störungen durch Lichtstreuung entstehen, während die Begrenzung des inneren Radius des ringförmigen Musters sicherstellt, dass der kritische Radius nicht unterschritten wird. Mit der Einstellung des inneren Radius wird außerdem die Eindringtiefe in die Probe gesteuert.
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In Ausführungsformen des TIRFM-fähigen Mikroskops ist eine zweite räumliche Filtervorrichtung im ersten optischen Pfad in einer zur Fokalebene (FP) des Objektivs konjugierten Ebene (cFP) angeordnet und ausgebildet, das Anregungslicht mit einer Mehrzahl verschiedener zweidimensionaler Muster räumlich zu filtern und ist die erste Steuereinheit oder eine zweite Steuereinheit ausgebildet, die zweite räumliche Filtervorrichtung zur Auswahl oder Erzeugung einer Serie von zweidimensionalen Mustern anzusteuern. Die zweite räumliche Filtervorrichtung ist in einer zur Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene (cFP) angeordnet, so dass ein zweidimensionales Muster der zweiten räumlichen Filtervorrichtung zu einer entsprechenden räumlichen Verteilung des Beleuchtungslichts am Ort des Fokus, also in der Probe bzw. dem Präparat, führt. Mit der Kombination der ersten und der zweiten Filtervorrichtung wird eine TIRF-Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (engl.: total internal reflection fluorescence structured illumination microscopy, TIRF-SIM) ermöglicht. Dabei prägt die erste räumliche Filtervorrichtung dem Anregungslicht in einer zur hinteren Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene ein ringförmiges Muster zur Erzeugung einer TI RF-Beleuchtung auf, während gleichzeitig die zweite räumliche Filtervorrichtung dem Anregungslicht in einer zur Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene eine Sequenz von strukturierten Mustern aufprägt und so den Ort in der Probe bestimmt, der von dem Anregungslicht beleuchtet wird. Auch bei einem TIRF-Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung (TIRF-SIM) handelt es sich um ein TIRFM-fähiges Mikroskop.
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In Ausführungsformen geeigneter variabler räumlicher Filtervorrichtungen ist die erste räumliche Filtervorrichtung als ein programmierbarer räumlicher Lichtmodulator, insbesondere als räumlicher Transmissions-Lichtmodulator oder als räumlicher Reflexions-Lichtmodulator, wobei insbesondere die zweite räumliche Filtervorrichtung als ein programmierbarer räumlicher Transmissions- oder Reflexions-Lichtmodulator ausgebildet ist. Bei einem programmierbaren räumlichen Lichtmodulator (engl.: spatial light modulator, SLM) handelt es sich in einer Ausführungsform um eine in Transmission betriebene LCD-Matrix, deren einzelne Pixel zwischen einem lichtdurchlässigen und einem lichtundurchlässigen Zustand hin- und her geschaltet werden können (Transmissions-SLM), und in einer alternativen Ausführungsform um eine Mikrospiegelmatrixvorrichtung (engl.: digital mirror device, DMD oder Reflexions-SLM), die ein Array bzw. eine Matrix von schwenkbaren Mikrospiegelelementen aufweist. Sowohl die Transmissions-SLM als auch die Reflexions-SLM können gezielt so angesteuert werden, dass sie bestimmte zweidimensionale Muster erzeugen, unter anderem beispielsweise einen Ring mit einem einstellbaren Innenradius und einem einstellbaren Außenradius. Die Tatsache, dass die räumlichen Lichtmodulatoren frei programmierbar sind, ermöglicht es, TIRFM-fähige Mikroskope in einer Vielzahl von Einstellungen flexibel aufzubauen und zu betreiben.
