JP6396137B2 - 顕微鏡照明装置、顕微鏡照明方法および顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡照明装置、顕微鏡照明方法および顕微鏡に関するものである。

従来、カバーガラスの表面直近の極薄い範囲の標本を観察する技術としてエバネッセント照明を利用した顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
エバネッセント照明は、液浸対物レンズの後ろ側焦点位置においてレンズ辺縁部に集光したレーザ光を液浸対物レンズに入射させ、液浸対物レンズによって略平行光となったレーザ光をカバーガラスと液体との界面において全反射させることにより、カバーガラス側にエバネッセント光を染み出させる照明方法である。カバーガラスの表面直近の極薄い範囲の標本を高コントラストで観察できる一般的な顕鏡手法であるが、１方向から照明する全反射照明では偏った蛍光情報しか得られないという問題がある。

そこで、カバーガラスへのレーザ光の入射方向を液浸対物レンズの軸線回りに回転させ、時間平均化された画像を取得することにより、偏射照明による画像中の陰影の形成やスペックルノイズを抑制する手法が示されている（例えば、特許文献２参照。）。

特開２００１−２７２６０６号公報 特開２００３−１３１１４１号公報

しかしながら、視野範囲を広げるために液浸対物レンズの後ろ側焦点位置に入射するレーザ光のＮＡを増大させる場合には、当該後ろ側焦点位置におけるレーザ光のエネルギ密度が極めて高くなり、液浸対物レンズが熱によって損傷するという不都合がある。すなわち、レーザ光のＮＡを増大させて照野を広げると、後ろ側焦点位置に形成されるレーザ光のスポット径が小さくなるうえに、広がった照野の明るさを広がる前と同等にするためには、その分、高いエネルギのレーザ光を入射させる必要があり、後ろ側焦点位置におけるレーザ光のエネルギ密度は相乗的に増加してしまうという不都合がある。さらに、時間平均化が必要なため、高速で撮影することができず、ガルバノミラーやモーターなどの振動により、被写体ズレが生じてしまう欠点がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光を集光させてケーラー照明を行うレンズの熱による損傷を防止しつつ視野範囲を拡大することができ、さらにスペックルノイズを生じることなく標本を照明することができる顕微鏡照明装置、顕微鏡照明方法および顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源から発せられたレーザ光を入射させ、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換して出射させる光変換部と、該光変換部から出射されたレーザ光を前記入射光軸に平行な方向に偏向する、パワーを有しない光学素子と、前記光変換部から出射されたレーザ光を前記入射光軸の延長軸線回りに回転させる回転機構とを備え、前記光学素子から出射されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる顕微鏡照明装置を提供する。

本態様によれば、光源から発せられたレーザ光が光変換部に入射されると、レーザ光は光変換部において円錐面上に分布する主光軸を有しかつ該主光軸に沿って集光するＮＡを有するレーザ光に変換される。光変換部から出射されたレーザ光は光学素子を通過することにより偏向されて入射光軸に平行な円筒面上に主光軸を分布させたＮＡを有するレーザ光となる。

そして、このようなレーザ光が集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光されることにより、集光レンズによって集光されたレーザ光はケーラー照明として標本を照明する。この場合において、集光レンズに入射するレーザ光は集光レンズの光軸を中心として周方向に主光軸を分布させているので、周方向の複数方向から同時に標本に射入射されて標本を照明する。

したがって、偏射照明による問題は解消されるとともに、集光レンズの瞳位置におけるレーザ光の集光位置が分散されているので、レーザ光のＮＡを大きくしかつ大きなエネルギのレーザ光を導入しても、集光位置におけるエネルギ密度が過大とはならず、集光レンズを健全な状態に維持することができる。さらに、時間平均化を必要としないため、高速での撮像が可能かつ、振動原を有しないので被写体ブレも生じない。