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Ausführungsformen eines TIRFM-fähigen Mikroskops bieten eine Möglichkeit zur Umschaltung zwischen einer TIRF-Beleuchtung und einer ortsselektiven Epi-Beleuchtung, indem das erste projizierende Linsensystemsystem ganz oder teilweise, das zweite projizierende Linsensystemsystem ganz oder teilweise und/oder die erste räumliche Filtervorrichtung so entlang dem ersten optischen Pfad beweglich angeordnet ist oder sind, dass die erste räumliche Filtervorrichtung reversibel aus der ersten Konfiguration in eine zweite Konfiguration verbringbar ist, in welcher die erste räumliche Filtervorrichtung in einer zur Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet ist. Damit entfällt die TIRF-Filterung in der zur hinteren Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene, so dass sich automatisch eine Epi-Beleuchtung einstellt, die von der ersten räumlichen Filtervorrichtung in der zweiten Konfiguration räumlich gefiltert wird.
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Wenn in Ausführungsformen ein drittes projizierendes Linsensystem umfasst ist, das ausgebildet und angeordnet ist, die erste räumliche Filtervorrichtung auf die Fokalebene des Objektivs zu konjugieren, wobei eine Schaltoptik zwischen der ersten räumlichen Filtervorrichtung und dem Objektiv angeordnet ist, die ausgebildet ist, den optischen Pfad zwischen dem zweiten projizierenden Linsensystem und dem dritten projizierenden Linsensystem umzuschalten, so ist eine alternative oder zusätzliche Möglichkeit zur Umschaltung zwischen einer TIRF-Beleuchtung und einer ortsselektiven Epi-Beleuchtung gegeben.
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Die Möglichkeit einer Beleuchtung mit zwei unterschiedlichen Lichtquellen, beispielsweise mit verschieden Farbspektren, ist in Ausführungsformen mit einer als Mikrospiegelmatrix (DMD) ausgebildeten ersten räumlichen Filtervorrichtung gegeben, wenn eine zweite inkohärente Lichtquelle umfasst ist, die zur Erzeugung und Aussendung von inkohärentem Anregungslicht ausgebildet ist, wobei die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle jeweils auf die erste räumliche Filtervorrichtung ausgerichtet sind, die als Mikrospiegelmatrixvorrichtung ausgebildet ist, wobei schwenkbare Mikrospiegelelemente der Mikrospiegelmatrixvorrichtung in einer ersten Schwenkstellung Anregungslicht von der ersten Lichtquelle und in einer zweiten Schwenkstellung Anregungslicht von der zweiten Lichtquelle in den ersten optischen Pfad lenken. So kann durch Ansteuerung des DMD die Lichtquelle ausgewählt werden und zwischen den Lichtquellen umgeschaltet werden. In Weiterbildungen ist für jede der beiden Lichtquellen ein Strahlabsorber vorgesehen, der den Anteil des Lichts von einer Lichtquelle aufnimmt und absorbiert, der nicht in den optischen Strahlengang des Mikroskops weitergeleitet wird.
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In Ausführungsformen umfasst oder umfassen die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle eine LED oder mehrere LEDs, eine Kombination aus einer Glühlampe und einem Lichtleiter oder eine Kombination aus einer Laserlichtquelle und einem dynamischen Diffusor. Bei einem dynamischen Diffusor handelt es sich um einen Diffusor, der mit hochfrequenten Bewegungen bewegt wird, etwa im Ultraschallbereich, und so die Kohärenz des Laserlichts zerstört. So kommt es nicht mehr zu Interferenz- und Beugungserscheinungen, die insbesondere an den Mikrospiegelelementen eines DMD ansonsten stark auftreten könnten.
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Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auch durch ein Verfahren zum Betreiben eines zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Mikroskops, welches zur Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie fähig ist (TIRFM-fähiges Mikroskop) gelöst, in dem eine Suchmusterfolge von zweidimensionalen Mustern auf der ersten räumlichen Filtervorrichtung zum Auffinden des Zentrums der hinteren Fokalebene des Objektivs verwendet wird, die jeweils einen einzelnen kleinen Pixelcluster zur Weiterleitung von Anregungslicht auf dem ersten optischen Pfad aufweisen, der innerhalb der Suchmusterfolge über, insbesondere gerade, Suchpfade bewegt wird, wobei Orte vermerkt werden, an denen die Lumineszenz des aus dem Objektiv zurückkommenden Fluoreszenzlichts Maxima aufweisen, und als Zentrum der hinteren Fokalebene des Objektivs das Zentrum eines Kreises ermittelt wird, auf dem die mehreren aufgefundenen Maxima der Lumineszenz liegen.
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Mit diesem Verfahren ist es möglich, eine Zentrierung vorzunehmen, da die Luminositätsmaxima alle auf einem Kreis liegen, der dem kritischen Winkel für die Totalreflexion entspricht. Bereits die Zentrierung des ringförmigen Blendenmusters auf dieses Zentrum sorgt somit für eine wirksame Zentrierung des Anregungslichts in Bezug auf die räumliche Anordnung des optischen Systems des Mikroskops.
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Vorzugsweise verlaufen mehrere Suchpfade unter verschiedenen Winkeln vom Rand zum Zentrum der ersten räumlichen Filtervorrichtung. Falls die Zentrierung des optischen Systems nahe an einer optimalen Zentrierung liegt, schneiden diese radialen Suchpfade den Kreis des kritischen Radius im Wesentlichen senkrecht, so dass sich die gesuchten Luminositätsmaxima in den Luminositätsverläufen besonders scharf darstellen. Streifende Suchpfadverläufe führen zu einer Verbreiterung der Maxima, die zu einer weniger genauen Zentrierung führen.
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Um die Zentrierung in allen Fällen zu optimieren, wird in Ausführungsformen des Verfahrens eine Abfolge von Suchmustern mit zunehmender Feinheit abgefahren und/oder es wird nach einer initialen Grobbestimmung des Zentrums der hinteren Fokalebene des Objektivs ein Kontroll-Suchmuster abgefahren, bei dem der gefundene Kreis von verschiedenen Richtungen aus radial überstrichen wird, um die Maxima der Luminosität mit maximaler Schärfe zu ermitteln und so eine Feinbestimmung des Zentrums vorzunehmen.
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Das erfindungsgemäße TIRFM-fähige Mikroskop lässt sich in verschiedenen Ausführungsformen zwischen einer TIRF-Beleuchtung und einer nicht-TIRF-Beleuchtung umschalten, in einem TIRF-SIM-Modus betreiben oder zwischen mehreren verschiedenen Lichtquellen umschaltbar betreiben. Es lässt sich auch einrichten, diese Merkmale zu kombinieren und von mehreren Lichtquellen eine in TIRF- und eine andere in Epi-Beleuchtung zu betreiben, indem das Umschalten zwischen den Lichtquellen mit einer Verlagerung der ersten räumlichen Filtervorrichtung aus der ersten Konfiguration in der cBFP-Ebene in die zweite Konfiguration in der cFP-Ebene einhergeht. So kann beispielsweise ein Überblicks-Modus mit breitbandiger Epi-Beleuchtung mit einem Detail-Modus mit schmalbandiger TIRF-Beleuchtung umschaltbar zusammengefasst werden.
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Weitere Merkmale der Erfindung werden aus der Beschreibung erfindungsgemäßer Ausführungsformen zusammen mit den Ansprüchen und den beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Erfindungsgemäße Ausführungsformen können einzelne Merkmale oder eine Kombination mehrerer Merkmale erfüllen.
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Im Rahmen der Erfindung sind Merkmale, die mit „insbesondere“ oder „vorzugsweise“ gekennzeichnet sind, als fakultative Merkmale zu verstehen.