また、光学素子はパワーを有しないので、光学素子の通過前後においてレーザ光のＮＡは変化無く保存される。すなわち、入射光軸に対して所定の角度をなして広がる途中の光軸上のどの位置に光学素子を配置するかによって、光学素子から出射されるレーザ光の主光軸が配置される円筒面の径寸法が変化し、集光レンズによって標本に入射されるケーラー照明の角度を連続的に変化させることができ、対物レンズや標本、観察条件に最適な照明状態を提供できる。そして、この場合においてもレーザ光のＮＡが変化しないので、ケーラー照明の光束径を一定に維持し、照野における明るさを一定に維持することができる。

さらに、集光レンズに入射するレーザ光を回転機構によって円筒面上において周方向に回転させると、集光レンズから標本へ照射されるレーザ光も、集光レンズの光軸回りに回転する。集光レンズから標本へ照射されるレーザ光の分割数が少なく、図５（ａ），（ｂ）に示されるような、レーザ光の干渉性に起因するスペックルノイズがレーザ光に含まれている場合には、該スペックルノイズもレーザ光の照明領域内において回転し、スペックルノイズに起因する明暗が照明領域において時間的に平均化されて視認されない程度まで低減される。これにより、実質的にスペックルノイズを生じることなく標本を照明することができる。

上記態様においては、前記光変換部が、レーザ光を偏向しかつＮＡを付与する回折格子であってもよい。
このようにすることで、単一の回折格子により、簡易に集光レンズの瞳位置におけるレーザ光のエネルギ密度を分散させ、ケーラー照明を行う集光レンズの損傷を防止しつつ視野範囲を拡大することができる。

また、上記態様においては、前記光変換部が、レーザ光にＮＡを付与する正のパワーを有するレンズと、レーザ光を偏向する回折格子とを備えていてもよい。
このようにすることで、回折格子の機能を単純化して簡易なものにすることができる。レンズによってＮＡを付与した後のレーザ光を回折格子によって偏向させてもよいし、逆でもよい。

また、上記態様においては、前記回転機構が、前記回折格子を、前記入射光軸に平行な回転軸線回りに回転させてもよい。
このようにすることで、回折格子の回転に伴って、回折格子から射出されるレーザ光を入射光軸の延長軸線回りに回転させることができる。ここで、回折格子から出射されるレーザ光の主光軸の位置および方向は、回折格子自身の中心軸と、回転機構による回折格子の回転軸線と、入射光軸との相対位置関係に依存しない。すなわち、回折格子は、光源からのレーザ光が入射する位置に配置されていればよく、周辺の光学素子に対する回折格子の精密なアライメントは不要である。さらに、回折格子は小さな板状の部材であるため、毎分１００００回転以上の高速の回転速度においても安定した回転が可能である。

また、上記態様においては、前記回転機構は、前記レーザ光の照射によって前記標本から発せられる観察光を撮影する撮像素子の露光時間をＴ秒としたときに、毎秒１／Ｔ回転以上の回転速度で前記光変換部を回転させることが好ましい。
このようにすることで、撮像素子が１フレーム分の観察光を露光している間に、標本を照明するレーザ光が１回転（３６０°）以上回転することによって、レーザ光の照明領域全体にわたって照度分布が時間的に平均化される。これにより、均一な照度分布を有するレーザ光によって標本を照明したときと同等の、スペックルノイズを含まない画像を撮像素子によって取得することができる。

また、上記態様においては、前記光変換部が、前記円錐面上に全周にわたって連続的に分布するレーザ光に変換してもよい。
このようにすることで、集光レンズの瞳位置に集光するレーザ光のエネルギ密度を最も低くすることができ、広く明るい視野範囲を確保することができる。

また、上記態様においては、前記光学素子が、前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動可能に設けられていてもよい。
このようにすることで、集光レンズの瞳位置へのレーザ光の径方向の入射位置を変化させ、集光レンズによる標本へのケーラー照明の入射角度を連続的に調節することができる。この場合に、入射角度を変化させても照野の明るさを一定に維持することができる。

また、本発明の他の態様は、光源から発せられたレーザ光を、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換する第１のステップと、該第１のステップにおいて変換されたレーザ光を、パワーを有しない光学素子によって前記入射光軸に平行な方向に偏向する第２のステップと、該第２のステップにおいて偏向されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる第３のステップと、前記光学素子を前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動させる第４のステップと、前記第３のステップにおいて前記集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させるレーザ光を前記入射光軸の延長軸線回りに回転させる第５のステップとを含む顕微鏡照明方法を提供する。