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Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, wobei bezüglich aller im Text nicht näher erläuterten erfindungsgemäßen Einzelheiten ausdrücklich auf die Zeichnungen verwiesen wird. Es zeigen:
- 1 eine schematische Prinzipdarstellung der optischen Gegebenheiten bei einer TIRF-Beleuchtung,
- 2 eine schematische Darstellung der optischen Komponenten eines TIRFM-fähigen Mikroskops in einer ersten Ausführungsform,
- 3 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform mit den optischen Komponenten eines TIRF-SIM-fähigen Mikroskops,
- 4 eine schematische Darstellung des Prinzips der Zentrierung mit einem TIRFM-fähigen Mikroskop,
- 5 eine schematische Darstellung der optischen Komponenten eines TIRFM-fähigen Mikroskops in einer dritten Ausführungsform,
- 6 eine schematische Darstellung der optischen Komponenten eines TIRFM-fähigen Mikroskops in einer vierten Ausführungsform,
- 7 ein Beispiel einer Lumineszenzmessung anhand von Suchpfaden und
- 8 Lumineszenzverläufe entsprechend den Suchpfaden aus 7.
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In den Zeichnungen sind jeweils gleiche oder gleichartige Elemente und/oder Teile mit denselben Bezugsziffern versehen, so dass von einer erneuten Vorstellung jeweils abgesehen wird.
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1 zeigt eine schematische Prinzipdarstellung der optischen Gegebenheiten bei einer TIRF-Beleuchtung. Das Objektiv 101 des Mikroskops, das eine oder mehrere optische Linsen aufweisen kann und zur Ermöglichung von TIRF-Mikroskopie eine große numerische Apertur aufweist, ist als Blackbox dargestellt. Die Ausbreitungsrichtung des Anregungslichts aus einer nicht dargestellten Lichtquelle verläuft von unten nach oben. Das Objektiv 101 weist eine Fokalebene FP und eine hintere Fokalebene BFP auf, die so definiert sind, dass ein paralleles Lichtstrahlenbündel, das von der Rückseite (in 1 unten) auf das Objektiv 101 trifft, in der Fokalebene FP fokussiert, während umgekehrt ein paralleles Lichtstrahlenbündel, das von außen (in 1 oben) auf das Objektiv 101 trifft, in der hinteren Fokalebene BFP fokussiert wird.
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In 1 sind zwei Strahlenbündel 102, 104 dargestellt, die, von der nicht dargestellten Lichtquelle kommend, die hintere Fokalebene BFP an zwei verschiedenen Punkten durchtreten. Das Strahlenbündel 102 verläuft durch das Zentrum der BFP, während das Strahlenbündel 104 an einem peripheren Punkt durchtritt. Beide Strahlenbündel 102, 104 umfassen Strahlen, die die beiden Punkte unter verschiedenen Winkeln durchtreten, sie sind also nicht kollimiert. Die optischen Eigenschaften des Objektivs 101 sind so, dass die Lichtstrahlen des zentralen Strahlenbündels 102 zu einem Strahlenbündel 103 kollimiert werden, das senkrecht aus dem Objektiv 101 austritt. Das periphere Strahlenbündel 103 wird ebenfalls kollimiert, tritt aber unter einem Winkel ϑ(r) als Strahlenbündel 105 aus, welcher von dem Abstand bzw. Radius des Strahlenbündels vom Zentrum der BFP abhängt. Dieser Zusammenhang veranschaulicht, warum bei einer TIRF-Beleuchtung, in der eine Totalreflexion stattfinden soll, nur solche Lichtstrahlen durchgelassen werden, die in der BFP einen Abstand zum Zentrum der BFP haben, der einen kritischen Radius übersteigt.
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Dieses Prinzip wird in realen TIRFM-Optiken daraufhin abgewandelt, dass die Blende für die TIRF-Beleuchtung nicht direkt in die hintere Fokalebene BFP des Objektivs 101 hineinplatziert wird, sondern in eine zur BFP konjugierte Ebene cBFP. Die Platzierung einer ringförmigen Blende mit geeigneten Dimensionen in einer cBFP hat den gleichen Effekt wie die Filterung direkt in der BFP, da eine cBFP durch die nachfolgenden optischen Elemente im Strahlengang in die BFP des Objektivs 101 abgebildet werden.