また、本発明の他の態様は、標本を搭載するステージと、該ステージに搭載された標本に対向して配置される集光レンズと、該集光レンズにレーザ光を入射させる上記いずれかに記載の顕微鏡照明装置とを備える顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光を集光させてケーラー照明を行うレンズの熱による損傷を防止しつつ視野範囲を拡大することができ、さらにスペックルノイズを生じることなく標本を照明することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡の構成を示す模式図である。 図１の顕微鏡において、矢視Ａ−Ａの（ａ）レーザ光の集光パターンの一例、（ｂ）他の例をそれぞれ示す図である。 図１の顕微鏡においてアキシコンレンズを光軸方向に移動させた場合の光束の形状の変化を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る顕微鏡照明方法を説明するフローチャートである。 （ａ）〜（ｄ）図１の顕微鏡において、矢視Ａ−Ａにおけるレーザ光の集光パターン（上段）と、カバーガラスの底面におけるレーザ光の照明領域に発生するスペックルノイズとを示す模式図である。 図１の顕微鏡において、回折格子の位置と、該回折格子から出射されるレーザ光との関係を説明する模式図である。 図１の顕微鏡の（ａ）本実施形態に係る顕微鏡照明装置、（ｂ）変形例に係る顕微鏡照明装置をそれぞれ示す模式図である。 図１の顕微鏡の他の変形例に係る顕微鏡照明装置を示す模式図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡照明装置４、顕微鏡１および顕微鏡照明方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、標本Ｓを搭載するステージ２と、該ステージ２の下方に近接して上向きに配置された液浸対物レンズ（集光レンズ）３と、該液浸対物レンズ３を介して標本Ｓにレーザ光を照射させる顕微鏡照明装置４とを備えている。

標本ＳはカバーガラスＧに載せた状態でステージ２に搭載されている。ステージ２には開口部２ａが設けられ、液浸対物レンズ３によって集光されたレーザ光が開口部２ａを介してステージ２上のカバーガラスＧ越しに標本Ｓに下方から照射されるようになっている。

液浸対物レンズ３は、図中、単一のレンズによって表示しているが、実際には多数のレンズを組み合わせて構成されている。液浸対物レンズ３の最先端のレンズの上面３ａとカバーガラスＧとの隙間には、純水等の液体Ｂが注入され、表面張力によって隙間内に保持されるようになっている。

本実施形態に係る顕微鏡照明装置４は、光ファイバ５によって導光されてきた光源からのレーザ光Ｌ１を集光して略平行光からなるレーザ光Ｌ２に変換するコリメートレンズ６と、該コリメートレンズ６によって略平行光に変換されたレーザ光Ｌ２を透過させる際に回折させる回折格子７と、該回折格子７から出射されたレーザ光Ｌ３を偏向する、パワーを有しないアキシコンレンズ８とを備えている。
図中、符号９，１０は、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐをリレーするリレーレンズ、符号１１は絞り、符号１２はミラー、符号１８は撮像素子である。

回折格子７は、略平行光からなるレーザ光Ｌ２を入射させ、透過させる際に、図１に示されるように、その入射光軸Ｘに対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有するレーザ光Ｌ３に変換して出射させるようになっている。すなわち、回折格子７によって回折されたレーザ光Ｌ３は、図２（ａ）に示されるように、その集光位置において、周方向に連続する円環状のパターンＣを有して集光するようになっている。

なお、本実施形態においては、回折格子７において、図２（ａ）に示されるように、周方向に連続するパターンＣで集光するレーザ光Ｌ３に変換することにしたが、連続していることは必ずしも必要ではなく、図２（ｂ）に示されるように周方向に間隔をあけて多数の位置に集光するパターンＣ’のレーザ光Ｌ３に変換してもよい。スポットの個数は２以上の任意の個数でよく、多ければ多いほど効果的である。

アキシコンレンズ８は、入射端側にテーパ面８ａを有している。テーパ面８ａの傾斜角度は、回折格子７から出射されたレーザ光Ｌ３の主光軸を回折格子７への入射光軸Ｘに平行な方向に偏向する角度に設定されている。アキシコンレンズ８はパワーを有していないので、アキシコンレンズ８を通過する前後においてレーザ光Ｌ３，Ｌ４のＮＡは変化しない。

回折格子７およびアキシコンレンズ８は、アキシコンレンズ８から出射されたレーザ光Ｌ４の集光位置が、リレーレンズ９，１０を構成する後ろ側のレンズ９の後ろ側焦点位置Ｑに一致するように配置されている。すなわち、アキシコンレンズ８から出射されたレーザ光Ｌ４は液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐと光学的に共役な位置Ｑに集光されるようになっている。

また、アキシコンレンズ８は、回折格子７へのレーザ光Ｌ２の入射光軸Ｘに沿う方向に移動可能に設けられている。この方向にアキシコンレンズ８を移動させると、図３に示されるように、回折格子７から出射されたレーザ光Ｌ３のアキシコンレンズ８のテーパ面８ａへの入射位置が径方向に変化する結果、レーザ光Ｌ４の集光位置におけるパターンの径寸法が変化するようになっている。図３に示す例では、アキシコンレンズ８を回折格子７に近接する方向に移動させることで、レーザ光Ｌ４の集光位置Ｑにおける円形パターンの径寸法を小さくするようになっている。

さらに、顕微鏡照明装置４は、回折格子７をレーザ光Ｌ２の入射光軸Ｘに平行な回転軸線Ｙ回りに回転させる回転機構１７を備えている。図１において、回転軸線Ｙは入射光軸Ｘと一致しているが、後で説明するように、回転軸線Ｙは入射光軸Ｘに対して偏心していてもよい。回転機構１７は、例えば、中空モータである。中空モータは、回折格子７の外側に取り付けられ、回折格子７が回転軸線Ｙ回りに回転可能となるように、回折格子７の外周面を支持する。あるいは、回転機構１７は、モータと、該モータから出力される回転力を回折格子７に伝達するギヤの組み合わせとから構成されていてもよい。

回転機構１７によって回折格子７が回転させられると、回折格子７から出射されるレーザ光Ｌ３の主光軸は、入射光軸Ｘ上に頂点が位置し入射光軸Ｘの延長軸線に対して対称な円錐面に沿って入射光軸Ｘの延長軸線回りに回転し、アキシコンレンズ８から出射されるレーザ光４の主光軸も、入射光軸Ｘの延長軸線を中心とする円筒面に沿って前記延長軸線回りに回転する。その結果、後述するように、液浸対物レンズ３からカバーガラスＧへ向かって出射される、円錐面上に分布するレーザ光Ｌ５が、前記円錐面に沿って液浸対物レンズ３の光軸Ｚ回りに回転するようになっている。

回転機構１７による回折格子７の回転速度は、撮像素子１８の露光時間Ｔ（秒）に応じて決定され、毎秒１／Ｔ回転（１／Ｔｒｐｓ）以上の高速に設定される。例えば、撮像素子１８の露光時間Ｔが１／６０秒（フレームレートが６０ｆｐｍ）である場合、回折格子７の回転速度は、６０ｒｐｓ以上に設定される。

さらに、観察対象が生体反応のような高速の現象である場合には、回折格子７の回転速度は、１００００ｒｐｍ以上であることが好ましい。生体反応の速度は、速いものでは数ミリ秒である。このような生体反応を観察するためには、撮像素子１８の露光時間Ｔを生体反応の速度と同程度にまで短縮する必要があり、撮像素子１８の露光時間Ｔの短縮に伴って回折格子７の回転速度も高める必要がある。例えば、数ミリ秒規模の生体反応を観察するために撮像素子１８の露光時間Ｔが１０ミリ秒に設定されている場合には、回折格子７の回転速度は１００００ｒｐｍに設定される。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡照明装置４および顕微鏡１を用いた顕微鏡照明方法について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて標本Ｓの観察を行うには、カバーガラスＧに載せた標本Ｓをステージ２に搭載し、光源からのレーザ光Ｌ１を光ファイバ５の出射端から出射させる。