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2 zeigt eine schematische Darstellung des optischen Systems eines TIRFM-fähigen Mikroskops in einer ersten Ausführungsform. Eine inkohärente Lichtquelle 201 erzeugt Anregungslicht, das über einen Strahlengang zu einem Objektiv 206 geleitet wird, das, wie in 1 gezeigt, über eine vordere und eine hintere Fokalebene, FP und BFP, verfügt. Der Strahlengang umfasst ein erstes projizierendes Linsensystem 202 und ein zweites projizierendes Linsensystem 204 sowie eine Umlenkeinheit 205, die beispielsweise als dichroitischer Spiegel ausgestaltet ist, mittels deren das Anregungslicht aus der Lichtquelle 201 wenigstens zum Teil in das Objektiv 206 gelenkt wird. In einer zur hinteren Fokalebene BFP des Objektivs 206 konjugierten Ebene cBFP zwischen dem ersten projizierenden Linsensystem 202 und dem zweiten projizierenden Linsensystem 204 ist eine erste optische Filtervorrichtung 203 angeordnet, die das Anregungslicht räumlich filtert und ausgebildet ist, verschiedene zweidimensionale Muster zur räumlichen Filterung zur Verfügung stellen zu können. Die Ansteuerung erfolgt mittels einer nicht dargestellten Steuereinheit. Die erste optische Filtervorrichtung 203 kann in diesem Fall als Transmissions-SLM ausgebildet sein, also mittels einer programmierbaren LCD-Matrix, deren Matrixpunkte zwischen einem transparenten und einem intransparenten Zustand schaltbar sind. Die Transmissions-SLM kann zum Beispiel angesteuert werden, eine ringförmige Blende zu erzeugen, deren Innendurchmesser gleich groß wie oder größer als der kritische Radius für Totalreflexion ausgangs des Objektivs 206 ist. Eine solche Einstellung erzeugt eine TI RF-Beleuchtung.
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Das Fluoreszenzlicht, das in einer Probe, die in der Fokalebene FP des Objektivs 206 angeordnet ist, angeregt wird, gelangt durch das Objektiv 206 zurück in das TIRFM-fähige Mikroskop. Es trifft nach Durchgang durch die Umlenkeinheit 205 und eine Tubuslinse 207 auf einen Detektor 208, welcher das Fluoreszenzlicht erfasst und in auswertbare elektrische Signale umwandelt. Die Umlenkeinheit kann ein Strahlteiler sein, aber auch ein dichroitischer Spiegel, dessen Transmissionsverlauf eine Kante zwischen der Wellenlänge des Anregungslichts und der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts aufweist, so dass das Anregungslicht fast vollständig umgelenkt wird, während das Fluoreszenzlicht fast vollständig zum Detektor 208 weitergeleitet wird.
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3 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel eines TIRFM-fähigen Mikroskops, das eine Abwandlung des ersten Ausführungsbeispiels darstellt. Inkohärentes Anregungslicht wird von einer Lichtquelle 301 erzeugt und über ein erstes projizierendes Linsensystem 302, ein zweites projizierendes Linsensystem 304, 306 und eine Umlenkeinheit 307 auf eine Fokalebene FP eines Objektivs 308 gelenkt, während Fluoreszenzlicht wiederum durch das Objektiv 308, die Umlenkeinheit 307 und eine Tubuslinse 309 auf einen Detektor 310 trifft. Im Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel ist allerdings das zweite projizierende Linsensystem 304, 306 zweigeteilt, wobei zwischen dem ersten Teil 304 und dem zweiten Teil 306 des zweiten projizierenden Linsensystems 304, 306 eine zur Fokalebene FP des Objektivs 308 konjugierte Ebene cFP vorhanden ist. In dieser cFP ist eine zweite räumliche Filtervorrichtung 305 angeordnet, die ebenfalls programmierbar ist.
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Da die erste räumliche Filtervorrichtung 303 in der cBFP angeordnet ist, kann dort eine ringförmige Blende und somit eine TIRF-Beleuchtung erzeugt werden. Die zweite räumliche Filtervorrichtung in der cFP selektiert, welcher Bereich der Fokalebene FP beleuchtet wird. Auf diese Weise wird eine TIRF-Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (TIRF-SIM) eingerichtet.