本実施形態に係る顕微鏡照明方法は、図４に示されるように、光ファイバ５の出射端から出射されコリメートレンズ６によって略平行光に変換されたレーザ光Ｌ２を、回折格子７によってその入射光軸Ｘを中心として広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有するレーザ光Ｌ３に変換する第１のステップＳ１と、該第１のステップＳ１において変換されたレーザ光Ｌ３を、パワーを有しないアキシコンレンズ８によって入射光軸に平行な方向に偏向する第２のステップＳ２と、該第２のステップＳ２において偏向されたレーザ光Ｌ４を、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐと共役な位置Ｑに集光させる第３のステップＳ３と、アキシコンレンズ８を入射光軸方向に沿って移動させる第４のステップＳ４と、回折格子７の回転によって、位置Ｑに集光するレーザ光Ｌ４を入射光軸Ｘの延長軸線回りに高速で回転させる第５のステップＳ５とを含んでいる。

光ファイバ５の出射端から出射されたレーザ光Ｌ１は、コリメートレンズ６によって略平行光からなるレーザ光Ｌ２に変換された後に、第１のステップＳ１において回折格子７に入射させられる。レーザ光Ｌ２は回折格子７において回折されることにより、入射光軸Ｘを中心とした円錐面上に延びる主光軸を有する円環状のパターンを有しかつ、所定のＮＡによって集光するレーザ光ｌ３に変換される。レーザ光Ｌ３は、その後、第２のステップＳ２においてアキシコンレンズ８を透過させられることにより、入射光軸Ｘに平行な方向に主光軸が偏向されて、入射光軸Ｘを中心とした円筒面上に延びる主光軸を有する円環状のパターンを有するレーザ光Ｌ４となって、第３のステップＳ３においてリレーレンズ９の後ろ側焦点位置Ｑに集光される。

集光されたレーザ光Ｌ４はリレーレンズ９，１０によってリレーされ、ミラー１２によって９０°偏向されて液浸対物レンズ３の後ろ側焦点位置である瞳位置Ｐに集光される。これにより、液浸対物レンズ３によって集光されたレーザ光Ｌ５は、平行光となって液体Ｂ内を伝播し、液浸対物レンズ３の全周方向からカバーガラスＧの底面に斜入射される。レーザ光Ｌ５の入射角度が臨界角度を超えて浅くなっている場合にはレーザ光Ｌ５はカバーガラスＧと液体Ｂとの界面において全反射し、エバネッセント光がカバーガラスＧを通過してカバーガラスＧの上面に接着している標本Ｓの接着面近傍の極薄い領域を照明する。

ここで、第５のステップＳ５において回折格子７を高速で回転させながら、前述のステップＳ１からステップＳ３を行うことによって、ステップＳ３において、レーザ光Ｌ４を入射光軸Ｘの延長軸線回りに回転させながら位置Ｑに集光させる。これにより、レーザ光Ｌ５は、液浸対物レンズ３の光軸Ｚ回りに回転しながら、液浸対物レンズ３からカバーガラスＧへ斜入射される。

エバネッセント光が照射された結果、標本Ｓの接着面近傍において発生した蛍光（観察光）Ｌｆが、液浸対物レンズ３によって集光される。ミラー１２は、レーザ光Ｌ４，Ｌ５を反射する一方、蛍光Ｌｆを透過させるダイクロイックミラーである。液浸対物レンズ３によって集光された蛍光Ｌｆは、ミラー１２によってレーザ光Ｌ５から分離され、レンズ１９によって撮像素子１８の撮像面上に集光され、撮像素子１８によって撮影されることにより、蛍光画像を得ることができる。
この場合において、本実施形態に係る顕微鏡照明装置４によれば、回折格子７によってレーザ光Ｌ４を輪帯状に分散させているので、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐにおけるレーザ光Ｌ４が一点に集中することなく、全周にわたって分散される。