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Ein Anwendungsbeispiel für den Betrieb eines TIRFM-fähigen Mikroskops ist in 4 schematisch dargestellt. Auf der linken Seite der 4 ist die Oberfläche einer Mikrospiegelmatrixvorrichtung (DMD) als Beispiel einer ersten räumlichen Filtervorrichtung 401 dargestellt, die in einer zur hinteren Fokalebene BFP eines Objektivs konjugierten Ebene cBFP angeordnet ist. Anstelle einer DMD kann auch eine Transmissions-SLM eingesetzt werden. Dieser Ebene überlagert ist ein Kreis, der dem kritischen Winkel für die Totalreflexion am Ort einer Probe vor dem Objektiv entspricht und auf einem Zentrum der cBFP zentriert ist. Ebenfalls gezeigt sind Pixelcluster 402, die auf drei Suchpfaden angeordnet sind, unter Winkeln von 120° zueinander vom Rand der Mikrospiegelmatrixvorrichtung zum Zentrum verlaufen und teilweise außerhalb, teilweise innerhalb des kritischen Radius angeordnet sind. Die Pixelcluster 402 sind mit verschiedenen Texturen kenntlich gemacht, die sich in dem Intensitätsverlauf wiederfinden, der in 4 auf der rechten Seite dargestellt ist. Dort ist erkennbar, dass die Intensität bzw. Luminosität l des angeregten Fluoreszenzlichts innerhalb des kritischen Radius r einen wenig veränderlichen Betrag aufweist. Bei Annäherung an den kritischen Radius bzw. den kritischen Winkel steigt die Luminosität stark an, um außerhalb des kritischen Radius stark abzufallen und schließlich zu verschwinden.
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Die Lage des Zentrums des kritischen Winkels lässt sich also durch Messung der Maxima der Luminosität des Fluoreszenzlichts bezüglich der verschiedenen Suchpfade und die Berechnung des Mittelpunkts des Kreises ermitteln, der durch die Pixelcluster mit den maximalen Luminosität verläuft.
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Für diese Zentrierung ist keine strukturierte Beleuchtung gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel in 3 notwendig, sondern die Strukturierung erfolgt in einer zur hinteren Fokalebene BFP des Objektivs konjugierten Ebene. Jeder Pixelcluster lässt ein nicht kollimiertes Strahlenbündel durch, welches beim Durchtritt durch die Fokalebene FP des Objektivs einem kollimierten Strahlenbündel entspricht, das unter einem bestimmten Winkel und in einer bestimmten Richtung durch die Grenzfläche zwischen Probenhalter und Probe tritt (vgl. 1) und abhängig vom Durchtrittswinkel total reflektiert wird oder auch nicht.
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In 5 sind die optischen Komponenten eines TIRFM-fähigen Mikroskops in einer dritten Ausführungsform schematisch gezeigt. In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Mikroskop zwei verschiedene inkohärente Lichtquellen 501 a, 501 b, die unterschiedliche Spektren erzeugen können, und jeweils über eigene erste projizierende Linsensysteme 502a, 502b auf eine als Mikrospiegelmatrixvorrichtung ausgebildete erste räumliche Filtervorrichtung 504 gerichtet sind, die in einer zur hinteren Fokalebene BFP eines Objektivs 507 konjugierten Ebene cBFP angeordnet ist. Die weiteren Komponenten 505, 506, 507, 508, 509 entsprechen den Komponenten 204, 205, 206, 207 und 208 aus dem ersten Ausführungsbeispiel. Zu deren Funktionsweise wird auf die Beschreibung zum ersten und zum zweiten Ausführungsbeispiel verwiesen.
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Der Umschaltvorgang zwischen der ersten Lichtquelle 501a und der zweiten Lichtquelle 501b wird im Folgenden beschrieben. Die Mikrospiegelelemente der ersten räumlichen Filtervorrichtung 504 sind zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position schwenkbar. Wenn Anregungslicht aus der ersten Lichtquelle 501a verwendet werden soll, werden die für die Erzeugung einer TIRF-Beleuchtung benötigten Mikrospiegelelemente in eine erste Position geschwenkt, in der Anregungslicht von der ersten Lichtquelle zum zweiten projizierenden Linsensystem reflektiert wird. Die übrigen Mikrospiegelelemente werden in eine zweite Position geschwenkt, und das Anregungslicht aus der ersten Lichtquelle 501a wird in einen Strahlungsabsorber 503a (engl.: beam dump) geleitet. Dies ermöglicht einen sehr hohen Kontrast. Auch der zweiten Lichtquelle 501 b ist ein Strahlungsabsorber 503b zugeordnet. Die Lichtquellen 501 a, 501b und die Strahlungsabsorber 503a, 503b sind symmetrisch zum weiteren Strahlengang angeordnet, so dass zum Umschalten von einer Lichtquelle zur anderen einfach die Schwenkstellung aller Mikrospiegelelemente invertiert werden muss und die erste Lichtquelle 501 a ausgeschaltet und die zweite Lichtquelle 501b eingeschaltet werden muss.
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Für eine Epi-Beleuchtung können auch beide Lichtquellen 501a, 501b angelassen werden, und es werden zum Umschalten sämtliche Mikrospiegelelemente der ersten räumlichen Filtervorrichtung 504 in eine erste bzw. eine zweite Schwenkposition gebracht.
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6 zeigt schematisch die optischen Komponenten eines TIRFM-fähigen Mikroskops in einer vierten Ausführungsform. Die Lichtquelle 601, das erste projizierende Linsensystem 602, das zweigeteilte zweite projizierende Linsensystem 604, 606, die Umlenkeinheit 607, das Objektiv 608, die Tubuslinse 609 und der Detektor 610 sowie eine zweite räumliche Filtervorrichtung 605 in der zur Fokalebene FP des Objektivs 608 konjugierten Ebene cFP zwischen den beiden Teilen 604, 606 des zweiten projizierenden Linsensystems entsprechen der Anordnung und den Komponenten der zweiten Ausführungsform in 3. Anstelle eines programmierbaren Transmissions-SLMs ist in der vierten Ausführungsform eine Blendenwechseleinrichtung 603 vorgesehen, beispielsweise in Form eines Blendenrings, welche eine Vielzahl verschiedener Blendenformen und -größen zur Verfügung stellt. Diese können Ringblenden und kreisförmige Blenden verschiedener Größen beinhalten, so dass sowohl eine Epi-Beleuchtung als auch eine TIRF-Beleuchtung für verschiedene Beträge kritischer Winkel eingestellt werden kann.
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Die 7 und 8 zeigen Beispiele für eine Zentrierung nach einem erfindungsgemäßen Verfahren. Dies erfordert eine Anordnung nach der ersten, zweiten oder dritten Ausführungsform, also eine programmierbare räumliche Filtervorrichtung am Ort einer cBFP-Ebene. In 7 ist die x-y-Position auf der Oberfläche einer räumlichen Filtervorrichtung, in diesem Fall einer Reflexions-SLM bzw. DMD, dargestellt. Es sind sechs Suchpfade im Abstand von jeweils 60° zueinander dargestellt, die jeweils vom Rand aus geradlinig auf das Zentrum der DMD bei x = 0 mm und y = 0 mm zulaufen. Entlang jedes dieser Suchpfade wird jeweils ein kleiner kreisförmiger Bereich zum Weiterleiten des Anregungslichts freigeschaltet und das Anregungslicht im Rest der Fläche blockiert. Der freigeschaltete kleine Bereich wird entlang der sechs Suchpfade geführt und die Luminosität des zurückkommenden Fluoreszenslichts gemessen. Die gemessene Luminosität ist als Helligkeit aufgetragen, wobei Schwarz ein verschwindendes Signal bedeutet und Weiß ein starkes Signal. Die entsprechenden Verläufe entlang der einzelnen Suchpfade in radialer Richtung vom Zentrum der DMD sind in 8 gegen den Abstand zum Zentrum aufgetragen.