これにより、視野範囲を増大させるために、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐに入射させるレーザ光Ｌ４のＮＡを増大させることで、瞳位置Ｐにおけるスポット径が縮小されても、さらに、広がった照野の明るさを維持するためにレーザ光Ｌ１のエネルギが増大させられても、瞳位置Ｐにおけるレーザ光Ｌ４のエネルギ密度が過度に高くなることが防止され、液浸対物レンズ３の熱による損傷を防止することができるという利点がある。

また、本実施形態に係る顕微鏡照明装置４および顕微鏡１によれば、第４のステップＳ４においてアキシコンレンズ８をその光軸方向に連続的に移動させることにより、リレーレンズ９の後ろ側焦点位置Ｑにおいて集光させられるレーザ光Ｌ４のパターンの径を連続的に変化させることができる。その結果、図３に示されるように、液浸対物レンズ３から標本Ｓに向けて出射されるレーザ光Ｌ５の傾斜角度を連続的に変化させることができる。傾斜角度を変化させることで、エバネッセント光の標本Ｓ側への染み出し量を連続的に調節することができる。

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡照明装置４によれば、アキシコンレンズ８がパワーを有していないので、光軸方向に移動させても透過するレーザ光Ｌ４の集光位置を光軸方向に変化させずに済み、また、レーザ光Ｌ４のＮＡも変化させずに済むという利点がある。
すなわち、集光位置を変化させないので、エバネッセント光の染み出し量を調節するためにアキシコンレンズ８を光軸方向に移動させても、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐにレーザ光Ｌ４を精度よく集光させ続けて、ケーラー照明を持続することができる。また、ＮＡを変化させないので、エバネッセント光の染み出し量を調節しても照野の広さと明るさを維持することができるという利点がある。

さらに、本実施形態に係る顕微鏡照明装置４および顕微鏡１によれば、回転機構１７によって回折格子７を高速で回転させながら、レーザ光Ｌ５による標本Ｓの照明と、撮像素子１８による蛍光Ｌｆの撮影とを行うことによって、スペックルノイズを含まない蛍光画像を撮像素子１８によって取得することができるという利点がある。

すなわち、レーザ光Ｌ１〜Ｌ４が通過するレンズ表面の汚れに起因して、レーザ光Ｌ５には、図５（ａ）に示されるように、局所的な干渉模様が含まれることがある。さらに、レーザ光Ｌ３〜Ｌ５が、図２（ｂ）に示されるような、周方向に間隔を空けた複数の位置に集光するパターンＣ’を有する場合、カバーガラスＧの底面の照明領域においては、図５（ｂ）〜（ｄ）に示されるように、複数方向から同時に斜入射されたレーザ光Ｌ５同士が干渉することによって、そのパターンＣ’に応じた干渉縞が発生する。図５（ａ）〜（ｄ）の下段に示されるようなスペックルノイズは、エバネッセント光および蛍光Ｌｆにも強度ムラを生じさせ、その結果、液浸対物レンズ３によって結像される蛍光像にもスペックルノイズが残る。

図５（ａ）〜（ｄ）において、上段は、瞳位置Ｐまたはこれと共役な位置Ｑにおけるレーザ光Ｌ３，Ｌ４の集光パターンＣ，Ｃ’を示し、下段は、カバーガラスＧの底面におけるレーザ光Ｌ５の照度分布を示している。また、図５（ｂ），（ｃ），（ｄ）の上段は、レーザ光Ｌ３が２本、４本、３６本に分割されて、２個、４個、３６個の位置に集光するパターンＣ’をそれぞれ示している。

本実施形態においては、カバーガラスＧの底面の照明領域に形成されたスペックルノイズも、レーザ光Ｌ５の光軸Ｚ回りの回転に伴って、撮像素子１８の露光時間Ｔの間に、光軸Ｚ回りに１回転以上する。これにより、照明領域においては、スペックルノイズに起因する不均一なレーザ光Ｌ５の照度分布が時間的に平均化されて視認されない程度にまで低減され、エバネッセント光および該エバネッセント光によって励起される蛍光Ｌｆの、スペックルノイズに起因する明暗も時間的に平均化される。撮像素子１８は、このようにしてスペックルノイズが実質的に除去された蛍光像を撮影するので、均一な照度分布を有するレーザ光を用いて蛍光Ｌｆを励起した場合と同等の、スペックルノイズを含まない蛍光画像を取得することができる。

また、回折格子７は、直径約１０ｍｍまたはそれ以下の円板状の小さな部材であるので、１２０００ｒｐｍ程度の高速の回転速度においても、安価かつ簡易な回転機構１７による安定した回転が可能である。

さらに、レーザ光Ｌ３を回転させる回転機構１７として、回折格子７を回転させる方式を採用することによって、特別な構成や制御を必要とせずにレーザ光Ｌ３を入射光軸Ｘの延長軸線回りに正確に回転させることができる。

すなわち、回折格子７から出射されるレーザ光Ｌ３は、図６（ａ），（ｂ）に示されるように、回折格子７の回折面に形成されている格子の、回転軸線Ｙ回りの角度のみによって制御され、回折格子７の、入射光軸Ｘに交差する方向の並進移動は、レーザ光Ｌ３に何ら影響しない。したがって、図６（ｂ）に示されるように、入射光軸Ｘと、回転機構１７による回折格子７の回転軸線Ｙと、回折格子７の中心軸Ｗとの三者は必ずしも一致している必要が無く、回折格子７は、どの回転角度においてもレーザ光Ｌ２が入射する位置に配置されていればよい。これにより、回折格子７の高精度なアライメントを不要とし、機械的な回転等に伴って回折格子７の位置ずれが発生したとしてもこれを許容することができる。

なお、本実施形態においては、回折格子７を回転させることによってレーザ光Ｌ３を回転させる回転機構１７について説明したが、回転機構１７の構成はこれに限定されるものではなく、他の光学素子、例えば像回転プリズムまたは２枚のガルバノミラーを用いてレーザ光Ｌ３またはＬ４を回転させる構成を採用してもよい。ただし、像回転プリズムおよびガルバノミラーを用いる場合には、高精度なアライメントや制御が必要となる。

例えば、アキシコンレンズ８とリレーレンズ９との間に配置した図示しない像回転プリズムの回転によってレーザ光Ｌ４を回転させる場合には、像回転プリズム自身の中心軸と、像回転プリズムの回転軸線と、入射光軸Ｘの延長軸線との三者が正確に一致していなければならない。さらに、像回転プリズムは比較的大きな部材であるため、回転に伴って数ミクロン規模の位置ずれが生じやすい。したがって、像回転プリズムの高精度なアライメントや、像回転プリズムの位置ずれを補償するための高度な制御が必要となる。

２枚のガルバノミラーによってレーザ光Ｌ４を互いに直交する方向に走査することによってレーザ光Ｌ４を回転させる場合にも、ガルバノミラーの反射光軸と、入射光軸Ｘの延長軸線とが正確に一致していなければならない。さらに、レーザ光Ｌ４を回転させるためには、２つのガルバノミラーを正確に同期させながら駆動しなければならない。もし２つのガルバノミラーの振動の位相および振幅がわずかでも理想値からずれてしまうと、レーザ光Ｌ４の回転軌跡が真円筒面ではなく楕円筒面になってしまう。したがって、ガルバノミラーの高度な制御が必要となる。

また、本実施形態においては、回折格子７を透過したレーザ光Ｌ３を偏向する光学素子として、図７（ａ）に示されるように、レーザ光Ｌ３を透過させる際に偏向するアキシコンレンズ８を例示したが、これに限定されるものではなく、図７（ｂ）に示されるように、テーパ面状の反射面１３ａとテーパ内面状の反射面１４ａとを組み合わせて反射によりレーザ光を偏向するミラー１３，１４を採用してもよい。