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Es zeigt sich, dass auf jedem der Suchpfade jeweils ein Luminositätsmaximum gefunden wird, allerdings ist der Abstand des jeweiligen Orts mit einem Luminositätsmaximum vom Zentrum abhängig vom Winkel des Suchpfades. Die Maxima liegen auf einem Kreis, der den kritischen Radius und das Zentrum der hinteren Fokalebene beschreibt. Diese Werte können zur Zentrierung und zur Ermittlung des Innradius eines geeigneten ringförmigen Musters für eine TIRF-Beleuchtung verwendet werden. Ein zweiter Suchlauf kann so durchgeführt werden, dass die Suchpfade auf das Zentrum des so gefundenen Kreises zulaufen. Dies hat den Vorteil, dass die Maxima besser definiert sind als in 8 und jeweils ähnlich scharf sind wie das Maximum der mit 105° bezeichneten Kurve in 8. Damit wird eine optimale Auflösung und Zentrierung erreicht.
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Alle genannten Merkmale, auch die den Zeichnungen allein zu entnehmenden sowie auch einzelne Merkmale, die in Kombination mit anderen Merkmalen offenbart sind, werden allein und in Kombination als erfindungswesentlich angesehen. Erfindungsgemäße Ausführungsformen können durch einzelne Merkmale oder eine Kombination mehrerer Merkmale erfüllt sein.
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Bezugszeichenliste
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- 101
- Objektiv
- 102
- Strahlenbündel
- 103
- kollimiertes Strahlenbündel
- 104
- Strahlenbündel
- 105
- kollimiertes Strahlenbündel
- 201
- Lichtquelle
- 202
- erstes projizierendes Linsensystem
- 203
- erste räumliche Filtervorrichtung
- 204
- zweites projizierendes Linsensystem
- 205
- Umlenkeinheit
- 206
- Objektiv
- 207
- Tubuslinse
- 208
- Detektor
- 301
- Lichtquelle
- 302
- erstes projizierendes Linsensystem
- 303
- erste räumliche Filtervorrichtung
- 304
- vorderer Teil eines zweiten projizierenden Linsensystems
- 305
- zweite räumliche Filtervorrichtung
- 306
- hinterer Teil eines zweiten projizierenden Linsensystems
- 307
- Umlenkeinheit
- 308
- Objektiv
- 309
- Tubuslinse
- 310
- Detektor
- 401
- erste räumliche Filtervorrichtung
- 402
- Pixelcluster auf Suchpfad
- 501a
- erste Lichtquelle
- 501b
- zweite Lichtquelle
- 502a
- erstes projizierendes Linsensystem
- 502b
- drittes projizierendes Linsensystem
- 503a
- erster Strahlabsorber
- 503b
- zweiter Strahlabsorber
- 504
- erste räumliche Filtervorrichtung
- 505
- zweites projizierendes Linsensystem
- 506
- Umlenkeinheit
- 507
- Objektiv
- 508
- Tubuslinse
- 509
- Detektor
- 601
- Lichtquelle
- 602
- erstes projizierendes Linsensystem
- 603
- Blendenwechseleinrichtung
- 604
- vorderer Teil eines zweiten projizierenden Linsensystems
- 605
- zweite räumliche Filtervorrichtung
- 606
- hinterer Teil eines zweiten projizierenden Linsensystems
- 607
- Umlenkeinheit
- 608
- Objektiv
- 609
- Tubuslinse
- 610
- Detektor
- BFP
- hintere Fokalebene
- FP
- Fokalebene
- cBFP
- zur hinteren Fokalebene konjugierte Ebene
- cFP
- zur Fokalebene konjugierte Ebene
- r
- Radius Luminosität