また、本実施形態においては、回折格子７において、レーザ光Ｌ２を漸次広がる円錐面上に主光軸を有し、かつ、ＮＡを有するレーザ光Ｌ３に変換したが、これに代えて、図８に示されるように、コリメートレンズ６によって略平行光に変換されたレーザ光Ｌ２にＮＡを付与する集光レンズ１５を設け、回折格子１６としては、集光レンズ１５から出射されたＮＡを有するレーザ光を円錐面上に沿う主光軸を有する光に変換するためのパワーを有しないものを採用してもよい。このようにすることで、回折格子１６の機能を単純化して簡易に構成することができる。また、回折格子１６に平行光を入射させ、回折格子１６から射出されたレーザ光にＮＡを付与するレンズを回折格子１６の後段に設けることにしてもよい。

また、本実施形態においては液体ＢとカバーガラスＧとの界面においてレーザ光Ｌ５を全反射させる全反射照明を行う顕微鏡照明装置４を例示したが、これに代えて、コンデンサレンズによって光軸に対して傾斜した方向から偏射照明したレーザ光Ｌ５を全反射させること無く透過させ、透過光が入射しない光軸上の位置において蛍光を観察するための暗視野照明を行う顕微鏡照明装置に適用することにしてもよい。

また、本実施形態においては、図１のアキシコンレンズ８から出射されたレーザ光Ｌ４の集光位置である、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐと光学的に共役な位置Ｑにレーザスペックルリデューサ（ランダム位相変調素子：図示略）を配置して、標本Ｓに照射されるレーザ光に含まれるスペックルノイズを低減することにしてもよい。

１ 顕微鏡
２ ステージ
３ 液浸対物レンズ（集光レンズ）
４ 顕微鏡照明装置
７，１６ 回折格子（光変換部）
８ アキシコンレンズ（光学素子）
１５ 集光レンズ（レンズ：光変換部）
１７ 回転機構
Ｐ 瞳位置
Ｑ 共役な位置
Ｓ 標本
Ｓ１ 第１のステップ
Ｓ２ 第２のステップ
Ｓ３ 第３のステップ
Ｓ４ 第４のステップ
Ｓ５ 第５のステップ

Claims (9)

1. 光源から発せられたレーザ光を入射させ、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換して出射させる光変換部と、
   該光変換部から出射されたレーザ光を前記入射光軸に平行な方向に偏向する、パワーを有しない光学素子と、
   前記光変換部から出射されたレーザ光を前記入射光軸の延長軸線回りに回転させる回転機構とを備え、
   前記光学素子から出射されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる顕微鏡照明装置。
2. 前記光変換部が、レーザ光を偏向しかつＮＡを付与する回折格子である請求項１に記載の顕微鏡照明装置。
3. 前記光変換部が、レーザ光にＮＡを付与する正のパワーを有するレンズと、レーザ光を偏向する回折格子とを備える請求項１に記載の顕微鏡照明装置。
4. 前記回転機構が、前記回折格子を、前記入射光軸に平行な回転軸線回りに回転させる請求項２または請求項３に記載の顕微鏡照明装置。
5. 前記回転機構は、前記レーザ光の照射によって前記標本から発せられる観察光を撮影する撮像素子の露光時間をＴ秒としたときに、毎秒１／Ｔ回転以上の回転速度で前記光変換部を回転させる請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡照明装置。
6. 前記光変換部が、前記円錐面上に全周にわたって連続的に分布するレーザ光に変換する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡照明装置。
7. 前記光学素子が、前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動可能に設けられている請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡照明装置。
8. 光源から発せられたレーザ光を、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換する第１のステップと、
   該第１のステップにおいて変換されたレーザ光を、パワーを有しない光学素子によって前記入射光軸に平行な方向に偏向する第２のステップと、
   該第２のステップにおいて偏向されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる第３のステップと、
   前記光学素子を前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動させる第４のステップと、
   前記第３のステップにおいて前記集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させるレーザ光を前記入射光軸の延長軸線回りに回転させる第５のステップとを含む顕微鏡照明方法。
9. 標本を搭載するステージと、
   該ステージに搭載された標本に対向して配置される集光レンズと、
   該集光レンズにレーザ光を入射させる請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡照明装置とを備える顕微鏡。

Images